KR20080007226A

KR20080007226A - 증가된 안정성을 가진 변형된 응고 인자 ⅷ 및 이의 유도체

Info

Publication number: KR20080007226A
Application number: KR1020077023533A
Authority: KR
Inventors: 한스 페터 하우저; 토마스 바이머; 제안 뤽 쁠란띠어; 마리에 셜렌 로드리쥐에제; 끌로드 네쥐리어
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2005-04-14
Filing date: 2006-04-10
Publication date: 2008-01-17
Also published as: WO2006108590A1; EP1874815A1; US20110124565A1; AU2006233638A1; CA2604299A1; JP2008537680A

Abstract

본 발명은 안정성이 개선된 응고 인자, 특히 사람 인자 VIII 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 가지나 안정성이 개선된 재조합 폴리펩티드 및 유도체, 및 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터를 또한 포함한다.

변형된 응고 인자 VIII, 혈액 응고 질환, 재조합 FVIII 변이체, 펩티드 링커, 사람 유전자 요법

Description

증가된 안정성을 가진 변형된 응고 인자 Ⅷ 및 이의 유도체{Modified coagulation Factor VIII with enhanced stability and its derivates}

본 발명은 안정성이 개선된 응고 인자, 특히 사람 인자 VIII 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 변형되지 않은 야생형 단백질의 생물학적 활성을 가지나, 안정성이 개선된 재조합 폴리펩티드 및 이의 유도체, 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 변형된 핵산 서열을 포함하는, 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터에 관한 것이다.

전형적 혈우병 또는 A형 혈우병은 유전성 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 염색체 X-연관된 결함으로 인한 것이며, 10,000 명당 한 명 내지 두 명의 발생률로 거의 전적으로 남성에게 일어난다. X-염색체 결함은 그 자신은 혈우병 환자가 아닌 여성 보인자에 의해 유전된다. A형 혈우병의 임상소견은 출혈 경향의 증가이다. 인자 VIII 농축물을 사용한 치료가 도입되기 전에, 중증 혈우병에 걸린 사람의 평균 수명은 20년 미만이었다. 혈장 유래의 인자 VIII의 농축물의 사용은 혈우병 환자의 평균 수명을 길게 연장시키고 이들 대부분에게 다소간의 정상 생활을 영위할 가능성을 주어, 혈우병 환자의 상황을 크게 개선시켰다. 그러 나, 혈장 유래 농축물 및 이의 사용에는 특정 문제가 있는데, 가장 심각한 것은 바이러스가 전달된다는 것이다. 지금까지, AIDS, B형 간염, 및 비-A형 비-B형 간염을 일으키는 바이러스가 사람들에게 심각한 피해를 주었다. 이후, 상이한 바이러스 불활성화 방법 및 새로운 고도로 정제된 인자 VIII 농축물이 최근에 개발되어, 혈장 유래된 인자 VIII에 대해 매우 높은 안전성 표준이 확립되었다.

인자 VIII에 대한 cDNA의 클로닝 [참조: Wood, W.I., et al. (1984) Nature 312, 330- 336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342]를 이용하여 인자 VIII를 재조합적으로 발현할 수 있었으며, 이로써 여러 재조합 인자 VIII 생성물의 개발이 유도되었고, 1992년 내지 2003년 사이에 규제 당국에 의해 승인되었다. 아미노산 Arg-740과 Glu-1649 사이에 존재하는 인자 VIII 폴리펩티드 쇄의 중앙 B 도메인이 완전한 생물학적 활성에 필요한 것으로 보이지 않는다는 사실은 B 도메인 결실된 인자 VIII의 개발을 이끌었다.

성숙한 인자 VIII 분자는 2332개의 아미노산으로 이루어지며, 이는 3개의 상동성 A 도메인, 2개의 상동성 C 도메인 및 하나의 B 도메인으로 구분될 수 있고 A1-A2-B-A3-C1-C2의 순서로 배열된다. 성숙한 사람 인자 VIII의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다. 혈장으로의 이의 분비 동안에, 단일쇄 인자 VIII가 B-A3 경계에서 및 B 도메인 내의 상이한 부위에서 절단되면서, 인자 VIII가 일련의 금속 이온 결합된 이종이량체로 세포내에서 프로세싱된다. 이러한 프로세싱은 A1, A2 및 B-도메인의 다양한 부분으로 이루어지고 분자량이 90 kDa 내지 200 kDa 범위인 중쇄를 생성시킨다. 중쇄는 금속 이온을 통해, A3, C1 및 C2 도메인으 로 이루어진 경쇄에 결합된다 (Saenko et al. 2002). 혈장에서, 이러한 이종이량체 인자 VIII는 높은 친화성으로 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand Factor)에 결합하여, 이를 조숙 이화작용으로부터 보호한다. VWF에 결합된 비-활성화된 인자 VIII의 반감기는 혈장에서 약 12 시간이다.

혈액 응고 과정 동안에, 인자 VIII는 중쇄 내의 아미노산 Arg372 및 Arg740에서 및 경쇄 내의 아미노산 Arg1689에서 FXa 및 트롬빈에 의한 단백질분해성 절단을 통해 활성화되어, 폰 빌레브란트 인자가 방출되고 활성화된 인자 VIII 이종삼량체가 생성되고, 이는 Ca² ⁺가 존재하는 경우에 FIXa 및 FX와 함께 인지질 표면 상에서 테나즈(tenase) 복합체를 형성할 것이다. 당해 이종삼량체는 A1 도메인, 50 kDa 단편, A2 도메인, 43 kDa 단편, 및 경쇄 (A3-C1-C2), 73 kDa 단편으로 이루어진다. 따라서, 인자 VIII의 활성형 (인자 VIIIa)은 트롬빈-절단된 A3-C1-C2 경쇄에 이가 금속 이온을 통해 연결된 A1-아단위, 및 A1 및 A3 도메인과 비교적 느슨하게 연결된 유리 A2 아단위로 이루어진다.

과도한 파종 응고를 피하기 위하여, 인자 VIIIa는 활성화 후 곧바로 불활성화되어야 한다. Arg336 및 Arg562에서의 절단에 의한 활성화된 단백질 C (APC)를 통한 인자 VIIIa의 불활성화는 율속 단계인 것으로 여겨지지 않는다. 차라리, 이종삼량체로부터 비-공유결합된 A2 아단위의 해리가 트롬빈 활성화 후 인자 VIIIa 불활성화에서의 율속 단계인 것으로 생각된다 [참조: Fay, PJ. et al, J. Biol. Chem. 266: 8957 (1991), Fay PJ & Smudzin TM, J. Biol. Chem. 267: 13246-50 (1992)]. 이는 신속한 과정으로서, 단지 2.1분에 불과한 혈장 내에서의 인자 VIIIa의 짧은 반감기를 설명해준다 [참조: Saenko et al., Vox Sang. 83: 89-96 (2002)]. 따라서, A1/A3-C1-C2 이종이량체에 대한 A2 도메인의 친화성을 증가시키면, 인자 VIIIa의 반감기가 연장될 것이고, 지혈 활성이 증가된 인자 VIII가 수득될 것이다.

예방적 치료를 받고 있는 중증 A형 혈우병 환자의 경우에, 인자 VIII는 혈장에서의 약 12 시간의 인자 VIII의 짧은 반감기로 인해 주당 약 3회 정맥내로 투여되어야 한다. 매번 정맥내 투여하는 것은 번거로우며, 통증을 수반하고, 환자 자신 또는 A형 혈우병으로 진단된 아이들의 부모에 의해 가정 요법으로 대부분 행해지기 때문에 특히 감염 위험이 있다.

따라서, 덜 자주 투여되어 지는, 인자 VIII를 함유하는 약제학적 조성물의 제조를 가능케 하는 작용성 반감기가 증가된 인자 VIII를 제조하는 것이 매우 바람직할 것이다.

세포 수용체와의 상호작용을 감소시키거나 (WO 03/093313A2, WO 02/060951 A2), 중합체를 인자 VIII에 공유결합시키거나 (WO 94/15625, WO 97/11957 및 US 4970300), 또는 인자 VIII의 캡슐화 (WO 99/55306)에 의해 비-활성화된 인자 VIII의 반감기를 연장시키려는 여러 시도가 있었다.

WO 97/03193에서, 신규 금속 결합 부위의 도입이 인자 VIII, 특히 His 또는 Met가 Phe652, Tyr1786, Lys1818, Asp1840 및/또는 Asn1864 중의 어느 하나에 의해 치환된 돌연변이체를 안정화시킬 수 있다는 것이 추측되었다. 그러나, 이러한 변형으로 얻어진 안정화를 의미하는 성공을 어떻게 결정하는 지에 대한 근거가 제공 되지 않았으며 또한 제안된 아미노산이 왜 선택되었는지에 대한 근거도 제공되지 않았다.

A2 도메인을 A3 도메인에 공유결합시키고 APC 절단 부위를 돌연변이시킴으로써 불활성화 내성인 인자 VIII를 제조하고자 하는 또 다른 시도가 있었다 [참조: Pipe and Kaufman, PNAS, (1997) 94:11851-11856, WO 97/40145 and WO 03/087355]. 또한, 이러한 유전자 작제물을 사용하여 문헌[WO 02/072023A2]에 기재된 바와 같이 유전자전이된(transgenic) 동물을 생산하였다. 이러한 변이체는 트롬빈 활성화 후 4시간이 지나도 이의 피크 활성의 38%를 여전히 나타내었다. 그러나, 이러한 변이체는 VWF 결합 도메인이 없는데, 그 이유는 A2를 A3 도메인에 융합시킴으로써 이 도메인이 결실되었기 때문이다. VWF 결합이 생체내에서 FVIII의 반감기를 현저히 연장시키기 때문에, IR8의 비-활성화된 형의 반감기가 줄어들 것으로 기대된다. 상기 발명자들은 스스로 이를 인식하고, 항체를 변형된 FVIII의 조성물에 첨가하여 이러한 문제를 극복하였다.

게일 등(Gale et al.) [참조 문헌: Protein Science (2002), 11 :2091-2101]은, A3 도메인을 A2 도메인에 공유결합시킴으로써 FV가 안정화된다는 것을 공개하였다. 이들은 구조 예측에 따라 두 개의 인접 아미노산, 즉 A2 도메인 상의 하나와 A3 도메인에 위치한 다른 하나를 동정하였고, 이들 두 개의 아미산을 시스테인 잔기로 대체하였고, 이들은 소포체로 배출되는 동안 디설피드 가교를 형성하였다. 동일한 방법을 사용하여, 디설피드 가교를 통해 인자 VIII의 A2를 A3 도메인에 공유결합시켰다 (WO 02/103024A2). 이러한 공유결합된 인자 VIII 돌연변이체는, 활 성화 후 40분 동안 초기의 최고 활성의 약 90%를 보유한 반면에, 야생형 인자 VIII의 활성은 초기 최고 활성의 10%로 빠르게 감소하였다. 인자 VIII 돌연변이체는, 더 이상의 활성의 손실 없이, 추가 3 시간 동안 이의 90% 활성을 보유하였다 (Gale et al., J. Thromb. Haemost. (2003), 1:1966-1971). 이들 FVIII 변이체가 생체내에서 트롬빈 활성화 후 또한 안정할 것인지 및 구성적으로 높은 수준의 인자 VIII가 혈전색전증의 위험 인자를 구성할 수 있다는 것이 최근에 밝혀졌기 때문에, 상기 FVIII 변이체가 혈전원성(thrombogenic)이 아닌지가 관측될 것이다 (Kyrle 2003, Hamostasiologie 1: p. 41-57).

따라서, 유리한 특성을 나타내는 변형된 혈액 응고 인자를 개발할 필요가 있다.

예전에는, Arg372에서의 트롬빈 매개된 절단이 FVIII 활성화의 전제조건이라고 생각되었으며, 이는 예를 들어 Arg372가 Ile로 대체되었을 때 불활성 FVIII 변이체가 생성된다는 사실로 지지되었다 [참조 문헌: Pittman (1988), PNAS 85:2429-2433]. 본 발명에서, FVIII의 A1과 A2 도메인 사이의 트롬빈 절단을 방지함으로써, 트롬빈 활성화 후 A2 도메인이 A1 도메인에 공유결합되어 유지되도록 함을 특징으로 하는 돌연변이를 도입함으로써, 트롬빈 활성화 후 생물학적으로 활성인 안정화된 FVIII 변이체가 수득될 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.

따라서, 제1 양상으로, 본 발명은 FVIII의 A1과 A2 도메인 사이의 트롬빈 절단을 방지하는 변형을 특징으로 하는 변형된 FVIII 변이체에 관한 것이다. 따라서, A2 도메인은, 트롬빈 활성화 후, A1 도메인에 공유결합되어 남아 있으며, 이들 FVIII 변이체는 작용상의 활성을 유지하며, 트롬빈에 의해 FVIIIa로 활성화된 후 연장된 작용성 반감기를 나타낸다. 본 발명의 FVIII 변이체는 R372에 불활성화된 트롬빈 절단 부위를 가지는데, 이는 비-제한적인 예로써, R372를 A372로 돌연변이시킴으로써 실현될 수 있다. 펩티드 링커 서열은 A1과 A2 도메인 사이에 도입될 수 있는데, 이는 변경될 수 있으며 면역원성이 아니어야 한다 [참조: Robinson et al.; PNAS (1998), Vol 95, p5929]. 본 발명의 바람직한 태양에서, 펩티드 링커는 Val374 (서열번호 2)를, 아미노산 서열 GlyGlySer 또는 GlyGlySerSer 또는 이의 임의의 조합의 다량체가 N-말단상에서 선행하는 Gly로 대체하며, 특히 바람직한 태양에서, 펩티드 링커는 80 내지 120개 아미노산 서열, 보다 더욱 바람직하게는 90 내지 110개 아미노산 서열, 가장 바람직하게는 99개 아미노산으로 이루어진다.

모든 척추동물 종으로부터의 FVIII가 본 발명에 의거하여 안정화될 수 있다. 특히 중요한 것은 사람 및 돼지 변형된 FVIII 변이체이다. 또한, 상이한 종으로부터의 키메라 FVIII 변이체, 예를 들어 사람/돼지 (US 05364771) 또는 사람/쥐 키메라가 본 발명의 일 양태이다.

또한, FV 및 FVIII의 키메라 분자가 본 발명의 또 다른 양태이다 [참조: Marquette et al. 1995, JBC, 270:10297-10303, Oertel et al. 1996, Thromb. Haemost. 75:36-44).

FVIII 변이체는 야생형 FVIII 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 임의로 링커에 의해 대체된 FVIII 변이체를 토대로 할 수 있다.

용어들 "혈액 응고 인자 VIII", "인자 VIII" 및 "FVIII"은 본원에서 서로 상 호교환적으로 사용된다. "혈액 응고 인자 VIII"는 야생형 혈액응고 인자 VIII의 친응고(procoagulant) 활성을 가진 야생형 혈액 응고 인자 VIII의 유도체를 포함한다. 유도체는 야생형 인자 VIII의 아미노산 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 부가를 가질 수 있다. 비-제한적인 예로써, 인자 VIII 분자는 전장의 재조합 인자 VIII, B 도메인 결실된 인자 VIII (Pittman 1993, Blood 81 :2925-2935), APC 절단을 방지하거나 감소시키는 인자 VIII 돌연변이체 (Amano 1998, Thromb. Haemost. 79:557-563), A2 도메인을 추가로 안정화시키는 인자 VIII 돌연변이체 (WO 97/40145), 증가된 발현을 초래하는 FVIII 돌연변이체 (Swaroop et al. 1997, JBC 272:24121-24124), 면역원성을 감소시키는 인자 VIII 돌연변이체 (Lollar 1999 Thromb. Haemost. 82:505-508), 상이하게 발현된 중쇄 및 경쇄로부터 재구성된 FVIII (Oh et al. 1999, Exp. MoI. Med. 31 :95-100), HSPG (헤파린 설페이트 프로테오글리칸) 및/또는 LRP (저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질)과 같이 FVIII의 이화작용을 유도하는 수용체에의 결합을 감소시키는 FVIII 돌연변이체 (Ananyeva et al. 2001 , TCM, 11 :251-257)를 포함한다. 인자 VIII의 친응고 활성을 측정하는 적당한 시험은 1 단계 또는 2 단계의 응고 검정이다 (Rizza et al. 1982 Coagulation assay of FVIIIc and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992).

사람 혈액 응고 인자 VIII의 성숙한 야생형의 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시된다. 특정 서열의 아미노산 위치에 대한 언급은 언급된 서열의 다른 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 결실, 삽입 및/또는 치환을 배제하지 않는다. 예를 들면, 서열번호 2에 대한 "Glu2004"의 돌연변이는, 변형된 동족체에서, 서열번호 2의 위치 1 내지 2003에서 하나 이상의 아미노산이 소실된 것을 배제하지 않는다.

본 발명의 변형된 FVIII 동족체는, 비-변형된 형 및/또는 야생형 FVIII에 비해 트롬빈 활성화 후 증가된 작용성 반감기를 나타낸다. 작용성 반감기는 US 2003/0125232의 도 5에 제시된 바와 같이, 또는 샌드베르그 (Sandberg) [참조: Thromb. Haemost. 2001;85(1):93-100] 및 게일 (Gale) [참조: Gale et al., J. Thromb. Haemost., 2003, 1:p. 1966-1971]에 의해 공개된 바와 같이 시험관내에서 측정될 수 있는데, 이는 기본적으로, 트롬빈 활성화 후 FVIII 활성의 반응속도론을 측정하는 것으로 이루어진다. 야생형에 비해, 동일한 농도에서 더 높은 지혈 효과 또는 안정화된 FVIII의 더 오래 지속되는 지혈 효과가 기대되는 FVIII 녹아웃 마우스와 같은 A형 혈우병의 동물 모델에서 변형된 FVIII의 증가된 작용성 반감기를 생체내에서 시험할 수 있다. 지혈 효과는 예를 들어 꼬리 클립 후 출혈이 정지하는 시간을 측정하는 방법으로 시험될 수 있다.

본 발명의 변형된 FVIII 변이체는, 트롬빈에 의한 활성화 후 40분에, 시험관내에서 측정된 이의 초기 피크 활성의 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 75% 이상을 보유한다.

작용성 반감기는 통상적으로, 비-변형된 형 및/또는 변형된 FVIII 변이체의 야생형에 비해 50% 이상, 바람직하게는 100% 이상, 보다 바람직하게는 200% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 500% 이상 증가된다. .

사람 인자 VIIIa의 야생형의 작용성 반감기는 2.1분이다. 본 발명의 변형된 인자 VIIIa의 작용성 반감기는 통상적으로 약 3.15분 이상, 바람직하게는 약 4.2분 이상, 보다 바람직하게는 약 6.3분 이상, 가장 바람직하게는 약 12.6분 이상이다.

추가로, 본 발명은 본원에 기재된 변형된 사람 FVIII 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 일반적으로, 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 일본쇄 DNA 또는 이본쇄 DNA, 또는 일본쇄 RNA 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 또한 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 비통상적 염기, 예를 들어 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 당업자에게 공지된 다수의 유용한 목적을 제공하는 각종 변형이 DNA 및 RNA에 가해질 수 있다고 생각될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 폴리뉴클레오티드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형뿐만 아니라, 바이러스 및 세포, 예를 들어 단순 및 복합 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형을 포괄한다.

당업자는, 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 소정의 폴리펩티드가 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다고 이해할 것이다. 이들 "변이체"는 본 발명에 포함된다.

본원에서 사용된 "인자 VIII"는 비-활성화된 형(인자 VIII)로 이루어진 생성물을 의미한다. 상기 정의 내에서 "인자 VIII"는 천연 사람 인자 VIII의 아미노산 서열을 가진 단백질을 포함한다. 이는 또한 약간 변형된 아미노산 서열, 예를 들어 N-말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단을 가진 단백질이 인자 VIIIa의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 이들 단백질을 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 VIII"는 또한, 개체에 따라 존재하고 발생할 수 있는 천연 대립형질 변이를 포함한다. 상기 정의 내에서 "인자 VIII"는 FVIII의 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기에서 상이하다. 이러한 차이의 예로는 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산 잔기)의 N- 및/또는 C-말단의 절두(truncation), 또는 N- 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 잔기의 부가, 예를 들어 N-말단에서 메티오닌 잔기의 부가뿐만 아니라, 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특징을 가진 아미노산, 예를 들어 (1) 소형 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산, (6) 방향족 아미노산 및 (7) 극성 아미노산의 그룹 내에서 수행된 치환이 포함된다. 이러한 보존적 치환의 예는 아래의 표에 제시된다.

(1)	알라닌, 글리신
(2)	아스파르트산, 글루탐산
(3)	아스파라긴, 글루타민
(4)	아르기닌, 히스티딘, 리신
(5)	이소루이신, 루이신, 메티오닌, 발린
(6)	페닐알라닌, 티로신, 트립토판
(7)	세린, 트레오닌

바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 "분리된" 폴리뉴클레오티드는 다른 핵산 물질, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA 등이 실질적으로 부재하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지된 통상의 핵산 정제 방법을 사용하여 분리된 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 상기 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오티드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 태양에서, 벡터는 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터이다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 일부인, 변형된 FVIII 변이체를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은, (a) 변형된 FVIII 변이체가 발현되는 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형된 FVIII 변이체를 임의로 회수하는 단계를 포함한다.

글리코실화 또는 기타 해독후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 특성에 따라 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 언급할 때, 이러한 서열의 해독후 변형은 본 출원에 포함된다.

본 발명의 변형된 동족체를 ≥80% 순도, 보다 바람직하게는 ≥95% 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 특히 바람직한 것은 오염성 고분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대하여 99.9% 초과의 순도이고, 감염성 및 발열성 제제가 부재한 약제학적으로 순수한 상태이다. 바람직하게는, 분리된 또는 정제된 본 발명의 변형된 동족체는 다른 폴리펩티드가 실질적으로 부재하다.

본 발명의 다양한 산물은 의약으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 FVIII 변이체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 기재된 재조합 단백질은 치료용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 생리학적으로 적합한 통상의 완충 수용액 중에 용해시킬 수 있으며, 이에 임의로, 약제학적 부형제를 첨가하여 약제학적 제제를 제공할 수 있다.

이러한 약제학적 담체 및 부형제뿐만 아니라 적합한 약제학적 제형은 당업계에 익히 공지되어 있다 [참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조된 형 또는 안정한 가용성 형으로 제형화될 수 있다. 본 폴리펩티드 변이체는 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 사용 전에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어 주사용 멸균수 또는 멸균 생리적 염류 용액을 첨가하여, 재구성한다.

본 조성물의 제형은 약제학적으로 적합한 임의의 투여 수단에 의해 개체에 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되었으며, 임의의 편리한 경로에 의해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신으로 투여된다. 전신 용도를 위해, 본 발명의 FVIII 변이체는, 통상의 방법에 따른 비경 구 (예: 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비내 또는 경피) 또는 장용 (예: 경구, 질 또는 직장) 전달을 위해 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 제형은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방 시스템을 포함한다.

본 발명의 변형된 생물학적 활성 FVIII 변이체는, 견딜 수 없는 부작용을 일으키는 용량에는 미치지 않지만, 치료 중인 상태 또는 징후의 중증도 또는 확산을 예방하거나 경감시키면서, 목적하는 효과를 일으키기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 예를 들어 징후, 제형, 투여방식과 같은 다수의 인자에 따라 달라지며, 개개의 징후에 대해 임상전 및 임상 시험에서 결정되어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이들 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는, 혈액 응고 질환의 치료 또는 예방용 의약을 제조하는데 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 FVIII 변이체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 플라스미드 또는 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도이다. 혈액 응고 질환에는 A형 혈우병이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 치료는 사람 유전자 요법을 포함한다.

또한, 본 발명은 A형 혈우병과 같은 혈액 응고 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 FVIII 변이체의 충분한 양을 상기 개체에 투여함을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 방 법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터의 유효량을 개체에 투여함을 포함한다. 달리, 본 방법은 본원에 기재된 본 발명의 숙주 세포의 유효량을 개체에 투여함을 포함할 수 있다.

제안된 돌연변이체의 발현

적당한 숙주 세포에서 재조합 돌연변이체 단백질을 고 수준으로 생산하는 것은, 당업자에게 공지된 방법에 따른 다양한 발현 시스템에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터 내에 적합한 조절 요소와 함께, 효율적인 전사 단위체로 위에 언급된 변형된 cDNA를 조립하는 것을 요구한다. 효율적인 전사 조절 요소는 동물 세포가 이들의 천연 숙주인 바이러스로부터 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 유인원(Simian) 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스, 또는 로우스(Rous) 육종 바이러스의 장말단 반복체로부터 유래된 프로모터-인핸서 조합체, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포에서 강하게 구성적으로 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합체가 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정한 고 수준의 mRNA를 수득하기 위하여, 전사 단위는 이의 3'-근접부에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 이 서열은 유인원 바이러스 40 조기(early) 전사 영역, 래빗(rabbit) 베타 글로빈 유전자, 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성화인자 유전자로부터 유래된다.

이어서, cDNA는 인자 VIII 단백질의 발현을 위한 적당한 숙주 세포주의 게놈 내로 통합된다. 바람직하게는, 이 세포주는, 정확한 폴딩, 디설피드 결합 형성, 아스파라긴-연결된 글리코실화 및 기타 해독후 변형뿐만 아니라, 배양 배지로의 분비를 보장하기 위하여, 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 다른 해독후 변형에 관한 예로는 티로신 O-황산화, 및 발생기 폴리펩티드 쇄의 단백질분해성 프로세싱이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포, 및 바람직하게는 햄스터 CHO-세포가 있다.

상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 여러 상이한 방법으로 동물 세포주내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스를 토대로 하는 벡터로부터 제조될 수 있다. 이들의 예로는 바큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 및 바람직하게는 소 유두종 바이러스를 토대로 하는 벡터이다.

상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위가 또 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포 속으로 도입될 수 있는데, 이때 함께 도입되는 또 다른 재조합 유전자는 이들 동물 세포에서 우성 선별 마커로서 작용할 수 있으므로, 당해 재조합 DNA를 게놈 속에 통합시킨 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 한다. 이러한 유형의 우성 선별 마커 유전자의 예로는 제네티신(geneticin) (G418)에 대해 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대해 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 푸로마이신에 대해 내성을 부여하는 푸로마이신 아세틸 트랜스퍼라제가 있다. 이러한 선별 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는, 목적하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 것과 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 숙주 세포의 게놈으로 동시에 도입 및 통합된 별개의 벡터 상에 암호화될 수 있으며, 종종 상이한 전사 단위 사이의 견고한 물리적 연결을 이룬다.

목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 선별 마커 유전자의 다른 유형은 디하이드로폴레이트 리덕타제 (dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위를 토대로 한다. 이러한 유형의 유전자를 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포 (DUKX-B11 , DG-44) 속으로 도입한 후, 이들을 뉴클레오시드가 결핍된 배지에서 성장시키는 것이 가능할 것이다. 이러한 배지의 예로는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 Ham's F12가 있다. 이들 dhfr- 유전자는, 인자 VIII cDNA 전사 단위와 함께, 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 연관된 상기 유형의 CHO-세포 내로 도입되어, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr-양성 세포주를 만들 수 있다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장하는 경우에, 메토트렉세이트에 대해 내성인 새로운 세포주가 출현할 것이다. 이들 세포주는, 연관된 dhfr 및 목적하는 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인하여, 재조합 단백질을 증가된 비율로 생산할 수 있다. 메토트렉세이트의 농도가 증가하는 중 (1-10000 nM)에, 이들 세포주를 증식시키면, 목적하는 단백질을 매우 높은 비율로 생산하는 새로운 세포주가 수득될 수 있다.

목적하는 단백질을 생산하는 상기 세포주는, 현탁 배양물 중에서 또는 다양한 고형 지지체 상에서, 대규모로 성장시킬 수 있다. 이들 지지체의 예로는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 토대로 하는 미세 운반체, 또는 중공 섬유 또는 각종 세라믹 물질 형태의 고형 지지체가 있다. 세포 현탁 배양물 중에서 또는 미세 운반체 상에서 성장시킬 때, 상기 세포주의 배양물은, 장기간에 걸쳐 조절 배지를 계속적으로 생산하면서, 바쓰 배양(bath culture)으로 또는 관류 배양(perfusion culture)으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주는 목적하는 재조합 돌연변이 단백질의 제조를 위한 공업적 방법의 개발에 특히 적합하다.

배지 중에 축적되는 상기 유형의 세포가 분비하는 재조합 돌연변이 단백질은, 각종 생화학적 및 크로마토그래피 방법, 예를 들어 세포 배양 배지 중의 목적하는 단백질과 다른 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특정 친화성 등의 차이를 이용하는 방법으로 농축 및 정제할 수 있다.

이러한 정제의 예로는, 고형 지지체 상에 고정된 모노클로날 항체에 대한 재조합 돌연변이 단백질의 흡착을 들 수 있다. 탈착 후, 당해 단백질은 상기 특성을 이용하는 각종 크로마토그래피 기법으로 추가로 정제할 수 있다.

본 발명에 기재된 재조합 단백질은 치료 용도의 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 생리학적으로 적합한 통상의 완충 수용액 중에 용해시킬 수 있으며, 임의로, 이에 약제학적 부형제를 첨가하여 약제학적 제제를 제공할 수 있다.

본 발명의 변형된 폴리뉴클레오티드 (예: DNA)는 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터 속으로 통합될 수 있다.

본원에 기재된 각종 태양은 서로 조합될 수 있다. 본 발명은 후술되는 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이다. 본 발명의 특정 태양은 첨부된 도면을 이용하 여 설명될 것이다.

도 1a:

FVIII 암호화 서열 내의 링커 삽입 부위의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열

도 1b:

링커의 아미노산 서열. Gly374 (밑줄)는 표시된 링커 서열에 의해 대체된다.

도 2:

일시적 형질감염 후 COS 세포 상층액으로부터 FVIII 항원 생성 (패널 A) 및 FVIII 비활성 (패널 B)의 측정 . COS 세포 (웰당 4x10⁵ 세포)를, 1㎍의 플라스미드 DNA와 예비항온처리된 5㎕ FuGENE 6™ (Roche Diagnostics, Meylan, France)를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일에, COS 세포를 세척하고, 1% BSA가 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove's modified Dulbecco medium (IMDM)) 중에 넣었다. 조절된 배지를 6 시간 후 수거하였다. FVIII 항원을 ELISA 키트 (Diagnostica Stago, Asmieres, France)를 사용하여 정량하고, FVIII 활성을 2가지 방법을 사용하여 측정하였다: 발색 (chromogenic) 방법 ("2-단계 응고 검정", Coamatic FVIII, Chromogenix, Milano, Italy) 또는 시간측정(chronometric) 방법 ("1-단계 응고 검정").

도 3:

헤파린-정제된 FVIII L99 의 면역블롯 분석 . 헤파린-정제된 FVIII 및 ReFacto를 Hepes 20 mM pH 7.4, CaCl₂ 5 mM, Tween 20 0.01 % 중에 희석시켜, 2250 ng/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이어서, 샘플 (50 ㎕)을 Laemmli 완충제 (25 ㎕) 중에 희석시키고, 비등시키고, SDS-PAGE로 분석하였다. 20 ㎕의 각 샘플을 레인 마다 로딩하였다. FVIII를 2개 마우스 항체 (항-경쇄 및 항-중쇄)의 혼합물을 사용하여 검출하였다.

도 4:

트롬빈에 의해 활성화시킨 후, 헤파린-정제된 FVIII WT 및 FVIII L99 의 면역 블롯 분석 . 헤파린-정제된 FVIII WT 및 L99를 5 mM CaCl₂ 및 2.5% 글리세롤의 존재하에서 IMDM 중에 희석시켰다. 각 FVIlI를 상이한 항온처리 시간 동안 37℃에서 트롬빈 (1 U FVIII/1 U 트롬빈)에 의해 활성화시켰다. 반응을 히루딘 (1 U FVIII/2U 히루딘)을 사용하여 차단시키고, Laemmli 완충제 중에 즉시 희석시키고, 비등시켰다. 이어서, 26 ng의 FVIII에 상응하는 샘플을 면역블롯팅시키고, 항-경쇄 및 항-중쇄 항체의 혼합물을 사용하여 검출하였다.

도 5:

FVIlI WT 및 FVIII L99 의 트롬빈 활성화 후 FVIIIa 불활성화 반응속도론의 비교 . 37℃에서, 150 ㎕의 최종 용적에서 50 ng의 FVIII 항원을 사용하여, FXa 생성을 실현시켰다. 150 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.4 및 5 mM CaCl₂, 2 μM PC/PS 75/25 및 0.5 % BSA를 함유하는 완충제 중에서 FXa 생성이 이루어졌다. 발색 혼합물은 93 nM FX, 1 nM FIXa 및 0.5 mM 스펙트로자임(Spectrozyme)을 함유한다.

도 6:

활성화된 FVIII L99 의 HuAPC 불활성화 반응속도론 . 50 ng의 FVIII를 이 시험에 사용하였다. 두 가지 비의 FVIII/APC를 사용하였다: 비 1/1 (패널 A) 또는 1/6 (패널 B). 각 비에 대하여, 다양한 농도의 단백질 S를 검정하였다. 표는 각 분자에 대하여 사용된 비를 요약한 것이다.

실시예 1: 인자 VIII 돌연변이체의 생성

FVIII cDNA 서열 내로 돌연변이를 도입하기 위한 토대는, 절두된 FIX 인트론을 함유하는 B 도메인 결실된 FVIII 서열이었다 [참조: Plantier JL et al. Thromb. Haemost. 86:596-603 (2001)]. FVIII 서열을, NotI/XhoI 단편을 통하여 pcDNA3.1로부터 pKSII+ (Stratagene)으로 이동시켜, 플라스미드 pKS-174를 생성시켰다. 위치 372에서의 트롬빈 절단 부위의 결실은, 표준 방법 (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene), 및 올리고뉴클레오티드 We1013 및 We1014 (서열번호 3 및 4)를 이용한 부위-지정된 돌연변이유발에 의해 Arg372를 Ala으로 교체함으로써, 이루어졌다. GlySer 링커 암호 서열의 삽입을 위한 제한 부위를 도입하기 위하여, 생성된 플라스미드를 올리고뉴클레오티드 We1015 및 We1016 (서열번호 5 및 6)을 사용하여 또 한 차례 돌연변이유발시켜, Val374을 Gly로 교체하여, 새로운 NarI 부위를 생성시켰다. 생성된 플라스미드는 pKS-190으로 명명되었다.

링커 연쇄체화 (concatemerization) 및 각각의 플라스미드로의 삽입을 위한 다양한 제한 부위를 제공하는 링커 모듈을, 각각 먼저 pCR4Topo 벡터 (Invitrogen)내로 클로닝하였다. 5개의 중첩하는 올리고뉴클레오티드 쌍, We884/We1052 (단편 1 , 서열번호 7 및 8), We884/We1053 (단편 2; 서열번호 7 및 9), We1051/We1052 (단편 3; 서열번호 10 및 8), We1051/We1054 (단편 4; 서열번호 10 및 11) 및 We890/We1052 (단편 5; 서열번호 12 및 8)을 각각 어닐닝하고, 연장시키고, PCR로 증폭시켜, 5개의 링커 단편을 생성시켰다. 이러한 목적을 위하여, 10 pmole의 각각의 올리고뉴클레오티드 쌍을, 95℃에서 2 분간의 초기 변성, 94℃에서 15초, 55℃에서 15초 및 72℃에서 15초의 10회 가열순환 (thermocycles)에 이어서, 72℃에서 3분간의 최종 연장에 의해 PCR 증폭시켰다. 이어서, 각 단편을 pCR4Topo 내로 클로닝시켰다. 후속적으로, 단편을 각각의 제한 엔도뉴클리아제를 사용한 분해에 의해 벡터로부터 잘라내었다. 단편 1은 MspI/NarI로 잘라내고, 단편 2는 MspI/BamH1로 잘라내고, 단편 3은 BgIII/NarI로 잘라내고, 단편 4는 BgIII/BspEI로 잘라내고, 단편 5는 BspEII/NarI로 잘라낸 다음에, 표준 방법 (Qiagen)을 사용하여 겔 정제하였다.

링커 단편을 FVIII 서열 내로 삽입하기 위하여, 플라스미드 pKS-190를 NarI로 선형화시키고, 링커 단편 및 이의 조합물을 삽입하였다. 20mer 링커를 삽입하기 위하여, 단편 1을 사용하고, 생성된 플라스미드를 pKS-249로 명명하였다. 42mer 링커를 삽입하기 위하여, 단편 2 및 3를 조합하고, 생성된 플라스미드를 pKS-250로 명명하였다. 61mer 링커를 삽입하기 위하여, 단편 2, 4 및 5를 조합하고, 생성된 플라스미드를 pKS-251로 명명하였다. 단편 1의 1개 복사체 또는 2개 복사체를 각각, NarI-선형화된 플라스미드 pKS-251 내에 삽입하여, 80mer 링커를 함유하는 플라스미드 pKS-259 및 99mer 링커를 함유하는 플라스미드 pKS-260를 생성시켰다. 단편 1을 플라스미드 260의 NarI 부위에 삽입하여, 118mer 링커를 함유하는 플라스미드 pKS-279를 생성시켰다. 단편 2 및 3을 플라스미드 260의 NarI 부위에 삽입하여, 140mer 링커를 함유하는 플라스미드 pKS-280을 생성시켰다. 단편 2, 4, 및 5를 플라스미드 260의 NarI 부위에 삽입하여, 159mer 링커를 함유하는 플라스미드 pKS-281를 생성시켰다.

링커 삽입체의 서열 검증 후, 다양한 길이의 링커를 함유하는 FVIII 서열을, NotI/XhoI 부위를 통하여 발현 벡터 pcDNA3.1 내로 역 이동시켰다. 표 1은 링커 길이 및 pKSII+ 및 pcDNA3.1의 플라스미드 수를 요약한 것이다. 도 1은 FVIII 중에서 다양한 링커의 아미노산 서열을 보여준다.

실시예 2: 인자 VIII 돌연변이체의 발현

인자 VIII 돌연변이체 클론의 형질감염 및 돌연변이체 인자 VIII 분자의 발현은 앞서 기재되고 당업자에게 공지된 바와 같이 수행된다 [참조: Plantier JL et al. Thromb. Haemost. 86:596-603 (2001)]. COS 세포에서 형질감염시킨 후, 모든 FVIII 돌연변이체가, FVIII WT와 유사하거나 심지어 더 많은 양으로 배지 중에 생성 및 분비되었다 (도 2, 패널 A). L0 발현 COS 세포의 상층액에서는 FVIII 활성이 검출되지 않았으며, 이는 R372A 돌연변이가 중증 A형 혈우병의 원인이기 때문에 예상된 결과이다. Coamatic FVIII 검정 ("2-단계 응고 검정")을 사용할 때, 돌연변이체로부터의 FVIII 활성은, FVIII WT를 사용하여 수득된 활성에 비해 낮았다. 그러나, 활성은 링커의 길이에 따라 비례적으로 증가하였다. 최고의 비활성은 FVIII L99 돌연변이체를 사용할 때 수득되었으며 (대조군의 약 13 %), 더 긴 링커를 보유한 돌연변이체를 사용하여도 증가하지 않았다. 시간측정 검정 ("1-단계 응고 검정")을 사용할 때, FVIII 활성은 또한 링커의 길이에 따라 증가하였다. 그러나, 비활성은 2-단계 응고 검정으로 수득된 수준 보다 훨씬 더 높은 수준에 도달하여, 대조군 활성의 최대 37%을 달성하였다. 이러한 제2 기법을 사용하는 경우에, 최고의 비활성은 FVIII L99를 사용할 때 수득되었다 (도 2, 패널 B).

요약하면, FVIII L99는 COS 세포에서 효율적으로 생산되며, 모든 링커 돌연변이체로부터 수득된 최고 비활성을 나타내었다. 따라서, 이 분자의 특성을 추가로 규명하기 위하여, FVIII L99 작제물을 CHO 세포에서 안정하게 형질감염시켰다.

실시예 3: FVIII L99 의 작용 분석

헤파린 크로마토그래피

롤러 병을 사용하여, FVIII L99를 제조하고, 헤파린 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 반-정제된 FVIII L99의 FVIII 활성을 coamatic FVIII 또는 "1-단계 응고 검정"을 사용하여 정량하였다. COS 상층액에서 관측되는 1-단계 응고 검정과 2-단계 응고 검정 사이의 불일치가 CHO 세포에서도 또한 관측되었다. 반-정제된 FVIII WT (100%)에 비해, coamatic FVIII로 측정된 비활성은 낮았던 (대조군의 7 %; n=3 정제) 반면에, "1-단계 응고 검정"으로 수득된 비활성은 FVIII WT 보다 더 높았다 (대조군 (FVIII WT)의 195 %; n=3 정제).

반-정제된 단백질을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 추가로 연구하였다. 단백질 검출을, 2개 항체 (항-경쇄 (aLC) 및 항-중쇄 (aHC) 항체)의 혼합물을 사용하여, ECL 시스템 (Amersham Biosciences, Orsay, France)으로 실현하였다. 항-HC 항체는 A1 쇄를 특이적으로 검출하였다 (도 3).

이들 환원 상태에서, L4 및 ReFacto FVIII는 유사한 이동 프로필을 갖는다. L99는 대조군 FVIII LC와 유사한 분자량을 가진 LC를 갖는다. 그러나, 이의 HC의 이동은, 분자량을 증가시키는 링커의 존재로 인하여, 대조군과 상이하였다. 59 kDa 보충 밴드가 모든 시험 샘플에서 검출되었다.

실시예 4: 트롬빈 활성화

이후, 헤파린-정제된 FVIII를 트롬빈으로 활성화시켰다. 반응을 이소코브 변형된 둘베코 배지 (IMDM) 내에서 CaCl₂ (5 mM) 및 글리세롤 (2.5%)의 존재하에 실현하였다.

각 FVIII 분취량 (시점 당 98 ng)을 상이한 항온처리 시간 동안 0.49 U의 트롬빈으로 활성화시켰다. 반응을 히루딘 (0.98U)을 사용하여 차단시킨 다음, 즉시 Laemmli 완충제로 희석시켰다. 샘플을 면역블롯팅시켰다.

FVIII WT의 A1 쇄는, 트롬빈과 30초간 항온처리한 후, 명백히 검출되었으며, 이는 HC의 예상된 절단을 확인시켜준다. LC에 상응하는 시그날이 5 분간의 트롬빈 활성화 후 완전히 사라졌다. 트롬빈은 Arg1689를 절단하여, a3 도메인을 유리시키는 것으로 알려졌다. 이 결과는, 항-LC 항체가 a3 도메인 내에 있는 것으로 보이며, LC 도메인이 5분간의 트롬빈 활성화 후 완전히 절단된다는 것을 제시하였다. 트롬빈의 존재하에서 5분 후, FVIII WT의 HC 및 LC 둘 모두 완전히 활성화되는 것으로 입증되었다.

FVIII L99의 경우에, 이의 LC는 FVIII WT처럼 동일하게 절단되었다 (즉, 5분간의 트롬빈 항온처리 후 사라짐). 반대로, 예상된 바와 같이, 이의 HC의 이동 프로필은 트롬빈 활성화 후 변형되지 않은 상태였다. 게다가, A1 도메인 시그널이 더 긴 ECL 발색 시간에서도 전혀 보이지 않았다. 이 결과는, A1과 A2 사이의 절단이 방지되었음을 입증하는 것이다 (도 4).

실시예 5: FVIII L99 의 트롬빈 활성화 후 안정성

트롬빈 활성화된 WT-FVIII 또는 L99의 반감기의 연구는 FXa 생성 검정을 사용하여 수행하였다. 당해 시험은 50 ng의 FVIII 항원을 사용하여 수행하였다. 각FVIII를 트롬빈으로 2분간 활성화시키고, FVIIIa 잔존 활성을 상이한 시점에 측정하였다. 활성화된 FVIII WT 또는 L99 반감기의 측정은 FXa 생성 검정을 사용하여 수행하였다. 당해 시험은 37℃에서, 50 ng의 FVIII 항원을 사용하여, 150 ㎕ 최종 용적으로 수행하였다. FXa 생성은, 150 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.4 및 5 mM CaCl₂, 2 μM PC/PS 75/25 및 0.5 % BSA를 함유하는 완충제 중에서 이루어졌다. 각FVIII를 트롬빈으로 2분간 활성화시켰다. 이어서, 반응을 히루딘 (1U FVIII/1 U 트롬빈/2U 히루딘)으로 차단시켰다. 이후, FVIIIa 잔존 활성을, 93 nM FX, 1 nM FIXa 및 0.5 mM 스펙트로자임(Spectrozyme를) 함유하는 발색 혼합물을 첨가하고 상이한 시점에 측정하였다. 착색된 생성물의 출현이 405 nm에서 모니터되었다.

FVIII WT로부터의 FVIII 활성은 빠르게 감소하였다. 활성화된 FVIII WT의 반감기는 약 4.69 분인 것으로 밝혀졌다. L99의 경우에, 이의 활성은 트롬빈 활성화 후 대략 안정한 상태였으며, 1 시간의 항온처리 시간 동안 감소를 보이지 않았다 (도 5).

실시예 6: 활성화된 FVIII L99 의 APC 불활성화

단백질 S (Protein S: Diagnostica Stago, Asnieres, France, hAPC: Aventis Behring, Marburg, Germany)를 사용하거나 사용하지 않은 APC 불활성화를, 활성화된 헤파린-정제된 FVIII L99에 대해 시험하였다. 50 ng의 FVIII L99를, 단백질 S의 존재 또는 부재하에 사람 APC를 첨가하기 전에, 2분 동안 트롬빈으로 활성화시켰다. 상이한 시점에, 잔존 FVIII 활성을 FXa 생성 시험으로 검출하였다.

이들 결과는, FVIII L99가 단백질 S의 존재 또는 부재하에 사람 APC에 의해 불활성화될 수 있다는 것을 입증하였다. FVIII/APC 비가 감소되었을 때 (1/6), 불활성화는 이미 단일 APC를 사용한 이의 최대치였으며, 단백질 S의 첨가가 FVIlI 활성을 추가로 감소시키지 않았다.

결과의 요약:

Arg372에서 트롬빈 활성화 부위를 대체하는 상이한 펩티드 링커의 삽입을 특징으로 하는 여러 FVIII 돌연변이체가 생성되었다. 이들 변형된 FVIII는 COS 세포 형질감염 후 잘 발현되었다. FVIII LO은 FVIII 친응고 활성을 나타내지 않았고, 반면에, 링커를 보유하는 FVIII 돌연변이체는 친응고 활성을 가진다. 이러한 활성 수준은 링커의 길이에 부수적으로 증가하였으며, 99개 아미노산이 삽입되었을 때 최대치에 도달하였다. 시간측정 방법을 사용하는 경우에, FVIII L99로 검출된 FVIII 활성은 FVIII WT에 유사하였고, 반면에 FVIII L118 및 FVIII L159는 당해 분자의 추가적 개선을 나타내지 않았다. 헤파린-정제된 L99는 "1-단계"와 "2-단계" 응고 검정 사이에 불일치를 나타내었는데, 이는 지금까지 설명되지 못하고 있다. 그러나, 면역블롯 분석은 FVIII WT와 유사한 트롬빈 활성화 반응속도론을 입증하였으며, 시간측정 방법으로 측정되었을 때, 비활성은 FVIII WT 보다 더 높았다. 흥미롭게도, 활성화된 FVIII L99는 1 시간 넘게 거의 안정하였다. 최종적으로, APC는 이러한 변형된 FVIII를 인식하고, FVIII L99를 효율적으로 불활성화시킬 수 있었다.

<110> CSL BEHRING GMBH <120> Modified coagulation Factor VIII with enhanced stability and its derivates <130> 2005_M002_A101 <150> EP 05008152.0 <151> 2005-04-14 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7056 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> DNA <222> (1)..(7056) <223> <400> 1 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca 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gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700 atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760 ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820 aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880 tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940 gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060 attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120 cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180 caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240 tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300 cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360 atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420 accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480 cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540 cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600 agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660 acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720 caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780 ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840 atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900 gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960 ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020 gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tactga 7056 <210> 2 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PROTEIN <222> (1)..(2332) <223> <400> 2 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val 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Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His 1595 1600 1605 Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu 1610 1615 1620 Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln 1625 1630 1635 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 1640 1645 1650 Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile 1655 1660 1665 Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680 Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695 Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1730 1735 1740 Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1760 1765 1770 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 1785 Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 1790 1795 1800 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1910 1915 1920 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1925 1930 1935 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1940 1945 1950 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> DNA <222> (1)..(37) <223> <400> 3 ccttccttta tccaaattgc ctcagttgcc aagaagc 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> DNA <222> (1)..(37) <223> <400> 4 gcttcttggc aactgaggca atttggataa aggaagg 37 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> DNA <222> (1)..(36) <223> <400> 5 ctttatccaa attgcctcag gcgccaagaa gcatcc 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> DNA <222> (1)..(36) <223> <400> 6 ggatgcttct tggcgcctga ggcaatttgg ataaag 36 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> DNA <222> (1)..(44) <223> <400> 7 gtgccgggtc 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Claims

FVIII의 A1과 A2 도메인 사이의 트롬빈 절단이 방지되고, 따라서 트롬빈 활성화 후 A2 도메인이 A1 도메인에 공유결합된 상태로 남아 있도록 변형된, FVIII 활성화 형의 개선된 안정성을 가지면서 트롬빈 활성화 후 생물학적으로 활성인 변형된 재조합 FVIII 변이체.
제1항에 있어서, A2 도메인이, 트롬빈에 의해 절단되지 않는 펩티드 링커를 통해, A1 도메인에 공유결합된, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제2항에 있어서, 펩티드 링커가 아미노산 Gly 및 Ser의 반복체로 이루어진, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 펩티드 링커가 80 내지 120개의 아미노산으로 이루어진, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 펩티드 링커가 90 내지 110개의 아미노산으로 이루어진, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제2항 또는 제3항에 있어서, 펩티드 링커가 99개의 아미노산으로 이루어진, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, FVIII 야생형에 비해 50% 이상 증가된 작용성 반감기를 갖는, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 트롬빈에 의한 활성화 후 40분 에, 초기 피크 활성의 25% 이상을 유지하는, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이가 야생형 FVIII 내에, 또는 B-도메인이 부분적으로 또는 완전히 결실되고 링커에 의해 대체될 수 있는 FVIII 내에 삽입된, 변형된 생물학적 활성 재조합 FVIII 변이체.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 FVIII 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제10항에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
제11항에 있어서, 발현 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제11항에 있어서, 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터인 플라스미드 또는 벡터.
제10항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
a) 제14항에 따른 숙주 세포를 변형된 FVIII 변이체가 발현되는 조건하에 배양하는 단계; 및

b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 변형된 FVIII 변이체를 임의로 회수하는 단계

를 포함하여, 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 FVIII 변이체를 제조하는 방법.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 FVIII, 제10항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제11항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
혈액 응고 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 있어서, 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 FVIII, 제10항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터, 또는 제 14항에 따른 숙주 세포의 용도.
제17항에 있어서, 혈액 응고 질환이 A형 혈우병인 용도.
제17항 또는 제18항에 있어서, 치료가 사람 유전자 요법을 포함하는 용도.