KR20240052746A - Kcnv2 유전자 요법 - Google Patents

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KR20240052746A
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Abstract

본원은 Kv8.2의 발현을 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터뿐만 아니라 본원에 개시된 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, KCNV2 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법을 포함하여, 본원에 개시된 발현 작제물 및 벡터를 사용하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 개시된 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

Description

KCNV2 유전자 요법
본 개시내용은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 망막 질환 치료를 위한 유전자 요법용 조성물 및 방법을 제공한다.
Kv8.2는 KCNV2에 의해 암호화된 전압 개폐 칼륨 채널 서브유닛이다. KCNV2 유전자는 염색체 9p24.2에 위치하며 545-아미노산 단백질을 암호화하는 2개의 엑손으로 구성된다. 해당 단백질은 간상체 및 원뿔체 광수용체 내부 분절(타원체 및 근양 영역)의 망막에서 발현되며, 인간, 마우스, 및 짧은꼬리원숭이(macaque)의 외부 분절에는 부재한다. Kv8.2는 간상체 및 원뿔체 내부 분절에서 발현되는 Kv2.1와 같은 기타 칼륨 서브유닛과 상호작용하며, 인간에서는 간상체에서는 발현되지 않지만 원뿔체에서는 발현되는 Kv2.2와 상호작용한다. Kv8.2는 Kv2 채널과 추가로 상호 작용하여 이의 생물물리학적 특성을 변경한다.
Kv8.2는 지금까지 인간 질병에 관여하는 유일한 칼륨 채널 서브유닛이다. Kv8.2의 변이/돌연변이는 "초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증"(CDSSR)로 공지된 중증 유전성 광수용체 이영양증을 유발한다. CDSSR의 증상은 시력 저하, 색각 결함, b파 진폭 상승을 포함한 망막전위도 반응의 변경을 포함한다.
따라서 KCNV2 돌연변이(CDSSR을 포함하되 이에 국한되지 않음)와 관련된 망막 질환의 치료를 위한 신규 요법이 시급히 필요하다.
일 양태에서 본 개시내용은 하기를 포함하는 발현 작제물을 제공한다:
(a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열, 및
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열;
여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
실시양태에서, 프로모터 서열은 CAG 또는 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 서열이다. 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8의 서열을 포함한다. 기타 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7의 서열을 포함한다.
실시양태에서, 발현 작제물은 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 발현 작제물은 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 추가로 포함한다. 실시양태에서, WPRE는 서열번호: 11과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나 서열번호: 11의 서열을 포함한다.
실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 WT KCNV2 유전자로부터의 코딩 서열(cds)이다. 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함하는 서열을 포함한다.
실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 KCNV2 유전자 서열이다. 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함하는 단백질을 암호화한다.
실시양태에서, 발현 작제물은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12를 포함한다.
실시양태에서, 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 실시양태에서, 발현 작제물은 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서 본 개시내용은 본원에 개시된 발현 작제물을 포함하는 벡터를 제공한다. 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다. 실시양태에서, 벡터는 AAV 혈청형 AAV2로부터 유래된 게놈을 포함한다. 실시양태에서, 벡터는 AAV7m8로부터 유래된 캡시드를 포함한다. 실시양태에서, 벡터는 AAV5로부터 유래된 캡시드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 망막 질환은 KCNV2 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관되어 있으며, 해당 방법은 대상체에게 벡터 또는 본원에 개시된 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 망막 질환은 초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증(CDSSR)이다.
또 다른 양태에서, KCNV2의 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 KCNV2의 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 광수용체에서 Kv8.2 수준의 증가를 필요로 하는 대상체의 광수용체에서 Kv8.2 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
실시양태에서, 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여된다. 개시된 방법의 실시양태에서, 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 주사된다.
도 1은 발현 작제물 pCAG-KCNV2 WT, pCAG-KCNV2 Opti, pRT-KCNV2 WT, 및 pRT-KCNV2 Opti의 개략도를 보여준다.
도 2는 qPCR에 의해 결정된 바와 같은 ARPE19 세포 내 KCNV2 WT 및 KCNV2 Opti에 대한 mRNA 수준과 비교하여 HEK293 세포 내 KCNV2 WT 및 KCNV2 Opti에 대한 mRNA 수준을 예시한다(형질감염 후 48시간).
도 3은 pCAG-GFP(가장 위쪽 줄), pCAG-KCNV2 Opti(가운데 줄), 및 pCAG-KCNV2 WT(가장 아래쪽 줄)로 형질감염된 ARPE19 세포의 Kv8.2 면역형광을 보여준다. 기준자=10μm.
도 4a 및 4b은 FACS에 의해 분석된 HEK293 세포로부터의 데이터를 보여준다. 도 4a 각각 pCAG-KCNV2 WT 및 pCAG-KCNV2 Opti 발현 작제물로 형질감염된 HEK293 세포에 대한 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 형광 강도(MFI)를 보여주는 FACS 데이터. 도 4b 비-형질감염 대조군 대 pCAG-KCNV2 WT 또는 pCAG-KCNV2 Opti 발현 작제물로 형질감염된 세포에서 Kv8.2-Alexa 488 양성 세포 집단의 비율을 보여주는 FACS 데이터. 코돈 최적화(Opti) 벡터 및 야생형(WT) 벡터 간에 Kv8.2 양성 세포 %에는 유의한 차이가 없었다.
도 5a 및 도 5b 형질도입된 ARPE19 세포 내 형질도입 효율을 보여준다. 도 5a는 2개의 감염 다중도(MOI)(세포당 평균 적분 밀도)에서 표시된 AAV5 벡터로 형질감염된 Kv8.2 면역표지된 ARPE19 세포 내 Kv8.2 형광 강도를 보여준다. 도 5b는 2MOI에서 표시된 AAV5 벡터를 사용한 형질도입 후 Kv8.2 양성이었던 DAPI 양성 ARPE19 세포의 비율을 보여준다.
도 6은 망막 오가노이드 형태(morphology)를 보여준다. 전체 망막 오가노이드의 실시간 명시야 이미징. 형질도입이 발생한 140일차의 WT(가장 위쪽 줄) 및 KCNV2 KO 망막 오가노이드의 전형적인 형태. 망막 오가노이드는 적층되어 있으며, 광수용체 외부 분절('솔 가장자리')과 때때로 망막색소상피(RPE) 클러스터를 갖는다. WT와 녹아웃(KO) 망막 오가노이드 간에는 총 형태학적 차이가 관찰되지 않았다.
도 7은 KCNV2 KO 망막 오가노이드(K28D5)에서의 유전자전이된 Kv8.2 발현을 보여준다. AAV7m8을 사용한 형질도입 3주 후 공초점 타일 스캔 분석. 신호는 가장 바깥쪽의 광수용체 세포층에서 감지된다. 기준자=100μm 및 10μm.
도 8은 내부 망막 세포의 AAV7m8 형질도입을 보여준다. Kv8.2 및 간상체 양극성 세포 마커 PKCa와 공동-염색된 형질도입된 망막 동결절편. WT 오가노이드는 ONL 외에 내부 핵층(INL)(외부 핵층(ONL)과 점선으로 구분됨)에 여러 개의 Kv8.2 양성 내부 망막 세포(화살표)를 포함하고 있는 반면, 대부분의 Kv8.2 양성은 형질도입된 세포는 외부 핵층에 있었다. 일부 Kv8.2 양성 광수용체 세포는 AAV7m8 RK-KCVN2 최적화 조건(*)의 ONL에서 볼 수 있었다 하더라도, pRK-KCNV2 벡터는 검출 가능한 Kv8.2 단백질(하단 패널)을 거의 생산하지 않았다. 기준자=10μm.
도 9는 RPE 세포의 AAV 형질도입을 보여준다. 광수용체 외에도 RPE 세포가 오가노이드 내에 존재한다. RPE는 생체내에서 볼 수 있듯이 광수용체 외부 분절에 인접한 평면 시트가 아닌 클러스터(화살표)로 존재한다. RPE는 극성화되어 이의 선단면(A)에서 CRALBP를 발현하고, 핵은 기저부에 위치한다(B). 망막 오가노이드 내에서 AAV를 효율적으로 형질도입한 RPE 세포는 세포질 전반에서 높은 수준의 Kv8.2가 검출된다. 대조적으로, AAV RK-KCNV2는 RPE 세포에서 검출 가능한 수준의 Kv8.2 발현을 생산하지 못했다.
도 10은 AAV5 pCAG-KCNV2-Opti, AAV5 pRK-KCNV2-Opti, AAV7m9 pCAG-KCNV2-Opti 및 AAV7m9 pRK-KCNV2-Opti를 이용한 뮬러 신경교세포(Muller Glia cell)의 형질도입을 보여준다. CRALBP는 신경 망막을 가로지르며 간상체 및 원뿔체 세포와의 긴밀한 접합을 통해 외부 제한막을 형성하는 뮬러 신경교세포를 염색한다. 뮬러 신경교세포는 광수용체 세포와 이의 가까운 근접성에도 불구하고 Kv8.2에 대해 공동 염색하지 않았다.
도 11은 유전자전이 Kv8.2 발현이 원형질막 및 광수용체 내부 분절에 국소화된다는 것을 보여준다. 로돕신 및 Kv8.2로 염색된 CAG 프로모터(CAG KCNV2-WT 및 7m8 CAG KCVN2 Opti)에 의해 유도되는 WT KCNV2 벡터 및 코돈 최적화된 7m8 AAV 벡터로 형질도입된 클론 K28(분화 5). 핵은 DAPI로 대조염색된다.
도 12는 광수용체 내부 분절에서 Kv2.1와 공동국소화되는 Kv8.2를 보여준다. WT 대 AAV5 CAG-WT 또는 AAV5 CAG-Opti 벡터로 형질도입된, 형질도입된 KCNV2 KO 오가노이드의 고배율 공초점 현미경 사진. 칼륨 채널 Kv2.1은 구형 내부 분절 구조의 원형질막에 국한되고, 벡터 유래 Kv8.2는 WT와 유사한 발현 패턴으로 내부 분절에서 공동 발현된다.
도 13a, 13b 및 13c는 WT, 대조군 및 형질도입된 망막 오가노이드의 TUNEL 염색을 보여준다. 도 13a 세포사멸의 지표인 DAPI 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL)으로 염색된 WT 망막 오가노이드 동결절편의 전체 공초점 타일 스캔(40x 확대). 망막 세포층(INL 및 ONL)에서는 TUNEL 반응성이 거의 또는 전혀 나타나지 않았지만, 오가노이드 중앙(점선 영역)과 망막 조직이 아닌 영역에서는 검출될 수 있었다. 도 13b 정성적으로, KCNV2 KO 오가노이드에서는 WT에 비해 TUNEL 반응성이 증가하지 않았고, AAV 7m8로 형질도입된 KO 오가노이드에서는 증가하지 않았다. 도 13c. 정량적으로, WT에 비해 KCNV2 KO 오가노이드에서 TUNEL 반응성이 증가하지 않았고, WT 또는 코돈 최적화된 KCNV2를 포함하는 AAV5 벡터로 형질도입된 KO 오가노이드에서 증가하지 않았다.
도 14는 AAV로 형질도입된 망막 오가노이드의 원뿔체 세포 수를 보여준다. LM 옵신 염색을 사용하여 표시된 벡터로 형질도입된 WT, KCNV2 KO 및 오가노이드에서 100μm당 평균 원뿔체 세포 수를 측정했다. 각 점은 하나의 7μm 망막 동결절편에서 원뿔의 수를 계수하는 형질도입된 오가노이드 하나를 나타낸다. 전체 오가노이드를 40x 배율로 이미지화하고 μm당 원뿔체 수를 계수하였다(오가노이드당 34개에서 483개까지 계수함). 모든 오가노이드는 원뿔체 세포의 분포가 양호했다. 비 형질도입된 KCNV2 KO 오가노이드는 WT 비편집 대조군보다 훨씬 더 많은 원뿔체 세포를 가졌다(p = 0.004, 짝을 이루지 않은 t-테스트). AAV 형질도입(모든 벡터 그룹화)은 WT에 비해 원뿔체 수를 감소시키지 않았지만(p=0.2), 비-형질도입된 것에 비해 원뿔체 수를 감소시켰다(p=0.02). 오차 막대=표준편차.
도 15a 및 15b는 qPCR에 의해 결정된 형질도입된 망막 오가노이드의 상대적인 mRNA 수준을 보여준다. 도 15a 2개의 상이한 버전의 KCNV2 유전자: 코돈 최적화 또는 WT의 발현을 유도하는 광수용체 특이적 RK 또는 구성적 CAG 프로모터를 포함하는 서로 다른 AAV 벡터로 형질도입된 KCNV2 KO 클론 K5, K12, K28에서의 KCNV2 발현. 비교를 위해 처리되지 않은 KO KCNV2 클론과 WT 동질유전자 대조군인 I5가 포함되어 있다. 그래프는 상이한 AAV 벡터, AAV5-CAG-KCNV2opti, AAV7m8-CAG-KCNV2opti, AAV5-RK-KCNV2opti 또는 AAV7m8-RK-KCNV2-Opti를 사용한 형질도입 후 21일차에 코돈 최적화된 KCNV2의 발현을 보여준다. 결과는 최저 발현 검체(AAV5 CAG-KCNV2-Opti)에 비해 KCNV2 mRNA 발현의 배수 변화로 표시된다. 도 15b 표시된 AAV 벡터를 사용한 형질도입 후 21일에 WT KCNV2의 발현을 보여주는 그래프. 결과는 동일한 KO 클론의 연령 일치 비형질도입된 대조군과 비교하여 WT KCNV2 mRNA의 배수 변화로 표시된다.
도 16a와 16b는 망막 오가노이드 면역 형광의 정량화를 보여준다. 도 16a는 외부 핵층(ONL)에서의 총 Kv8.2 형광을 보여준다. 막대 = 형질도입된 오가노이드의 평균 형광을 측정된 영역으로 정규화하여 WT 대조군 오가노이드의 % 형광으로 표시. 타일 스캔 이미지를 획득하여 ONL의 전체 길이에 걸쳐 형광 측정값을 얻었다. 점선은 비-형질도입된 KO 대조군 오가노이드의 평균 '배경' 신호를 나타낸다. 각 점은 하나의 오가노이드를 나타낸다. n=독립 실험에서 얻은 오가노이드 3-4개. 오차 막대=+/- SEM. 7m8과 AAV5 캡시드 모두에서 CAG와 RK 프로모터 간의 총 형광에 유의한 차이가 있었다(각각 p=0.031 및 0.028, 양방 검증, 쌍으로 구성된 스튜던트 t 검정). 코돈 최적화된(Opti) 벡터에서 형광 강도가 증가하는 경향에도 불구하고 CAG 또는 RK 프로모터가 있는 벡터에서 WT와 Opti 간에는 유의한 차이가 없었다. 도 16b는 형질도입된 KCNV2 KO, WT, AAV 7m8 Kv8.2 형질도입 오가노이드의 광수용체 층에서 나타나는 대표적인 면역 형광을 보여준다. Kv8.2 및 칼륨 채널 서브유닛 Kv.2.1, 원뿔체 Arrestin(Arr3) 및 핵을 DAPI로 염색한다. 기준자=10μm.
도 17은 형질도입된 오가노이드에서 Kv8.2와 Kv2.1의 상대적인 공동 위치를 보여준다. 오가노이드 동결절편은 Kv.2.1 및 Kv8.2로 공동 염색되었으며 전체 공동국소화 영역은 FIJI의 임계값 이미지에서 측정되었으며 오가노이드당 분석된 망막 길이로 정규화되었다. 결과는 비형질도입 대조군에 비해 변화 배수로 표시된다. 결과는 일원 분산 분석(one way ANOVA)과 Dunnett의 다중 비교 테스트를 통해 분석되었다. *p=0.02, **p=0.002.
도 18a, 18b, 18c는 형질도입된 오가노이드의 근접결합분석(PLA) 신호 특이성을 보여준다. 도 18a. 광수용체 내부/외부 분절이 위치한 외부 주변부의 망막 오가노이드에서 Kv2.1 및 Kv8.2 공동 염색(점)을 따르는 PLA 신호가 풍부하게 나타났다. 도 18b KCNV2 KO 오가노이드의 ONL(광수용체 층)에서는 PLA 신호가 거의 나타나지 않았다. 도 18c 오가노이드당 측정 영역(n=3개의 관심 영역(ROI))으로 정규화된 PLA (이미징된 J)의 정량화. WT(클론 K28 및 K12)에 비해 KCNV2 KO 광수용체에서 PLA 신호가 현저히 감소했다(p <0.03). 오차 막대 = SEM.
도 19는 형질도입된된 AAV5 및 AAV7m8 광수용체의 PLA 신호를 보여준다. 7μm 오가노이드 동결절편에서 최대 강도 투사의 63배이다. 광수용체 층(ONL)은 핵이 없는 외부 망상층 위의 DAPI 채널에서 볼 수 있는 독특한 소형 구조를 가지고 있다. PLA 신호(점)은 Kv.2.1/Kv8.2 단백질-단백질 상호작용을 나타낸다. PLA 신호는 광수용체 내부 분절(IS) 영역의 ONL 정점 가장자리에 집중되었다. 형질도입된 오가노이드는 IPSC 클론 K12에서 유래된 비 형질도입 KCNV2 KO 오가노이드보다 더 높은 PLA 신호 밀도를 가졌다.
도 20a 및 20b 2개의 형질도입된 망막 오가노이드 클론(각각 클론 12 및 클론 28)에서 PLA 누점의 정량화를 보여준다. 간상체는 측정된 영역으로 정규화된 시야당 ONL의 PLA 누점의 평균 수(100 내지 150개의 광수용체당 약 32개, 시야당 계수된 10 내지 600 누점)를 나타낸다. 오차 막대=SEM).
칼륨 전압 개폐 채널 조절제 서브패밀리 V 멤버 2(Kv8.2)(Potassium Voltage-Gated Channel Modifier Subfamily V Member 2 (Kv8.2))의 발현을 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터뿐만 아니라, KCNV2 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환을 치료하기 위한 발현 작제물, 바이러스 게놈 및 벡터를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
Kv8.2
Kv8.2는 전압 개폐 칼륨 채널 서브유닛이다. KCNV2 유전자는 염색체 9p24.2에 위치하며 545-아미노산 Kv8.2 단백질을 암호화하는 2개의 엑손을 포함한다. Kv8.2는 기능성 동종성 채널을 형성할 수 없지만 기타 칼륨 채널 서브유닛인 Kv2.1 및 Kv2.2와 상호 작용하여 생물물리학적 특성을 변경한다. Kv8.2는 지금까지 인간 질환에 연루된 유일한 침묵 서브유닛이다. 변이/돌연변이는 "초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증"(CDSSR)으로 알려진 중증 유전성 광수용체 이영양증을 유발한다.
KCNV2(Kv8.2)는 간상체 및 원뿔체 광수용체 내부 분절(타원체 및 근양 영역)의 망막 내에서 발현되며 인간, 마우스 및 짧은꼬리원숭이 내 외부 분절 내에는 부재한다. Kv8.2는 간상체 및 원뿔체 내부 분절 내에서 발현되는 Kv2.1 및 인간의 간상체가 아닌 원뿔체에서 발현되는 Kv2.2와 상호작용한다.
KCNV2(Kv8.2) 동형접합성 녹-아웃(KO) 마우스는 밝은 빛 자극에 대한 감소된 a-파 및 증가된 b-파 반응을 보이는 망막전위도(ERG)를 포함하여 인간 장애와 많은 유사점을 보여준다. KCNV2 KO 마우스는 원뿔체 세포 수의 감소(WT의 80%), 망막 전체에서의 TUNEL 양성 세포의 증가(1, 3 및 6개월령에서) 및 외부 핵층의 전반적인 얇아짐(6개월령에서 WT의 ONL 60%)을 나타낸다.
많은 중요한 광수용체 단백질의 정확한 세포이하의(sub-cellular) 위치는 이전에 입증되었다(예를 들어, 로돕신, RetGC, ABCA4는 간상체 외부 분절에 위치함; Bassoon, Ribeye는 시냅스 말단에 위치함). KCNV2 전사체의 존재가 단일 세포 RNA 서열에 의해 인간 망막 오가노이드 내에서 검출되었을 지라도, 인간 배아 줄기 세포(HESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(IPSC) 유래 인간 망막 오가노이드 내 칼륨 채널 서브유닛 Kv8.2, Kv2.1 및 Kv2.2의 존재는 아직 어떤 간행물에서도 조사되지 않았다. Kv8.2 및 이의 결합 파트너의 기능에 대한 문서화된 종별 차이(예를 들어, 마우스 망막 내 Kv2.2의 부재)로 인해 잠재적인 KCNV2 AAV 유전자 요법 개발에 있어 인간 세포 모델을 사용하는 것이 중요해지고 있다.
KCNV2의 돌연변이는 초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증(CDSSR)과 같은 광수용체 이영양증을 포함한 망막 질환을 유발할 수 있다. 해당 질환의 진단은 전기생리학적 평가에 의해 확립되며; 기능적 결과는 질병의 단계 및 개인의 연령에 따라 다르다. 예를 들어, CDSSR은 밝은 빛 자극에 대한 감소된 a-파 반응 및 증가된 b-파 반응을 보이는 망막전위도(ERG)와 연관이 있다. 원뿔체 이영양증의 진단은 원뿔체 세포 수 감소(정상의 약 80%)가 입증되면 뒷받침될 수 있다. 예를 들어, KCNV2 발현이 비정상적인 망막은 TUNEL 양성 세포가 증가하고 외부 핵층이 전반적으로 얇아질 수 있다(ONL, 정상의 60%).
발현 작제물
일 양태에서, 발현 작제물로서, (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열, 및 (b) 칼륨 전압 개폐 채널 조절제 서브패밀리 V 멤버 2(Kv8.2)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며; 여기서 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 발현 작제물이 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된"은 Kv8.2에 대한 코딩 서열과 인접한 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터) 및 Kv8.2의 발현을 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하는 발현 조절 서열 모두를 지칭한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 처리 및/또는 분비를 향상시키는 서열을 포함한다.
예를 들어 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 다수의 발현 조절 서열이 당업계에 공지되어 있으며 원하는 발현 유형에 따라 유전자의 발현을 유도하는데 활용될 수 있다. 진핵 세포의 경우, 발현 조절 서열은 전형적으로 프로모터, 인핸서, 및 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화(폴리 A) 서열은 Kv8.2를 암호화하는 서열 뒤와 3' ITR 서열 앞에 일반적으로 삽입된다. 본원에 개시된 방법에 유용한 rAAV의 또 다른 조절 구성요소는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 생산하는 데 사용될 수 있다. IRES(또는 기타 적합한 서열)는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 함유하는 단백질을 생산하거나 동일한 세포로부터 또는 동일한 세포 내에서 두 개의 서로 다른 단백질을 발현하는 데 사용된다. 예시적인 IRES는 광수용체, RPE 및 신경절 세포에서 전이유전자 발현을 지원하는 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 서열이다. 바람직하게는, IRES는 rAAV 벡터에서 Kv8.2를 암호화하는 서열의 3'에 위치한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 합성사이토메갈로바이러스 유래 프로모터 서열(CAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이며, 즉 프로모터는 광수용체 세포에서는 활성을 가지지만, 기타 세포 유형에서는 활성이 감소되거나 전혀 없다.
일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 WT KCNV2 유전자로부터의 코딩 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다.
일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함한다.
일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 전사후 조절 요소를 포함한다. 일 실시양태에서, 발현 작제물은 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11을 포함한다.
일 실시양태에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일 실시양태에서, 발현 작제물은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12를 포함한다.
벡터
일 양태에서, 전이유전자 또는 발현 작제물을 세포 내로 도입하기 위한 재조합 벡터 및 그의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 숙주 세포에서 DNA의 복제 및 적절한 수준의 표적 세포에서의 표적 유전자의 발현을 제공하는 DNA 분절을 포함하는 추가의 DNA 요소를 포함하는 재조합 DNA 작제물을 포함한다. 당업자는 발현 조절 서열(프로모터, 인핸서 등)이 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 촉진하는 능력에 기초하여 선택된다는 것을 인식하고 있다. 본원에 사용된 “벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비히클을 의미한다. 벡터의 비제한적 예에는 재조합 플라스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 미니 염색체, DNA 미니서클, 또는 바이러스(바이러스 유래 서열 포함)가 포함된다. 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 핵산을 포함하는 비리온을 지칭할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 바이러스 게놈을 포함하는 비리온을 지칭하며, 여기서 재조합 바이러스 게놈은 하나 이상의 ITR 및 전이유전자를 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터 또는 다수의 바이러스 벡터의 조합이다.
일 양태에서, 본원에 개시된 발현 작제물 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 제공된다.
일 양태에서, (a) 광수용체 세포 내 발현을 부여하는 프로모터 서열 및 (b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공되며, 여기서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 합성사이토메갈로바이러스 유래 프로모터 서열(CAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이다.
일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 WT KCNV2 유전자로부터의 코딩 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다.
Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함한다.
Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일인 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 벡터는 전사후 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11을 포함한다.
일 실시양태에서, 벡터는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 벡터는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12를 포함한다.
일 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, ITR 서열은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6을 포함한다.
일 실시양태에서, 벡터는 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) CAG 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) CAG 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 핵산 서열;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호:9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호:9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호:10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85% 적어도, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b)Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
바이러스 벡터
표적 세포, 조직, 또는 오가노이드 내 표적 유전자의 발현을 위한 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 합성 바이러스 벡터(예를 들어, 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스, 또는 유사형 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자, 또는 소분자를 함유하는 바이러스)를 포함한다.
AAV 벡터
아데노 연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 효율적인 복제를 촉진하기 위해 헬퍼 바이러스가 필요한 작은 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 4.7kb의 AAV 게놈은 두 개의 역말단 반복부(ITR)와 각각 Rep 단백질 및 Cap 단백질을 암호화하는 두 개의 오픈 리딩 프레임을 특징으로 한다. Rep 리딩 프레임은 분자량이 78kD, 68kD, 52kD 및 40kD 인 네 개의 단백질을 암호화한다. 해당 단백질은 주로 AAV 복제, AAV를 숙주 세포의 염색체로의 구조 및 통합을 조절하는 기능을 한다. Cap 리딩 프레임은 비리온 캡시드를 형성하는 분자량 85kD(VP1), 72kD(VP2) 및 61kD(VP3)의 세 개의 구조적 단백질을 암호화한다. AAV 비리온 내 전체 단백질 중 80% 이상이 VP3를 포함한다. 5' 및 3' 말단에서 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임 플랭킹(flanking)은 약 141bp 길이의 ITR이다. ITR은 AAV 복제, 구조, 패키징 및 AAV 게놈 통합에 필수적인 유일한 시스(cis) 요소이다. 전체 rep 및 cap 도메인은 잘라져 치료적 또는 리포터 전이유전자로 대체될 수 있다.
재조합 아데노 연관 바이러스 "rAAV" 벡터는 임의의 아데노 연관 바이러스 혈청형으로부터 유래된 임의의 벡터가 포함된다. rAAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 바람직하게는 Rep 및/또는 Cap 유전자를 가질 수 있지만 기능성 플랭킹 ITR 서열을 유지한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 rAAV 게놈 및 하나 이상의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 비리온이다. 일부 실시양태에서, rAAV 게놈은 본원에 개시된 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바이러스 벡터는 Kv8.2를 암호화하는 서열에 대해 각각 5' 및 3'에 위치한 AAV 5' ITR 및 3' ITR을 포함하는 핵산을 포함한다. 그러나 특정 실시양태에서, 핵산이 일렬로, 예를 들어 5'에서 3'으로 또는 선단에서 말단으로, 또는 또 다른 대안적인 구성으로 배열된 5' ITR 및 3' ITR 서열을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 기타 실시양태에서, 핵산이 ITR의 다중 카피를 함유하거나, Kv8.2를 암호화하는 서열에 대해 5' 및 3' 모두에 위치하는 5' ITR(또는 반대로, 3' ITR)을 갖는 것이 바람직할 수 있다. ITR 서열은 이종 분자의 바로 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있거나, 개재 서열이 있을 수 있다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구조, 복제 및 패키징을 제공하는 한 변경될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 삭제 또는 치환에 의함). ITR은 본원에 기술된 바와 같이 AAV2로부터, 또는 기타 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 예를 들어 AAV1(즉, AAV1 ITR 및 AAV1 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV2(즉, AAV2 ITR 및 AAV2 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV3(즉, AAV3 ITR 및 AAV3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV4(즉, AAV4 ITR 및 AAV4 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV5(즉, AAV5 ITR 및 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV6(즉, AAV6 ITR 및 AAV6 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV7(즉, AAV7 ITR 및 AAV7 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV8(즉, AAV8 ITR 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAV9(즉, AAV9 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAVrh74(즉, AAVrh74 ITR 및 AAVrh74 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), AAVrh.8(즉, AAVrh.8 ITR 및 AAVrh.8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV), 또는 AAVrh.10(즉, AAVrh.10 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 단백질을 포함하는 AAV)이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 하나의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 함유하는 위형화된 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 위형화된 AAV는 AAV2/5(즉, AAV2 ITR을 및 AAV5 캡시드 단백질을 함유하는 AAV)이다. 일부 실시양태에서, 위형화된 AAV는 AAV2/7m8(즉, AAV2 ITR 및 AAV7m8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV)이다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh74, AAVrh.8, 또는 AAVrh.10으로부터의 캡시드 단백질 중 하나 이상의 키메라를 함유하는 캡시드 단백질과 같은 재조합 캡시드 단백질을 함유한다. 실시양태에서, 캡시드는 AAV2 변이체 rAAV2-레트로(본원에 참조로 통합된 WO 2017/218842로부터의 서열번호: 44)와 같은 변이체 AAV 캡시드이다.
일 양태에서, (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열 및 (b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공되며, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 RK 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 7을 포함한다.
일 실시양태에서, 프로모터 서열은 CAG 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열번호: 8을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 광수용체 세포에 특이적이다.
일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 야생형 KCNV2유전자로부터의 코딩 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함한다.
일 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 코돈-최적화된 서열이다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호:10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, RetGC를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함한다.
일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 일부 실시양태에서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 13을 포함하는 단백질을 암호화한다.
일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 전사후 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 WPRE를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 서열번호: 11을 포함한다.
일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 폴리아데닐화 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 바이러스 게놈은 BGH-polyA 신호를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 12를 포함한다.
일 양태에서, 바이러스 게놈은 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)를 포함하는 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, ITR 서열은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 5' ITR 서열은 서열번호: 5를 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 3' ITR 서열은 서열번호: 6을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 서열번호: 1 내지 4의 임의의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) CAG 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) RK 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) 코돈 최적화된 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) CAG 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) 코돈 최적화된 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) WPRE;
(d) BGH-polyA 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) 코돈 최적화된 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a)서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) 코돈 최적화된 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 코돈 최적화된 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함함;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a)서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d)서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 9를 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호: 10을 포함함;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 7을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈이 제공된다:
(a) 서열번호: 8을 포함하는 프로모터 서열;
(b) Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 Kv8.2 단백질은 서열번호: 13을 포함하고, 여기서 Kv8.2 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결됨;
(c) 서열번호: 11을 포함하는 전사후 조절 요소;
(d) 서열번호: 12의 서열을 포함하는 폴리아데닐화 신호; 및
(e) 하나 이상의 ITR. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 2개의 ITR 서열을 포함한다.
아데노바이러스(AV) 벡터는 예를 들어 인간 아데노바이러스 2형 및 인간 아데노바이러스 5형에 기반한 벡터를 포함하며, E1 및 E3 영역의 결실을 통해 복제에 결함이 생기도록 만들어졌다. 전사 카세트가 E1 영역에 삽입되어 재조합 E1/E3 결실 AV 벡터가 수득될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 바이러스 코딩 서열을 함유하지 않는 헬퍼 의존성 고용량 아데노바이러스 벡터(고용량, "게놈이 없는(gutless)" 또는 "게놈이 제거된(gutted)" 벡터라고도 공지되어 있음)를 포함한다. 해당 벡터는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스-작용 요소, 주로 역말단 반복 서열(ITR) 및 패키징 신호(CY)를 포함한다. 해당 헬퍼 의존적인 AV 벡터 게놈은 수백 개의 염기쌍 내지 최대 대략 36kb의 외래 DNA를 운반할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
대안적으로, 렌티바이러스 벡터와 같은 기타 체계를 사용할 수도 있다. 렌티바이러스 기반 체계는 분열 세포뿐만 아니라 비분열 세포도 형질도입할 수 있어 예를 들어 CNS의 비분열 세포를 표적으로 하는 적용에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스에서 유래되었으며, 해당 바이러스와 마찬가지로 숙주 게놈에 통합되어 매우 장기적인 유전자 발현 가능성을 제공한다.
발현 카세트를 함유하는 표적 유전자를 운반하는 플라스미드, YAC, 미니염색체 및 미니서클을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 양이온성 지질, 중합체 또는 둘 모두를 운반체로 사용하는 비바이러스 벡터 체계에 의해 세포 또는 유기체에 도입될 수도 있다. 공액 폴리-L-리신(PLL) 중합체 및 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 체계도 벡터를 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 세포에 벡터를 전달하는 기타 방법은 유체역학적 주입 및 전기천공, 세포 배양 및 유기체 모두에 대한 초음파 사용을 포함한다. 유전자 전달을 위한 바이러스 및 비바이러스 전달 체계에 대한 검토는 본원에 참조로 통합된 Nayerossadat, N. 외(Adv Biomed Res. 2012; 1:27)를 참조한다.
rAAV 비리온 생산
본원에 개시된 rAAV 비리온은 당업자에게 공지된 재료 및 방법뿐만 아니라 본원에 기술된 재료 및 방법을 사용하여 구성 및 생산될 수 있다. 본 발명의 임의의 실시양태를 구성하는 데 사용되는 해당 공학적 방법은 핵산 조작에 있어 당업자에게 공지되어 있으며 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, 상기 인용된 Sambrook 외, Ausubel 외, 및 국제특허공보 제WO 95/13598호를 참조한다. 추가로, 아데노바이러스 캡시드 내에서 rAAV 카세트를 생산하는 데 적합한 방법은 미국 특허 제5,856,152호 및 제5,871,982호에 기술되어 있다.
간단히 말해서, rAAV 게놈을 rAAV 비리온으로 패키징하기 위해서는 숙주 세포는 AAV rep 및 AAV cap 또는 이의 기능적 단편뿐만 아니라 AAV 생산에 필요한 헬퍼 유전자를 발현하는 데 필요한 서열을 포함해야 한다. AAV rep 및 cap 서열은 본원에 확인된 바와 같이 AAV 공급원으로부터 획득된다. AAV rap 및 cap 서열은 당업자에게 공지된 임의의 방식으로 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 여기에는 형질감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA 코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 일 실시양태에서, rap 및 cap 서열은 하나 이상의 핵산 분자에 의해 숙주 세포로 형질감염되고 세포 내에서 에피솜으로서 안정적으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, rep 및 cap 서열은 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 또 다른 실시양태에서는, rep 및 cap 서열이 숙주 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 예를 들어, 해당 형질감염에 유용한 핵산 분자는 5′ 내지 3′의 프로모터, 프로모터와 rep 유전자 서열의 시작 부위 사이에 개재된(interpose) 선택적 스페이서, AAV rep 유전자 서열 및 AAV cap 유전자 서열을 포함한다.
rep 및 cap 서열은 이의 발현 조절 서열과 더불어 단일 벡터로 공급되거나, 각 서열이 이의 자체 벡터로 공급될 수 있다. 바람직하게는, rep 및 cap 서열은 동일한 벡터로 제공된다. 대안적으로, 숙주 세포에 도입될 것인 기타 DNA 서열을 함유하는 벡터로 rep 및 cap 서열이 공급될 수도 있다. 바람직하게는, 해당 작제물에 사용되는 프로모터는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 구성적, 유도성 또는 천연 프로모터일 수 있다. rep 및 cap 단백질을 제공하는 분자는 해당 구성요소를 숙주 세포로 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 해당 분자는 플라스미드 형태이며, 마커 유전자와 같은 기타 비바이러스 서열을 함유할 수 있다. 해당 분자는 AAV ITR을 함유하지 않으며 일반적으로 AAV 패키징 서열을 함유하지 않는다. 상동 재조합의 발생을 피하기 위해 이 플라스미드에서는 기타 바이러스 서열, 특히 아데노바이러스의 서열을 피한다. 해당 플라스미드는 세포에 안정적으로 형질감염될 수 있도록 구성되는 것이 바람직하다.
rep 및 cap을 제공하는 분자는 숙주 세포에 일시적으로 형질감염될 수 있지만, 숙주 세포는 숙주 세포 내 기능적 rep 및 cap 단백질을 발현하는 데 필요한 서열로, 예를 들어 에피솜으로 또는 숙주 세포의 염색체에 통합하여 안정적으로 형질도입되는 것이 바람직하다. 이렇게 안정적으로 형질감염된 숙주 세포의 발현을 조절하는 프로모터에 따라, rep/cap 단백질은 일시적으로 발현될 수 있다(예를 들어, 유도성 프로모터의 사용을 통해).
본 발명의 실시양태를 구성하기 위해 이용되는 방법은 상기 참고문헌에 기술된 것과 같은 통상적인 유전 공학 또는 재조합 공학 기술이다. 예를 들어, rAAV는 제조업체의 지침에 따라 인산칼슘 방법(Clontech) 또는 Effectene 시약(캘리포니아주 ㅎ 소재 Qiagen)을 사용하는 삼중 형질감염 방법을 활용하여 생산될 수 있다. 또한 이하의 실시예에서 사용된 방법에 대해서는 전이유전자, CPA-RPE65, AAV rep 및 cap을 함유하는 헬퍼 플라스미드, E2A, E4Orf6 및 VA의 아데노바이러스 헬퍼 기능을 공급하는 플라스미드를 갖는 플라스미드를 이용하는 Herzog 외, 1999, Nature Medic., 5(1):56-63를 또한 참조한다. 본원은 특정 작제물의 예시적인 실시예를 제공하지만, 당업자는 본원에 제공된 정보를 사용하여 스페이서, 프로모터 및 적어도 하나의 번역 개시 및 종결 신호와 폴리아데닐화 부위의 선택적 추가를 포함한 기타 요소를 선택하여 기타 적합한 작제물을 선택하고 설계할 수 있다.
이어서, rAAV 비리온으로 패키징될 rAAV 게놈, AAV rep 서열 및 AAV cap 서열을 함유하는, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 바이러스를 함유하는 숙주 세포를, 이들의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 배양하여 rAAV 비리온이 생산된다. 적합한 바이러스 헬퍼 유전자, 예를 들어, 아데노바이러스 E2A, E4Orf6 및 VA와 같은 다른 가능한 헬퍼 유전자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로, 바람직하게는 별도의 플라스미드 상에서 배양에 제공될 수 있다. 그 후, 전이유전자의 발현을 지시하는 재조합 AAV 비리온은 오염성 헬퍼 바이러스 또는 WT AAV가 부재한 상태에서 세포 또는 세포 배양으로부터 단리된다.
KCNV2 유전자의 발현은 당업계에 공지된 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 시험관내에서 감염될 수 있고, 세포 내 전이유전자의 카피 수는 서던 블롯팅(Southern blotting) 또는 정량 중합효소 연쇄반응법(PCR)으로 모니터링될 수 있다. RNA 발현 수준은 노던 블롯팅(Northern blotting) 또는 정량 역전사효소(RT)-PCR(qPCR)로 모니터링될 수 있으며; 단백질 발현 수준은 웨스턴 블로팅(Western blotting), 면역조직화학, 효소결합면역흡착검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 또는 하기 실시예에서 상세히 설명하는 특정 방법을 통해 모니터링될 수 있다.
약학적 조성물
본원에는 본원에 개시된 임의의 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
Kv8.2를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 AAV는 바람직하게는 통상적인 방법에 의해 오염을 평가한 후 환자에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물로 제형화된다.
해당 제형물은 적절한 생리학적 수준에서 pH를 유지하기 위해 약학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 비히클 또는 담체, 특히 완충 식염수 또는 예를 들어, HEPES인 기타 완충제와 같은 망막하 주사에 적합한 것의 사용을 포함한다.
본 발명의 벡터는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 해당 조성물은 벡터 이외에 약학적 및/또는 생리학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 또는 당업자에게 잘 공지된 기타 첨가제를 포함할 수 있다. 해당 물질은 독성이 없어야 하고 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 약학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 추가 담체는 본원에 참고로 통합된 국제특허공보 제WO 00/15822호에 제공되어 있다. 생리 식염수 용액, 염화마그네슘, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에 플루론산(PF68) 0.001%과 같은 계면활성제가 사용될 수 있다. 일부 경우에 링거 주사(Ringer's Injection), 유산을 가한 링거 주사(Lactated Ringer's Injection), 또는 하트만 용액(Hartmann's solution)이 사용된다. 요구에 따라 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
지연 방출을 위해, 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 생체적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캡슐 내 또는 리포솜 담체 체계 내와 같은 서방형을 위해 제형화된 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
바이러스를 장기간 보관할 경우 글리세롤이 존재하는 상태에서 냉동될 수 있다.
치료 방법
KCNV2 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 관련된 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본원에 개시된 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 본원에서는 망막 질환의 치료가 필요한 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 벡터가 제공되며, 여기서 망막 질환은 KCNV2 유전자의 하나 이상의 돌연변이와 연관되어 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 KCNV2에 돌연변이를 보유한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "포유동물"은 인간, 실험 동물, 가정용 애완동물, 및 농장 동물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 포유동물은 인간 또는 소, 말, 개, 양, 또는 고양이 등과 같은 비-인간 포유동물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 개인 및 환자도 본원의 대상체이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다(treat)", "치료된(treated)", "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리학적 병태, 장애 또는 질환을 늦추거나(완화하거나) 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상의 완화; 병태, 장애 또는 질환의 정도 감소; 병태, 장애 또는 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 병태, 장애 또는 질환의 발병 지연 또는 진행 늦춤; 병태, 장애 또는 질환 상태의 개선; 및 관해(부분적 또는 전체적을 불문함), 또는 병태, 장애 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 이끌어내는 단계를 포함한다. 치료는 치료를 받지 않을 시에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것도 포함한다. 용어 "예방하다(prevent)", "예방(prevention)" 등은 질병 또는 장애가 명백히 발병하기 전에 질병 또는 장애가 발달하는 것을 방지하거나 질병 또는 장애의 정도를 최소화하거나 발병 과정을 늦추기 위해 행동하는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 망막 질환은 원뿔체 이영양증이다. 일 실시양태에서, 망막 질환은 초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증(CDSSR)이다.
일 양태에서, 하기를 포함하는 방법이 제공된다:
대상체가 KCNV2 유전자 내 돌연변이를 갖고 있는지 여부를 결정하는 단계; 및
대상체가 KCNV2 유전자 내 돌연변이를 갖고 있을 시, 대상체에게 본원에 개시된 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계.
투여 경로 및 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 직접적인 망막, 망막하 또는 유리체내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 투여된다.
본 발명의 벡터의 용량은 다양한 파라미터, 특히 치료 대상 환자의 연령, 체중 및 병태, 특정 안구 질환 및 질환이 진행성인 경우 그 질환이 발달한 정도, 투여 경로 및 요구되는 레지멘에 따라 결정될 수 있다. 다시 말하지만, 의사는 임의의 특정 환자에게 요구되는 투여 경로 및 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 프로모터 서열의 조절하에 원하는 전이유전자를 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 rAAV의 유효량은 약 1×109 내지 2×1012 rAAV 게놈 입자 또는 1×1010 내지 2×1011 게놈 입자 범위가 바람직하다. 게놈 입자는 (실시간 PCR과 같은) 서열 특정 방법으로 정량화될 수 있는 단일 가닥 DNA 분자를 함유하는 AAV 캡시드로 본원에 정의된다. 일부 실시양태에서, 약 1×109 내지 2×1012 rAAV 게놈 입자는 약 150 내지 약 800μl의 부피로 제공된다. 일부 실시양태에서, 약 1×1010 내지 2×1011 rAAV 게놈 입자는 약 250 내지 약 500μl의 부피로 제공된다. 여전히 해당 범위 내 기타 투여량은 주치의가 선택할 수 있다.
용량은 단회 용량으로 제공될 수 있지만, 다른 눈에 대해 반복될 수 있거나 벡터가 (수술 합병증과 같은) 어떠한 이유로 망막의 정확한 영역을 표적으로 삼지 못하는 경우에는 반복될 수 있다. 치료는 바람직하게는 각 눈에 대한 단일 영구 치료이지만, 예를 들어 향후 몇 년 내 및/또는 상이한 AAV 혈청형을 사용한 반복 주사가 고려될 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 약학적 조성물의 다회 "부스터" 투여량을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 안구 표적 세포 내부의 전이유전자의 기간에 따라, 6개월 간격으로 또는 첫 번째 투여 후 매년 부스터 투여량을 전달할 수 있다. 해당 부스터 투여량 및 그에 대한 필요성은 예를 들어 당업계에 공지된 망막 및 시각 기능 테스트 및 시각 행동 테스트를 사용하여 주치의에 의해 모니터링될 수 있다. 기타 유사한 테스트를 사용하여 시간 경과에 따른 치료받은 대상체의 상태를 확인할 수 있다. 주치의가 적절한 테스트를 선택할 수 있다. 여전히 대안적으로, 본원에 개시된 방법은 WT 망막에서 발견되는 수준에 가까운 시각 기능 수준을 허용하기 위해 단일 또는 다중 감염에서 더 많은 부피의 벡터 함유하는 용액을 주사하는 것을 포함할 수도 있다.
추가 방법
일 양태에서, 본원에 개시된 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, Kv8.2의 발현을 증가시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 Kv8.2의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 일 양태에서, 세포 내 Kv8.2의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 해당 방법은 세포를 본원에 개시된 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다.
제조 물품 및 키트
또한, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 양태에서, 키트는 적합한 패키징에 본원에 기술된 조성물(예를 들어, Kv8.2 코딩 서열의 전달을 위한 조성물)을 포함한다. 본원에 기술된 (주사용 안구 조성물과 같은) 조성물에 적합한 패키징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 (밀봉된 바이알과 같은) 바이알, 용기, 앰플, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 밀봉된 비닐봉지)을 포함한다. 해당 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 해당 키트는 본원에 기술된 용도와 같이 조성물을 사용하는 방법에 대한 지침(들)을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 조성물의 투여를 수행하거나 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 키트는 표적 세포에서 Kv8.2 단백질의 발현을 위한 KCNV2 전이유전자를 포함하는 rAAV, 주사에 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 주사를 수행하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물을 포함한다.
본 발명은 기술된 특정 분자, 조성물, 방법론, 또는 프로토콜에 국한되지 않는 것으로 이해되어야 하며, 이는 다양할 수 있기 때문이다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시양태를 실행하거나 테스트하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원의 본 발명의 개시 내용은 해당 특정 특징의 모든 가능한 조합을 포함한다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 특징이 본 발명의 특정 양태 또는 실시양태, 또는 특정 청구항의 맥락에서 개시되는 경우, 해당 특징은 또한 본 발명의 기타 특정 양태 및 실시양태와의 조합 및/또는 맥락에서, 그리고 일반적으로 본 발명 내에서 가능한 정도까지 사용될 수 있다.
2개 이상의 정의된 단계를 포함하는 방법에 대해 본원에서 언급되는 경우, 정의된 단계는 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있으며(문맥상 그러한 가능성이 배제되는 경우 제외), 방법은 수행되는 하나 이상의 기타 단계를 포함할 수 있다. 정의된 단계 이전, 정의된 두 단계 사이 또는 정의된 모든 단계 이후(컨텍스트에서 해당 가능성을 배제하는 경우 제외).
기타 참조된 모든 특허 및 출원은 그 전체가 본원에 참조로 통합되어 있다. 또한, 본원에 참조로 포함된 참고문헌의 용어 정의 또는 사용이 본원에 제공된 해당 용어의 정의와 일치하지 않거나 상반되는 경우, 본원에 제공된 해당 용어의 정의가 적용되며 참고문헌의 해당 용어의 정의는 적용되지 않는다.
본 발명의 이해를 보다 촉진하기 위해, 하기의 구체적인 실시양태가 주어진다. 하기의 실시예는 본 발명의 전체 범위를 제한하거나 정의하는 것으로 읽혀서는 안 된다.
실시예
실시예 1: AAV-KCNV2 발현 작제물 설계 및 생산
먼저, KCNV2 cDNA 또는 코돈 최적화된 KCNV2 cDNA가 유비쿼터스 CAG 프로모터 또는 광수용체 특이적 RK1 프로모터의 AAV 단일 가닥 백본 다운스트림에 클로닝되었다. Kozak 공통 서열은 프로모터와 전이유전자 사이에 배치되었다. 우드척 간염 바이러스 돌연변이 6(WPREm6) 서열을 전이유전자 및 폴리A 사이에 배치했다. 폴리A 서열은 소 성장 호르몬 폴리A(BghpA) 서열이었다. 4개의 발현 작제물의 도식적 표현은 도 1을 참조한다. 클로닝은 VectorBuilder, Inc.(미국 일리노이주 시카고)에서 수행되었다. 플라스미드를 수령한 후 Genewiz(미국 뉴저지주 사우스 플레인필드)에서 완전한 시퀀싱(ITR 영역 포함)을 수행하고 Snapgene(미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하여 시퀀스를 플라스미드 맵에 정렬했다. 4개의 작제물은 HEK293 T 세포 내 삼중 형질감염에 의해 AAV5 및 7m8 캡시드로 패키징되었고 SignaGen 실험실(미국 메릴랜드주 프레더릭)에서 염화세슘 원심분리에 의해 정제되었다.
실시예 2: 세포주 내 형질감염에 의한 CAG 발현 작제물의 검증.
전이유전자 발현 작제물을 검증하기 위해, HEK293 및 발생하는 망막색소상피(ARPE19) 세포를 표준 핵감염 기법을 사용하여 형질감염시켰다. 처음에, CAG 프로모터(pCAG-KCNV2 WT 및 pCAG-KCNV2 Opti)의 조절 하에 각각 WT KCNV2 유전자 또는 코돈 최적화된 KCNV2 유전자를 포함하는 발현 작제물로 세포를 형질감염시켰다. 녹색 형광 단백질(GFP) 전이유전자 및 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(CMV-GFP)를 포함하는 발현 플라스미드를 대조군으로 사용했다. 발현은 qPCR, 면역형광법 및 FACS에 의해 검증되었다.
qPCR에 의한 CAG 발현 작제물의 검증.
KCNV2 WT 및 KCNV2 Opti mRNA 수준은 각각 pCAG-KCNV2 WT 또는 pCAG-KCNV2 Opti 발현 작제물을 사용하여 HEK293 또는 ARPE19 세포의 각 핵감염 후 48시간 째에 평가되었다. WT 및 Opti 전사체를 검출하도록 설계된 TAQMAN 프라이머 프로브 세트를 사용하여 qPCR에 의해 mRNA 수준을 결정했다. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 GAPDH 및 β 액틴에 대해 정규화되었다. 두 발현 플라스미드는 모두 두 세포주 모두에서 검출 가능한 KCNV2 mRNA를 생산했다. 동일한 양의 플라스미드 DNA의 형질감염에도 불구하고, ARPE19는 48시간 째에 HEK293 보다 WT 및 Opti 전사체 모두가 적었으며 이는 형질감염 효율이 더 낮음을 시사한다(도 2). Opti 및 WT 전사 수준은 프라이머 쌍 간의 증폭 효율 차이로 인해 해당 분석에서 직접 비교할 수 없다.
면역형광법에 의한 CAG 발현 작제물의 검증.
ARPE19 세포를 각각 pCAG-KCNV2 WT 및 pCAG-KCNV2 Opti 발현 작제물로 핵감염 시켰다. ARPE19 세포는 또한 Lonza Biosciences(미국 노스캐롤라이나주 모리스빌)의 pmaxGFP(CAG 프로모터에 의해 지시되는 GFP) 발현 작제물을 대조군으로 사용하여 형질감염되었다. Kv8.2 단백질은 KCNV2 토끼 다클론성 1차 항체(Sigma Aldrich #HPA031131, 1:100)와 당나귀 항토끼 Alexa Fluor 555 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 두 KCNV2 발현 플라스미드 모두로 형질감염된 특정 ARPE19 세포는 면역형광법으로 검출 가능한 Kv8.2 단백질을 생산했다(도 3). 많은 ARPE19 세포에서 Kv8.2 단백질이 검출되지 않은 것으로 보아 감염 수준은 낮았다. Kv8.2 단백질은 세포막과 세포질에 국소화되어 있다.
형광-활성화된 단일 세포 분류(FACS)를 통한 CAG 발현 작제물의 검증
HEK293 세포를 3.5μg pCAG-KCNV2 WT 또는 pCAG-KCNV2 Opti 발현 작제물로 형질감염시키고 48시간 후에 수확하였다. pCMV-GFP 발현 작제물을 대조군으로 사용했다. 세포를 Kv8.2 1차 항체(Sigma Aldrich #HPA031131, 1:100) 및 Alexa Fluor 488 항-토끼 항체를 사용하여 현탁액에서 염색하였다. 세포 집단은 형질감염되지 않은 대조군과 비교하여 게이팅(gated)되었다(도 4). 48시간 째에 WT 대 코돈 최적화된 플라스미드에서 Kv8.2 발현 세포의 수에는 유의한 차이가 없었다(n=3개의 독립 실험).
중앙 형광 강도(MFI)를 사용하여 형질감염된 세포에서 Kv8,2 단백질 발현 수준을 정량화했다. 48시간 째에 KCNV2 WT 대 KCNV2 Opti 발현 작제물에서 Kv8.2/Alexa Fluor 488 염색된 세포의 형광 중앙값 간에는 유의한 차이가 없었다(n=3개의 독립 실험).
실시예 3: ARPE19 세포 내 발현 작제물의 AAV 형질도입
AAV5 KCNV2 벡터(CAG-KCNV2 WT, CAG-KCNV2 Opti, RK-KCNV2 WT, 및 RK-KCNV2 Opti)를 챔버 슬라이드 상의 ARPE19 세포에 두 번의 다중 감염(MOI)(세포당 1E4 벡터 게놈(VG) 및 세포당 1E5 VG)에서 형질도입하고 21일 후 고정했다. Kv8.2 1차 항체 및 Alexa Fluor 555 2차 항체로 염색된 세포를 공초점으로 이미지화했다. 조건당 세개의 이미지(세개의 웰에서)를 촬영하고 FIJI 내에서 분석하기 전에 블라인드 처리했다(이미지 J). Kv8.2 발현 세포의 비율은 DAPI와 비교하여 점수를 매겼고 Kv8.2 발현 세포의 평균 염색 강도(통합된 밀도)는 FIJI 내에서 정량화했다(이미지 J).
AAV(Opti 및 WT)를 발현하는 CAG 프로모터는 RK(Opti 및 WT)보다 Kv8.2 발현 세포의 비율 및 Kv8.2 염색 강도 수준에서 더 높은 점수를 받았다. CAG Opti 및 CAG WT 벡터는 가변성이 높았음에도 불구하고 두 MOI 모두에서 Kv8.2 발현 세포 내 염색 강도 수준이 유의하게 상이하지 않았다. CAG Opti는 1E4 병태에서 훨씬 더 많은 Kv8.2 양성 세포를 가졌으나 1E5에서는 그렇지 않았다(도 5).
실시예 4: 오가노이드 내 발현 작제물의 AAV 형질도입
발현 작제물을 이용한 오가노이드의 AAV 형질도입 방법
망막 오가노이드를 96웰 저부착 플레이트(웰당 1개의 오가노이드)로 옮기고 140일차에 총 100μL의 배지 내 오가노이드 당 3E11 바이러스 게놈(VG)의 용량으로 8개의 AAV KCNV2 작제물(AAV5 CAG-KCNV2 WT, AAV5 CAG-KCNV2 Opti, AAV5 RK-KCNV2 WT, AAV5 RK-KCNV2 Opti, AAV7m8 CAG-KCNV2 WT, AAV7m8 CAG-KCNV2 Opti, AAV7m8 RK-KCNV2 WT 및 AAV7m8 RK-KCNV2 Opti) 중 하나를 사용하여 형질도입했다. 다음날, 오가노이드를 24웰 저부착 플레이트로 옮기고 3일 후에 배지를 교체했다. 형질도입을 위한 망막 오가노이드는 형태를 기준으로 선택되었고; 면역형광법에 의한 고정 및 분석을 위해 명확한 적층된 구조 및 눈에 보이는 외부 분절 솔 가장자리(도 6)의 존재를 선택했다. 내부 로제트 구조(광수용체가 내부 구조에 존재하는)를 가진 오가노이드를 qPCR 분석을 위해 형질도입하여 전체 오가노이드의 mRNA를 검정했다.
전체 오가노이드를 급속 냉동(qPCR 및 웨스턴 블롯)하거나 4% 파라포름알데히드(PFA)에 4℃에서 30분간 고정하여 수확하기 전에 오가노이드를 추가로 3주 동안 배양했다. 다음으로, 오가노이드를 표준 인산염 완충 식염수 용액(PBS)에서 두 번 세척한 후 4℃에서 밤새 30% 수크로스를 포함하는 PBS에 담갔다. 다음 날, 오가노이드를 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 삽입하고-80℃에서 보관한 후 7μm로 동결절편화했다.
KCNV2 KO 오가노이드의 각 형질도입에는 동일한 클론 및 분화 배치로부터의 비형질도입된 대조군과 WT(비CRISPR 편집된) 대조군이 포함되었다.
광수용체 세포의 최외곽층에서의 AAV7m8 KCNV2 형질도입
AAV 형질도입 3주 후 KCNV2 KO 망막 오가노이드를 절편화하고 전이유전자 KCNV2 단백질 생성물 Kv8.2에 대해 검정했다. 전체 망막 오가노이드의 공초점 분석은 KCNV2 WT 및 KCNV2 코돈 최적화된 벡터가 모두 최외곽층의 광수용체 층에서 발현되었음을 나타내었다(도 7).
내부 망막 세포의 AAV7m8 KCNV2 형질도입
형질도입된 오가노이드의 내 내부 망막층에는 검출 가능한 Kv8.2 생성물이 거의 없었다. 양극성 세포 마커 PKCa와 공동 염색한 결과, Kv8.2 염색을 통해 PKCa 양성 양극성 세포가 드러나지 않았지만, WT 망막 오가노이드에는 무축삭, 수평 또는 원추형 양극성 세포일 가능성이 있는 Kv8.2에 면역 양성인 내부 망막 세포(흰색 화살표 도 7)가 여러 개 있었다. 대조적으로, 형질도입된 KCNV2 KO 망막 오가노이드는 CAG 프로모터 함유 벡터에서 형질도입된 광수용체에서 높은 발현에도 불구하고 Kv8.2 양성 내부 망막 세포가 거의 없었으며(도 8), 이는 AAV가 해당 층에 접근할 수 없고/거나 광수용체 세포에 선호되는 벡터 친화성을 나타낸다.
망막색소상피(RPE) 세포의 AAV7m8 KCNV2 형질도입
색소성 RPE 세포 및 광수용체는 동일한 발달 전구 세포 집단에서 유래한다. 생체내에서 RPE 단층은 망막하 공간의 경계를 정의하는 광수용체 외부 분절에 인접해 있다. 망막 오가노이드 내 RPE 세포는 오가노이드의 외부 표면 상에 클러스터로 배열된다(도 9, 왼쪽 패널). 존재하는 경우, RPE 세포는 AAV5 및 7m8 둘 모두에 의해 형질도입되었고 CAG-KCVN2는 높은 수준의 Kv8.2 단백질을 발현했다. RK-KCNV2는 RPE 세포 내에서 검출 가능한 Kv8.2를 발현하지 않았는데, 이는 아마도 RK 프로모터의 광수용체 특이성 때문일 것이다.
뮬러 신경교세포의 AAV7m8 KCNV2 형질도입
뮬러 신경교세포는 망막의 전체 두께에 걸쳐 건축학적 지지를 제공하고 외부 및 내부 제한막을 형성한다. RPE 세포 외에도 CRALBP는 내부 및 외부 핵층에 걸쳐 외부 제한막을 형성하는 것으로 볼 수 있는 망막 오가노이드 내 뮬러 신경교세포에 대한 마커이다. Kv8.2를 사용한 CRALBP와의 공동 염색은 해당 두 마커의 공동 염색을 드러내지 않았으며, 이는 AAV5 및 AAV7m8이 뮬러 신경교세포에서 전이유전자를 형질도입하고/거나 발현한다는 것을 시사한다(도 10).
실시예 5: AAV7m8 KCNV2 형질도입된 세포 내 Kv8.2 국소화
광수용체 내부 분절 내 Kv8.2 국소화
내인성 KCNV2(Kv8.2) 단백질은 간상체 및 원뿔체 내부 분절의 원형질막에서 발현되고 외부 분절에서는 발현되지 않는 것으로 보고되었다. 광수용체 단백질을 정확한 세포내 구획으로 트래픽킹(trafficking)하는 것은 그의 기능에 매우 중요하며, 부정확하게 폴딩된 단백질을 잘못 트래픽킹하는 것은 많은 유전성 망막 퇴행성 장애의 병인의 기초가 된다.
형질도입된 망막 오가노이드는 로돕신으로 염색되었으며, 이는 막성 외부 분절 구조에 정확하게 국소화하는 것으로 밝혀졌다. 전이유전자 kv8.2(7m8 CAG-WT 및 7m8 CAG-Opti)는 광수용체 세포체의 내부 분절(IS) 및 원형질막에 국소화되는 것으로 밝혀졌다(도 11). Kv8.2 염색은 외부 분절(OS)에는 부재했다. 이는 WT 및 코돈 최적화된 벡터 모두에서 생성된 단백질이 번역 후 적정하게 트래피킹된다는 것을 의미한다.
AAV7m8 KCNV2 형질도입된 세포 내 Kv2.1과 Kv8.2 공동국소화
KCVN2 유전자 생성물 Kv8.2는 망막 내 칼륨 채널 서브유닛 Kv2.1과 상호 작용한다. Kv8.2는 침묵 Kv 채널 서브유닛이므로 더 큰 Kv 채널 서브유닛과의 상호 작용을 통해서만 기능할 수 있다. WT 망막 오가노이드에서, aKv2.1 항체는 원뿔체 내부 분절(타원체 영역) 내에서 더 강한 신호로 광수용체 내부 분절을 명확하게 표지했다(도 12). 내인성 Kv8.2 단백질(도 12)은 Kv2.1과 공동국소화된 간상체 및 원뿔체 내부 분절에 존재했다. Kv8.2가 부재한 경우 KO 망막 오가노이드에서는 Kv2.1 염색의 내부 분절 타원체 패턴이 광수용체로 감지된다. AAV 유래 Kv8.2 단백질(WT 및 코돈 최적화된 벡터 모두)은 또한 형질도입된 망막 오가노이드의 광수용체 내부 분절 구조에서 발현되었으며, 이는 두 전이유전자 모두 정확한 세포내 구획으로 효율적으로 수송되는 단백질로 번역된다는 것을 시사한다(도 12).
실시예 6: AAV 형질도입 후 구조 및 독성 평가
KCNV2 KO 마우스 모델에서 생후 1, 3, 6개월차에 망막 전반에 걸쳐 TUNEL 반응성이 증가한 것으로 보고되었으며, 6개월차에 mm2 당 원추 세포 수가 WT의 80%로 감소한 것으로 보고되었다. 태아 단계 KCNV2 KO 망막 세포 모델이 형질도입 시 해당 표현형을 반복하는지 여부를 확인하고 벡터 관련 세포 독성을 평가하기 위해 TUNEL 반응성 및 원뿔체 세포 수를 WT 대 KO 오가노이드 및 모든 AAV 벡터로 형질도입된 KO 오가노이드에서 측정했다.
AAV 형질도입된 오가노이드 내 TUNEL 반응성
TUNEL은 세포사멸 동안 생성된 이중 가닥 DNA 절단 내 3'-하이드록실 말단을 표지하여 DNA 단편화를 검출하는 방법이다. 망막 오가노이드 내 동결절편의 TUNEL 반응성은 KCNV2 KO 형질도입된 오가노이드 대 비형질도입 대조군 및 WT에서 평가되었다.
도 13a는 형질도입 3주 후 AAV5 CAG-KCNV2-Opti 처리된 망막 오가노이드(클론 K28)의 TUNEL 염색을 보여준다. TUNEL 양성 세포는 망막 세포층(ONL, INL) 내 TUNEL 양성 세포가 없거나 거의 없는 오가노이드(점선)의 중앙에 주로 나타났다. WT에 비해 KCNV2 KO 광수용체의 TUNEL 반응성은 증가하지 않았는데, 이는 해당 모델에서 '시험관내' 망막 변성이 해당 시점에서 발생하지 않았음을 시사한다.
WT 또는 최적화된 전이유전자를 갖는 ONL 또는 INL에서, 두 AAV 혈청형 중 어떤 것도 유의한 수준의 TUNEL 양성 세포를 유발하지 않았다(도 13b 및 13c). 이는 테스트된 AAV 혈청형과 과발현된 전이유전자 단백질은 망막 세포에 대한 세포독성이 없음을 시사한다. 오가노이드 중앙에 TUNEL 양성 세포가 존재한다는 것은 기타 HIPSC 망막 오가노이드 모델에서 널리 보고되었으며, 이는 저산소증 및/또는 망막 오가노이드 중앙에 있는 세포로의 영양분 전달이 원활하지 않음에 인한 것일 가능성이 높다.
AAV 형질도입된 오가노이드 내 클론 세포 수
KCNV2 KO 마우스는 생후 6개월차에 WT 수준의 80%까지 원뿔체 세포가 약간 손실되는 것으로 나타났다. 해당 표현형이 인간 태아 단계의 망막 오가노이드에서 재현되는지 확인하기 위해 망막 조직 100μm 당 원뿔체 세포를 WT 및 KCNV2 KO 망막 오가노이드에서 면역형광법으로 정량화했다. L/M 옵신 양성 원뿔체 세포 수는 40x 배율(7μm 망막 동결절편)에서 촬영한 전체 오가노이드 타일 스캔에서 계수되었으며 망막 조직의 전체 길이에 대해 정규화되었다. 평균 원뿔체 세포 수는 총 12개의 WT 및 8개의 처리되지 않은 KO 망막 오가노이드에서 계수되었다. WT에 비해 KCNV2 KO 세포주에서 원뿔체 세포 수가 유의하게 증가했다(도 14). 형질도입된 망막 오가노이드(n=30으로 그룹화된 모든 벡터)는 WT와 형질도입된 오가노이드 p=0.2 간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았지만 비형질도입 KO(p=0.02)에 비해 유의한 감소를 보였다.
실시예 7: 형질도입된 오가노이드 내 유전자전이 KCNV2 mRNA 및 Kv8.2 단백질의 정량적 평가.
qPCR로 형질도입된 오가노이드 내 KCNV2 mRNA 수준을 평가했다.
벡터 유도 전이유전자 발현의 정량적 비교는 qPCR에 의해 수행되었다. KCNV2 mRNA 발현 수준은 RK 또는 CAG 프로모터에 의해 유도되고 AAV2/5 또는 AAV2/7m8에 의해 전달되는 KCNV2 유전자의 WT 및 코돈 최적화된 버전으로 형질도입된 KCNV2 KO 오가노이드 내에서 평가되었다. 클론 K12, K5 및 K28로부터 전체 형질도입된 오가노이드를 형질도입 후 21일차에 급속 동결에 의해 수확하였다. RNA를 추출하고, DNAse를 처리하고 SOP(PRCL-SOP-RNA 정제 cDNA 합성)에 따라 0.1μg의 RNA로 cDNA가 제작되었다. 유전자 발현 수준은 내인성 하우스키핑 유전자 GAPDH 및 β 액틴에 대해 정규화되었고, 상대적인 발현은 ΔΔCT 방법을 사용하여 결정되었다.
AAV5-RK 코돈 최적화된 KCNV2, AAV5-CAG 코돈 최적화된 KCNV2 또는 AAV7m8-CAG 코돈 최적화를 받은 망막 오가노이드와 비교하여, AAV7m8-RK 코돈 최적화된 KCNV2로 형질도입된 망막 오가노이드 내에서 가장 높은 수준의 KCNV2-Opti 발현이 관찰되었다(도 15a).
최고 수준의 벡터 유래 KCNV2 WT mRNA가 AAV7m8-CAG-WT KCNV2로 형질도입된 오가노이드에서 관찰되었다. AAV7m8-CAG-WT KCNV2로 처리된 오가노이드 내에서의 KCNV2 발현은 비형질도입 KCNV2 KO 대조군보다 약 138배 더 높았고(도 9b) AAV7m8-RK-WT KCNV2는 비형질도입 대조군보다 약 86배 더 높았다. CAG 프로모터 또는 RK 프로모터의 조절 하에 AAV5와 함께 전달된 상이한 버전의 KCNV2 WT 유전자로 형질도입된 망막 오가노이드는 비형질도입된 대조군보다 약 10배 더 높았다(도 15b).
전반적으로 AAV2-7m8은 AAV5 보다 망막 오가노이드에서 광수용체를 형질도입하는 데 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도 광수용체 특이적 RK 프로모터 또는 구성적 CAG 프로모터에 의해 유도되는 벡터에서 WT 또는 Opti KCNV2 mRNA에는 유의한 차이가 없었다.
면역형광법으로 평가된 형질도입된 오가노이드 내 Kv8.2 단백질 수준.
Kv8.2 단백질 수준은 형질도입된 오가노이드의 외부 핵층에서 발현되었다(도 7, 도 16b 참조). 벡터 간의 상대적 누적 단백질 수준을 결정하기 위해 오가노이드 동결절편을 Kv8.2 항체로 염색하고 ONL(원시 통합 밀도)의 총 누적 형광을 FIJI(이미지 J)에서 정량화하고 측정된 총 ONL 영역으로 정규화했다. 도 16은 동일한 블록에 삽입되어 같은 날 이미지화된 WT 오가노이드의 비율로 표현된 총 형광을 보여준다. 7m8 및 AAV5 캡시드 모두에서 CAG와 RK 프로모터 사이의 총 형광에 유의한 차이가 있었다(각각 p=0.031 및 0.028, 양방 검증, 쌍을 이룬 스튜던트 t 테스트). 코돈 최적화된(Opti) 벡터에서 형광 강도가 증가하는 경향에도 불구하고 CAG 또는 RK 프로모터를 갖는 WT와 Opti 벡터 사이에는 유의한 차이가 없었다.
실시예 8: 형질도입된 망막 오가노이드 내 Kv8.2 및 Kv2.1의 공동국소화.
면역형광법으로 평가한 Kv8.2 및 Kv2.1의 상대적인 공동국소화
Kv8.2는 전압 개폐 칼륨 채널 Kv2.1을 갖는 이종체를 형성함으로써 망막에서 기능한다. 정성적 분석을 통해 광수용체 내부 분절에서 벡터 유래 Kv8.2와 내인성 Kv2.1의 공동국소화가 밝혀졌다(도 12). 복원된 Kv8.2의 상대적 수준을 결정하기 위해 정량적 면역형광법 및 공동국소화 분석을 수행했다. 7um 오가노이드 동결절편은 Kv8.2 및 Kv2.1로 공동 염색되었으며 전체 오가노이드 절편은 40x 배율로 이미지화되었으며 이후 LSM 소프트웨어에서 병합되어 전체 오가노이드의 타일 스캔을 생성하여 FIJI 이미지 분석 소프트웨어로 내보냈다. 벡터당 n=3 내지 5 오가노이드의 타일 스캔을 획득하고 FIJI에서 분석했다(이미지 J). 내부 분절 영역의 전체 공동국소화 영역은 Kv.2.1 및 Kv8.2 채널 모두에서 임계값 이상의 픽셀을 결정하기 위해 "이미지 계산>및" 기능을 사용하여 결정되었다. 해당 값은 다양한 망막 오가노이드 크기를 설명하기 위해 관심 영역의 길이까지 정규화되었다.
WT(CTR) 및 비 처리된 KCNV2 KO 오가노이드 사이에는 유의한 차이가 있었다(도 16). 7m8 CAG-WT 및 7m8 CAG-Opti 처리된 오가노이드 내에서 평균 공동국소화 영역이 증가하는 경향이 있었지만 그 차이는 유의한 수준에 도달하지 못했다(일원 분산 분석, Dunnett의 다중 비교 테스트). 7m8 RK-WT 및 RK-Opti 평균 공동국소화 영역은 처리되지 않은 영역과 유사했으며, 이는 해당 방법으로 검출 가능한 벡터 유래 Kv8.2 발현이 부족함을 시사한다.
근접 결찰 검정으로 평가된 Kv8.2 및 Kv2.1의 공동국소화 및 근접성
칼륨 채널 서브유닛 Kv8.2와 Kv2.1 사이의 광수용체에서 단백질-단백질 상호작용을 평가하기 위해 근접 결찰 검정(PLA)이 개발되었다. 형질도입된 KCNV2 KO 망막 오가노이드를 WT(양성 대조군) 및 비형질도입 KO(음성 대조군)와 함께 고정하고 동결절편화를 위해 동일한 블록의 OCT에 삽입했다. 7μm 동결절편을 Kv8.2(토끼) 및 Kv2.1(마우스) 항체와 토끼 및 마우스 PLA 플러스 및 마이너스 프로브로 공동 염색했다. 결찰 및 증폭 단계(듀오 링크 -주황색)에 따라 외부 핵층의 PLA 누점을 공초점 현미경으로 63x 배율로 시각화했다. 전체적으로 오가노이드를 관찰한 결과, 광수용체 세포층의 위치, 특히 광수용체 내부 분절이 위치하는 위치에 PLA 신호의 명확한 농도가 있었다(도 18a). 이는 예상되는 세포 유형 및 세포하 구획에서 kv.8.2/Kv2.1 상호작용의 특이성을 확인시켜 준다. 추가로, KCNV2 KO 망막 오가노이드의 ONL에서 신호의 유의한 감소에 의해 특이성이 확인되었다(도 18b, 18c). PLA 신호의 정량화는 동일한 슬라이드 상에서 처리된 WT 오가노이드에 비해 KCNV2 KO 클론(K28 및 K12)에서 ONL의 면적당 PLA 누점 수의 유의한 감소를 나타냈다(도 18c).
형질도입된 망막 오가노이드에서 PLA 신호의 정량화
AAV 벡터로 형질도입된 KCNV2 KO 망막 오가노이드는 KCNV2 mRNA 및 Kv8.2 단백질을 발현한다. 벡터 유래 번역 단백질의 기능은 전압 개폐 칼륨 채널 kv2.1을 갖는 이종체를 형성하는 그의 능력에 따라 달라진다. 벡터 유래 KCNV2 전사체 및 단백질 내 Kv8.2의 총량을 평가하는 것 외에도 본 발명자는 PLA를 사용하여 Kv2.1과의 상호작용 정도를 평가했다.
클론주로부터 표시된 8개 벡터 중 하나로 형질도입된 KCNV2 KO 오가노이드는 WT(양성 대조군) 및 비형질도입된 KCNV2 KO 오가노이드(음성 대조군)와 동일한 동결보존 조직 블록에 삽입되었으며, 실험은 KCNV2 KO 클론 세포주 K12 및 K28 내에서 반복되었다. 상기와 같이 7μm 동결절편을 Kv8.2(토끼) 및 Kv2.1(마우스) 항체와 토끼 및 마우스 PLA 플러스 및 마이너스 프로브로 공동 염색했다. 63x 배율의 최대 강도 z 투사를 사용하여 시야당 PLA 누점을 정량화했다. 각 z 투사는 100 내지 150개의 광수용체 세포를 포착했으며 17(비형질도입됨)에서 550(최대 신호) 누점이 포함되었다. Kv8.2 항체 역가는 PLA 누점의 유착 없이 신호를 최대화하기 위해 1/100에서 1/400으로 감소되었다. 도 19는 AAV 2/5 및 AAV7m8 캡시드 둘 다로 형질도입된 KCNV2 KO 클론 K12 대 WT 및 비형질도입된 것의 대표적인 최대 강도 투사를 보여준다. PLA 누점은 비형질도입에 비해 형질도입된 오가노이드에서 더 풍부했으며, 광수용체 내부 분절 영역의 정점 가장자리에서 신호 주파수가 가장 높았다. ONL의 누점은 FIJI(이미지 J) '입자 분석' 기능을 사용하여 정량화되었다. ONL 크기의 국부적 차이로 인해 측정된 ONL 영역에 대한 신호의 정규화가 필요했다.
PLA 누점 수(P >0.001, 일원 분산 분석)에 대한 AAV 형질도입의 유의한 효과가 있었다. 개별 비교에서는 모든 벡터가 비형질도입된 것보다 유의하게 높은 신호를 생성했음을 보여주었다(도 20a 및 20b). CAG WT 벡터는 RK WT 벡터(K12 p=0.02, K28 P=0.01) 보다 유의하게 높은 PLA 신호를 생성했지만 CAG Opti와 RK Opti 벡터(K12 p=0.17, K28 p=0.77) 간에는 유의한 차이가 없었다.7m8 RK Wt 및 7m8 RK Opti(K12 p<0.0001, K28 p>0.01) 간에는 유의한 차이가 있었다.
KCNV2 KO 광수용체에서 더 높은 PLA 신호는 더 높은 기능성 단백질 수준을 나타내는 지표이다. 모든 7m8 벡터에서 신호는 클론 K12 내 7m8 RK-WT을 제외하고 WT 수준과 유의하게 다르지 않았다.
이는 모든 7m8 벡터가 기능성 Kv2.1/Kv8.2 이종체를 WT 수준으로 복원할 수 있게 하는 충분한 효능으로 KCNV2를 인간 광수용체 세포에 전달할 수 있음을 나타낸다.
서열 개요

Claims (36)

  1. 발현 작제물로서,
    (a) 광수용체 세포에서 발현을 부여하는 프로모터 서열, 및
    (b) Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열
    을 포함하며;
    상기 핵산 서열은 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 발현 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터 서열이 CAG 또는 로돕신 키나아제(RK) 프로모터 서열인, 발현 작제물.
  3. 제2항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 8과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 8의 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  5. 제2항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 7과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 프로모터 서열이 서열번호: 7의 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 발현 작제물이 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
  9. 제7항에 있어서, WPRE가 서열번호: 11과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  10. 제9항에 있어서, WPRE가 서열번호: 11을 포함하는 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 WT KCNV2 유전자인, 발현 작제물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 9와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  13. 제12항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 9를 포함하는 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 코돈 최적화된 KCNV2 유전자 서열인, 발현 작제물.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 10과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  16. 제15항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 10을 포함하는 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 13과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는, 발현 작제물.
  18. 제17항에 있어서, Kv8.2를 암호화하는 핵산 서열이 서열번호: 13을 포함하는 단백질을 암호화하는, 발현 작제물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(BGH-polyA) 신호를 추가로 포함하는, 발현 작제물.
  20. 제19항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 12와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  21. 제20항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 12를 포함하는, 발현 작제물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 작제물이 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 발현 작제물이 서열번호: 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 발현 작제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인, 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 벡터가 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인, 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 벡터가 AAV 혈청형 AAV2로부터 유래된 게놈을 포함하는, 벡터.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 벡터가 AAV7m8로부터 유래된 캡시드를 포함하는, 벡터.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 벡터가 AAV5로부터 유래된 캡시드를 포함하는, 벡터.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  31. 망막 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 망막 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 망막 질환은 KCNV2 유전자 내 하나 이상의 돌연변이와 연관되며, 상기 방법은 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제30항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 망막 질환이 초정상 간상체 반응을 동반한 원뿔체 이영양증(CDSSR)인, 방법.
  33. KCNV2의 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 KCNV2의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제30항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 광수용체 내 Kv8.2 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 광수용체 내 Kv8.2 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제30항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 안내 주사에 의해 투여되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 벡터 또는 약학적 조성물은 대상체의 중심 망막에 주사되는, 방법.
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