KR100535325B1 - Ａａｖ 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 - Google Patents

Ａａｖ 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드에 관한 것으로, 구체적으로는 AAV 혈청형2의 VP3 유전자를 다른 혈청형의 VP3 유전자로 치환시킨 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 및 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 헬퍼 플라스미드를 이용하여 제조된 AAV 유전자 전달체는 AAV2 항체 존재하에서도 AAV 유전자를 전달하는 효율이 뛰어나므로, AAV 유전자 전달체를 이용하여 암 및 유전질환과 같은 난치성 질환을 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＡＡＶ 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드{Helper plasmids for the preparation of AAV vector for gene delivery}
본 발명은 신규한 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 및 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드를 도입한 형질전환체에 관한 것이다.
유전자를 이용하여 암 또는 유전질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 것은 유전자 이상에 의한 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 방법이다. 이러한 유전자 치료에는 치료 유전자, 치료유전자 발현체계 및 유전자 전달체로 구성되는 3가지 핵심 기술이 있다. 이중에서 유전자 전달체는 각종 치료 유전자 및 치료 유전자 발현체계를 포함하고 있어 다양한 질병의 유전자 치료에 범용될 수 있으므로 유전자 치료 기술 중에서 가장 핵심이 되는 요소이며, 바이러스성 유전자 전달체와 비바이러스성 유전자 전달체로 나눌 수 있다. 바이러스성 유전자 전달체에는 아데노-연합 바이러스(adeno-associated virus, 이하 'AAV'라 약칭함), 아데노바이러스(adenovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus) 등이 있다.
AAV는 파보바이러스(parvovirus) 과에 속하는 인체 비병원성 바이러스로서 단일가닥의 DNA 유전체(4,680 bp)를 갖고 있으며, 유전자 양말단에 145 bp 길이의 말단 반복 부위(inverted terminal repeat : ITR)가 존재하는데(Muzyczka N, Curr Topics Microbiol, 1992, 158, 96-127), 각 ITR의 125 bp는 T모양의 머리핀 구조를 형성한다. AAV 유전체는 구조 단백질과 비구조 단백질 정보를 갖고 있다. AAV 비구조 단백질(nonstructural protein)은 AAV DNA 복제 및 전사를 조절하는 기능을 갖는 Rep 단백질이다. AAV 바이러스는 외곽을 구성하는 캡시드 단백질인 세 개의 구조 단백질(VP1, VP2 및 VP3)로 이루어져 있으며, 상기 단백질들은 각각 87, 73 및 61 kDa의 분자량을 갖는다. VP3 단백질은 바이러스 입자에 가장 많이 존재하는 단백질(입자 단백질의 90%)이며, VP1과 VP2는 각각 5%씩 존재한다.
AAV 벡터는 포유동물 세포내로 치료유전자를 효율적으로 도입시킬 수 있으며, 다른 벡터와는 다른 몇 가지 특징적인 성질을 갖고 있다. 즉, AAV는 비병원성 바이러스라 안전하고, 숙주세포의 범위가 넓으며, 분열하는 세포 뿐만 아니라 신경세포, 근육세포 등과 같은 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있고, AAV 유전자 전달체에 의해 세포에 도입된 유전자의 발현기간이 길며(근육세포의 경우 1 년 이상), AAV 벡터 자체에 대한 면역반응, 특히 세포성 면역반응이 낮고, 특별한 경우에 숙주세포 염색체의 특정 부위에 유전자를 삽입(integration)시킬 수 있다는 점 등의 장점이 있다. 상기의 이유로 AAV는 난치성 질환의 유전자 치료용 유전자 전달체로서 전망이 밝은 것으로 평가되고 있다(Monahan PE & Samulski RJ, Gene Therapy, 2000, 7, 24-30).
AAV는 UV 조사 및 스트레스와 같은 특별한 경우를 제외하고는 스스로 복제할 수 없다. AAV의 헬퍼 바이러스(helper virus)로서 아데노 바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 등이 알려져 있으며, 헬퍼 바이러스가 있을 경우에만 AAV 입자들이 많이 만들어지기 때문에 AAV 유전자 전달체를 제조하기 위해서는 통상 헬퍼바이러스로서 아데노바이러스를 이용하거나 AAV 증식에 필요한 아데노바이러스의 유전자들을 함유한 헬퍼아데노플라스미드를 이용한다.
AAV 유전자 전달체에는 AAV1 내지 AAV6 유전자 전달체가 있으며, 현재까지 AAV2에 근거한 유전자 전달체가 제작되어 임상시험에 적용되고 있다(Gardner P. et al, Hum. Gene. Ther., 2002, 20;13(11), 1349-1359; Barranger JM, Novelli EA., Expert. Opin. Biol. Ther., 2001, 1(5), 857-867 ; High KA, Ann. N. Y. Acad. Sci., 2001, 953, 64-74). 그러나, 대부분의 사람들이 AAV2에 대한 항체를 갖고 있어 AAV2 유전자 전달체를 AAV2에 대한 항체를 갖는 사람에게 적용할 때는 유전자 전달효율이 감소되어 치료효능의 한계가 발생하게 된다. 또한, AAV2 유전자 전달체의 반복투여가 필요한 경우 AAV2 캡시드 단백질에 대한 항체가 유도되어 반복 투여의 효율성이 저하된다(Halbert CL et al., J Virol, 1998, 72, 9795-9805; Beck SE et al., J Virol, 1999, 73, 9446-9455).
이에 상기의 문제점들을 극복하는 AAV 유전자 전달체를 개발하기 위해 새로운 혈청형인 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5 및 AAV6에 근거한 AAV유전자 전달체들이 개발되고 있다(Chiorini JA et al., J. Virol., 1997, 71, 6823-6833; Rutledge EA et al., J. Virol., 1998, 72, 309-319; Xiao W et al., J. Virol., 1999 , 73, 3994-4003; Chiorini JA et al., J. Virol. 1999, 73: 1309-1319). 서로 다른 혈청형의 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자간의 상동성을 보면, AAV2는 AAV 혈청형 1, 2, 3 및 6과 약 80% 가량의 상동성을 보이며, AAV5와는 단지 51 내지 59%의 상동성을 가진다(Bantel-Schall U et al., J. Virol., 1999, 73, 939-949). 또한, 서로 다른 혈청형의 AAV 유전자 전달체들의 생체내 유전자 전달효능에도 차이가 있다 (Zabner et al., J. Virol., 2000, 74, 3852-3858; Handa A et al., J. Gen. Virol., 2000, 81, 2077-2084). 예를 들면, 뇌의 실질(parechyma)에 서로 다른 혈청형의 AAV 유전자 전달체들을 투여한 후 유전자 발현을 조사한 결과, AAV4 유전자 전달체는 상의세포(ependymal cell)에만 유전자를 전달하였고, AAV2 유전자 전달체는 신경세포(neuronal cell)에만 유전자를 전달하였으며, AAV5 유전자 전달체는 신경교 성상세포(neuronal astrocytes) 및 뇌세포에 AAV2 보다 130 내지 3,000배 가량 더 효율적으로 유전자를 전달하였다 (Davidson BL et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97:3428-3432). 특히, AAV5에 근거한 유전자 전달체는 AAV2 유전자 전달체와는 다른 세포 수용체를 이용하는 것으로 밝혀졌다(Chiorini JA et al., J. Virol., 1999, 73, 1309-1319; Walters RW et al., J Biol Chem, 2001, 276, 20610-20616; Kaludov N et al., J Virol, 2001, 75, 6884-6893).
AAV 유전자 전달체는 바이러스입자를 구성하고 있는 VP1, VP2 및 VP3 세 종류의 캡시드 단백질로 구성되어 있고, VP1, VP2는 VP3의 모든 아미노산을 가지고 있므며, 이 중 VP3는 AAV 캡시드 단백질의 90%를 이루고 있어(Muzyczka N, Curr Topics Microbiol, 1992, 158, 96-127), AAV 유전자 전달체를 생체에 투여할 경우의 주된 면역원으로 작용할 것으로 보여진다(Monahan, P. and Samulski, R. Gene Ther., 2000, 7, 24-30 ; Russell, D. and Kay, Ma., Blood, 94, 864-874).
이에, 본 발명자들은 AAV2에 대한 항체 존재하에서 유전자를 전달할 수 있는 새로운 AAV 유전자 전달체를 제조하기 위하여 AAV2의 VP3 대신에 AAV1 또는 AAV5의 VP3 유전자를 도입한 새로운 헬퍼 플라스미드를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 및 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환체를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 헬퍼 플라스미드는 AAV2의 Rep 및 Cap 유전자와 AAV1 내지 AAV6로 구성된 군으로부터 선택된 AAV 유래 VP3 유전자를 포함한다. 상기에서 VP3 유전자는 AAV1 또는 AAV5 유래인 것이 바람직하다. 또한, 상기 VP3 유전자는 다른 혈청형 AAV VP3 유전자로 용이하게 대치될 수 있도록 유전자의 말단에 제한효소 인식 부위를 포함하고 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 NheⅠ 및 EcoRⅤ에 대한 인식부위를 포함하며, AAV2 유전자 전달체의 VP3 유전자를 제거하고 다른 혈청형의 VP3 유전자를 도입할수 있는 pKSⅡ2VP3 플라스미드를 예시하였다.
바이러스성 유전자 전달체를 제조하기 위해서는 외부 유전자를 포함하는 플라스미드, 바이러스 복제 및 입자 형성을 할 수 있는 헬퍼 플라스미드 및 헬퍼 바이러스를 필요로 한다. 현재까지 AAV2에 근거한 유전자 전달체가 제작되어 임상시험에 적용하고 있으나 AAV2에 대한 항체를 갖는 사람에게 적용할 때에는 유전자 전달효율이 감소되어 치료 효능에 한계가 있었다. 그 이유로는, AAV2에 근거한 유전자 전달체에는 AAV2의 구조 단백질이 존재하는데, 치료 대상자에게 이미 AAV2의 구조 단백질에 대한 항체가 있거나 또는 AAV2에 근거한 유전자 전달체를 지속적으로 투여시 AAV2의 구조 단백질에 대한 항체가 생성되기 때문이다.
따라서, 본 발명에서는 AAV2의 구조단백질 중에서 VP3 단백질을 코딩하는 유전자를 AAV2 이외의 다른 혈청형 AAV의 VP3 유전자로 대체한 헬퍼 플라스미드를 제공한다. 여기에서, AAV2 이외의 다른 혈청형 AAV는 특정한 혈청형에 한정되는 것이 아니므로, 모든 혈청형의 VP3 유전자가 사용될 수 있음은 당업자에게 있어서는 자명하다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 AAV2의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 AAV1 또는 AAV5 혈청형 유래의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환한 pKSⅡ1VP3 및 pKSⅡ5VP3 플라스미드를 예시하였다(도 2 참조). 그리고, pKSⅡ5VP3 플라스미드를 대장균인 DH5α에 형질전환한 형질전환체를 2002년 9월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10338BP).
본 발명의 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 제조하기 위해, 우선 AAV 혈청형2의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자 및 AAV DNA 복제 유도 유전자를 포함하는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 제조한다(도 1 참조). 다음으로, 상기 AAV2 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드의 AAV 혈청형2의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 제거하고, AAV 혈청형2의 VP3 유전자와 상동성이 적은 다른 AAV 혈청형의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 제조한다(도 2 참조).
상기 AAV 혈청형2의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자와 치환하여 제조할 수 있는 것으로는 AAV 혈청형 1, 3, 4, 5 및 6의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 사용하는 것이 바람직하며, AAV 혈청형 1 및 5의 VP3 구조 단백질을 코딩하는 유전자를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 당업자에게 알려진 통상적인 형질전환 방법을 이용하여 상기 헬퍼 플라스미드 및 유전자 치료를 할 수 있는 외부유전자를 도입한 플라스미드를 숙주 세포에 동시 형질전환시킴으로써 제조된다. 상기 외부유전자는 질환을 치료하려는 목적에 따라 어느 것이든 사용할 수 있으며, 암 또는 유전자 이상에 의해 발생하는 질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 유전자인 것이 바람직하다.
또한, 상기 플라스미드를 도입하여 형질전환시키는 세포로는 바이러스 유전자가 항상 발현되는 세포주를 사용할 수 있으며, 293 세포, Cos-7 세포, Renca 세포, B16(f-1) 세포 및 B16(w) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 상기와 같은 종양 유래의 세포주 뿐만 아니라 다른 형태의 정상 세포도 사용될 수 있음은 당연하다.
본 발명은 상기 헬퍼 플라스미드 및 외부 유전자를 포함하는 플라스미드를 도입한 형질전환체에 아데노 바이러스를 감염시킨다. 상기 바이러스 감염된 세포로부터 바이러스 입자가 생성되는데, 상기 바이러스 입자는 외부 유전자를 포함하는 것으로, 상기 바이러스 입자를 분리 및 정제하여 AAV 유전자 전달체를 획득할 수 있다.
AAV 혈청형2에 대한 항체가 존재하는 혈청을 사용하여 배양한 세포에 바이러스 감염시켜 획득한 AAV 유전자 전달체는 세포마다 차이가 있긴 하지만, 유전자 전달 효율이 뛰어남을 확인하였다(도 8 참조). 이에, 본 발명에서 제조한 헬퍼 플라스미드를 이용하여 제조한 AAV 유전자 전달체는 유전자 전달 효율이 뛰어남을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> AAV 유전자 전달체 제작용 헬퍼 플라스미드 pKSⅡ2VP3의 제조
본 발명자들은 AAV 혈청형2의 구조 단백질을 코딩하는 VP3 유전자를 다른 혈청형의 AAV 구조 단백질을 코딩하는 VP3 유전자로 용이하게 대체하기 위한 헬퍼 플라스미드를 제조하였다.
<1-1> EcoR V 부위가 제거된 pBlu2KSP의 제조
pBluescriptKSⅡ(+)(Stratagene, 이하 'pKSBlu2KSP'라 약칭함)을 통상의 클로닝 방법(Sambrook J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 의해 평활 말단(blunt end)으로 절단되는 제한효소 HincⅡ 및 SmaI으로 절단한 후 절단된 DNA를 분리(elution)하여 T4 DNA 라이게이즈(ligase)로 하룻밤 동안 반응시켜 연결한 후 대장균에 형질전환하여 pKSBlu2KSP 벡터의 HincⅡ 및 SmaI 사이에 존재하는 EcoRV 부위가 제거된 pBlu2KSP(EcoRV-)를 제조하였다( 도 1).
<1-2> pKSⅡ-Cap의 제조
아데노-연합 바이러스의 복제유전자(replication, 이하 'Rep'이라 약칭함) 및 캡시드 유전자(capsid, 이하 'Cap'이라 약칭함)를 포함하는 AAV2 유전체를 함유하고 있는 공지의 pSub201 벡터(Samulski RJ et al., J Virol, 1989, 63, 3822-3829)를 BamHI 및 PvuⅡ로 절단하여 AAV2 Cap 유전자를 함유하는 3.6 kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 상기 DNA 절편을 pBlu2KSP의 BamHI-EcoRV 부위에 도입하여 pKSⅡ-Cap 플라스미드를 제조하였다(도 1).
<1-3> pKSⅡ-CapNE의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pKSⅡ-Cap 플라스미드를 주형으로 하고 3종류의 프라이머 쌍을 이용하여 3종류의 DNA 절편을 증폭시켰다. 사용된 프라이머 쌍은 하기와 같고 각각의 프라이머쌍들의 위치는 pKSⅡ-Cap 플라스미드 모식도에 화살표로 표시하였다(도 1).
프라미어 쌍 1: 서열번호 1로 기재되는 -20 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 VP3AS(NheI) 프라이머(NheI 절단부위를 안티센스 방향으로 갖는 프라이머),
프라이머 쌍 2: 서열번호 3으로 기재되는 VP3S(NheI) 프라이머(NheI 절단부위를 센스 방향으로 갖는 프라이머) 및 서열번호 4로 기재되는 VP3AS(EcoRV) 프라이머(EcoRV 절단부위를 안티센스 방향으로 갖는 프라이머) 및
프라이머 쌍 3: 서열번호 5로 기재되는 VP3S(EcoRV) 프라이머(EcoRV절단부위를 센스 방향으로 갖는 프라미머) 및 서열번호 6으로 기재되는 리버스 프라이머.
상기의 프라이머로 증폭된 3종류의 DNA 절편들을 각각 BamHI-NheI, NheI-EcoRV, EcoRV-HindⅢ로 절단하여 3종류의 DNA절편을 획득하고, 상기 DNA 절편들을 함께 pKSBlu2KSP의 BamHI-HindⅢ 부위에 도입하여 pKSⅡ-CapNE를 얻었다(도 1).
<1-4> pKSⅡ2VP3의 제조
상기 실시예 <1-3>에서 제조한 pKSⅡ-CapNE를 HindⅢ-XbaI으로 절단하여 2VP3NE DNA 절편을 함유하고 있는 2.6 kb의 DNA 절편을 얻었다. 상기 실시예 <1-2>에서 사용한 pSub201 벡터를 HindⅢ-XbaI으로 절단하여 1.6 kb의 DNA 절편을 얻었다. 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 pBlu2KSP(EcoRV-)를 XbaI으로 처리한 후 알카라인 포스파타제를 처리하여 얻은 플라스미드, 상기의 2.6 kb 2VP3NE HindⅢ-XbaI DNA 절편 및 상기에서 얻은 1.6 kb pSub201 HindⅢ-XbaI DNA 절편을 연결하여 AAV 혈청형2의 구조단백질을 코딩하는 VP3 유전자를 포함하는 플라스미드 pKSⅡ2VP3를 제조하였다(도 1).
<실시예 2> AAV1VP3 및 AAV5VP3 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드 pKSⅡ1VP3 및 pKSⅡ5VP3의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 pKSⅡ2VP3를 이용하여 AAV1VP3 및 AAV5VP3 유전자 전달체를 제조하기 위한 헬퍼 플라스미드 pKSⅡ1VP3 및 pKSⅡ5VP3를 제조하였다. 구체적으로, AAV1(ATCC VR-645) 및 AAV5(Bantel-Schall U et al., J. Virol. 1999, 73, 939-949)를 아데노바이러스와 함께 293 세포(ATCC CRL 1573)에 감염시켜 증폭시켰다. 증폭된 바이러스로부터 증식된 AAV1 DNA 및 AAV5 DNA를 낮은 분자량의 DNA을 분리하는 공지의 방법인 허트씨의 방법(Hirt B. J., Mol Biol, 1967, 26, 365-369)으로 추출하였다. 상기 추출한 AAV1 DNA 및 AAV5 DNA 각각을 주형으로 하여 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 AAV1VP3 유전자 및 AAV5VP3 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 1.6 kb의 AAV1VP3 DNA 및 AAV5VP3 DNA를 NheI-EcoRV로 각각 절단하고, 상기 실시예 1에서 제조한 pKSⅡ2VP3를 제한효소 NheI-EcoRV로 절단하여 얻은 AAV2의 VP3 유전자가 제거된 플라스미드에 통상의 클로닝 방법으로 결합시켜 각각 pKSⅡ1VP3 및 pKSⅡ5VP3 플라스미드를 제조하였다(도 2). 그리고, 상기에서 제조한 pKSⅡ5VP3 플라스미드를 대장균인 DH5α에 형질전환하여 형질전환체를 얻고 이를 2002년 9월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10338BP).
<실시예 3> pKSⅡ1VP3, pKSⅡ2VP3 및 pKSⅡ5VP3를 이용한 AAV 유전자 전달체의 제조
본 발명자들은 AAV 유전자 전달체를 제조하기 위하여, 외부 유전자가 도입되는 플라스미드, 재조합 바이러스를 복제하고 입자를 형성하게 하는 헬퍼 플라스미드 및 헬퍼 바이러스인 아데노바이러스를 이용하여 AAV 유전자 전달체를 제조하였다.
본 발명의 AAV 유전자 전달체의 유전자 전달능을 확인하기 위해, 외부유전자로 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, 이하 'GFP'라 약칭함) 또는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, 이하 'LacZ'라 약칭함)를 사용하였다. 본 발명의 외부 유전자가 도입되는 플라스미드(pAAV-GFP, pAAV-LacZ)는 AAV 복제 시작 부위 및 입자화 시그날을 갖는 ITR, 외부 유전자, 외부 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 프로모터 및 poly(A) 시그날을 포함한다. 또한, 재조합 바이러스를 복제하고 입자를 형성하게 하는 헬퍼 플라스미드(pKSⅡ1VP3, pKSⅡ2VP3 또는 pKSⅡ5VP3)는 재조합 바이러스의 DNA 복제를 유도하는데 필요한 Rep 유전자 및 바이러스 입자 형성에 필요한 Cap 유전자를 포함한다. 상기의 헬퍼 플라스미드에는 AAV의 ITR 및 입자화시그날이 존재하지 않아 재조합 AAV 입자를 형성할 수 없다.
상기에서 제조한 AAV 유전자 전달체 제작용 헬퍼플라스미드(pKSⅡ1VP3, pKSⅡ2VP3, pKSⅡ5VP3)각각과 ITR을 포함하는 LacZ 혹은 GFP 발현 벡터 각각을 칼슘 인산 침전 방법으로 100 mm 직경의 배양접시에 분할하여 키운 293세포 각 10 장 에 도입하였다(전체 세포수 약 108 개; 100 mm 배양접시 하나당 DNA양은 20 ug; pKSⅡ1VP3, pKSⅡ2VP3 또는 pKSⅡ5VP3 10 ug, AAV-ITR-LacZ 또는 AAV-ITR-GFP 10 ug)(Sambrook J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 상기 293 세포가 70 내지 80% 자랐을 때 10% 혈청(Gibco BRL) 이 든 LDMED 또는 IMDM 배지(Gibco BRL)로 교체하였다. 배지를 갈아준 후 약 8시간 뒤에 칼슘 인산 침전 방법으로 형질도입하였다. 상기 방법으로 칼슘 포스페이트 침전을 형성한 다음 15분 동안 상온에 방치한 후 3 내지 4 회 피펫팅하여 형성된 DNA 침전물을 잘게 부순 후, 70 내지 80% 자란 세포 위에 위치를 바꾸어가며 한 방울씩 바꾸어가며 떨어뜨려 형질전환하였고, 상기와 같이 처리된 세포를 천천히 흔들어 준 다음, 37℃ 배양기에 4 내지 8 시간 정도 두어 DNA 침전물이 세포배양 접시바닥에 침적된 것을 확인한 뒤에, 10% 소태아혈청이 첨가된 LDMEM(Gibco) 배지로 갈아주면서 아데노바이러스 5(Adenovirus type 5, ATCC # VR 5)를 5 moi(감염 중복도, multiplicity of infection)가 되도록 첨가시켜 주었다.
상기 방법으로 플라스미드를 293 세포에 형질도입시킨 뒤 약 48 시간 후에 세포를 수획하였다. 상기 수획한 세포 배양액과 함께 세포를 원심 분리하여 얻은 펠렛을 PBS(phosphate buffered saline)에 현탁한 후 3회에 걸친 동결과 해동의 절차를 밟은 후에 세포내에 존재하는 AAV-GFP 또는 AAV-LacZ 유전자 전달체를 유리시켰다. 상기에서 얻은 용액을 56℃에서 30분간 처리하여 아데노바이러스를 불활성화시켰다. 상기에서 수득한 용액중에서 AAV 유전자 전달체를 분리 및 정제하기 위하여 PBS-MK(PBS, 1 mM MgCl2, 2.5 mM KCl)를 완충액으로 하여, 공지의 AAV 분리 정제 방법인 이오디자놀(Iodixanol) 밀도구배 초원심분리(Zolotukhin S et al., Gene Therapy, 1999, 6, 973-985)를 수행하여 AAV 유전자 전달체를 분리하였다.
그 결과, AAV 유전자 전달체인 AAV1VP3LacZ, AAV2VP3-LacZ, AAV2VP3-LacZ 또는 AAV1VP3-GFP AAV2VP3-GFP, AAV5VP3-GFP를 얻을수 있었다(도 3 및 표 1).
분리한 AAV 유전자 전달체
외부유전자 도입 플라스미드 헬퍼 플라스미드
pKSⅡIVP3 pKSⅡ2VP3 pKSⅡ5VP3
pAAV-LacZ AAV1VP3-LacZ AAV2VP3-LacZ AAV2VP3-LacZ
pAAV-GFP AAV1VP3-GFP AAV2VP3-GFP AAV5VP3-GFP
<실시예 4> 분리 정제된 AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ의 정량 및 유전자 전달능 검증
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 분리 정제한 AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ의 정량 및 유전자 전달능을 검증하였다.
<4-1> AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ의 정량
상기 실시예 3에서 분리 정제한 AAV-LacZ 유전자 전달체들의 바이러스 입자량은 통상의 서던 블랏 혼성반응 방법(Sambrook J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)으로 검증하였다. 보다 상세하게는, 상기 분리 정제된 AAV 유전자 전달체들을 함유하는 용액 12.5, 25 및 50 ㎕를 취하여 프로티네이즈 K로 처리한 후, 70℃에서 10분간 처리하였다. 페놀/클로로포름으로 단백질들을 제거한 다음 에탄올로 AAV DNA를 침전시켰다. 상기 침전된 AAV DNA는 1% 아가로즈 젤을 이용한 전기영동으로 분리하였다. 상기 아가로즈 젤을 0.5 N NaOH 및 0.1 N NaCl이 첨가된 용액에서 1 시간 동안 변성시킨 후, 다시 30분간 증류수에서 세척하고, 80℃에서 1시간동안 진공 건조시켰다. 상기에서 얻어진 젤 막을 32P로 표지된 AAV-ITR DNA 절편을 탐침으로 이용하여 서던 블랏 혼성반응을 수행하였다. 이때 AAV 입자수를 결정하기 위하여, AAV ITR을 함유하고 있는 pSub201 DNA 0.05, 0.5, 5 및 50 ng을 표준시료로서 사용하였다. 상기 서던 블랏 혼성 반응으로 나타난 AAV 단일 가닥 DNA의 양을 포스포이메이저(Fujix BAS1000 phosphorimager, Fuji Photo Film Co)를 통하여 정량한 결과, 각 AAV 유전자 전달체의 유전체 수(genomic titer)는 거의 동일하였으며, AAV1 혹은 AAV5의 VP3 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드(pKSⅡ1VP3 또는 pKSⅡ5VP3)는 AAV2 유전자 전달체를 제조하는 데에 필요한 헬퍼플라미드(pKSⅡ2VP3)만큼 효율적임을 알 수 있었다( 도 4a).
<4-2> AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ의 유전자 전달능력 검증
본 발명자들은 상기 실시예 <4-1>에서 정량한 AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ의 유전자 전달 능력을 검증하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 동일한 바이러스 입자수를 갖는 AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ(3가지의 서로 다른 농도; 1.2, 6, 30 ㎕)를 혈청이 없는 DMEM에 가하여 200 ㎕의 접종용량이 되도록하여 Cos-7 세포(ATCC CRL-1651)에 형질 도입시킨 후 β-gal 염색을 실시하였다.
그 결과, AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ로 도입된 Cos-7 세포에 베터갈락토시다제 유전자가 도입되었으며, 상기 결과를 정량화한 결과 AAV5VP3 유전자 전달체의 Cos-7 세포로의 유전자 전달효율은 AAV2VP3보다 다소 적었으나 현저한 차이는 보이지 않았다. 따라서, AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체들은 Cos-7 세포에 유전자를 효과적으로 전달함을 알 수 있었다(도 4b).
<실시예 5> AAV2에 대한 항체를 갖는 사람혈청의 검색 및 AAV2 유전자 전달체의 유전자 전달능
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 헬퍼 플라스미드들을 이용하여 제조한 AAV1VP3 유전자 전달체 및 AAV5VP3 유전자 전달체들이 AAV2에 대한 항체 존재하에서도 유전자를 전달할 수 있는지를 검증하기 위한 항체를 확보하기 위하여, 5종의 정상인의 혈청을 수집한 후, 이들 중에 AAV2에 대한 항체가 존재하는지를 조사하였다.
<5-1> AAV2에 대한 항체 조사 1
정제된 AAV2-GFP 유전자 전달체를 #1, 2, 3, 4 또는 #5 혈청 0.4 ㎕를 동량으로 희석하여 각각 첨가한 DMEM에 넣어 전체 용량이 200 ㎕가 되도록 하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 헬라 세포(HeLa, ATCC CCL-2)를 24 웰 플레이트에 접종하여 웰 당 5 ×104 세포수가 되도록 배양하였다. 세포가 안정하게 부착된 뒤 10 mM이 되도록 하이드록시 유레아를 배지에 첨가시켜 하룻밤 배양한 후, 상기에서 제조한 AAV유전자 전달체-혈청 혼합액을 각각의 웰에 가하여 37℃에서 1시간동안 형질도입시켰다. 상기 형질도입 1시간 후에 5% 우혈청이 들어있는 DMEM을 가하였다. 상기 반응 36시간 후에 재조합 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, 이하 'GFP'라 약칭함)을 발현하는 세포를 200 ㎕의 1 ×트립신-EDTA(Gibco BRL)으로 처리하여 떼어내고, 1.3 ㎖의 1 ×PBS가 들어있는 에펜도르프 튜브에 넣어 4℃, 3000 rpm에서 원심분리하였다. 가라앉은 세포 분획을 남기고 PBS/트립신 용액을 제거한 다음, 100 ㎕의 1 ×PBS를 다시 첨가하여 세포를 파이펫으로 천천히 현탁한 후에 10 ㎕의 세포액을 헤모사이토미터에 넣어 가시광선하에서 전체 세포를 계수하고, UV 광원하에서 GFP 발현세포를 형광 현미경(Fluovert, Wild Leitz)으로 계수하여 백분율로 표시하였다.
그 결과, #5 혈청에 AAV2에 대한 중화항체가 가장 많이 존재하는 것으로 나타났다(도 5의 A).
또한, #5 혈청만을 1/100, 1/200, 1/600, 1/1000, 1/2000 및 1/4000로 단계적으로 희석하여 상기의 방법으로 다시 AAV2-GFP 유전자 전달체와 반응시킨 후 헬라세포에 상기 방법으로 도입시킨 결과, 200배로 혈청을 희석한 경우에는 GFP의 발현이 관찰되지 않았고, 200배 이상 희석하였을 경우에는 GFP의 발현이 희석 배수와 함께 증가되었다(도 5의 B).
<5-2> AAV2에 대한 항체 조사 2
본 발명자들은 #5 혈청 중에 AAV2에 대한 항체가 존재하는지의 여부를 분자적으로 살펴보기 위하여, AAV2VP3를 비교적 약하게 중화시키는 혈청 #2와 중화반응이 활발한 #5 혈청을 이용하여 면역침전하여 웨스턴 블랏을 다음과 같이 수행하였다. 정제된 AAV2 입자를 #2 또는 #5혈청 2 ㎕와 혼합시키고 1 ×PBS를 첨가시켜 최종 부피가 500 ㎕가 되도록 하여 2시간 동안 4℃에서 천천히 흔들어주면서 반응시켰다. 상기 반응액에 다시 사람의 항체와 결합할 수 있는 1/20로 희석한 프로테인 A 아가로스(Invitrogen)를 50 ㎕ 첨가하여 하룻밤동안 4℃에서 흔들어주면서 반응시켰다. NP-40 용해버퍼(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 10% NP-40)를 500 ㎕씩 넣어 5000 rpm으로 원심분리하여 3회 세척하고, 침전된 아가로스를 수거하였다. 전기영동 킷트(Mighty small gel electrophoresis kit, Hoefer)를 이용하여 10% SDS PAGE를 25 mA로 약 90분 동안 전기영동하였고, 니트로셀룰로스(Hybond-C nitrocellulose, Amersham)와 트랜스퍼 유니트(transferring unit, Hoefer)를 이용하여 150 mA로 트리스-글리신 트랜스퍼 완충액(트리즈마 베이스 15.6 mM , 글리신 120 mM, 20% 메탄올, pH 8.1-8.4)에서 2 시간 동안 전기영동하여 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼된 단백질을 포함하는 막은 5% 탈지분유(서울 탈지분유, 서울우유)/1 ×PBST(1 ×PBS , 0.05% 트윈-20) 를 사용하여 상온에서 2시간 블로킹하였다. 1차항체로 생쥐 항-VP3 단일클론 항체(B1 항체, Wistuba A, Weger S, Kern A, Kleinschmidt JA, J. Virol. 1995 . 69, 5311-5319)를 10:1로 1 ×PBST에 희석하여 사용하였고 상온에서 흔들어주면서 반응시켰다. 그 후 1 ×PBST로 5분간 5회 세척 후, 2차항체로 항-생쥐 HRP(anti-mouse HRP, Sigma)를 2000:1로 1 ×PBST에 희석하여 1시간동안 반응시킨 후 1 ×PBST로 10분간 3회 세척한 후 발색반응기(ECL, Amersham)로 단백질 밴드를 검증하였다.
그 결과, #5 혈청은 #3에 비하여 AAV2VP3과 분자간 결합력이 강하다는 것을 알 수 있었고, 이로부터 #5 혈청이 AAV2VP3을 중화하는 능력이 더 크다는 것을 알 수 있었다(도 5의 C). 따라서, AAV2에 대한 높은 타이터의 항체를 갖는 사람의 혈청은 #5이며, #5혈청이 AAV2 유전자 전달체의 유전자 전달을 가장 강하게 저해함을 알 수 있었다.
<실시예 6> AAV2에 대한 항체존재하에서 AAV1VP3, AAV5VP3 유전자 전달체의 유전자 전달능 검증
본 발명자들은 헬퍼 플라스미드로서 pKSⅡ1VP3, pKSⅡ5VP3 존재하에서 제작한 AAV1VP3-LacZ, AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체의 유전자 전달능이 AAV2에 대한 항체존재하에서 영향을 받는지를 Cos-7 세포주를 대상으로 확인하였다.
먼저, 5 ×104 Cos-7 세포를 12-웰 배양접시에서 분배하여 키웠다. 하루가 지난후 세포가 잘 붙었을 때, 하이드록시유레아(hydroxyurea)의 농도가 10 mM이 되도록 배양액에 가한후 16시간 동안 계속 배양시켰다. 동일한 유전체 수(genomic titer; 1 ×108)를 갖는 AAV2VP3-LacZ, AAV1VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체 각각을 DMEM에 희석한 후, 상기 희석된 유전자 전달체를 단계적으로 희석한 사람의 #5혈청에 가하여 전체 용량이 200 ㎕가 되도록 하였다. 상기 AAV 유전자 전달체-혈청 혼합액을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 하이드록시유레아를 처리한 Cos-7 세포에 200 ㎕의 AAV 유전자 전달체-혈청 혼합액을 넣어주고 1시간 동안 형질 도입시켰다. 상기 형질 도입후 1시간 뒤에 5%의 FBS(송아지 태아 혈청, fetal bovine serum)가 들어있는 DMEM을 가하였다. 상기 반응 36 시간 후에 X-gal을 이용하여, LacZ 염색을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 플레이트에서 배지를 제거한 후에 2%의 포르마린(formalin)으로 세포를 30초간 처리하여 세포를 배양접시에 고정시켰다. 상기 고정된 세포를 생리식염수로 1회 세척한 후에, X-gal 염색액(K3Fe(CN)6 0.065 g, K4Fe(CN)3H2O 0.083 g, 1 M MgCl2 20 ㎕, X-gal(디메틸포름아마이드 20 mg/㎖) 0.5 ㎖, PBS 9.5 ㎖)을 200 ㎕ 씩 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다.
그 결과, AAV2VP3 유전자 전달체는 500배로 희석한 #5 혈청존재하에서 혈청이 없는 경우에 비해 50% 이상 유전자 전달이 저해된 반면, AAV5VP3 유전자 전달체의 경우에는 #5 혈청을 10배로 희석한 경우에도 유전자 전달이 저해받지 않았다. AAV1VP3 유전자 전달체의 경우는 AAV5VP3 경우에 비해 상대적으로 #5혈청 존재하에서 유전자 전달이 저해되었으나, AAV2VP3 유전자 전달체보다는 많이 유전자를 전달하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6). 따라서, 본 발명에서 제작한 헬퍼 플라스미드 pKSⅡ1VP3 및 pKSⅡ5VP3를 이용하여 AAV 유전자 전달체를 제작할 경우, 특히 pKSⅡ5VP3를 이용할 경우에는 AAV2에 대한 항체가 있더라도 치료 유전자를 전달할 수 있으며, AAV2 유전자 전달체를 1차적으로 사용한 후 반복 투여를 할 경우에 AAV5VP3 유전자 전달체를 이용하면 치료 유전자를 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 7> AAV2에 대한 항체 존재하에서의 AAV1VP3-GFP, AAV2VP3-GFP 및 AAV5VP3-GFP 유전자 전달체의 293세포들로의 유전자 전달능
본 발명자들은 헬퍼 플라스미드로서 pKSⅡ1VP3, pKSⅡ5VP3 존재하에서 제작한 AAV1VP3-GFP, AAV5VP3-GFP 유전자 전달체의 유전자 전달능이 AAV2에 대한 항체 존재하에서 영향을 받는지를 293 세포주를 대상으로 실시하였다.
동일한 유전체 수(genomic titer; 1 ×109)를 갖는 정제된 AAV2VP3-GFP, AAV1VP3-GFP 및 AAV5VP3-GFP 유전자 전달체 각각을 DMEM에 희석한 후, 이들을 단계적으로 희석한 사람의 #3 혹은 #5 혈청에 가하고, 전체 용량이 200 ㎕가 되도록 하였다. 293 세포를 24 웰 플레이트에 접종하여 웰 당 5 ×104 세포수가 되도록 배양하였다. 세포가 안정하게 부착된 뒤 10 mM이 되도록 하이드록시유레아를 배지에 첨가시켜 하룻밤 배양한 후, 상기에서 제조한 AAV유전자 전달체-혈청 혼합액을 각각의 웰에 가하여 37℃에서 1시간동안 형질도입시켰다. 상기 형질도입 1시간 후에 5%의 FBS가 들어있는 DMEM을 가하였다. 상기 반응 36시간 후에 재조합 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, 이하 'GFP'라 약칭함)를 발현하는 GFP 발현 세포를 형광 현미경에서 헤모사이토미터를 이용하여 계수하였다.
그 결과, 293 세포주에서의 형질 도입은 동일한 유전체 수를 사용한 경우 AAV2VP3, AAV1VP3, AAV5VP3의 순으로 형질 도입되었다. 전체적으로 사람의 혈청 #5가 존재할 때 AAV2-GFP 유전자 전달체들의 유전자 전달은 사람의 혈청 #3보다 현저하게 저하되었다. 이는 앞서 기술한 실시예 5의 결과와 유사하였다. 또한, 사람의 혈청 #3 혹은 #5 존재하에서 유전자 전달이 저해 받지 않는 유전자 전달체는 AAV5VP3-GFP, AAV1VP3-GFP, AAV2VP3-GFP의 순이었다(도 7). 따라서, 본 발명에서 제조한 pKSⅡ5VP3로 AAV유전자 전달체를 제작할 경우 AAV2에 대한 항체 존재하에서도 유전자를 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 8> 각종 세포로의 AAV1VP3-LacZ, AAV2VP3-LacZ 및 AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체들의 유전자 전달 효율
본 발명자들은 AAV 유전자 전달체들의 각종 세포로의 유전자 전달 효율을 검증하였다. 구체적으로, 유전자 전달능이 세포에 따라 증감되는 지를 알아보기 위하여 분리정제된 동일한 유전체 수(genomic titer; 1 ×108)를 갖는 AAV1VP3-LacZ, AAV2VP3-LacZ, AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체들 각각을 Cos-7, Renca(Sayers TJ et al., Cancer Res, 1990, 50, 5414-20), B16(f-1)(ATCC CRL-6323), B16(w)(KIST code M060, 한국생명공학연구원에서 구입) 세포에 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 형질 도입시켰다.
그 결과, AAV 유전자 전달체는 Cos-7 및 B16(w) 세포주에서는 형질 도입이 잘 되지 않았고, Renca 및 B16(f-1) 세포주에서는 형질 도입이 잘 되었다(도 8의 A).
또한, 동일한 유전체 수에서 AAV 유전자전달체들의 유전자 전달효율을 293세포과 Cos-7세포에서 정량적으로 조사한 결과, 신규로 제작한 AAV1VP3-LacZ는 293세포주에 효과적인 반면에 Renca세포에서는 유전자 전달효율이 불량하였으며, AAV5VP3-LacZ 유전자 전달체는 293세포로의 유전자 전달이 AAV2VP3-LacZ보다 다소 낮은 반면에 Renca 세포주에서는 AAV2VP3-LacZ보다 30% 정도 높았다(도 8의 B).
상기 결과로부터, 본 발명에서 제작한 AAV유전자 제작용 헬퍼 플라스미드들로 제조한 AAV1VP3 및 AAV5VP3 유전자 전달체는 미세하나마 AAV2 유전자 전달체와는 다른 세포 지향성을 나타내지만, 현저한 차이는 나타내지 않음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 이용하면 AAV 유전자 전달체를 용이하게 제조할 수 있으며, 상기에 의해 제조된 AAV 유전자 전달체는 AAV2에 대한 항체 존재하에서도 유전자를 효과적으로 전달할 수 있어, 암 및 유전질환과 같은 난치성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 AAV 유전자 전달체 제조에 유용한 헬퍼 플라스미드를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2는 본 발명에서 제조한 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드의 모식도이고,
도 3은 본 발명의 AAV 유전자 전달체를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4a는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드를 이용하여 제조한 AAV 유전자 전달체의 전달 효율을 분석한 것으로, AAV 유전자 전달체를 분리, 정제하여 서던 블랏으로 농도를 비교한 사진(a) 및 AAV 유전자 전달체 입자수를 정량화한 그래프(b)이고,
도 4b는 Cos-7 세포에 AAV 유전자 전달체를 형질 도입하여 효율을 나타낸 것으로, AAV 유전자 형질 도입된 외형 사진(a) 및 AAV 유전자의 형질 도입 수(b)를 나타낸 것이고,
도 5는 사람 혈청을 이용하여 AAV 혈청형2에 근거한 유전자 전달체의 유전자 전달을 중화하는 항체를 갖고 있는지를 검증하는 것으로, 사람 혈청 첨가시 AAV2 유전자 전달체의 형질 도입능을 비교한 그래프(A), #5 사람 혈청을 희석하여 첨가시 AAV2 유전자 전달체의 형질 도입능을 비교한 그래프(B) 및 사람 혈청에 존재하는 AAV2 유전자 전달체의 유전자 전달을 중화하는 항체를 확인한 웨스턴 블랏 사진(C)이고,
도 6은 AAV2 유전자 전달체의 유전자 전달을 중화하는 항체를 가진 #5 사람 혈청을 희석해 첨가시, AAV 혈청형1, 2 및 5에 근거한 유전자 전달체를 형질 도입한 세포의 사진이고,
도 7은 AAV2 유전자 전달체의 유전자 전달을 중화하는 항체를 가진 #3 및 #5 사람 혈청 존재하에서, AAV 혈청형1, 2 및 5에 근거한 유전자 전달체를 형질 도입하여 유전자 전달이 저해되는지를 비교한 그래프이고,
도 8은 AAV 혈청형1, 2 및 5에 근거한 유전자 전달체를 형질 도입하여 유전자 전달능을 나타낸 세포 사진(A) 및 Renca 세포 및 293 세포에 형질 도입된 유전자의 효율을 비교한 그래프(B)이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Helper plasmids for the preparation of AAV vector for gene delivery <130> 2p-08-05 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -20 primer <400> 1 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3 NheI antisense primer <400> 2 tctgccattg gtgcgccact gccgctagcc at 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3 NheI sense primer <400> 3 atggctagcg gcagtggcgc accaatggca ga 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3 EcoRV antisense primer <400> 4 agtcagatat ctggtgccaa tggggcgagg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3 EcoRV sense primer <400> 5 cctcgcccca ttggcaccag atatctgact 30 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 ggaaacagct atgaccatg 19

Claims (8)

  1. AAV 2의 Rep 및 Cap 유전자를 포함하는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드에 있어서, 상기 AAV2 Cap 유전자의 Vp3 단백질을 코딩하는 유전자가 AAV1 또는 AAV5 Cap 유전자의 Vp3 단백질을 코딩하는 유전자로 치환되는 것을 특징으로 하는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 헬퍼 플라스미드는 AAV2 Cap 유전자의 VP3 단백질을 코딩하는 유전자가 AAV1 Cap 유전자의 Vp3 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 도 2의 pKSII1VP3인 것을 특징으로 하는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 헬퍼 플라스미드는 AAV2 Cap 유전자의 VP3 단백질을 코딩하는 유전자가 AAV5 Cap 유전자의 Vp3 단백질을 코딩하는 유전자로 치환된 도 2의 pKSII5VP3인 것을 특징으로 하는 AAV 유전자 전달체 제조용 헬퍼 플라스미드.
  5. 삭제
  6. 제 1항의 헬퍼 플라스미드 및 외부유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환체.
  7. 제 6항에 있어서, 외부유전자는 암 또는 유전자 이상에 의해 발생하는 질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제 4항의 헬퍼 플라스미드를 도입한 대장균 형질전환체(수탁번호: KCTC 10338BP).
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000773A1 (en) * 1992-11-19 1997-01-09 Boss Systems, L.L.C. Linerless labeling system
WO2000028004A1 (en) * 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
KR20010082234A (ko) * 1998-10-20 2001-08-29 추후기재 표적 세포에 의한 인자 ｖｉｉｉ의 발현을 위한 아데노관련 벡터
US20020045264A1 (en) * 2000-03-14 2002-04-18 During Matthew J. Production of chimeric capsid vectors

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997000773A1 (en) * 1992-11-19 1997-01-09 Boss Systems, L.L.C. Linerless labeling system
KR20010082234A (ko) * 1998-10-20 2001-08-29 추후기재 표적 세포에 의한 인자 ｖｉｉｉ의 발현을 위한 아데노관련 벡터
WO2000028004A1 (en) * 1998-11-10 2000-05-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Virus vectors and methods of making and administering the same
US20020045264A1 (en) * 2000-03-14 2002-04-18 During Matthew J. Production of chimeric capsid vectors

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Virol. 2000 Oct;74(19):9281-93, Wobus CE *
J Virol. 2000 Sep;74(18):8635-47, Wu P *
Virology. 1999 Dec 20;265(2):274-85, Rabinowitz JE *

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