KR20010082234A - 표적 세포에 의한 인자 ｖｉｉｉ의 발현을 위한 아데노관련 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 세포에서 유전자 발현에 유용한 개선된 바이러스 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 유전자 치료요법에 적합한 아데노 관련 벡터 (AAV)를 제공한다. 이들 벡터는 생체 내에서 수용 개체 내에서 장기간 치료량의 생물학적으로 활성인 인자 VIII을 생성하는 작제물을 함유한 핵산을 전달할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물뿐 아니라, 이들 작제물의 제조 방법 및 이용 방법을 제공한다.

Description

표적 세포에 의한 인자 ＶＩＩＩ의 발현을 위한 아데노 관련 벡터{Adeno-Associated Vectors for Expression of Factor VIII by Target Cells}

혈우병은 혈액 응고 결함으로 특징지워지는 유전적 질병이다. 혈우병 A (대표적 혈우병, 인자 VIII 결여)에서는, X-염색체-연결된 유전자의 결여는 혈액 응고 캐스케이드에서 중요한 성분인 혈장 당단백질 인자 VIII을 코딩하는 유전자를 분열시킨다. 인간 인자 VIII은 예상 분자량이 265 kDa인 단쇄 폴리펩티드로서 합성된다. 인자 VIII 유전자는 2351개의 아미노산을 코딩하고, 단백질은 6개의 도메인을 갖고, A1-A2-B-A3-C1-C2로서 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 지정된다 (문헌[Wood et al., Nature 312:330 (1984)], [Vehar et al., Nature 312:337 (1984)]및 [Toole et al., Nature 312:342 (1984)]). 인간 인자 VIII는 세포 내에서 가공되어, A1, A2 및 B 도메인을 포함하는 200 kDa의 중쇄 및 A3, C1 및 C2 도메인을 포함하는 80 kDa의 경쇄를 주성분으로 하여 구성된 이종 이량체를 생산한다 (문헌[Kaufman et al., J. Biol. Chem., 263:6352-6362 (1988)]). 단쇄 폴리펩티드 및 이종 이량체 둘다는 비활성 전구체로서 혈장 중에서 순환한다 (문헌[Ganz et al., Eur. J. Biochem., 170:521-528 (1988)]). 혈장에서 인자 VIII의 활성화는 A2와 B 도메인 사이의 트롬빈 개열에 의해 개시되며, 이를 통해 B 도메인이 방출되어 A1 및 A2 도메인으로 구성된 중쇄가 생성된다. 980개의 아미노산을 가진 B 도메인은 단백질 형태의 활성화 전구 응고체가 결여되어 있다. 부가적으로, 천연 단백질에서, B 도메인을 플랭킹한 2개의 폴리펩티드 쇄 ("a" 및 "b")는 2가 칼슘 양이온에 결합되어 있다. 혈우병은 점 돌연변이, 결실, 또는 정지 코돈에서의 돌연변이로 인해 초래될 수 있다 (문헌[Antonarakis et al., Mol. Biol. Med. 4:81 (1987)]을 참조).

이 질병은 10,000명의 남성 중 대략 1명에서 발생하는 정도로 비교적 드물다. 비록 환자인 아버지와 보인자인 어머니 사이의 여아뿐 아니라, X-염색체가 비정상 (예, 터너 증후군, X-모자이키즘 등)인 여성에게서 혈우병이 발생할 수는 있지만, 혈우병은 여성에게서는 극히 드물다. 각 환자의 질병의 중증도는 환자 증상의 중증도 및 인자 VIII의 순환 농도에 따라 "경증", "중간증" 및 "중증"의 세 군으로 광범위하게 특성화된다. 인자 VIII의 정상 농도는 혈장 ml 당 50 내지 200 ng 범위이고, 경증 환자의 경우에는 이 수치의 6 내지 60%이고, 중간증 환자의 경우에는 이 수치의 1 내지 5%이다. 중증 환자의 경우에는 인자 VIII의 정상 농도의 1% 미만이다.

혈우병자는 수술 또는 심각한 외상 후에 응고 인자를 반드시 필요로 하나, 일상적으로는 자연적인 내부 출혈시에 보다 중요하다. 혈우병자는 유아기 때부터 자연 출혈뿐 아니라, 자연 혈관절증 및 혈액 응고 인자 교체를 요하는 다른 출혈을 경험한다. 효과적으로 치료하지 않으면, 만성 혈우병 관절증이 청년기에 나타난다. 중증 환자는 조직면을 찢고 나올 수 있는 심각한 출혈이 나타날 수 있어서, 궁극적으로 손상된 생체 기관으로 인해 죽음에 이르게 된다.

혈종은 보통 중간증 및 중증 혈우병자에게서 관찰된다. 이들 환자에서는, 혈종이 점점 커져서 사방으로 찢고 나온다. 이들 혈종의 일부는 국부적으로 커져서, 인접 기관, 혈관 및 신경을 국부적으로 압박한다. 드물지만 종종 치명적인 복부 혈종의 합병증으로 인해 혈종이 결장으로 관통하여 흘러나가 감염 및 패혈증을 일으킨다. 두개골내 및(또는) 두개골외 출혈 또한 매우 위험한 출혈 상황을 나타낸다. 피하 혈종은 근육을 찢고 나올 수 있으며, 인두 혈종 및 인두후 혈종 (예, 박테리아성 또는 바이러스성 인두염 합병증)은 커져서 기도를 막아, 때때로 인자 VIII 농도를 정상화하기 위해 충분한 양의 인자 VIII 농축물을 투여하는 것을 요하는 치명적인 상황을 초래한다.

혈종뿐 아니라, 혈관절증도 혈우병성 출혈의 약 75%로 여겨지는 관절로의 출혈을 수반하여 혈우병자에게서 일반적으로 관찰된다. 반복되는 관절로의 출혈은 결국 인공 연골, 활액 과다형성, 및 인접 조직 및 골에서의 다른 반응 변화의 광범위한 파괴를 초래한다. 반복된 혈관절증의 주요 합병증은 근위축 및 연조직 구축에 의해 흔히 수반되는 관절 기형증이고, 관절 공간이 점점 손실됨에 따라 연골하 골의 골다공증 및 낭종 부위 또한 진행될 수 있다.

혈뇨 및 점막 출혈을 비롯한 다른 증상이 혈우병자에게서 흔히 관찰된다. 사실상 모든 중증 혈우병자는 일생 동안 때때로 혈뇨를 경험하고, 점막 출혈은 혈우병자에게 있어서 흔히 일어난다. 골낭종 (가성 종양)은 드물지만, 혈우병성 출혈의 위험한 합병증이다. 이러한 여러 경우에는, 신속한 처치가 필요하다.

1980년대 초반에, 여러 중증 혈우병자들에게 인자 VIII 농축물을 매주 약 3회 처치하였다. 유감스럽게도, 이들 농축물은 헤파티티스 B 및(또는) C와 같은 바이러스, 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)를 전염시켰다. 미국 및 서부 유럽에서는, 인자 VIII 농축물 수용자의 75% 이상이 항-HIV 항체를 갖는 것을 보고되었다 (상기 Schrier 및 Leung의 문헌 참조). 이들 환자의 일부에서는 또한 혈우병자에게 있어서 매우 심각한 합병증인 HIV-관련 면역 혈소판 결핍증이 진행되었다. 질병 진행을 늦추는데 도움이 되는 항바이러스성 치료요법 (예, 지도부딘 (zidovudine) 및 펜타미딘 예방법)에도 불구하고, HIV에 감염된 혈우병자에게서 완전한 AIDS (후천성 면역결핍증)가 엄청난 속도로 나타난다. 실제로, 이는 혈우병자의 예상 수명의 개선을 퇴행시켰으며, 즉 1970년대에는 66세가 최고였으나 49세로 저하되었다 (상기 Schrier 및 Leung의 문헌 참조). 무-바이러스 제조물 및 재조합 인자 VIII의 개발이 감염성 바이러스 오염을 조절하는데 도움이 된다.

그러나, 혈우병자의 경우, 무-바이러스 농축물 및 재조합 인자 VIII의 유용성은 상당하지만 해결책의 일부일 뿐이다. 자연적인 내부 출혈 현상을 막기 위해서는, 혈우병 A로 고통받는 환자는 혈청 인자 VIII 농도가 약 1%, 바람직하게는 약 5%로 일정해야 한다. 일반적으로, 무-바이러스 농축물 및 재조합 인자 VIII의 비용이 혈액 응고의 예방 또는 유지를 위해 투여하기에는 엄청나게 비싸다. 실제로, 미국의 대부분의 혈우병자들은 유지를 위해서는 재조합 인자 VIII 치료요법을 받지 않을 뿐 아니라, 출혈이 일어날 수 있는 활동 및 상황 (예, 수술) 전에도 또는 자연 출혈의 치료를 위해서도 받지 않는다.

또한, 비용효과적인 재조합 또는 무-바이러스 인자 VIII의 제조물이 유용하다 하더라도, 매일 투여하여서는 인자 VIII의 농도를 일정하게 할 수 없다. 기껏해야, 환자는 광범위한 농도의 인자 VIII을 받는다. 투여 전에는 농도가 생리학적 농도보다 낮은 반면, 투여 직후에는 농도가 생리학적 농도보다 높다. 따라서, 비교적 경제적이고 혈우병자의 출혈, 특히 자연 출혈의 치료 및 예방에 유용한 방법 및 조성물이 여전이 요구되고 있다. 또한, 정상 개체에서 관찰되는 일정한 생리학적 농도에 보다 가깝게 할 수 있는 응고 인자 (예, 인자 VIII)의 장기간 전달을 위한 방법 및 조성물이 당업계에서 필요로 된다.

<발명의 요약>

본 발명은 혈우병 치료를 위한 유전자 치료요법에 적합한 개선된 바이러스 벡터를 제공한다. 특히, 본 발명은 AAV 벡터, 및 응고 단백질 인자 VIII을 코딩하는 핵산을 전달함으로써 혈우병 A의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물뿐 아니라, 벡터의 제조 방법 및 이용 방법을 제공한다.

본 발명은 혈우병 A 유전자 치료요법에 특히 적합하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양에서는, 인자 VIII을 코딩하는 핵산 분자를 함유한 1종 이상의 AAV 벡터를 적합한 수용 세포에서 인자 VIII의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 다음, 인자 VIII을 발현시키는 조건하에 상기 AAV 벡터를 개체의 수용 세포에 도입한다. 따라서, 개체는 출혈 상황 동안 혈액을 응고시키는데 유용한 인자 VIII을 연속적으로 공급받는다.

본 발명의 방법을 이용하여, 치료적 농도의 인자 VIII을 장기간 발현시키는 것이 생체 내에서 달성되었다. 한 실시태양에서는, 동물에게 간문맥을 통해 2개의 AAV 벡터, 즉 인자 VIII의 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 운반하는 벡터 및 인자 VIII의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 운반하는 다른 벡터를 투여한다. 혈액 샘플을 주기적으로 수집하고, 인자 VIII의 활성을 분석한다. 동물에서 600 내지 900 ng/ml의 생물학적으로 활성인 인자 VIII이 재현가능하게 발현되었고, 이 농도는 정상적인 생리학적 농도인 약 200 ng/ml보다 큰 농도이다. 또한, 이들 농도는 인자 VIII의 농도 및 활성을 감소시키지 않고 13개월에 걸쳐 유지되었다. 관련 실시태양에서는, B-도메인 결실 형태의 인자 VIII을 단일 AAV 벡터에로 클로닝시켜, 생물학적으로 활성인 인자 VIII이 발현된다는 것을 밝혔다.

그러나, 본 발명은 구체적인 실시태양으로 제한되지는 않는다. 다른 여러 형태의 재조합 인자 VIII을 제조하고, 다양한 다른 제어 및 조절 서열을 이용하여 시험관 내 및 생체 내에서 모두 시험하였다. 본 발명에 교시된 AAV 벡터 및 방법을 이용함으로써 생물학적으로 활성인 인자 VIII을 코딩하는 임의의 DNA 서열을 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내에서 생물학적으로 활성인 인자 VIII 단백질을 생성하는 인자 VIII 서열을 포함하는 임의의 AAV 벡터 또는 벡터들을 포함한다.

예를 들면, 일부 실시태양에서는, AAV 벡터가 10개의 아미노산 신호 서열뿐 아니라 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 인자 VIII 경쇄의 처음 57 염기 쌍을 포함한다. 일부 대안적인 실시태양에서는, 벡터가 또한 A1 및 A2 도메인뿐 아니라, B 도메인의 N-말단으로부터 5개의 아미노산 및(또는) B 도메인의 C-말단으로부터 85개의 아미노산뿐 아니라, A3, C1 및 C2 도메인을 포함한다. 또다른 실시태양에서는, 인자 VIII 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 B 도메인의 14개 아미노산을 코딩하는 42개의 핵산에 의해 분리된 단일 벡터에로 클로닝시켰다.

본 발명은 또한 상기 기재된 벡터를 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 수용 환자 또는 시험 동물의 간으로 AAV 벡터를 전달하는데 적합한 방법을 포함한다. 본 발명은 어떠한 투여 경로로도 제한되지 않는다. 그러나, 바람직한 실시태양에서는, 본 발명의 AAV 벡터를 간문맥 또는 간동맥을 통해 성공적으로 투여한다.

본 발명의 이들 및 다른 실시태양은 본원의 개시 내용에 비추어 당업자들이 용이하게 인식할 것이다.

<도면의 간단한 설명>

도 1은 인자 VIII 단백질의 개략도이다.

도 2는 인자 VIII 단백질의 B-도메인 결실 형태의 개략도이다.

도 3은 조절 서열을 비롯한, 내부 종결 반복부 (ITR에서 ITR로)로부터의 B-도메인 결실된 인자 VIII AAV 작제물 (AAV-F8-1)의 개략도이다.

도 4는 조절 서열을 비롯한, 내부 종결 반복부 (ITR에서 ITR로)로부터의 B-도메인 결실된 인자 VIII AAV 작제물 (PVM4.1c-F8AB))의 개략도이다.

도 5는 플라스미드 골격 생략된 pAAV-F8-1 (ITR에서 ITR로)의 서열이다.

도 6은 플라스미드 골격 생략된 pVm4.1cF8△B (ITR에서 ITR로)의 서열이다.

도 7은 rAAV-hFVIII-HC 및 rAAV-hFVIII-LC 벡터의 맵이다.

도 8은 마우스 혈장에서 다양한 인간 FVIII 작제물의 발현을 입증하는 그래프이다.

도 9는 (A) hFVIII의 경쇄 및 (B) hFVIII의 중쇄에 대해 특이적인 프로브를 이용한 간 DNA에 대한 써던 블롯 분석이다.

도 10은 (A) hFVIII의 경쇄 및 (B) hFVIII의 중쇄에 대해 특이적인 프로브를 이용한 다른 조직의 DNA에 대한 써던 블롯 분석이다.

도 11은 (A) hFVIII의 경쇄 및 (B) hFVIII의 중쇄에 대해 특이적인 프로브를 이용한 간 DNA에 대한 노던 블롯 분석이다.

<발명의 일반적인 설명>

본 발명은 인간 세포에서 고농도로 유전자 생성물을 발현시키는데 유용한 개선된 바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 치료요법에 적합한 AAV 벡터를 제공한다. 이들 벡터는 숙주에서 인자 VIII 단백질을 생성시킬 수 있는 작제물을 함유한 핵산을 전달할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물뿐 아니라, 상기 작제물의 제조 방법 및 이용 방법을 제공한다.

본 발명의 AAV 벡터 및 rAAV 비리온은 당업자에게 공지된 표준 방법을 통해 제조될 수 있다. 이 방법은 일반적으로 (1) AAV 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계, (2) AAV 벡터에는 없는 AAV 헬퍼 기능을 보완하기 위해 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함하는 AAV 헬퍼 작제물을 숙주 세포에 도입시키는 단계 (3) 숙주 세포에서 효과적인 재조합 AAV ("rAAV") 비리온 생성을 유지할 수 있는 보조 기능을 제공하는 1종 이상의 헬퍼 바이러스 및(또는) 보조 기능 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계 및 (4) 숙주 세포를 배양하여 rAAV 비리온을 생성하는 단계를 포함한다. AAV 벡터, AAV 헬퍼 작제물 및 헬퍼 바이러스 또는 보조 기능 벡터(들)은 표준 형질감염 기술을 통해 동시에 또는 차례로 숙주 세포에 도입될 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 문헌[Sambrook et al. (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; [Glover (ed.) DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II]; [Gait (ed.) Oligonucleotide Synthesis]; [Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization]; [Hames and Higgins (eds.) Transcription and Translation]; [Tijessen (ed.) CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I and II]; 및 [Field and Knipe (eds.) Fundamental Virology, 2nd Edition, Vols. I and II]에서 기술한 것들을 포함하는 당업자의 바이러스학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상의 방법을 사용한다.

정의

본 발명을 기술하는데 있어서, 하기의 용어를 사용할 것인데, 하기에 나타낸 것과 같이 정의되도록 의도된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 수송 (gene transfer)" 및 "유전자 전달 (gene delivery)"은 특정 뉴클레오티드 서열 (예:DNA)을 표적 세포내로 확실히 삽입시키는 방법 또는 시스템을 나타낸다. 특히 바람직한 실시태양에서, 뉴클레오티드 서열은 인자 VIII의 적어도 일부를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어, "벡터" 및 "유전자 수송 벡터"는 임의의 유전 요소, 예를 들어 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 크로모좀, 바이러스, 비리온 등을 나타내며, 이들은 적합한 조절 서열과 관련될 때 복제가능하고(거나) 세포들 사이에서 핵산 서열을 수송할 수 있다. 따라서, 이 용어는 바이러스 벡터 뿐 아니라 클로닝 및 발현 벡터를 포함한다.

유전자 수송 벡터는 전사 서열, 예를 들어 폴리아데닐화 부위, 선택가능한 마커 또는 리포터 유전자, 인핸서 서열, 및 전사의 유도를 허용하는 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절 서열은 하기에 더욱 완전하게 기술한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "발현 벡터"는 특히 숙주 생물체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 바람직한 코딩 서열 및 적합한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 나타낸다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 통상 다른 서열 뿐 아니라 프로모터, 오퍼레이터 (임의로) 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 필수 발현에 영향을 미치지 않고 몇몇 요소를 제거하고다른 요소를 첨가시킬 수 있지만, 통상 프로모터 (구성적, 유도적 또는 조직 특이적인 것), 인핸서, 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "숙주" 및 "발현 숙주"는 재조합 유전자 또는 단백질의 발현에서의 사용에 적합한 생물체 및(또는) 세포 뿐만 아니라 외생 DNA 서열 (예를 들어, 형질감염에 의한 서열), 발현 벡터 또는 비히클을 포함하는 생물체 및(또는) 세포를 나타낸다. 본 발명을 세포 또는 생물체의 임의의 특정형으로 제한하려는 의도는 아니다. 실제로, 임의의 적합한 생물체 및(또는) 세포가 본 발명에서 숙주로서의 용도로 발견될 것으로 생각된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "바이러스의 복제단위" 및 "바이러스의 복제 기점"은 적합한 복제 인자를 발현시키는 숙주 세포 중 벡터의 염색체외 복제를 허용하는 바이러스 DNA 서열을 나타낸다. 몇몇의 실시태양에서, SV40 또는 폴리오마 바이러스의 복제 기점을 포함하는 벡터는 높은 카피 수로 복제하는 반면, 소의 유두종바이러스 또는 에프스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스로부터의 복제단위를 포함하는 벡터는 염색체외로 낮은 카피 수로 복제하며 다른 실시태양에서 이용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "AAV 벡터"는 기능성 또는 부분 기능성 ITR 서열을 갖는 벡터를 나타낸다. ITR 서열은 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래될 수 있으며, 이것으로 한정되지는 않으나, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-X7 등을 포함한다. 그러나, ITR들은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 기능을 보유하는 한 변경 (예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경)될 수 있다. AAV 벡터는 전체 또는 부분이 결실된 1종 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는rep및(또는)cap유전자를 가질 수 있지만 기능성 플랭킹 ITR 서열을 보유한다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 구조, 복제 및 패키징에 필요하다. 따라서, "AAV 벡터"는 본 명세서에서 바이러스의 복제 및 패키징을 위해cis에서 요구되는 이들 서열을 최소한 포함하는 것으로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 "ITR"은 도립 종결 반복부 (inverted terminal repeats)를 나타낸다. 용어 "아데노 관련 바이러스 도립 종결 반복부" 또는 "AAV ITR"는 DNA 복제 기점 및 바이러스의 패키징 신호로서cis에서 함께 기능하는 AAV 유전자의 각각의 말단에서 발견되는 당업자가 인식할 수 있는 팔린드로믹 영역 (palindromic region)을 나타낸다. 본 발명의 몇몇 실시태양의 용도에서, 플랭킹 AAV ITR은 1종 이상의 선택된 이종 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3'으로 위치한다. 임의로는rep코딩 영역 또는 Rep 발현 생성물과 함께 ITR은 표적 세포의 게놈으로 선택된 서열의 삽입을 제공한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "AAVrep코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 유전자의 당업자가 인식할 수 있는 영역을 나타낸다. 이들 Rep 발현 생성물은 DNA 복제의 AAV 기점의 인식, 결합 및 니킹 (nicking), DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사의 조절을 비롯한 많은 기능을 갖는 것으로 보였다. Rep 발현 생성물은 AAV 게놈을복제하는데 집합적으로 요구된다. 문헌[Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-129 (1992)] 및 [Kotin, Hum. Gene Ther., 5:793-801 (1994)]은 하기에 기술되는cap코딩 영역 뿐만 아니라 AAVrep코딩 영역에 관한 추가의 설명을 제공한다. AAVrep코딩 영역의 적합한 상동체는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로 알려진 인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6)rep유전자 [참고: Thomson et al., Virol., 204:304-311 (1994)]를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "AAVcap코딩 영역"은 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩하는 AAV 게놈의 당업자가 인식할 수 있는 영역, 또는 그의 기능적 상동체를 나타낸다. 이들cap발현 생성물은 바이러스 게놈을 패키징하는데 집합적으로 요구되는 패키징 기능을 공급한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "AAV 헬퍼 기능"은 AAV 벡터에는 없는 AAV 바이러스 기능을 보완하기 위해 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 나타낸다. 통상, AAV 헬퍼 기능은 AAVrep코딩 영역 및 AAVcap코딩 영역을 포함한다. "AAV 헬퍼 작제물"은 AAV 벡터 (예, AAVrep코딩 영역 및 AAVcap코딩 영역)에는 없는 AAV 바이러스 기능을 보완하는데 요구되는 AAV 코딩 영역을 포함하는 벡터이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "보조 기능" 및 "보조 인자"는 복제를 위해 AAV에 의해 요구되는 기능 및 인자이지만, AAV 비리온 (또는 rAAV 비리온) 자체에 의해 제공되지는 않는다. 따라서, 이들 보조 기능 및 인자는 숙주 세포, 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스), 또는 동일한 세포에서 동시 발현되는 또다른 발현 벡터에 의해 제공되어야 한다. 통상, 아데노바이러스의 E1, E2A, E4 및 VA 코딩 영역은 AAV 복제 및 패키징에 요구되는 필수 보조 기능을 공급하는데 사용된다 [참고: Matsushita et al., Gene Therapy 5:938 (1998)].

본 명세서에 사용되는 용어 "야생형 ("wt")"은 자연 발생원으로부터 단리될 때의 유전자 또는 유전자 생성물의 특성을 갖는 유전자 또는 유전자 생성물을 나타낸다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 자주 관찰되는 것이고, 따라서 유전자의 "정상" 또는 "야생형"으로 임의적으로 지칭된다. 대조적으로, 용어 "변형된" 또는 "변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때, 서열 및(또는) 기능적 특성 (즉, 변경된 특성)의 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 나타낸다. 자연-발생 변이체를 단리할 수 있다는 것이 주목되는데, 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 변경된 특성을 갖는다는 사실에 의해 확인된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "AAV 비리온"은 완전 바이러스 입자, 예를 들어 "야생형" (wt) AAV 바이러스 입자 (AAV 캡시드 단백질 코트와 관련된 선형, 단일-가닥 AAV 핵산 게놈)를 나타낸다. 이에 관하여, 서로 상보적 센스인 단일-가닥 AAV 핵산 분자 (예를 들어, "센스" 또는 "안티센스" 가닥)는 임의의 1종의 AAV 비리온에로 패키징될 수 있으며, 양쪽 가닥 모두는 동일하게 감염성이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "재조합 AAV 비리온" 및 "rAAV 비리온"은 AAV ITR에 의해 양쪽에 플랭킹된 목적 이종 DNA 분자 (예를 들어, 인자 VIII 서열)를포함하는 감염성 바이러스 입자를 나타낸다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, rAAV 비리온은 숙주 세포로 도입되는 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 보조 기능을 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생성된다. 이러한 방식으로, 숙주 세포는 목적 재조합 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인자 VIII 또는 인자 VIII 도메인의 적어도 일부를 포함하는 AAV 벡터를 후속적인 유전자 전달을 위한 재조합 비리온 입자에로 패키징하는데 요구되는 AAV 폴리펩티드를 코딩할 수 있게 된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 삽입을 말하고, 세포는 외생 DNA가 세포 막 안으로 도입될 때 "형질감염된다". 수많은 형질감염 기술이 당 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다 [참고: Graham et al., Virol., 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, (1986); 및 Chu et al., Gene 13:197 (1981)]. 이러한 기술은 하나 이상의 외생 DNA 일부, 예를 들어 유전자 수송 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 수용 세포로 도입하는데 사용할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "안정한 형질감염" 및 "안정하게 형질감염된"은 외래 DNA를 형질감염된 세포의 게놈에로 도입 및 삽입하는 것을 나타낸다. 용어 "안정한 형질감염체"는 외래 DNA를 유전자 DNA로 안정하게 삽입시키는 것을 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 용어 "일시적인 형질감염" 또는 "일시적으로 형질감염된"은 외래 DNA가 형질감염된 세포의 게놈에로 도입되지 않는 세포에로 외래 DNA를도입시키는 것을 나타낸다. 외래 DNA는 수일동안 형질감염된 세포의 핵에 잔존한다. 이 시기동안 외래 DNA는 염색체 중 내생 유전자의 발현을 조절하는 제어를 받는다. 용어 "일시적인 형질감염체"는 외래 DNA가 도입되지만, 이 DNA가 염색체 내로 삽입되지는 않는 세포를 말한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "형질도입"은 복제가 불가능한 바이러스 벡터, 예를 들어 재조합 AAV 비리온을 통해 DNA 분자를 생체 내 또는 시험관 내에서 수용 세포로 전달하는 것을 말한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "수용 세포"는 선택된 목적 뉴클레오티드 서열 (즉, 인자 VIII)을 갖는 핵산 작제물 또는 벡터에 의해 형질감염되거나 또는 형질도입되거나, 또는 형질감염 또는 형질도입될 수 있는 세포를 나타낸다. 이 용어는 선택된 뉴클레오티드 서열이 존재하는 한, 후대 (progeny)가 형태학적으로 또는 유전자 구성적으로 원래의 모체와 동일하든 아니던간에 모세포의 후대를 포함한다.

핵산 서열, 예를 들어 코딩 서열 및 조절 서열에 관련한 것으로서 용어 "이종"은 함께 정상적으로 결합하지 않고(거나) 특정 세포와 정상적으로 관련하지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종" 영역은 핵산의 사실상 다른 분자와 결합되지 않는 또다른 핵산 분자 내의 또는 여기에 부착하는 핵산 단편이다. 예를 들어, 핵산 작제물 또는 벡터의 이종 영역은 사실상 코딩 서열과 관련하지 않는 서열로 플랭킹된 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또다른 예는 코딩 서열 자체가 사실상 발견되지 않는 작제물이다 (예: 천연 서열과 상이한 코돈을 갖는 합성 서열). 유사하게는, 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 작제물로 형질감염된 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종성으로 고려될 것이다. 대립 유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이에서는 본 명세서에 사용되는 이종성 DNA가 발생되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 용어 "코딩 서열" 또는 특정 항원을 "코딩하는" 서열은 적합한 조절 서열의 조절을 받을 때 생체 내 또는 시험관 내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우)되고 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 원핵세포 또는 진핵세포 mRNA로부터의 cDNA, 원핵세포 또는 진핵세포 DNA로부터의 DNA 서열 게놈, 및 합성 DNA 서열조차 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 나타낸다. 이 용어는 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체, 예를 들어 이것으로 한정되는 것은 아니지만 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 수도이소시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸수도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸리노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 수도우라실, 퀴오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 수도우라실, 퀴오신, 2-티오시토신 및 2,6-디아민푸린을 포함하는 서열을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 기술에 의해 함께 결합된 DNA 단편을 포함하는 DNA분자를 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 용어 "조절 요소"는 핵산 서열의 발현 양상을 조절하는 유전 요소를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 등이다 (infra로 정의됨).

용어 DNA "조절 서열"은 수용 세포 중 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역에 집합적으로 제공되는, 조절 요소, 예를 들어 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 도입 부위 ("IRES"), 인핸서 등을 집합적으로 나타낸다. 선택된 코딩 서열이 적합한 수용 세포 내에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 조절 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다.

진핵세포에서 전사 조절 신호는 통상 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 포함되는 세포 단백질과 특이적으로 상호반응하는 DNA 서열의 짧은 배열로 구성된다 [참고: Maniatis et al., Science 236:1237(1987)). 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유류 세포 및 바이러스의 유전자를 포함하는 다양한 진핵세포원으로부터 단리되어 왔다 (유사 조절 서열, 즉, 프로모터는 또한 원핵세포에서도 발견된다). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 세포형이 목적 단백질을 발현시키는데 사용되는 것인가에 좌우된다 (즉, 인자 VIII). 몇몇의 진핵세포의 프로모터 및 인핸서는, 다른 것들이 범위가 한정된 세포형에서 기능성인 반면에, 광범위한 숙주 범위를 갖는다 [참고: Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 [1986]; and Maniatis et al., supra, for reviews]. 예를 들어, SV40 조기 유전자 인핸서는 많은 포유류종으로부터의 광범위한 세포형에서 활성이 크며, 포유류 세포 중 단백질의 발현에 광범위하게 사용되어 왔다 [참고: Dijkema et al, EMBO J. 4:761 [1985]]. 포유류 세포형의 넓은 범위에서 활성이 있는 프로모터 및 인핸서 요소의 2가지 다른 예는 인간 연장 (elongation) 인자 1α유전자 [참고: Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791 (1989); Kim et al., Gene 91:217 (1990); 및 Mizushima and Nagata, Nucl. Acids. Res., 18:5322 (1990)] 및 로우스 사르코마 바이러스 (Rous sarcoma virus) [참고: Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)] 및 인간 시토메갈로바이러스 [참고: Boshart et al., Cell 41:521 (1985)]의 긴 말단 반복부로부터의 것들이다. 프로모터 및 인핸서는 자연적으로 단독으로 또는 함께 발견될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부는 프로모터 및 인핸서 기능 모두를 함유한다. 또한, 통상 프로모터 및 인핸서는 전사 또는 번역하고자 하는 유전자와 독립적으로 행동한다. 따라서, 인핸서 및 프로모터는 "내생" 또는 "외생" 또는 "이종"일 수 있다. "내생" 인핸서/프로모터는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외생" 또는 "이종" 인핸서 및 프로모터는 유전자의 전사가 인핸서/프로모터에 직접 연결되는 유전자 조작 (즉, 분자 생물학적 기술)의 방법으로 유전자에 병치된 것이다.

본원에 사용된 용어 "조직 특이적"은 핵산 서열이 실제로 특정 세포 유형 또는 조직에서 보다 높게 발현되는 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소 또는 조절 서열을 의미한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 알부민 프로모터 및 트랜스티레틴 프로모터는 다른 세포 유형에 비해 간세포에서 FVIII의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발명은 알부민 또는 트랜스티레틴 프로모터, 또는 다른 조직 특이적 조절 요소로서 간-특이적 발현, 또는 변화된 유전자 발현 패턴을 나타내는 조절 요소로 한정되는 것으로 생각되진 않는다.

발현 벡터상의 "스플라이싱 신호"의 존재는 흔히 재조합 전사체를 더 높은 수준으로 발현시킨다. 스플라이싱 신호는 일차 RNA 전사체에서 인트론이 제거되도록 조절하며 스플라이스 공여 부위 및 수용 부위로 이루어져 있다[샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), pp. 16.7-16.8]]. 일반적으로 사용되는 스플라이스 공여 부위 및 수용 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이스 연결부이다.

진핵 세포에서 재조합 DNA 서열이 효과적으로 발현되기 위해서는 생성된 전사체의 효과적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 신호가 발현되어야 한다. 전사종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되며 몇백개의 뉴클레오티드 길이이다. 본 명세서에 사용된 용어 "폴리 A 부위" 또는 "폴리 A 서열"은 초기 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 둘다 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리 A 말단이 결여된 전사체는 불안정하며 빠르게 분해되기 때문에 재조합 전사체를 효과적으로 폴리아데닐화하는 것이 바람직하다. 발현 벡터에 사용된 폴리 A 신호는 "이종"이거나 또는 "내생"일 수 있다. 내생 폴리 A 신호는 본래 게놈에서 임의 주어진 유전자의 코딩 영역의 3' 말단에서 발견되는 것이다. 이종 폴리 A 신호는 한 유전자로부터 단리되어 다른 유전자의 3'에 놓인 것이다. 일반적으로 사용되는 이종 폴리 A 신호는 SV40 폴리 A 신호이다. SV40 폴리 A 신호는 237 bpBamHI/BclI 제한 단편상에 포함되어 있으며, 종결 및 폴리아데닐화를 모두 지시한다[샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌[supra, at 16.6-16.7]].

"작동가능하게 연결된"은 상기 설명된 요소들이 그들의 통상적인 기능을 수행할 수 있게끔 배열된 것을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 한다면 조절 서열은 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 전사는 되지만 번역은 되지 않는 삽입 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 생각할 수 있다.

용어 "단리된"은, "단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"와 같이 핵산과 관련하여 사용되는 경우, 통상적으로 자연 발생원과 관련된 1종 이상의 오염 물질 핵산으로부터 확인 및 분리된 핵산 서열을 의미한다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과는 다른 형태 또는 배치로 존재한다. 대조적으로, 단리되지 않은 핵산은 자연에서 존재하는 상태로 발견되는 DNA 및 RNA와 같은 핵산이다. 예를 들어, 소정의 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 숙주 세포 염색체상의 인접 유전자 근처에서 발견되며, 특정 단백질을 코딩하는 특정 mRNA 서열과 같은 RNA 서열은 세포에서 다수의 단백질을 코딩하는 많은 다른 mRNA와의 혼합물로 발견된다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산의 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단백질을 발현시키는데 이용될 것이고, 이 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 포함하지만 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있음), 센스 및 안티-센스 가닥을 모두 포함할 수도 있다 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있음).

본 명세서에 사용된 것으로, 용어 "정제된" 또는 "정제하다"는 샘플로부터 오염 물질을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 오염성 비면역글로불린 단백질을 제거하여 정제할 수 있으며, 목적 항원 (예를 들어, 인자 VIII의 일부)과 결합하지 않는 면역글로불린을 제거하여 정제할 수도 있다. 비면역글로불린 단백질을 제거하고(하거나) 목적 항원 (예를 들어, 인자 VIII의 적어도 일부)과 결합하지 않는 면역글로불린을 제거하면, 샘플 중 원하는 항원-반응성 면역글로불린의 퍼센트가 증가하게 된다. 다른 예로는, 인자 VIII의 재조합 폴리펩티드가 박테리아숙주 세포에서 발현되고 이 폴리펩티드가 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제됨에 따라 재조합 폴리펩티드의 퍼센트는 샘플 중에서 증가된다.

본 명세서에 사용된 것으로, 용어 "키메라 단백질"은 함께 클로닝된 상이한 유전자로부터 얻어진 2종 이상의 코딩 서열을 의미하며, 번역 후에는 단일 폴리펩티드 서열로 작용한다. 본 명세서에 사용된 것으로, "키메라 단백질"은 이종 생물체로부터 얻어진 코딩 서열 및 동종 생물체로부터 얻어진 코딩 서열을 의미한다.

본원에 사용된 "소정의 폴리뉴크레오티드 서열을 포함하는 조성물"이라는 용어는 대체로 소정의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의 조성물을 의미한다. 이 조성물은 수용액을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것으로, 용어 "위험 상태"는 출혈 증상을 경험한 위험한 상태의 개체와 관련하여 사용된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 개체는 경증, 중간증 또는 중증의 혈우병에 걸린 혈우병자이다.

본 명세서에 사용된 것으로, 용어 "개체"는 임의 동물 (즉, 척추동물 및 무척추동물)을 의미하며, 용어 "척추동물 개체"는 척삭동물 아문의 임의 일원을 의미한다. 상기 용어는 척삭동물 아문의 임의 일원은 포함하고 인간 및 다른 영장류, 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫트 및 기니 피그), 라가모르프 (예를 들어, 토끼), 소과 동물 (예를 들어, 소), 양과 동물 (예를 들어, 양), 염소과 동물 (예를 들어, 염소), 돼지과 동물 (예를 들어, 돼지), 말과 동물 (예를 들어, 말), 개과 동물 (예를 들어, 개), 고양이과 동물 (예를 들어, 고양이), 가금류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위 및 기타 가금류 등)뿐 아니라 유제 동물 (예를 들어, 사슴), 곰,물고기, 라가모르프, 설치류 및 조류 등을 비롯한 야생 동물을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 수컷 또는 암컷인 성체 및 신생 개체, 및 태아를 포함한다.

본 명세서에 정의된 것으로, 용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투여량"은 충분량의 인자 VIII을 생산함으로써 개체의 혈액이 응고하는 시간을 줄여줄 수 있는 AAV 벡터 또는 비리온의 양 또는 투여량이다. 일반적으로, 혈우병에 걸리지 않은 환자의 전혈 응고시간이 약 10분인 것에 비해, FVIII을 정상 수준의 1 % 미만으로 가지는 중증 혈우병자는 60분 이상의 전혈 응고시간을 갖는다.

본 출원은 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는, 미국 가출원 제60/125,974호 (1999년 3월 24일 출원) 및 동 제60/104,994호 (1998년 10월 20일)을 우선권으로 주장한다.

본 발명은 혈우병 유전자 치료요법에 적합한 AAV 벡터 (Adeno-Associated Vectors)에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 이들 AAV 벡터는 개체의 혈액을 응고시킬 수 있도록, 혈우병 A로 고통받는 수용 개체에게 인자 VIII을 코딩하는 핵산을 전달하는데 적합하다.

본 발명은 혈우병 A 유전자 요법에 적합한 AAV 벡터에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이 AAV 벡터는 인자 VIII을 코딩하는 핵산을, 혈액 응고 장애로 고통받는 것으로 짐작되는 수용체 숙주에게 전달하는데 적합하다. 인자 VIII을 코딩하는 핵산을 주형으로 사용하면, 숙주는 인자 VIII을 생산하게 되어 개체의 혈액은 응고될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 AAV 벡터를 포함하는 제약 조성물을 제공할뿐 아니라 이 작제물을 제작 및 사용하는 방법도 제공한다.

I. AAV 벡터

아데노 관련 바이러스 (AAV)는 비병원성인 복제-결함성의 헬퍼-의존성 파보바이러스 (또는 "디펜도바이러스" 또는 "아데노-새털라이트 바이러스")이다. AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5 및 AAV-7 등으로 명명되는 6종 이상의 인식된 혈청형이 있다. 배양 및 혈청학상 증거는 인간이 AAV-2 및 AAV-3에 감염됨을 나타낸다. 인간 집단의 85 %가 AAV-2에 대해 혈청 양성이지만, AAV-2 바이러스는 인간의 병과는 전혀 상관관계가 없다. 재조합 AAV (rAAV) 비리온은 그의 광범위한 숙주 범위, 우수한 안정성, 및 감염된 숙주에서 지속적인 형질전환유전자 발현으로 인해 유전자 요법을 위한 벡터로 흥미를 끈다. 재조합 AAV (rAAV) 비리온의 한가지 두드러진 특징은 생체내에 투여한 후에도 장시간 발현된다는 것이다.

본 발명의 AAV 벡터는, 공지된 기술을 사용하여 (a) 전사 개시 및 종결 영역을 비롯한 조절 서열 및 (b) 인자 VIII의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 작동가능하게 연결된 요소들로서 전사 방향으로 배치되게끔 작제할 수 있다. 조절 서열은 표적 수용체 세포에 기능성인 것을 선택한다. 상기 작동가능하게 연결된 요소를 포함하는 생성 작제물은 기능성 AAV ITR 서열의 (5' 및 3')과 연결된다.

AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다[예를 들어, AAV-2 서열에 관하여는 코틴 (Kotin)의 문헌[Hum. Gene Ther., 5:793-801 (1994)] 및 번즈 (Berns)의 문헌["Parvoviridae and Their Replication"]을 참조한다]. 본 발명의 벡터에 사용된 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요가 없으며, (예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 변형될 수도 있다. 또한, AAV ITR은 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5 및 AAV-7 등을 비롯한 여러 AAV 혈청형 중 임의 것으로부터 유도될 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 또한, AAV 벡터에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 양측에 있는 5' 및 3' ITR은, 그들이 목적하는 기능을 하기만 한다면 반드시 동일하거나 또는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유도 또는 단리할 필요는 없다.

A. 조절 서열

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 이종 조절 서열을 벡터와 함께 사용할 수 있다. 유용한 이종 조절 서열에는 일반적으로 포유동물 또는 바이러스의 유전자를 코딩하는 서열로부터 유도된 것들이 포함된다. 그 예에는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방암 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP), 단순포진 바이러스 (HSV) 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터 영역 (CMVIE)과 같은 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 로우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 합성 프로모터 및 하이브리드 프로모터 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또한, 쥐의 메탈로티오네인 유전자와 같은 비바이러스 유전자로부터 유도된 서열을 본 발명에서 사용할 수도 있다. 이러한 프로모터 서열은 [예를 들어, 스트라타진 (Stratagene)사에서] 시판된다.

몇몇 실시태양에서는, 조직-특이적 발현이 바람직한 것으로 생각된다 (예를 들어, 간세포에 의한 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 발현). 본 발명은 임의 특정 세포 또는 세포 유형에 의한 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 발현으로 한정되지 않는다. 그러나, 간세포 (즉, 간 세포)는 통상적으로 인자 VIII을 합성하는 세포이기 때문에[카우프만 (Kaufman)의 문헌[Ann.Rev.Med., 43:325 (1992)]을 참조한다], 특히 바람직한 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 조성물을 간에 투여해야할 것으로 생각된다.

바람직한 실시태양에서, 인자 VIII의 코딩 서열과, 선택된 조직 유형에 의해 특이적으로 전사된 유전자로부터 유도된 이종 조절 서열을 커플링하여 발현시킨다. 선택된 조직 유형에서 발현을 지시할 수 있는 많은 조직-특이적 프로모터가 상기에 기재되어 있다. 그러나, 상기 AAV 벡터에 사용할 수 있는 조절 서열은 통상적으로 선택된 핵산 서열과 결합되는 조절 서열을 포함할 수도 있다.

B. AAV 인자 VIII 벡터의 작제

AAV ITR에 의해 연결된 조절 서열 및 목적 뉴클레오티드 서열 (즉, 인자 VIII을 코딩하는 서열의 적어도 일부)을 포함하는 AAV 벡터 (즉, AAV 벡터)는, 선택된 서열을 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")이 절단된 AAV 게놈내에 직접 삽입하여 작제할 수 있다. 충분한 ITR 부분이 존재하여 복제 및 패키징 기능을 할 수 있다면 AAV 게놈의 다른 부분은 결실될 수도 있다. 이러한 작제물은 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 설계할 수 있다[예를 들어, 미국 특허 제5,173,414호 및 동 제5,139,941호 (이들 문헌은 거명을 통해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨), 국제 특허 출원 공개 공보 제WO 92/01070호 및 동 제WO 93/03769호, 레브코브스키 (Lebkowski) 등의 문헌[Mol.Cell.Biol., 8:3988-3996 (1998)], 빈센트 (Vincent) 등의 문헌[Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1990)], 카터 (Carter)의 문헌[Curr.Opin.Biotechnol., 3:533-539 (1992)], 무지크즈카 (Muzyczka)의 문헌[Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:97-129 (1992)], 코틴 (Kotin)의 문헌[Hum.Gene Ther., 5:793-801 (1994)], 쉘링 (Shelling) 및 스미스 (Smith)의 문헌[Gene Ther., 1:165-169 (1994)] 및 조우 (Zhou) 등의문헌[J.Exp.Med., 179:1867-1875 (1994)]을 참조한다].

또는, 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌[상기 문헌]에 기재된 것과 같은 표준 라이게이션 기술을 사용하여 AAV ITR을 바이러스 게놈으로부터 절단하거나 또는 다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 작제물의 동일한 융합된 5' 및 3'을 포함하는 AAV 벡터로부터 절단할 수 있다. 예를 들어, 20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 ㎍/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 40 μM ATP, 0 ℃에서 0.01 내지 0.02 (Weiss) 단위의 T4 DNA 리가제 ("접착성 말단" 라이게이션의 경우) 또는 1 mM ATP, 14 ℃에서 0.3 내지 0.6 (Weiss) 단위의 T4 DNA 리가제 ("평활 말단" 라이게이션의 경우)의 조건에서 라이게이션을 수행할 수 있다. 분자내 "접착성 말단" 라이게이션은 일반적으로 30 내지 100 ㎍/ml의 총 DNA 농도 (5 내지 100 nM의 최종 총 농도)에서 수행된다. ITR을 포함하는 AAV 벡터는 예를 들어 거명을 통해 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 제 5,139,941호에 기재되어 있다. 특히, 이 문헌에는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ("ATCC")에 기탁 번호 제53222호, 제53223호, 제53224호, 제53225호 및 제53226호로 기탁된 몇몇 AAV 벡터가 기재되어 있다.

또한, 선택된 핵산 서열의 5' 및 3'에 배열된 AAV ITR 서열을 포함하는 키메라 유전자를 합성적으로 생산할 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있다[예를 들어, 에지 (Edge)의 문헌[Nature 292:756 (1981)], 남베어 (Nambair) 등의 문헌[Science 223:1299(1984)], 및 제이 (Jay) 등의 문헌[J.Biol.Chem., 259:6311 (1984)]을 참조한다].

또한, 본 발명은 임의 특정 인자 VIII 서열로 한정되지 않는다. 다양한 여러 조절 요소 및 조절 서열을 사용하여, 시험관내 및 생체내 모두에서 인자 VIII의 많은 천연 형태 및 재조합 형태를 단리 및 분석하였다. 따라서, 본 발명에서 설명된 AAV 벡터 및 방법을 사용하여, 생물학적으로 활성인 인자 VIII을 코딩하는 임의 공지되거나 또는 나중에 발견된 DNA 서열을 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 벡터와 함께 발현시킬 수 있다. 인자 VIII의 천연 형태 및 재조합 형태의 예는 미국 특허 제5,563,045호, 동 제5,451,521호, 동 제5,422,260호, 동 제5,004,803호, 동 제4,757,006호, 동 제5,661,008호, 동 제5,789,203호, 동 제5,681,746호, 동 제5,595,886호, 동 제5,045,455호, 동 제5,668,108호, 동 제5,633,150호, 동 제5,693,499호, 동 제5,587,310호, 동 제5,171,844호, 동 제5,149,637호, 동 제5,112,950호, 동 제4,886,876호, 국제 특허 공개 공보 제WO 94/11503호, 동 제WO 87/07144호, 동 제WO 92/16557호, 동 제WO 91/09122호, 동 제WO 97/03195, 동 제WO 96/21035호, 동 제WO 91/07490호, 유럽 특허 제0 672 138호, 동 제0 270 618호, 동 제0 182 448호, 동 제0 162 067호, 동 제0 786 474호, 동 제0 533 862호, 동 제0 506 757호, 동 제0 874 057호, 동 제0 795 021호, 동 제0 670 332호, 동 제0 500 734호, 동 제0 232 112호, 동 제0 160 457호, 샌버그 (Sanberg) 등의 문헌[XXth Int. Congress of the World Fed. Of Hemophilia (1992)] 및 린드 (Lind) 등의 문헌[Eur.J.Biochem., 232:19 (1995)]를 비롯한 특허문헌 및 과학 문헌에서 찾을 수 있다.

상기 기재된 인자 VIII을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 인자 VIII을 발현시키는 세포로부터의 cDNA 및 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 동일한 것을 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 상기 서열을 유도함으로써 수득할 수 있다. 또한, 페놀 추출법 및 cDNA 또는 게놈 DNA의 PCR과 같은 표준 기술을 이용하여 원하는 서열을 포함하는 세포 및 조직으로부터 이들을 직접 단리할 수 있다[예를 들어, DNA를 수득 및 단리하는데 사용되는 기술에 대한 설명은 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌[상기 문헌]을 참조한다]. 또한, 목적 항원 (즉, 인자 VIII 서열)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 클로닝보다는 합성법에 의해 생산할 수 있다. 또한, 완전한 서열은 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립하여 완전한 코딩 서열로 조립할 수 있다[예를 들어, 에지 (Edge)의 문헌[Nature 292:756 (1981)], 남베어 (Nambair) 등의 문헌[Science 223:1299 (1984)], 및 제이 (Jay) 등의 문헌[J.Biol.Chem., 259:6311 (1984)]을 참조한다].

본 발명은 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 생산을 평가하는 임의 특정 방법에 한정되지 않지만, 면역분석법 (예를 들어, ELISA) 및 생물학적 활성 분석법 (예를 들어, 응집활성분석법)을 생각할 수 있다.

또한, 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에는 인간 인자 VIII이 포함되지만, 본 발명은 인간 인자 VIII로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에는 수행 동물 (예를 들어, 개과 동물, 고양이과 동물 및 말과 동물), 가축 (예를 들어, 소과 동물, 염소과 동물 및 양과 동물), 실험 동물 (예를 들어, 쥐와 같은 설치류 및 라가모르프), 및 외래 동물 (예를 들어, 해양 포유동물 및 큰 고양이 등)을 비롯한 인간 이외의 동물로부터의 인자 VIII이 포함되지만 이들로 한정되지 않는다.

II. 비리온 생산

본 발명의 AAV 인자 VIII 벡터 및 rAAV 인자 VIII 비리온을 생산하는 것은 일반적으로 (1) 인자 VIII 유전자를 포함하는 AAV 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계, (2) AAV 헬퍼 작제물을 숙주 세포에 도입시키는 단계 (여기서, 헬퍼 작제물은 숙주 세포에서 발현되어 AAV 벡터에는 없는 AAV 헬퍼 기능을 보완할 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함함), (3) 1종 이상의 헬퍼 바이러스 및(또는) 보조 기능의 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계 (여기서, 헬퍼 바이러스 및(또는) 보조 기능의 벡터는 숙주 세포에서 효과적인 재조합 AAV("rAAV") 비리온 생산을 뒷받침할 수 있는 보조 기능을 제공함) 및 (4) 숙주 세포를 배양하여 rAAV 비리온을 생산하는 단계를 포함한다.

당업자에게 공지된 표준 방법 (예를 들어, 형질감염법)을 이용하여 상기 기재된 벡터 및 작제물을 세포에 도입할 수 있다. 많은 형질감염 기술은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, 그라함 (Graham) 등의 문헌[Virol., 52:456 (1973)], 샘브룩 (Sambrook) 등의 문헌[상기 문헌], 데이비스 (Davis) 등의 문헌[상기 문헌] 및 슈 (Chu) 등의 문헌[Gene 13:197 (1981)]을 참조한다]. 특히 적합한 형질감염 방법에는 칼슘 포스페이트 공동침전법[그라함 (Graham) 등의 문헌[Virol., 52:456-467 (1973)]], 배양된 세포내로의 직접 미세-주입법[카페치 (Capecchi)의 문헌[Cell 22:479-488 (1980)]], 전기천공법[시게까와 (Shigekawa)등의 문헌[BioTechn., 6:742-751 (1988)]], 리포좀-매개 유전자 전달법[만니노 (Mannino) 등의 문헌[BioTechn., 6:682-690 (1988)]], 지질-매개 형질도입법[펠그너 (Felgner) 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417 (1987)]], 및 고속 미세투입기 (microprojectile)를 사용한 핵산 전달법[클라인 (Klein) 등의 문헌[Nature 327:70-73 (1987)]]이 포함된다.

본 발명의 목적을 위해, rAAV 비리온을 생산하는데 적합한 숙주 세포에는 이종 DNA 분자의 수용체로 사용될 수 있는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포가 포함된다. 이 용어에는 형질감염된 최조 세포의 후대가 포함된다. 따라서, 상기 기재한 바로는, 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"는 일반적으로 외생 DNA 서열로 형질감염됨 세포를 의미한다. 본 발명의 실시에 있어서는 안정한 인간 세포주인 293 (ATCC 기탁번호 제CRL 1573호)으로부터의 세포가 바람직하다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 타입-5 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이며[그라함 (Graham) 등의 문헌[J.Gen.Virol., 36:59 (1997)]], 아데노바이러스의 E1a 및 Elb 유전자를 발현시킨다[아이엘로 (Aiello) 등의 문헌[Virol., 94:460 (1979)]]. 293 세포주는 쉽게 형질감염되며, rAAV 비리온을 생산하기에 특히 편리한 토대를 제공한다.

상기 설명한 AAV 벡터를 포함하는 숙주 세포는, AAV ITR가 양측에 있는 뉴클레오티드 서열을 복제하고 캡시드화하여 rAAV 비리온을 생산하기 위해 AAV 헬퍼 기능을 제공할 수 있게끔 만들어야 한다. AAV 헬퍼 기능은 일반적으로 발현되어 AAV 유전자 산물을 제공할 수 있는, 다시 말하면 풍부한 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능할 수 있는 AAV-유도된 코딩 서열이다. 본 발명에서는, AAV 헬퍼 기능을 사용하여 AAV 벡터로부터 상실된 필수적인 AAV 기능을 보완한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능에는 주요 AAV ORF, 즉rep및cap코딩 영역, 또는 이들의 기능적 상동체의 하나 또는 모두가 포함된다.

AAV 벡터를 사용한 형질감염 이전에 또는 그와 동시에 숙주 세포를 AAV 헬퍼 작제물로 형질감염시킴으로써 AAV 헬퍼 기능을 숙주 세포에 도입한다. 이와 같이 AAV 헬퍼 작제물을 사용하여 적어도 일시적으로 AAVrep및(또는)cap유전자를 발현시킴으로써 풍부한 AAV 감염에 필수적인 AAV 기능의 상실을 보완한다. AAV 헬퍼 작제물은 AAV ITR이 결여되어 있어서 복제할 수 없을뿐더러 자체 패키징할 수도 없다.

바람직한 실시태양에서, 이들 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 바이러스 또는 비리온을 비롯한 벡터의 형태로 존재하나 이에 한정되지 않는다. Rep 및 Cap 발현 산물을 둘다 코딩하는 통상적으로 사용되는 플라스미드인 pAAV/Ad 및 pIM29+45와 같은 많은 AAV 작제물이 기재되어 있다[예를 들어, 사물스키 (Samulski) 등의 문헌[J.Virol., 63:3822-3828 (1989)] 및 맥카르티 (McCarty) 등의 문헌[J.Virol., 65:2936-2945 (1991)]]. Rep 및(또는) Cap 발현 산물을 코딩하는 많은 다른 벡터가 기재되어 있다[예를 들어, 거명을 통해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,139,941호 참조].

AAV 벡터 및 AAV 헬퍼 작제물은 하나 이상의 임의 선택적 마커를 포함게끔 작제될 수 있다. 적합한 마커에는 세포를 적절한 선택 배지에서 배양하는 경우 선택적 마커를 포함하는 핵산 작제물로 형질감염된 세포에 항생제 내성 또는 감응성을 부여하거나, 색깔을 나타내게 하거나 또는 세포의 항원성을 변화시키는 유전자가 포함된다. 본 발명의 실시에 있어 유용한 몇몇 선택적 마커 유전자에는 G418 (시그마 (Sigma)사)에 내성을 부여함으로써 포유동물 세포에서 선별을 가능케 하는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 유전자가 포함된다. 다른 적합한 마커는 당업자에게 공지되어 있다.

또한, rAAV 비리온을 생산하기 위해서는 숙주 세포 (또는 패키징 세포)가 비-AAV 유도된 기능 또는 "보조 기능"을 제공할 수 있도록 만들어져야 한다. 보조 기능은 AAV의 복제가 좌우되는 비-AAV 유도된 바이러스 및(또는) 세포의 기능이다. 따라서, 보조 기능에는 적어도 AAV 유전자 전사, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제,rep및cap발현 산물의 합성 및 AAV 캡시드 조립의 활성화에 관여하는 것을 비롯하여 AAV 복제에 필요한 비-AAV 단백질 및 RNA가 포함된다. 바이러스계 보조 기능은 공지된 헬퍼 바이러스 중 임의 것으로부터 유도될 수 있다.

특히, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 보조 기능을 숙주 세포에 도입하여 발현시킬 수 있다. 통상적으로, 보조 기능은 관련되지 않은 헬퍼 바이러스로 숙주 세포를 감염시켜 제공된다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 예를 들어 단순포진 바이러스 유형 1 및 2, 및 백시니아 바이러스를 비롯한 많은 적합한 헬퍼 바이러스가 알려져 있다. 또한, 본 발명에서는 여러 공지된 물질 중 임의 것을 사용한 세포 동조화[예를 들어, 불러 (Buller) 등의 문헌[J.Virol., 40:241-247 (1981)], 맥페르손 (McPherson) 등의 문헌[Virol., 147:217-222 (1985)] 및 슐레호퍼 (Schlehofer) 등의 문헌[Virol., 152:110-117 (1986)]]에 의해 제공되는 것과 같은 비바이러스성 보조 기능이 사용될 것이다.

대안적으로, 보조 기능은 보조 기능 벡터를 사용하여 제공될 수 있다. 보조 기능 벡터는 1개 이상의 보조 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 보조 기능 벡터는 숙주 세포에서 효과적인 AAV 비리온 생성을 뒷받침하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 보조 기능 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 트랜스포손 또는 코스미드의 형태일 수 있다. 보조 벡터는 또한 1개 이상의 선형 DNA 또는 RNA 단편의 형태일 수 있으며, 이는 적절한 조절 서열 및 효소와 관련된 경우 숙주 세포에서 전사되거나 발현되어 보조 기능을 제공할 수 있다.

보조 기능을 제공하는 핵산 서열은 아데노바이러스의 게놈과 같은 천연원으로부터 얻어질 수 있거나, 당분야에 공지된 재조합 또는 합성 방법을 이용하여 제작될 수 있다. 이 점에 대해서는, 아데노바이러스-유도 보조 기능은 광범위하게 연구되어 왔으며, 보조 기능과 연관된 많은 아데노바이러스 유전자가 확인되고 부분적으로 특성화되었다 (예를 들어, 문헌[Carter, "Adeno-Associated Virus Helper Function," in CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I (P. Tijssen, ed.) (1990)], 및 [Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immun., 158: 97-129 (1992)] 참조). 구체적으로, 초기 아데노바이러스 유전자 영역 E1a, E2a, E4, VAI RNA, 및 가능하다면 E1b는 보조 과정에 참여하는 것으로 여겨진다 ([Janik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925-1929 (1981)]). 헤르페스바이러스-유도 보조 기능이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌[Young et al., Prog. Med. Virol., 25: 113 (1979)] 참조).백시니아 바이러스-유도 보조 기능이 또한 기재되어 있다 (예를 들어, 상기 Carter의 문헌 및 문헌[Schlehofer et al., Virol., 152: 110-117 (1986)] 참조).

헬퍼바이러스에 의한 숙주 세포의 감염, 또는 보조 기능 벡터에 의한 숙주 세포의 형질감염의 결과 때문에 보조 기능이 발현되어 AAV 헬퍼 작제물을 트랜스활성화시켜 AAV Rep 및(또는) Cap 단백질을 형성한다. Rep 발현 생성물은 AAV 벡터로부터 재조합 DNA (인자 VIII의 한 부분 이상을 코딩하는 목적 DNA를 포함함)의 절단을 지시한다. Rep 단백질은 또한 AAV 게놈을 복제하는 작용을 한다. 발현된 Cap 단백질은 캡시드로 조립되고, 재조합 AAV 게놈은 캡시드내로 패키징된다. 따라서, 증식성 AAV 복제가 잇따라 일어나고, DNA가 rAAV 비리온 내로 패키징된다.

하기 재조합 AAV 복제에서, rAAV 비리온은 숙주 세포로부터 CsCl 구배와 같은 다양한 종래의 정제 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 또한, 헬퍼 바이러스 감염이 보조 기능을 발현하는데 이용된다면, 나머지 헬퍼 바이러스는 공지된 방법을 이용하여 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 적절하다면 약 20분 이상 동안 약 60℃의 온도로 가열함으로써 비활성화될 수 있다. 이 처리는 열에 안정한 rAAV를 보존시키는 반면 열에 약한 헬퍼 아데노바이러스를 선택적으로 비활성화시킨다.

III. 제약 조성물

얻어진 rAAV 비리온은 그 후 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 생성을 위해 개체에 전달될 수 있는 제약 조성물에 사용되기 위해 준비된다. 제약 조성물은 출혈의 감소, 중지 및(또는) 예방을 위해 수용자가 치료적 유효량의 인자 VIII를 생성하도록 하는 충분한 유전 물질을 포함한다. 조성물은 단독으로, 또는 임의의 생물학적으로 상용성인 멸균 제약 담체 (식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물이 포함되나 이에 제한되지 않음)로 투여될 수 있는 안정화 화합물과 같은 1종 이상의 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 조성물은 환자에게 단독으로, 또는 다른 약제, 응고 인자 또는 인자 전구체, 약물 또는 호르몬과 함게 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 제약 조성물은 또한 제약적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제에는 그 자체는 조성물을 수용하는 개체에게 해로운 면역 반응을 유도하지 않는 임의의 제약 약제가 포함되며, 이는 지나친 독성없이 투여될 수 있다. 제약적으로 허용가능한 부형제에는 물, 식염수, 글리세롤, 당 및 에탄올과 같은 액체가 있으나 이에 제한되지 않는다. 제약적으로 허용가능한 염에는 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤젠산염 등과 같은 유기산염이 포함될 수 있다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조제가 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 제약적으로 허용가능한 부형제에 대한 전반적 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co., N.J. (1991)]에 나와있다.

비경구 투여에 적합한 제약 제형은 수용액, 바람직하게는 핸크 용액 (Hanks's solution), 링겔 용액과 같은 생리학적으로 상용성 완충액, 또는 생리학적으로 완충된 식염수로 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 참기름과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레에이트 또는 중성지방과 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜이 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제, 또는 고농도의 용액의 제조를 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 시약을 포함할 수 있다.

국소 또는 비강 투여를 위해, 투과하고자 하는 특정 장벽에 적절한 투과제 (penetrant)가 제형에 사용된다. 이러한 투과제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있다.

본 발명의 제약 조성물은 당분야에 공지된 방법으로 (예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당코팅, 분쇄 (levigating), 유화, 캡슐화, 트랩핑 (entrapping), 또는 동결건조법에 의해) 제조될 수 있다.

제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있으며, 많은 산과 형성될 수 있으며, 산에는 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 용매 또는 다른 양자성 용매에 더 잘 용해될 것이다. 다른 경우, 바람직한 제제는 사용되기 전에 완충액과 혼합되는, pH 4.5 내지 5.5에서 1-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 및 2-7% 만니톨 중 임의의 성분 또는 모든 성분을 포함할 수 있는 동결건조된 분말일 수 있다.

제약 조성물을 제조한 후, 이는 적절한 용기에 보관될 수 있으며 처리를 위해 표지될 수 있다. 벡터를 포함하는 인자 VIII의 투여를 위해 이러한 표지는 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법을 포함할 것이다.

본 발명에 사용하기에 적합한 제약 조성물에는 활성 성분이 의도하는 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유되는 조성물이 포함된다. 치료적 유효량을 결정하는 것은 ELISA 및 ChromZ FVIII 응고 활성 분석법과 같은 본 발명에서 교시된 기술을 이용하여, 그리고 당분야에 공지된 다른 기술을 이용하여 당업자가 할 수 있다. 치료적 투여량은 다른 인자, 즉 개체의 나이 및 전신상태, 혈우병의 중증도, 및 조절 서열의 강도에 따라 변할 것이다. 따라서, 인간에게 있어 치료적 유효량은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위내에 있을 것이다.

본 발명에서 사용되는 투여량 처치 및 섭생법은 개체 및 사용되는 제제에 따라 변할 것이다. 그러므로, 투여량 처치는 1회 투여 계획 또는 여러회 투여 계획일 수 있다. 또한, 개체는 원하는 혈액 응고 시간을 성취하거나 유지시키기에 적절한 많은 투여량을 투여받을 수 있다.

생체 내에서 제약 조성물의 직접 전달은, 종래보다 개선된 전달 방법과 같은 다른 전달 방법 (예를 들어, 본 명세서에서 참고 문헌으로 채택된 미국 특허 제5,720,720호 참조)이 있긴 하지만 일반적으로 종래의 주사기를 이용하여 주사를 통해 달성될 수 있다. 이 점에 대해서, 조성물은 피하, 표피, 피내, 수막강내, 안와내, 점막내 (예, 비강, 직장 및 질), 복강내, 정맥내, 동맥내, 경구 또는 근육내로 전달될 수 있다. 다른 투여 방법에는 경구 및 폐 투여, 좌약 및 경피 투여가 있다. 특히 바람직한 실시태양에서 조성물은 간문맥 또는 간동맥내 정맥내로 투여된다.

당업자들은 상기 기재된 방법 및 조성물이 또한 당분야에 공지된 다른 처치섭생법의 한 범위에 적용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 생체 외 치료요법 (예를 들어, 세포가 체내로부터 제거되고, AAV 벡터와 인큐베이션되고, 처리된 세포가 체내로 회수됨)과 필적할 만하다.

IV. 투여

AAV 벡터는 인자 VIII의 발현에 적합한 임의의 조직에 투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 AAV 벡터는, 이에 구애되지는 않지만, 벡터가 간세포를 형질도입한다고 생각되는 간문맥 또는 간 동맥을 통해 성공적으로 투여된다. 간으로 유전자를 표적화하는 최근 접근법은 생체 외 유전자 치료요법에 초점이 맞춰지고 있다. 생체 외 간-관련 유전자 치료요법은 간세포의 수술 제거, 간세포의 시험관 내 형질도입 (예, 재조합 레트로바이러스 벡터에 의한 체외이식된 세포의 감염)후, 환자의 간 또는 비장내로 유전적으로 변형된 간세포의 주사를 수반한다. 간의 생체 외 유전자 치료요법의 심각한 단점은 간세포가 배양물 내에서 유지되고 확장될 수 없다는 점이다. 그러므로, 생체 외 간-관련 유전자 치료요법의 성공은 유전적으로 변형된 (즉, 형질도입된) 간세포 및 그의 후대를 효과적이고 안정하게 그래프팅할 수 있는 능력에 달려있다. 최상의 조건하에서도 그래프팅되는 간 또는 비장으로 주사된 자가 변형된 간세포는 간의 총 세포 수 중 소량 (10% 미만)만을 나타낸다고 보고되었다. 간세포에서의 그래프팅의 문제점을 해결하기 위해 복강내로 형질도입된 1차 간세포의 이소성 그래프팅이 시도되었다.

생체 외 간-관련 유전자 치료요법과 관련된 문제점으로 인하여, 재조합 레트로바이러스, 재조합 아데노바이러스, 리포솜 및 분자 접합의 사용을 포함하여 간세포 내로의 유전자 전달을 위한 생체 내 접근법이 연구되어 왔다. 생체 내 접근법은 생체 외 간-관련 유전자 치료요법과 관련된 단점으로 어려움을 겪진 않지만 특이적으로 간세포를 표적화하는 방법을 제공하지 않는다. 또한, 여러 이들 접근법은 생체 내 전달된 유전자의 장기간 발현을 획득하기 위해 부분적 간절제술의 실행을 필요로 한다. 전달 방법에 기초한 아데노바이러스 및 분자 접합은 또한 인자 VIII 유전자 치료요법의 바람직하지 못한 특성인 간 독성 및 염증을 일으킨다. 본 발명은 생물학적으로 활성인 인자 VIII의 장기간 발현을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 생체 내에서 치료적 농도로 인자 VIII를 발현시키는 동안 부분적 간절제술을 필요로 하지 않을 것이라고 예상된다. 본 발명은 또한 처리된 개체에 의해 인자 VIII의 제조를 위해 간세포를 표적화하는 유전자 치료요법 조성물 및 방법을 제공한다.

그러나, 다른 조직은 정상적으로 인자 VIII를 합성하는 조직이 아니라 해도 인자 VIII의 발현에 적합할 수 있다. 예를 들어, 근육 세포는 정상적으로는 간에서 합성되는 것인 생물학적으로 활성인 혈액 응고 인자 IX를 발현하는 것으로 나타났다.

마지막으로, AAV 벡터는 생물학적으로 활성인 인자 VIII를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, AAV 벡터는 그 자체는 생물학적으로 활성이 아니지만 개체에 투여시 혈액 응고 시간을 개선시키거나 회복시키는 인자 VIII의 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 위에서 논의된 바와 같이 인자 VIII 단백질은 2종의 폴리펩티드 쇄, 즉 프로세싱 중에 잘라지는 B-도메인에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 본 발명에 의해 입증된 바와 같이, 인자 VIII 중쇄 및 경쇄로 동시 형질도입하는 수용자 세포는 생물학적으로 활성인 인자 VIII를 발현시키게 된다. 그러나, 대부분의 혈우병자는 쇄 중 오직 하나 (예, 중쇄 또는 경쇄)에서의 돌연변이 또는 결실을 함유하기 때문에, 환자에서 결핍된 쇄만을 투여하고 환자가 다른 쇄를 공급하도록 하는 것이 가능할 수 있다. 이 경우에 단일 쇄 (즉, 중쇄 또는 경쇄)는 생물학적으로 활성이 아닐 것이지만, 제2 쇄를 공급할 수 있는 개체에게 투여시 생물학적으로 활성인 인자 VIII를 형성하기 때문에 AAV 벡터는 본 발명의 범위 내에 있을 것이다.

V. 인자 VIII 분석

하기 실험 부분에 기재된 바와 같이, 인자 VIII 발현 및 활성을 분석하는 많은 방법이 있다. 본 발명은 면역분석 방법에 제한되지 않지만, 본 발명은 또한 a) 인자 VIII를 함유할 것으로 추정되는 샘플, 및 기지의 인자 VIII의 기지량을 함유하는 대조군을 제공하는 단계; 및 b) 기지의 대조군과 시험 샘플을 비교하여 샘플에 함유된 인자 VIII의 상대 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 인자 VIII 발현의 검출 방법을 제공한다. 그러므로, 상기 방법은 인자 VIII의 충분량 또는 불충분량을 함유하는 샘플 (예, 환자 샘플)을 확인할 수 있다. 또한, 상기 방법은 시험 및 대조군 샘플에 함유된 인자 VIII의 상대 농도를 결정하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 실행될 수 있으며, 웨스턴 블롯 분석법, 노던 블롯 분석법, 써던 블롯 분석법, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (예, SDS-PAGE), 역전사효소-커플링된 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 효소-연결 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광면역분석법 (IFA)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러므로, 상기 방법은 시험 샘플의 동물원의 게놈 중 정상 인자 VIII 서열의 존재, 또는 인자 VIII의 발현 (mRNA 또는 단백질)을 결정하는 것 뿐만 아니라, 시험 샘플 중 비정상 또는 돌연변이 인자 VIII 유전자 서열의 존재를 검출하기 위해 실행될 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 인자 VIII의 존재는 면역화학분석법에 의해 검출된다. 예를 들어, 면역화학분석법은 인자 VIII의 에피토프에 특이적인 항체의 결합을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서 상기 항체는 단일클론 항체를 포함하지만, 상기 방법의 다른 바람직한 실시태양에서 상기 항체는 다클론 항체를 포함한다.

또한, 인자 VIII의 적어도 일부분에 대하여 관련된 항체가 인자 VIII의 위치 및 구조에 대한 당분야에 공지된 방법 (예, 웨스턴 블롯팅), 적절한 생물학적 샘플에 함유된 그의 농도를 측정하는 등의 방법에 사용될 것이라고 예상된다. 항체는 개체 (예, 본 발명의 방법 및(또는) 조성물을 사용하여 처리된 개체)로부터의 생물학적 샘플 중에서 인자 VIII를 검출하는데 사용될 수 있다. 생물학적 샘플은 생물학적 액체일 수 있으며, 혈액, 혈청, 혈장, 간질액, 뇨, 척수액, 활액 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 특히, 항원은 세포원 (간세포가 있으나 이에 제한되지 않음)으로부터 검출될 수 있다. 예를 들어, 세포는 개체로부터 얻어서, 용해시킬 수 있다 [예를 들어, 동결-해동 반복, 또는 약한 세포융해 세정제 (TRITON X-100, 디기토닌, NONIDET P (NP)-40, 사포닌 등, 또는 그들의 혼합물이 있으나 이에 제한되지 않음; 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 92/08981호 참조)에 의한 처리에 의함].

그 후, 생물학적 샘플은 적절한 방법 (예, ELISA 또는 RIA) 및 포멧 (format) (예, 마이크로웰, 딥스틱 (dipstick) [예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 93/03367호에 기재됨] 등)을 이용하여 인자 VIII의 존재에 대해 직접 시험될 수 있다. 대안적으로, 샘플에 함유된 단백질은 크기에 따라 분리될 수 있다 (예, 도데실 황산나트륨 (SDS)의 존재 또는 부재, 및 이뮤노블롯팅 [예, 웨스턴 블롯팅]에 의해 검출되는 인자 VIII의 존재하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해). 이뮤노블롯팅 기술은 일반적으로 단백질의 에피토프에 상응하는 펩티드에 대하여 생성되는 항체에 더 효과적이며, 특히 본 발명에 적합하다. 다른 바람직한 실시태양에서, 인자 VIII의 농도는 당분야에 공지된 기술 [Herzog et al., Nature Medicine 5:56 (1999)]을 이용하여 개체의 혈액의 전혈 응고 시간 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)을 이용하여 분석된다.

특정 분석 시스템에 대한 상기 설명은 단지 예시하기 위해서 나타낸 것이며, 본 발명의 가능한 개시물을 나타낸 것이다. 본 발명이 본 발명의 개념 및 범위 내에서 다양한 면역화학 분석 프로토콜이 고려된다는 것을 이해해야 한다. 사실, 인자 VIII의 존재 및 활성을 검출하는 생물학적 분석법과 같은 다른 방법도 본 발명에 포함된다.

그러므로, 상기 기재된 면역분석 시스템 이외에 다른 분석 시스템, 예를 들어 인자 VIII 및(또는) 개체의 혈액 응고 능력의 측정 및(또는) 검출을 위해 고안된 방법이 또한 본 발명에 포함된다 (예를 들어, ChromZ FVIII 응고 활성 [FVIII-c] 분석법 [Helena Labs]).

실험

본 발명을 수행하는 구체적인 실시태양의 예가 하기에 기재되어 있다. 이 예는 단지 예시하기 위해 제공된 것이며, 어떠한 방법으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

사용된 숫자 (예, 양, 온도 등)에 대하여 명확하게 하기 위해 노력하였으나, 몇몇 실험적 오차 및 편차는 물론 있을 수 있다.

하기 실험에 대한 기재에서 하기 약어를 사용한다.

N (노르말 농도); M (몰 농도); mM (밀리몰 농도); μM (마이크로몰 농도); g (그램); ㎎ (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); ng (나노그램); l 또는 L (리터); ㎖ (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); ㎝ (센티미터); ㎜ (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); ㎚ (나노미터); mU (밀리유닛);⁵¹Cr (크롬 51); μCi (마이크로큐리에); EC (섭씨); hFVIII (인간 인자 VIII); FVIII (인자 VIII); pH (수소 이온 농도); JRH 등급 (grade); NaCl (염화나트륨); HCl (염산); OD (광학농도); bp (염기쌍(들)); ATP (아데노신 5'-트리포스페이트); PCR (중합효소 연쇄반응); DNA (데옥시리보핵산); cDNA (상보 DNA); AAV (아데노 관련 바이러스); rAAV (재조합 아데노 관련 바이러스); ITR (도립 종결 반복부); FCS 또는 FBS (소 태아 혈청); CFA (완전 프로인드(Freund) 보조제); BSA (소 혈청 알부민); ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 메릴랜드주의 락빌(Rockville)); 시그마 (Sigma Aldrich, 미주리주의 세인트 루이스); 바이오디자인 인터내셔널 (Biodesign International, 미시간주의 케네분크); 박스터 힐랜드 (Baxter Healthcare Corp., Biotech Group-Hyland Division, 캘리포니아주의 헤이워드); 헬레나 랩스 (Helena Laboratories, 텍사스주의 뷰몬트); 아메리칸 다이아그노스티카 (American Diagnostica, 코넥티커트주의 그린위치); 어큐레이트 케미칼 (Accurate Chemical and Scientific Corp., 뉴욕주의 웨스트베리); 몰레큘라 프로브즈 (Molecular Probes, 오레곤주의 유겐); 비시스 (Vysis, 일리노이주의 다우너 그로브); 텔-테스트 (Tel-Test, Inc., 텍사스주의 프렌즈우드); 몰레큘라 다이나믹스 (Molecular Dynamics, 캘리포니아주의 써니베일); NUNC (일리노이주의 나페르빌); 및 스트라타젠 (Stratagene Cloning Systems, 캘리포니아주의 라졸라); 및 바이오디자인 (Biodesign International, 메인주의 케네불크포트).

<실시예 1>

이중 벡터 플라스미드 작제물

인간 인자 VIII (hFVIII)의 경쇄 및 중쇄를 문헌[Yonemura et al., Prot. Engineer., 6:669-674 (1993)]에 의해 개시된 문헌에 따라 조립하고, 발현 카세트로서 AAV 벡터에 클로닝하였다. 두 벡터 모두 인간 연장 인자 1α(EF1α) 유전자의 프로모터 및 제1 비코딩 인트론 (-573 내지 +985) (문헌[Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791-5798(1989)]; 및 [Kim et al., Gene 9:217-223(1990)]을 참조한다)을 함유하였다. 또한, 각각의 벡터는 19 개의 아미노산 신호 서열을 코딩하는 FVIII 중쇄의 처음 57 염기쌍을 포함하였다. 중쇄 작제물은 A1 및 A2 도메인및 B 도메인의 N 말단으로부터 5 개의 아미노산을 코딩하였다. 경쇄 벡터는 A3, C1 및 C2 도메인과 함께 B 도메인 카르복시 말단의 85 개 아미노산을 코딩하였다. 두 벡터 모두 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호를 이용하였다. 발현 카세트를 AAV ITR 사이에 삽입하였다. 초기 클로닝 단계는 pVm4.1e-hFIX의SpeI 및XcmI 부위 사이의 EF1α서열의 854 bp를 결실시키고 (문헌[Nakai et al., Blood 91:1-9 (1998)]을 참조한다), 다시 라이게이션시켜 pVm4.1eδD-hFIX를 생성하는 것을 포함하였다.

이후, 이 작제물을EcoRI로 절단시켜, hFIX cDNA를 방출하고, pVm4.1eδD-링커를 생성하는,MfeI 말단 (EcoRI-호환가능) 및 내부ClaI 제한 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 라이게이션시켰다. hGH 폴리아데닐화 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 단편을ClaI-BstEII 단편으로서 각각 pVm4.1cFVIII-HC 및 pVm4.1cFVIII-LC로부터 단리하였다. 이 단편들을 플라스미드 pVm4.1eδD-FVIII-HC (또한, rAAV-hFVIII-HC) 및 pVm4.1eδD-FVIII-LC (또한, rAAV-hFVIII-LC)를 생성하는 pVm4.1eδD-링커에서 상응하는 부위들 사이에 클로닝시켰다.

도 7은 작제물의 맵을 제공한다. 이 도면에서, 각 패널의 윗쪽 선은 벡터의 유전자 구조를 나타내며, 아래쪽 선은 벡터에 의해 코딩되는 hFVIII 단백질 도메인의 구조를 나타낸다 (ITR, AAV 도립 종결 반복부, EFIαPro/인트론 1, 인간 폴리펩티드 연장 인자 1α유전자 프로모터 및 제1 인트론; hFVIII-HC 인간 FVIII cDNA; hFVIII-LC, 인간 FVIII cDNA, hGH PA, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호; SS, 인간 FVIII 신호 서열; hFVIII 단백질의 A1, A2, "B", A3, C1, C2, 완전 및 불완전(") 단백질 도메인).

<실시예 2>

단일 벡터 플라스미드 작제물

인자 VIII의 경쇄 및 중쇄 모두를 포함하는 플라스미드 pAAV-F8-1 작제물을 하기와 같이 구성하였다. 클로닝 부위, EF1α 및 면역글로불린 G (IgG) 인트론 서열 기재 합성 인트론의 5'-스플라이싱 공여 부위, 코작 (Kosak) 서열 및 서열을 코딩하는 인간 응고 인자 VIII (FVIII)의 처음 16개의 뉴클레오티드를 포함하는 PCR 단편인 Z8을 올리고뉴클레오티드 Z8S 및 Z8A를 사용하여 생성하였다. 핵산의 서열을 하기와 같이 나타냈다:

올리고뉴클레오티드 Z8S:

5'cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcc3'(서열 1)

올리고뉴클레오티드 Z8A:

5'ccgctcgagcagagctctatttgcatggtggaatcgatgccgcgggaaccacacacggc3'(서열 2)

PCR 단편 Z8:

5'cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcggcatcgattccaccatgcaaatagagctctgctcgagcgg3'(서열 3)

핵산 Z8을HindIII 및XhoI 부위 사이의 pZERO-2 (인비트로겐)에 삽입하여 pZ8을 생성하였다. 분기점, 폴리피리미딘 트랙트, 및 합성 인트론의 3' 스플라이싱 수용 부위를 포함하는 PCR 단편인 INT3를 하기에 나타낸 서열인 올리고뉴클레오티드 INT3S 및 INT3A를 사용하여 생성하였다.

올리고뉴클레오티드 INT3S:

5'ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactga3'(서열 4)

올리고뉴클레오티드 INT3A:

5'gaatcgatacctgtggagaaaaagaaaaagtggatgtcagtgtcagtaattcaaggc3'(서열 5)

PCR 단편 INT3:

5'ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactgacactgacatccactttttctttttctccacaggtatcgattc3'(서열 6)

INT3을 pZ8의SacII 및ClaI 부위 사이에 삽입하여 pZ8.I를 생성하였다. 그러므로, Z8.I는AvrII 및ClaI 부위 사이의 전체 합성 인트론을 함유하였다.SacI 및XhoI 제한 부위를 가지는 hFVIII cDNA 단편을 pZ8.I의SacI 및XhoI 부위 사이에 삽입하여 pZ8.I.dB를 생성하였다. 그러므로, pZ8.I.dB는 합성 인트론 및 hFVIII의 전체 코딩 서열을 포함하였다.

3 개의 HNF-3 결합 부위 및 마우스 알부민 유전자의 -54 내지 +8을 포함하는 PCR 단편인 EG3를 링커 서열이 제거되게 변형된 올리고뉴클레오티드 EG3S 및 EG3A를 사용하여 생성하였다. EG3S 및 EG3A의 서열은 하기와 같았다:

올리고뉴클레오티드 EG3S:

5'agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaa3'(서열 7)

올리고뉴클레오티드 EG3A;

5'ggaaaggtgatctgtgtgcagaaagactcgctctaatatacttctttaaccaataactg3'(서열 8)

PCR 단편 EG3:

5'agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaagaagtatattagagcgagtctttctgcacacagatcacctttcc3'(서열 9)

이후, EG3을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 포스포릴화시키고, pZ8.I.dB의SmaI 부위에 삽입하여 pZ8.I.dB.egg를 생성하였다. 래빗 β-글로빈 서열 기재의 효과적 합성 폴리 A 신호를 포함하는 DNA 단편인 SPA (Genes and Develop., 3:1019)를 2개의 올리고뉴클레오티드 SPA.S 및 SPA.A를 혼성화하여 생성하였다.

올리고뉴클레오티드 SPA.S:

5'tcgagaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggccgc3'(서열 10)

올리고뉴클레오티드 SPA.A:

5'tcgagcggccgcacacaaaaaaccaacacacagatctctagagctctgatcttttattc3'(서열 11)

PCR 단편 SPA:

5'tcgagaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggccgctcga3'(서열 12)

SPA를 pZero-2의XhoI 부위에 삽입하여 pZero-2.SPA를 생성하였다. SPA를 pZero-2.SPA 클론으로부터 잘라내고, pZ8.I.dB.egg의XhoI 부위에 삽입하여pZ8.I.dB.egg.A를 생성하였다. pAAV-CMV-FIX9를ClaI를 이용하여 잘라내고, T4 중합효소를 이용하여 평활-말단으로 만들고, 다시 라이게이션시켜 pAAV(Cla^-)-CMV-FIX9를 생성하였다.

HNF-3.알부민 프로모터-합성 인트론-hFVIII-합성 폴리 A 신호를 포함하는 전체 발현 카세트를NotI를 사용하여 pZ8.I.dB..egg.A로부터 잘라내고, pAAV (Cla-)-CMV-FIX9로부터 플라스미드 골격 및 AAV ITR에 라이게이션시켜 pAAV-F8-1을 생성하였다. ITR에서 ITR로의 벡터의 뉴클레오티드 서열 (즉, 플라스미드 골격 제외)을 서열 13으로 나타냈다.

<실시예 3>

비리온 제조

AAV 벡터를 본원에서 전문을 참고 문헌으로 인용한 미국 특허 제5,858,351호, 동 제5,846,528호, 동 제5,622,856호 및 문헌[Matsushita et al., Gene Ther 5:938 (1998)]에서 앞서 개시된 바와 같이 Ad 유리 시스템을 사용하여 이 플라스미드로부터 제조하였다. 요약해서, 293 세포 (ATCC, 카탈로그 번호 CRL-1573)를 10 mL 배지 중에서 접시 당 3×10⁶세포의 밀도로 10 cm 접시 중에 시딩하고, CO₂및 습기가 있는 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 세포가 약 70 내지 80% 전면생장되었다.

이후, 세포를 당업계에 공지된 바와 같이 인산칼슘 방법에 의해서 DNA로 형질감염시켰다. 요약해서, 7 ㎍의 인자 VIII 코딩 영역을 포함하는 AAV 벡터, 7 ㎍의 보조 기능을 제공하는 플라데노5, 및 7 ㎍의 1909 AAV 헬퍼를 멸균 피펫 끝을 사용하여 3 mL의 멸균 폴리스티렌 스냅 캡 튜브에 첨가하였다. 이후, 10 mL의 300 mM CaCl₂(JRH 등급)를 각각의 튜브에 첨가하여 위아래로 피페팅하여 혼합하였다. 2X HBS (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 42 mM HEPES, 1.4 mM Na₂PO₄, 12 mM 덱스트로스, pH 7.05, JPH 등급)의 등 부피를 2 mL 피펫을 이용하여 첨가하고, 용액을 위아래로 3 회 피펫팅하였다. DNA 혼합물을 10 cm 접시 전체에 한 번에 한 방울씩 즉시 세포에 첨가하였다. 이후, 세포를 CO₂와 습기가 있는 37 ℃에서 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 과립형 침전물이 형질감염된 세포 배양물 중에 보였다. 6 시간 후, DNA 혼합물을 세포로부터 제거하고, 이를 새로운 배지에 제공하여 72 시간 동안 인큐베이션하였다.

72 시간 후, 세포를 수확하고, 펠렛화시키고, 1 mL의 TBS/1% BSA 중에 재현탁시켰다. 냉동/해동 추출물을, 드라이 아이스 상에서 세포 현탁물을 냉동시키고 37℃로 해동시키는 것을 3회 반복하여 제조하였다. 분리된 바이러스를 -80℃에서 저장하고, 감염의 제1 단계 전에 도트 블롯 분석으로 적정하였다.

<실시예 4>

시험관 내 세포 형질도입

안정한 인간 세포주의 세포, 293 (ATCC No. CRL1573)을 6-웰 플레이트 (즉, 세포 성장 동안 6 개의 웰을 가지는 플레이트) 중에서 5×10⁵세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 단층이 80-90% 전면생장되었을 때, 이들을 rAAV 비리온 AAV-eδD-FVIII-HC, AAV-eδD-FVIII-LC, AAV-eδD-FVIII-HC과 AAV-eδD-FVIII-LC의 동 비율, 또는 3×10³및 3×10⁴의 MOI에서 AAV-eδD-FIX로 감염시켰다. 감염 18 시간 후, 배지를 DMEM/10% 열 비활성 FBS로 대체하였다. 배지를, FVIII 경쇄 항원 농도에 대하여 ELISA (하기에 기술됨)으로, 생물학적 활성에 대하여 응고 활성 (FVIII-c) 분석 (헬레나 연구실 (Helena Labs)으로서 ChromZ FVIII으로 당업자의 지시 및 실시예 6에서 기술된 바를 이용하여 수집하였다.

<실시예 5>

단쇄 인자 VIII 감염도 분석

이 실시예에 있어서, 단쇄 인자 VIII의 감염도를 조사하였다. rAAV-hF8-1의 감염도를 측정하기 위하여 HepG2, 293 및 H2.35 세포를 rAAV-hF8-1 및 대조 벡터 rAAV-hF8L로 세포 당 1×10⁴바이러스 입자의 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포 중의 재조합 AAV DNA를 허트 (Hirt) 추출로 단리시키고, 알칼리성 아가로스 겔에서 수행하였다. 인간 F8 프로브를 사용하는 써던 블롯 분석은 rAAV-hF8-1 및 rAAV-hF8L의 유사량이 감염된 세포 중의 코팅되지 않은 바이러스로부터 단리되었음을 나타냈다. 당업계에 공지된 감염 센터 분석 (ICA) (문헌[Snyder, Current Protocols in Genetics, Chapter 12, John Wiley & Sons (1997)]을 참조한다)을 rAAV-hF8-1의 감염도를 추가로 특징화시키는 데 사용하였다. 이 분석에 있어서, 전체 입자에 대한 rAAV-F8-1의 감염 입자 비율 및 4645 뉴클레오티드의 게놈 크기인 대조 rAAV 벡터의 비율을 측정하였다. 결과는 rAAV-hF8-1이 대조 벡터와 필적할 만한 약 1:1000의 총 입자에 대한 감염 입자 비율을 가졌음을 나타냈다. 함께 취하는 경우, 이 결과는 rAAV-hF8-1이 야생형 AAV의 게놈 크기인 rAAV 벡터로서 유사한 감염도를 가짐을 나타냈다.

<실시예 6>

인자 VIII 단백질 발현 분석

FVIII의 경쇄에 특이적인 ELISA를 이용해서 293 세포에 있어서뿐 아니라 감염된 동물 (하기 기술됨)에 있어서 FVIII 경쇄 항원 농도를 결정하였다. NUNC Maxisorb 96 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅 완충액 중의 50 ㎕의 경쇄 특이적 항체, N77110 (Biodesign Internatonal)의 1:500 희석액으로 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS, 0.05% 트윈 20)으로 3 회 세척하고, 200 ㎕의 블로킹 완충액 (PBS, 10% 말 혈청, 0.005% 트윈 20)으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 3 회 세척하고, 스탠다드 및 샘플을 도포하였다. 바이오클레이트 (bioclate) 재조합 인간 FVIII (박스터 힐랜드 (Baxter Hyland))를 스탠다드로 사용하고, 블로킹 완충액 중에서 320 ng/mL 내지 10 ng/mL 범위의 농도로 희석하였다.

형질도입된 배양물 상청액의 분석용으로, 스탠다드는 50% 배지를 함유하고, 마우스 혈장의 분석용으로, 스탠다드는 정상적인 마우스 혈장 푸울 (시그마 (Sigma)) 중에 10%로 희석하였다. 스탠다드 분석 참고용 혈장 (SAPP, 헬레나 연구실)가 또한 분석에 포함되었다. 스탠다드와 샘플 (95 ㎕/웰)의 적재에 이어서, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액 (200 ㎕/웰)으로 5회 세척하였다. 호스라디히 (horseradich) 퍼옥시다제-접합 경쇄 특이적 항체인 ESH8-HRP의 1:200 희석액 (아메리칸 디아노스티카 (American Diagnostica))을 첨가하고 (100 ㎕/웰), 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 세척 완충액으로 4 회 세척하고, 항원을 제조자의 지시에 따라서 ABTS 퍼옥시다제 기질 키트 (BioRad)를 사용하여 검출하였다. 결과를 하기의 실시예 7의 표 1에 나타냈다.

<실시예 7>

인자 VIII 생물학적 활성 분석

ChromZ FVIII 응고 활성 (FVIII-c) 분석 (헬레나 연구실, 미국 텍사스주 버몬트)을 실시예 4에서 기술된 바와 같이 감염된 293 세포 중의 생물학적으로 활성인 FVIII를 검출하는 데 사용하였다. 바이오클레이트 재조합 인간 FVIII (박스터 힐랜드)를 스탠다드로 사용하여 형질감염된 배양물 상청액을 분석하였다. 스탠다드를 10 ng/mL 내지 0.313 ng/mL의 범위에서 혈장 희석 완충액 (키트 중에 공급됨) 중에 희석하고, 배지 중에서 2.5%로 만들었다. 이 분석은 인간 및 뮤린 FVIII 활성을 모두 검출할 수 있기 때문에, 이를 마우스 혈장 중의 생물학적으로 활성인 인간 인자 VIII를 없애도록 변형했다. 마우스 혈장을 인간 FVIII에 대한 항체 특이적을 가지도록 예비 인큐베이션한 후 분석을 수행하였다. 비처리된 혈장 샘플과 항체 처리된 샘플 사이의 FVIII 활성의 차이는 혈장 중의 생물학적으로 활성인 인간 FVIII의 양을 나타냈다. 이 분석에서 사용된 스탠다드는 정상적인 인간 혈장 푸울 (FACT; 조지 킹 바이오메디칼사 (George King Biomedical)로부터 입수함)였다. FACT의 일련의 희석액을 비희석액 (200 ng/mL)에서 6.25 ng/mL로 FVIII 결핍 혈장 중에서 만들었다. 스탠다드 (10 ㎕)을 37 ℃에서 15 분 동안, 2 ㎕ 항체 N77110의 첨가 또는 첨가없이 인큐베이션하였다. 유사하게, 마우스 혈장 샘플을 FVIII 결핍 혈장 중에 희석시키고, 10 ㎕의 이 희석된 샘플을 37 ℃에서 15 분 동안, 2 ㎕ 항체 N77110의 첨가 또는 첨가없이 인큐베이션하자마자 얼음에 두었다. 이후, 항체를 첨가하여 100% 혈장 중에서 인큐베이션하였다. 항체 흡수 및 비흡수 FACT 스탠다드 뿐 아니라, 마우스 혈장 샘플을 ChromZ 키트 중에 제공되는 혈장 검출 완충액 중에서 1:20으로 희석시켰다. 이후, 이 분석에 사용된 FACT 스탠다드의 최종 농도는 10 ng/mL 내지 0.313 ng/mL의 범위였다.

이 희석액의 25 ㎕를 냉각된 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 얼음 위에 둔 채, 25 ㎕의 FIXa 시약 및 50 ㎕의 FX를 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 기질 (50 ㎕)을 첨가하고, 플레이트를 추가로 3 분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 25 ㎕의 50% 아세트산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 405 nm에서 광학 농도를 측정하였다.

하기의 표 1에서 나타낸 바와 같이, AAV-eδD-FVIII-HC로 293 세포를 감염시키면 항원 생성물뿐 아니라 생물학적으로 활성인 단백질이 생성되지 않았다. AAV-eδD-FVIII-LC로 감염된 세포는 FVIII 경쇄를 생성하였으나 생물학적으로 활성인 단백질은 생성하지 않았다. 그러나, 두 벡터로 형질도입된 세포는 투여량 의존적으로 FVIII 경쇄 및 생물학적으로 활성인 FVIII를 생성하였다. 음성 대조 벡터인 AAV-eδD-FIX로 세포를 형질도입시키면, 항원 뿐 아니라 임의의 생물학적 활성인FVIII도 생성되지 않았다. 이는 등량의 중쇄 및 경쇄가 형질도입된 세포에 생성되었음을 의미하였다. 활성 단위는 1 단위가 정상적인 인간 혈장 푸울 1 mL 중의 FVIII의 양 또는 200 ng과 동일하다는 정의를 사용하여 나노그램으로 환산하였다.

두개의 rAAV 벡터로부터 생물학적으로 활성인 인간 인자 VIII의 시험관 내 생성
벡터	MOI	ELISA(ng/ml)	ChromZ
			(mU/ml)	(ng/ml)
AAV-eδD-FVIII-HC 및 AAV-eδD-FVIII-LC	3 x 103	24	35	7.1
AAV-eδD-FVIII-HC 및 AAV-eδD-FVIII-LC	3 x 104	121	440	87.9
AAV-eδD-FVIII-HC	3 x 103	0	0	0
AAV-eδD-FVIII-HC	3 x 104	0	0	0
AAV-eδD-FVIII-LC	3 x 103	20.5	0	0
AAV-eδD-FVIII-LC	3 x 104	96.9	0	0
AAV-hFIX	3 x 103	0	0	0
AAV-hFIX	3 x 104	0	0	0
벡터 없음		0	0	0

<실시예 8>

FVIII 중쇄 및 경쇄의 면역형광 염색법

이 실험에서, 상기 기재된 바와 같이 형질도입한 293 세포를 면역형광 염색법을 이용하여 분석하였다. 293 세포를 래트 꼬리 콜라겐 코팅된 2-웰 배양물 슬라이드에 웰당 4 x 10⁵셀의 밀도로 플레이팅하였다. 48 시간 후, rAAV-hFVIII-HC 및 rAAV-hFVIII-LC 세포당 3 x 10⁴입자의 MOI에서 세포를 형질도입하였다. 형질도입 48 시간 후, 세포를 동일계에서 아세톤으로 고정하고, 2 % BSA로 블로킹하고,형광표지된 항-hFVIII 경쇄 항체 및 형광표지된 항-hFVIII 중쇄 항체로 염색하였다. 이용한 항-hFVIII 경쇄 항체는 제조사의 지시에 따라 알렉사-488 (몰레큘라 프로브즈 (Molecular Probes))로 형광표지된 ESH-4 단일클론 항체 (아메리칸 다이그노스티카 (American Diagnostica))이었다. 이용한 항-hFVIII 중쇄 항체는 제조사의 지시에 따라 알렉사-594 (몰레큘라 프로브즈)로 형광표지된 MAS530P 단일클론 항체 (어큐레이트 케미칼 (Accurate Chemical))이었다. 세포를 DAPI를 이용하여 반대-염색하였다. DAPI, FITC 및 로다민 신호를 위한 별도의 필터 및 CCD 카메라가 있는 제이스 아시오스콥 (Zeiss Axioskop) 형광 현미경을 이용하여 수거하였다. 큅스 (Quips) 이미징 소프트웨어 (비시스 (Vysis))를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.

상기 나타난 바와 같이, rAAV-eδD-FVIII-HC 또는 AAV-eδD-FVIII-LC 중 하나에 의한 세포 감염 후, 두 쇄 모두를 항체로 염색하여 인간 FVIII의 개별쇄를 생성시켰다. 두 벡터 모두로 동시 감염된 세포의 면역형광 염색은, 몇몇 세포들은 오직 hFVIII의 중쇄 또는 경쇄를 발현시키지만, 많은 세포들이 동시 발현된 인간 FVIII의 두 쇄 모두를 동시 발현시킨다는 것을 입증하였다.

<실시예 9>

단일 작제물을 이용한 인자 VIII의 시험관 내 발현

하기 표 2는 상이한 프로모터에 의해 유도된 인자 VIII의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 두개의 단일 벡터 작제물이 생물학적으로 활성인 인자 VIII를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 작제물 pAAV-hF8-1 (서열 13) 및 pVm4.1cF8△B (서열 14)를 293세포로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 48 내지 72 시간 동안 세포가 인자 VIII를 발현하게 하였다. 제조사의 지시에 따라, 배양물 배지에서 인자 VIII를 ChromZ FVIII 응고 활성 (FVIII-c) 분석에 의해 분석하였다.

생물학적으로 활성인 FVIII의 시험관 내 생성
작제물(들)	ELISA(ng/ml)	ChromZ(ng/ml)
대조군	-	0
pAAV-hF8-1	-	4.9
pVm4.1cF8△B	-	46

<실시예 10>

조직 특이적 프로모터를 이용한 인자 VIII 발현

이 실험에서, 상이한 프로모터 및 인핸서 요소를 이용하여 인자 VII 코딩 서열의 발현을 유도하였다. 상이한 프로모터를 이용하여 인자 VIII의 발현을 293 세포 및 HepG2에서 비교하였다. pAAVeF8△B는 hGH 인트론이 있는 EF-1α 프로모터, B-도메인 결실 (F8△B) 및 폴리 A가 있는 인자 VIII를 함유하였다. 상기 기재된 바와 같이, pAAV-hF8-1은 최소 인트론이 있는 HNF-3 알부민 프로모터에 이어 F8△B 및 최소 폴리 A를 이용하였다. 작제물 pAAV-c8은 CMV 인핸서-프로모터 및 F8△B를 이용하였다. pAAV8b1은 HNF-3 알부민 프로모터에 이어 F8△B 및 최소 폴리 A 부위가 있는 CMV/B-글로빈 인트론을 함유하였다. 하기 표 3은 HepG2 및 293 세포에서 대조 플라스미드 pV4.1eF8△B와 관련된 알부민 프로모터를 이용한 인자 VIII 발현을 기재하고 있다. 이러한 데이타는 293 세포에서 인자 VII 발현과 비교하여, 알부빈 프로모터가 있는 HepG2 간 세포에서 인자 VIII의 발현이 증가되었음을 보여준다.

프로모터의 상대적 조직 특이성
플라스미드 작제물	HepG2 세포	293 세포
pAAV-hF8-1	6.2	0.6
pAAV8bl	6.7	1.0
pAAVc8	30.0	41.0
pV4.1eF8△B	100	100

다음으로, 트란스티레틴 (TTR) 유전자 프로모터로부터 유도된 몇몇 프로모터를 HepG2 세포로 형질감염시켰다. TTR은 풍부한 혈청 단백질이고, 유전자 인핸서-프로모터는 널리 공지된 간-특이적 전사 인자 결합 부위를 함유한다 (문헌[Samadani et al., Gene Expression 6:23 (1996)]; [Yan et al., EMBO 9:869 (1990)]; [Costa and Grayson, Nuc. Acids Res., 19:4139 (1991)]; [Costa et al., Mol. Cell. Bio., 6:4697 (1986)]를 참조한다). pAAV-hF8-1에서 HNF-3 알부민 프로모터를 다양한 길이의 TTR 프로모터-인핸서로 치환함으로써 작제물을 제조하였다. 약한 친화성 결합 부위를 강한 친화성 결합 부위로 치환함으로써 TTR 인핸서-프로모터를 변형시켜, pAAV-hF8-2를 제조하였다. pAAV-hF8-TTR-E-L-P202 작제물은 인핸서와 프로모터 간에 링커가 있는 완전한 TTR 프로모터를 함유하였다. 나머지 작제물은 5' 결실이 있었다. pAAV-hF8-TTR-E-P202는 링커가 없은 프로모터 및 인핸서를 갖고, pAAV-hF8-TTR-E-P197은 프로모터로부터의 5 염기 쌍 결실을 갖고, pAAV-hF8-TTR-E-P151은 50 염기 쌍 결실을 갖고, pAAV-hF8-TTR-E-P202는 TTR 인핸서가 부족하고, pAAV-hF8-TTR(X)는 인핸서 중 65 염기 쌍 결실을 갖는다. 대조 플라스미드인 pAAV-hF8-1은 약 4.6 mU/ml 발현되었다. 하기 표 4는 대조 플라스미드와 관련된 TTR 프로모터류를 이용함으로써 인자 VIII 활성이 여러 배로 증가한다는 것을 보여주고 있다.

TTR-유도된 프로모터를 이용한 인자 VIII 발현
플라스미드 작제물	상대적인 인자 VIII 활성
pAAV-hF8-STTR	3.16
pAAV-hF8-TTR-E-L-P202	8.86
pAAV-hF8-TTR-E-P202	6.1
pAAV-hF8-TTR-EP197	7.3
pAAV-hF8-TTR-E-P151	13.3
pAAV-hF8-TTR-P202	2.3

<실시예 11>

인자 VIII의 생체 내 발현

생체 내에서 본 발명의 AAV 벡터 접근법을 실험하기 위해, AAV-eδD-FVIII-HC 3 x 10¹¹입자, AAV-eδD-FVIII-LC 3 x 10¹¹입자, 또는 AAV-eδD-FVIII-HC 및 AAV-eδD-FVIII-LC 모두 3 x 10¹¹입자를 간문맥을 통해 5 C57BL/6 마우스의 3개 군에게 주입하였다. 또한, 4 마리의 동물 군에 AAV-eδD-FIX 3 x 10¹¹입자를 주입하였다. 이는 유전자가 아데노바이러스 벡터를 통해 간문맥으로 전달될 경우, 마우스의 이러한 스트레인은 인간 FVIII에 대한 면역 반응을 유도하지 못한다는 것을 보여주고 있다 (문헌[Connelly et al., Blood 87:4671-4677 (1996)]를 참조한다).하기 도시된 결과로부터 나타난 바와 같이, 이 실험 동안 얻은 데이타는 FVIII의 중쇄 및 경쇄를 독립적으로 전달하기 위해 두개의 AAV 벡터를 이용하여 생물학적으로 활성인 FVIII를 제조하는 가능성을 입증하고 있다.

후안화총 (retro-orbital plexus)을 통해 처음 2 달간 격주 간격으로 혈액 샘플을 시트르산나트륨에 수거하였고, 그후 6개월 및 11개월 동안 한달 간격으로 혈액 샘플을 수거하였다. 도 8에 도시된 바와 같이 AAV-eδD-FVIII-LC 단독 또는 두개의 벡터 모두 주입된 동물에서 매우 높은 수준의 FVIII 경쇄가 발현되었다.

동물에서 생성된 생물학적으로 활성인 인간 FVIII의 양을 분석하기 위해, 변형 ChromZ 분석을 이용하였다. 이러한 분석이 인간 및 마우스 FVIII를 검출하기 때문에, 혈장에 존재하는 FVIII의 양은 인간 FVIII에 특이적인 항체로 흡수되기 전 및 후에 결정하였다. 흡수 후 혈장내 잔류하는 FVIII의 양은 활성 마우스 FVIII의 양을 나타내었고, 차이점은 활성 인간 FVIII의 양이었다. 대조 실험은 샘플이 32 ng 이하의 인간 FVIII으로 혼성화된 경우, 항체가 마우스 혈장 샘플로부터 80 내지 90 %의 인간 FVIII를 제거할 수 있다는 것을 입증하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 변형 ChromZ 분석은 두 벡터 모두 주입된 동물들만이 생물학적으로 활성인 FVIII을 생성한다는 것을 나타내었다. 유사한 결과를 주입 10 주 및 5 개월 후에 얻었지만, 하기 표 5에 도시된 결과는 주입 8주 후에 수거된 혈장으로부터의 것이다. 중쇄 및 경쇄 벡터 모두가 동시-주입된 5 마리의 동물 중 하나에서는 VIII이 발현되지 않았고 (비효율적인 주입 때문이라 예상), 이를 분석에서 제외하였다. 두 벡터 모두가 주입된 동물은 ELISA에 의해 측정하여 2 ㎍/ml 초과의 hFVIII 경쇄를 생성하였다. ChromZ 분석은 혈장중에서 총 600 내지 900 ng/ml의 활성 hFVIII이 검출된다는 것을 나타내었다. 뮤린 인자 VIII로부터의 기여 정도는 약 400 내지 500 ng/ml이었는데, 이는 약 230 내지 430 ng/ml의 활성 인간 인자 VIII가 혈장 중에 존재한다는 것을 나타내었다. 총 단백질의 한 분획물만이 활성인 것으로 밝혀졌지만, 동물들은 생리학적 농도의 활성 단백질 (즉, 200 ng/ml)을 생성하였다. 동물들은 이러한 생리학적 농도의 활성 단백질을 감소시키지 않으면서 11 개월 이상 유지하는 것으로 밝혀졌다. 경쇄 벡터 단독, 중쇄 벡터 단독 또는 hFIX 벡터 주입된 동물에서 수행한 유사한 분석은 이러한 동물들의 혈장에서 생물학적으로 활성인 인간 FVIII가 생성되지 않음을 입증한다.

생체 내 인간 인자 VIII의 생물학적 활성
이용한 작제물(들)	ELISA(ng/ml)	총 FVIII (-Ab)(유닛)	마우스 FVIII (+Ab)(유닛)	인간 FVIII(ng/ml)
AAV-eδD-FVIII-HC 및AAV-eδD-FVIII-LC*	2288	3.9	2.2	342
AAV-eδD-FVIII-LC*	3329	1.4	1.6	0
AAV-eδD-FVIII-HC	0	1.6	1.6	0
AAV-eδD-FIX	0	1.4	2.0	0
* 동물 세마리에 대한 평균

<실시예 12>

조직내 유전자 수송 및 벡터 발현

이 실험에서, 써던 블롯 분석 후, 주입 8주 후에 희생된 (즉, 실시예 11에 기재된 바와 같이) 각 실험군의 동물 한마리로부터 DNA를 단리함으로써 유전자가 간으로 이동한다는 증거를 얻었다. 또한, 간 이외의 장기에서 벡터 발현의 정도를결정하기 위해 다른 조직으로부터도 DNA를 얻었다.

BglII을 이용하여 20 마이크로그램의 DNA를 절단하고, 1 %의 아가로스 겔을 이용하여 분리하고, hFVIII (중쇄 프로브)의 A1 및 A2 도메인을 코딩하는³²P-표지된 1126 bpAlwNI 단편, 또는 hFVIII (경쇄 프로브)의 A3, C1 및 C2 도메인을 코딩하는³²P-표지된 1456 bpNdeNI 단편으로 혼성화시켰다.BglII-절단된 중쇄 또는 경쇄 플라스미드 DNA (각각 pVm4.1eδD-hFVIII-HC 및 pVm4.1eδD-hFVIII-LC)가 있는BglII-절단된 천연 마우스 간 DNA를 배수체 게놈당 10, 5, 1, 0.1 및 0.01 카피율로 혼성화함으로써 카피 수 대조군을 발생시켰다. 스토름 (Storm) 860 방사형광 분석기 (phosphoimager) (몰레큘라 다이나믹스 (Molecular Dynamics))를 이용하여 혼성화된 막을 분석하고, 이미지쿠아NT (ImageQuaNT) 소프트웨어 (몰레큘라 다이나믹스)를 이용하여 벡터 카피 수의 양을 평가하였다. 혼성화된 막의 방사능 사진법을 또한 수행하였다. RNA 스탯 (Stat) 추출 키트 (Tel-Test)를 이용하여 총 RNA를 간 조직으로부터 단리하였다. 하기 간단히 기재된 바와 같이, 상기 기재된 hFVIII의 중쇄 및 경쇄에 특이적인³²P-표지된 프로브와 관련된 당업계에 공지된 방법을 이용하여 10 ㎍ RNA에서 노던 블롯 분석을 또한 수행하였고, 방사능 사진법을 혼성화된 막 상에서 수행하였다.

BglII를 이용하여 간 DNA를 절단한 후, 당업계에 공지된 방법으로 하기 기재된 hFVIII 경쇄 프로브를 혼성화시키고, rAAV-hFVIII-LC, 또는 중쇄 및 경쇄 벡터 모두를 주입한 동물에서 3015 bp의 예상 크기로 밴드를 검출하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이 (rAAV-hFVIII-LC, 레인 1; rAAV-hFIX, 레인 2; rAAV-hFVIII-HC, 레인 3; rAAV-hFVIII-LC 및 rAAV-hFVIII-HC, 레인 4; 상응하는 플라스미드가 있는BglII 절단된 천연 마우스 간 DNA를 배수체 게놈당 10, 5, 1, 0.1 및 0.01 카피의 속도로 혼성화함으로써 카피 수 대조군을 발생시킴, 레인 5 내지 9), 이러한 밴드는 경쇄 벡터 단독 또는 hFIX 벡터가 주입된 동물의 DNA에서는 관찰되지 않았다. 방사형광 분석은 경쇄 벡터 단독 또는 두 벡터 모두 주입된 동물에서 경쇄 벡터가 배수체 게놈당 각각 약 2.4 및 1.5 카피의 속도로 존재한다는 것을 밝혔다.BglII-절단된 DNA가 hFVIII 중쇄 프로브를 이용하여 혼성화될 경우, 도 9B에 도시된 바와 같이, 중쇄 벡터 단독 또는 두 벡터 모두 주입된 동물에서 예상된 밴드를 2318 bp에서 관찰하였지만, 경쇄 벡터 단독 또는 hFIX 벡터가 주입된 동물에서는 검출되지 않았다. 중쇄 벡터 단독 및 두 벡터 모두가 주입된 동물에서 카피 수는 배수체 게놈당 각각 1.1 및 1.7 벡터 카피이다.

hFVIII 경쇄 프로브 또는 중쇄 프로브를 이용하여 비장, 신장 및 심장 조직으로부터 추출된 DNA의 혼성화 결과는 이러한 조직에 10 배수체 게놈당 벡터 서열의 1 카피 미만이 함유되어 있다는 것을 나타내고 있으며, 도 10A 및 도 10B에 도시된 바와 같이 벡터가 간문맥 내 주입 후에 일차적으로 간으로 분배된다는 것을 입증하고 있다.

마우스의 간에서 인간 FVIII 유전자 발현도 또한 주입 8 주 후에 희생된 동물로부터 (상기 기재된 바와 같이) 단리된 RNA에서 노던 블롯 분석에 의해 분석하였다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 예상 크기 (2.7 kb)의 hFVIII 경쇄의 전사를경쇄 벡터 단독 또는 두 벡터 모두 주입된 동물에서 관찰하였다. 유사하게, 도 11B에 도시된 바와 같이 중쇄 벡터 단독 또는 두 벡터 모두 주입된 동물에서 예상된 hFVIII 중쇄 전사 (2.7 kb)를 검출하였다. 중쇄 및 경쇄 DNA 서열은 두 벡터 모두 주입된 동물에서 써던 블롯 분석에 의해 거의 동일한 카피 수로 존재하도록 (배수체 게놈당 각각 1.7 및 1.5 카피) 도시되었고, 이러한 결과는 hFVIII의 중쇄 및 경쇄 모두 거의 동등한 양으로 간내에서 발현된다는 것을 입증하였다.

Claims (30)

1. a) 인자 VIII을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1종 이상의 재조합 아데노 관련 벡터를 제공하고,

   b) 개체에서 치료적 유효량을 제공하는 농도로 상기 인자 VIII 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 조건하에 상기 1종 이상의 재조합 아데노 관련 벡터를 상기 개체에게 투여하는 것

   을 포함하는, 인간에서 혈우병의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 인자 VIII 뉴클레오티드 서열이 상기 개체의 간에서 발현되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애를 개선시키는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 개체가 인간인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터가 상기 인자 VIII의 경쇄를 코딩하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터가 상기 인자 VIII의 중쇄를 코딩하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 인자 VIII 뉴클레오티드 서열이 A1, A2, A3, B, C1 및 C2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 인자 VIII 도메인을 코딩하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터를 정맥내로 투여하는 것인 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 정맥내 투여가 간문맥을 통한 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터가 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
12. a) i) 혈액 응고 장애로 고통받는 개체,

    ii) 인자 VIII의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 아데노 관련 벡터, 및

    iii) 인자 VIII의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 아데노 관련 벡터

    를 제공하고,

    b) 상기 개체에서 치료적 유효량을 제공하는 농도로 상기 인자 VIII의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 조건하에 상기 제1 및 제2 재조합 아데노 관련 벡터를 상기 개체에게 투여하는 것

    을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 인자 VIII의 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열이 상기 개체의 간에서 발현되는 것인 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 인자 VIII 뉴클레오티드 서열이 A1, A2, A3, B, C1 및 C2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 인자 VIII 도메인을 코딩하는 것인 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애를 개선시키는 것인 방법.
16. 제12항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A인 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 개체가 인간인 방법.
18. 제12항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터를 정맥내로 투여하는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 정맥내 투여가 간문맥을 통한 것인 방법.
20. 제12항에 있어서, 상기 재조합 아데노 관련 벡터가 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
21. 인자 VIII의 적어도 일부의 번역의 전사를 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 인자 VIII의 상기 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스-관련 벡터, 및 제약적으로 허용가능한 부형제.
22. 제21항에 있어서, 인자 VIII을 코딩하는 상기 핵산이 인자 VIII의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
23. 제21항에 있어서, 인자 VIII을 코딩하는 상기 핵산이 인자 VIII의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
24. 제21항에 있어서, 인자 VIII의 적어도 일부를 코딩하는 상기 핵산이 A1, A2, A3, B, C1 및 C2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 인자 VIII 도메인을 코딩하는 것인 벡터.
25. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 벡터.
26. 인자 VIII을 발현할 수 있는, 1종 이상의 재조합 아데노 관련 벡터를 함유한 숙주 세포.
27. 제26항에 있어서, 상기 세포가 간 세포인 숙주 세포.
28. 제26항에 있어서, 상기 인자 VIII을 생리학적 농도 이상으로 발현시키는 것인 숙주 세포.
29. 제26항에 있어서, 약 200 ng/ml 이상의 농도로 인자 VIII을 발현시키는 숙주 세포.
30. 제29항에 있어서, 동물에 존재하는 것인 숙주 세포.