TW202003554A - 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含因子VIII(FVIII)多肽及XTEN多肽之嵌合蛋白。該FVIII多肽可對馮威里氏因子(VWF)具有較小親和力。將適當尺寸之XTEN多肽插入該FVIII多肽中特定位置以延長該FVIII多肽之半衰期。本發明亦包括核苷酸、載體、宿主細胞及使用該等嵌合蛋白例如以治療出血疾病及病症之方法。

Description

因子VIII-XTEN融合物及其用途
本發明提供包含因子VIII(FVIII)多肽及XTEN多肽之嵌合蛋白。該FVIII多肽可對馮威里氏因子(VWF)具有較小親和力。將適當尺寸之XTEN多肽插入該FVIII多肽中特定位置以延長該FVIII多肽之半衰期。本發明亦包括核苷酸、載體、宿主細胞及使用該等嵌合蛋白例如以治療出血疾病及病症之方法。
A型血友病為一種由編碼凝血因子VIII(FVIII)之基因中之缺陷引起的出血病症且在10,000個男性新生兒中有1-2個病患。Graw等人，Nat.Rev.Genet.6(6)：488-501(2005)。可藉由輸注經純化或重組產生之FVIII來治療患有A型血友病之患者。然而，已知所有市售FVIII產品均具有約8-12小時之半衰期，從而需要頻繁地向患者靜脈內投藥。參見Weiner M.A.及Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001；Lillicrap,D.Thromb.Res.122增刊4：S2-8(2008)。另外，已經嘗試了大量方法以延長FVIII半衰期。舉例而言，延長凝血因子之半衰期的發展中之方法包括聚乙二醇化、糖聚乙二醇化及與白蛋白接合。參見Dumont等人，Blood.119(13)：3024-3030(2012年1月13日線上出版)。然而，不論使用何種蛋白質工程，目前處於開發中之長效FVIII產品據報導具有有限的半衰期，在臨床前動物模型中僅限於約1.5至2小時。參見上文。已經在人類中顯示了一致的結果，例如據報導rFVIIIFc與ADVATE®相比在A型血友病患者中使半衰期改良至高達約1.7倍。參見上文。因此，儘管改良較小，但半衰期增加仍可指示存在其他T1/2限制因素。參見Liu,T.等人，2007 ISTH會議，摘要編號P-M-035；Henrik,A.等人，2011 ISTH會議，摘要編號P=MO-181；Liu,T.等人，2011 ISTH會議，摘要編號P-WE-131。
血漿馮威里氏因子(von Willebrand Factor；VWF)之半衰期為約12小時(在9小時至15小時之範圍內)。VWF半衰期可受以下大量因素之影響：糖基化模式、ADAMTS-13(具有凝血栓蛋白基元-13之解整合素及金屬蛋白酶)，及VWF中之各種突變。
在血漿中，95-98%的FVIII係以與全長VWF之緊密非共價複合物的形式循環。形成此複合物對於維持FVIII之適當活體內血漿含量為重要的。Lenting等人，Blood.92(11)：3983-96(1998)；Lenting等人，J.Thromb.Haemost.5(7)：1353-60(2007)。全長野生型FVIII主要以具有重鏈(MW 200kD)及輕鏈(MW 73kD)之雜二聚體的形式存在。當FVIII因在重鏈中位置372及740及在輕鏈中位置1689之蛋白水解而活化時，結合於FVIII之VWF自經活化之FVIII移除。經活化之FVIII連同經活化之因子IX、鈣及磷脂一起(「tenase複合物」)誘導因子X之活化，從而產生大量凝血酶。凝血酶接著又會裂解纖維蛋白原以形成可溶性纖維蛋白單體，其接著自發聚合以形成可溶性纖維蛋白聚合物。凝血酶亦活化因子XIII，其連同鈣一起用以交聯且穩定化可溶性纖維蛋白聚合物，從而形成交聯(不溶性)纖維蛋白。經活化之FVIII藉由蛋白水解自循環中快速清除。
由於頻繁的給藥及由給藥方案引起之不便，因此仍需要開發需要較低投藥頻率之FVIII產品，即半衰期長於目前處於臨床評價之產品的半衰期限度之1.5至2倍的FVIII產品。
本文提供包含FVIII多肽及XTEN序列之嵌合蛋白。已發現含有(i)對馮威里氏因子(VWF)之親和力較低的FVIII多肽及(ii)XTEN序列之嵌合蛋白為尤其有利的。驚人的是，已顯示在FVIII多肽中之特定位置選擇性引入較短XTEN序列會進一步增加此等嵌合蛋白之半衰期。
因此，在一個實施例中，嵌合蛋白包含(i)因子VIII(FVIII)多肽及(ii)XTEN序列，其中該FVIII多肽對馮威里氏因子(VWF)之親和力較低。嵌合蛋白亦可包含至少四個XTEN序列。
在另一實施例中，嵌合蛋白包含(i)FVIII多肽及(ii)至少四個XTEN序列。
在一個實施例中，將XTEN序列插入FVIII多肽之A1域中、插入FVIII多肽之A2與A3域之間、插入FVIII多肽之A3域中及插入VIII多肽之C端。
在一個實施例中，至少四個XTEN序列中至少一者之長度不超過72個胺基酸。在一個實施例中，至少四個XTEN序列中至少一者之長度為36或42個胺基酸。
在一個實施例中，嵌合蛋白在FVIII多肽中之胺基酸與XTEN中之胺基酸之間包含間隔子。在一個實施例中，間隔子包含由具有限制位元點之多核苷酸編碼的裂解序列或胺基酸。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745-1685。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸741-1689。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1680。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽在全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1680中含有突變。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽含有突變Y1680F。在一個實施例中，FVIII多肽含有突變Y1680C。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含對應於全長成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸編號1669-1689的胺基酸。
在一個實施例中，將FVIII多肽連接於至少兩個XTEN序列、至少三個XTEN序列、至少四個XTEN序列、至少五個XTEN序列或至少六個XTEN序列。在一個實施例中，將FVIII多肽連接於至少四個XTEN序列。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1720的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1900的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1720及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1900及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745、1900及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1720、1900及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745、1720及2332的下游。
在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745及2332的下游。
在一個實施例中，XTEN序列之長度為36-72個胺基酸或長度為42至78個胺基酸。在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：22(36AE)。在一個實施例中，嵌合蛋白在XTEN序列與因子VIII多肽之間包含間隔子。在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：36(42AE)。在一個實施例中，XTEN插入位點在選自由以下組成之群的殘基之緊接下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、403或1720，或其任何組合。
在一個實施例中，至少兩個XTEN序列係選自由SEQ ID NO： 22(36AE)及SEQ ID NO：36(42AE)組成之群。在一個實施例中，至少兩個XTEN插入位點選自由以下組成之群的殘基之緊接下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、403或1720，或其任何組合。在一個實施例中，嵌合蛋白包含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745及2332之緊接下游的XTEN插入。在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：23(72AE)。在一個實施例中，嵌合蛋白在XTEN序列與因子VIII多肽之間包含間隔子。在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：24(78AE)。在一個實施例中，將XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403或1900或其任何組合之下游。
在一個實施例中，至少兩個XTEN序列係選自由SEQ ID NO：23(72AE)及SEQ ID NO：24(78AE)組成之群。在一個實施例中，將至少兩個XTEN緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403或1900或其任何組合之下游。在一個實施例中，嵌合蛋白進一步包含在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745及2332之緊接下游的XTEN插入。
在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：37(144AE)或SEQ ID NO：38(144AG)。在一個實施例中，嵌合蛋白在XTEN序列與因子VIII多肽之間包含間隔子。在一個實施例中，XTEN序列為SEQ ID NO：98(150AE)或SEQ ID NO：99(150AG)。在一個實施例中，XTEN插入位點在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403或1900之緊接下游。
在一個實施例中，至少兩個XTEN序列係選自由SEQ ID NO：37(144AE)、SEQ ID NO：38(144AG)、SEQ ID NO：98(150AE)及SEQ ID NO：99(150AG)組成之群。在一個實施例中，至少兩個XTEN插入在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403或1900之緊接下游。在一個實施例中，嵌合蛋白進一步包含在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745及2332之緊接下游的XTEN插入。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基18之下游的SEQ ID NO：22(36AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：37(144AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1900之 下游的SEQ ID NO：37(144AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：39(288AE)之XTEN序列。在一個實施例中，嵌合蛋白在各XTEN序列與FVIII多肽之間進一步包含間隔子。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基18之下游的SEQ ID NO：36(42AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：98(150AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1900之下游的SEQ ID NO：98(150AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：100(294 AE)之XTEN序列。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745-1685。在一個實施例中，FVIII多肽包含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1-744及1686-2332。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：37(144AE)或SEQ ID NO：39(288AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1720之下游的SEQ ID NO：22(36AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1900之下游的SEQ ID NO：37(144AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：39(288AE)之XTEN序列。在一個實施例中，嵌合蛋白在各XTEN序列與FVIII多肽之間進一步包含間隔子。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：98(150AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1720之下游的SEQ ID NO：36(42AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1900之下游的SEQ ID NO：98(150 AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：100(294AE)之XTEN序列。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745-1685。在一個實施例中，FVIII多肽包含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1-744及1686-2332。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基18之下游的SEQ ID NO：22(36AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：37(144AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1720之 下游的SEQ ID NO：22(36 AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：39(288AE)之XTEN序列。在一個實施例中，嵌合蛋白在各XTEN序列與FVIII多肽之間進一步包含間隔子。
在一個實施例中，至少4個XTEN序列包含緊接地插入殘基18之下游的SEQ ID NO：36(42AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基745之下游的SEQ ID NO：98(150AE)之XTEN序列、緊接地插入殘基1720之下游的SEQ ID NO：36(42AE)之XTEN序列，及緊接地插入殘基2332之下游的SEQ ID NO：100(294AE)之XTEN序列。
在一個實施例中，嵌合蛋白中之FVIII多肽不含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745-1685。在一個實施例中，FVIII多肽包含對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1-744及1686-2332。
在一個實施例中，XTEN序列延長FVIII多肽之半衰期。在一個實施例中，FVIII多肽當投與受試者時，其半衰期較之野生型FVIII蛋白之半衰期要延長至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。在一個實施例中，受試者係選自由小鼠、狗及人類組成之群。
在一個實施例中，FVIII多肽之半衰期為至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
本文亦提供編碼該等嵌合蛋白之多核苷酸。在一個實施例中，多核苷酸或一組多核苷酸編碼嵌合蛋白。在一個實施例中，多核苷酸進一步包含編碼PC5或PC7之多核苷酸鏈。
本文亦提供載體。在一個實施例中，載體包含編碼嵌合蛋白之多核苷酸及一或多個可操作地連接於該多核苷酸或該組多核苷酸之啟動 子。亦提供包含載體之組合物。在一個實施例中，組合物進一步包含另一載體，該另一載體包含編碼PC5或PC7之多核苷酸鏈。
本文亦提供宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞包含編碼嵌合蛋白之多核苷酸或多核苷酸組，或載體，或包含載體之組合物。在一個實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在一個實施例中，哺乳動物細胞係選自由HEK293細胞、CHO細胞及BHK細胞組成之群。
醫藥組合物包含嵌合蛋白、載體、組合物或宿主細胞，且亦提供醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中，藉由選自由以下組成之群的途徑投與醫藥組合物：表面投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。在一個實施例中，非經腸投與為靜脈內或皮下投與。在一個實施例中，使用該醫藥組合物以治療有需要之受試者的出血疾病或病狀。在一個實施例中，該出血疾病或病狀係選自由以下組成之群：出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何組合。在一個實施例中，受試者預定要經歷手術。在一個實施例中，治療為預防性的或按需的。
本文亦提供治療方法。在一個實施例中，治療有需要之受試者的出血疾病或病症之方法包括投與有效量之嵌合蛋白、多核苷酸、載體、組合物或宿主細胞。在一個實施例中，該出血疾病或病症係選自由以下組成之群：出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血及髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血病症為A型血友病。在一個實施例中，治療為預防性的或按需的。在一個實施例中，有效量為0.1μg/kg至500mg/kg。在一個實施例中，藉由選自由以下組成之群的途徑投與嵌合蛋白、多核苷酸、載體、組合物或宿主細胞：表面投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。在一個實施例中，非經腸投與係選自由以下組成之群：靜脈內投與、皮下投與、肌肉內投與及皮內投與。
本文亦提供製備嵌合蛋白之方法。在一個實施例中，該方法包括用多核苷酸、載體或組合物轉染一或多種宿主細胞並在宿主細胞中表現嵌合蛋白。
本文亦提供延長或增加FVIII蛋白之半衰期的方法。在一個實施例中，該方法包括將有效量之嵌合蛋白、多核苷酸、載體、組合物、宿主細胞或醫藥組合物添加至有需要之受試者，其中XTEN序列會延長或增加FVIII蛋白之半衰期。
在一個實施例中，將嵌合蛋白用於製備用於治療出血病症之藥物。在一個實施例中，提供用於治療A型血友病之嵌合蛋白。
E1.一種重組型FVIII蛋白，其包含：包含式I：(A1)-a1-(A2)-a2-[B]之第一多肽；及包含式II：a3-(A3)-(C1)之第二多肽；
其中該第一多肽與該第二多肽經融合或締合成雜二聚體；
其中，a)A1為FVIII之A1域；b)A2為FVIII之A2域；c)[B]視情況存在且為FVIII之B域或其片段；d)A3為FVIII之A3域；e)C1為FVIII之C1域；且f)a1、a2及a3為酸性間隔區；
其中在A1域中許可環-1區(A1-1)中、A1域中許可環-2區(A1-2)中、A2域中許可環-1區(A2-1)中、A2域中許可環-2區(A2-2)中、A3域中許可環-1區(A3-1)中、A3域中許可環-2區(A3-2)、a3區或其任何組合中之一或多個胺基酸為取代或缺失的；
其中FVIII蛋白包含至少一個XTEN；且
其中該重組型FVIII蛋白顯示促凝血活性。
E2.如實施例E1之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中。
E3.如實施例E1之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於該a3區中。
E4.如實施例E1至E3中任一項之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中至少一者或該a3區中。
E5.如實施例E1至E4中任一項之重組型FVIII蛋白，其中 該第一多肽與該第二多肽形成包含式(A1)-a1-(A2)-a2-[B]-[a3]-(A3)-(C1)之單一多肽鏈。
E6.如實施例E1至E5中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該第二多肽包含式[a3]-(A3)-(C1)-(C2)，其中(C2)為FVIII之C2域。
E7.如實施例E1、E2或E4至E6中任一項之重組型FVIII蛋白，其中根據儲存為DSSP資料庫之寄存編號2R7E的成熟因子VIII之二級結構，該許可環含於表面暴露的可撓性環結構中，且其中A1-1位於β股1和β股2之間、A1-2位於β股11和β股12之間、A2-1位於β股22和β股23之間、A2-2位於β股32和β股33之間、A3-1位於β股38和β股39之間且A3-2位於β股45和β股46之間。
E8.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A1-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸15至約胺基酸45的區域。
E9.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A1-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸18至約胺基酸41的區域。
E10.如實施例E1至E9中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-1中。
E11.如實施例E10之重組型FVIII蛋白，其中A1-1中該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸19至22、胺基酸19至26、胺基酸19至32、胺基酸19至40、胺基酸23至26、胺基酸23至32、胺基酸23至40、胺基酸27至32、胺基酸27至40，或胺基酸33至40。
E12.如實施例E10或E11之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E13.如實施例E10或E11之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII之在A1-1中的胺基酸18、胺基酸22、胺基酸26或胺基酸32的下游。
E14.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A1-2之 該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸201至約胺基酸232的區域。
E15.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A1-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸218至約胺基酸229的區域。
E16.如實施例E1至E15中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-2中。
E17.如實施例E16之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E18.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A2-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸395至約胺基酸421的區域。
E19.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A2-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸397至約胺基酸418的區域。
E20.如實施例E1至E19中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A2-1中。
E21.如實施例E20之重組型FVIII蛋白，其中在A2-1中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之在A2-1中之胺基酸400至403。
E22.如實施例E20或實施例E21之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E23.如實施例E20或實施例E21之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII的在A2-1中之胺基酸399之下游。
E24.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A2-2之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸577至約胺基酸635的區域。
E25.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A2-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸595至約胺基酸607的區域。
E26.如實施例E1至E25中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A2-2中。
E27.如實施例E26之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E28.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A3-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1705至約胺基酸1732的區域。
E29.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A3-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。
E30.如實施例E1至E29中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A3-1中。
E31.如實施例E30之重組型FVIII蛋白，其中在A3-1中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1712至1720、胺基酸1712至1725或胺基酸1721至1725。
E32.如實施例E30或實施例E31之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E33.如實施例E30或實施例E31之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII的在A3-1中之胺基酸1711或胺基酸1720之下游。
E34.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中包含A3-2之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1884至約胺基酸1917的區域。
E35.如實施例E7之重組型FVIII蛋白，其中A3-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1899至約胺基酸1911 的區域。
E36.如實施例E1至E35之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A3-2中。
E37.如實施例E36之重組型FVIII蛋白，其中在A3-2中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1901至1905、胺基酸1901至1910、胺基酸1906至1910、胺基酸1901至1905、胺基酸1901至1910或胺基酸1906至1910。
E38.如實施例E36或實施例E37之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E39.如實施例E36或實施例E37之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII的在A3-2中之胺基酸1900或胺基酸1905之下游。
E40.如實施例E1至E39中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於a3區中。
E41.如實施例E40之重組型FVIII蛋白，其中在該a3區中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1649至1689。
E42.如實施例E40或實施例E41之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或a3區中之至少一者中。
E43.如實施例E40或實施例E41之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1645之下游。
E44.如實施例E1至E43中任一項之重組型FVIII蛋白，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2區及該a3區中之至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或七者中之一或多個胺基酸為取代或缺失的。
E45.如實施例E44之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2區及該a3區中之至少兩者、至 少三者、至少四者、至少五者、至少六者或七者中。
E46.如實施例E45之重組型FVIII蛋白，其中將XTEN緊接地插入對應於成熟原生人類FVIII中之選自以下之胺基酸的胺基酸之下游：SEQ ID NO：4之胺基酸18、SEQ ID NO：4之胺基酸22、SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸40、SEQ ID NO：4之胺基酸216、SEQ ID NO：4之胺基酸220、SEQ ID NO：4之胺基酸224、SEQ ID NO：4之胺基酸336、SEQ ID NO：4之胺基酸339、SEQ ID NO：4之胺基酸399、SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸409、SEQ ID NO：4之胺基酸599、SEQ ID NO：4之胺基酸603、SEQ ID NO：4之胺基酸1711、SEQ ID NO：4之胺基酸1720、SEQ ID NO：4之胺基酸1725、SEQ ID NO：4之胺基酸1900、SEQ ID NO：4之胺基酸1905、SEQ ID NO：4之胺基酸1910，或其任何組合。
E47.如實施例E1至E46中任一項之重組型FVIII蛋白，其包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個插入FVIII蛋白中之XTEN。
E48.如實施例E47之重組型FVIII蛋白，其中將至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個XTEN中之一或多者插入FVIII蛋白之B域或a1區中或融合於FVIII蛋白之C端，或其任何組合。
E49.如實施例E1至E48中任一項之重組型FVIII蛋白，其中至少兩個XTEN為相同或不同的。
E50.如實施例E1至E49中任一項之重組型FVIII蛋白，其中至少一個XTEN包含插入FVIII序列中之一或多個胺基酸的序列。
E51.如實施例E1至E50中任一項之重組型FVIII蛋白，其進一步在各XTEN與該FVIII多肽之間包含間隔子。
E52.如實施例E1至E51中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該XTEN會增加該重組型FVIII蛋白之活體內半衰期。
E53.如實施例E52之重組型FVIII蛋白，其中該XTEN包含36AE、36AG、42AE、42AG、72AE、72AG、144AE、144AG、288AE、288AG、576AE、576AG、864AE。
E54.如實施例E53之重組型FVIII蛋白，其中該XTEN包含選自由SEQ ID NO：22-34、36-44及94-108組成之群的序列。
E55.如實施例E1至E54中任一項之重組型FVIII蛋白，其中至少一個XTEN包含提高該蛋白質之穩定性的元件。
E56.如實施例E1至E55中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該重組型FVIII蛋白具有原生FVIII之促凝血活性之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
E57.如實施例E1至E56中任一項之重組型FVIII蛋白，其中該促凝活性係藉由顯色基質分析、單級凝血分析或兩者來量測。
E58.一種融合蛋白，其包含如實施例E1至E57中任一項之重組型FVIII蛋白。
E59.一種核酸，其包含編碼如實施例E1至E57中任一項之重組型FVIII蛋白的序列。
E60.一組核酸，其包含一組編碼如實施例E1至E57中任一項之重組型FVIII蛋白的序列或如實施例E58之融合蛋白。
E61.一種表現載體，其包含如實施例59之核酸或如實施例60之核酸組。
E62.一組表現載體，其包含如實施例E60之核酸組。
E63.一種宿主細胞，其包含如實施例E59之核酸、如實施例E60之核酸組、如實施例E61之載體或如實施例E62之表現載體組。
E64.如實施例E63之宿主細胞，其中該重組型FVIII蛋白為活體內表現的。
E65.如實施例E64之宿主細胞，其中該重組型FVIII蛋白為活體外表現的。
E66.一種製造重組型FVIII蛋白之方法，其包括在使該重組型FVIII蛋白表現之條件下培養如實施例E63至E65中任一項之宿主細胞。
E67.一種組合物，其包含如實施例E1至E57中任一項之重組型FVIII蛋白、如實施例E58之融合蛋白、如實施例E59之核酸、如 實施例E60之核酸組、如實施例E61之表現載體、如實施例E62之表現載體組或如實施例E63至E65中任一項之宿主細胞，及醫藥學上可接受之賦形劑。
E68.一種藉由投與有效量之如實施例E67之組合物來預防、治療、改善或管理有需要之患者的凝血疾病或病狀之方法。
E69.一種用如實施例E67之組合物對患者之凝血疾病或病狀進行診斷或成像的方法。
E70.一種製備重組型FVIII蛋白之方法，其包括取代或缺失在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2、a3區或其任何組合中之一或多個胺基酸，其中該重組型FVIII蛋白包含XTEN且顯示促凝血活性。
E71.如實施例E70之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中。
E72.如實施例E71方法，其中將XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2區或該a3區中之至少兩者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或七者中。
E73.如實施例E70或E71中任一項之方法，其中將該XTEN緊接地插入對應於成熟原生人類FVIII中之選自由以下組成之群的胺基酸之胺基酸的下游：SEQ ID NO：4之胺基酸18、SEQ ID NO：4之胺基酸22、SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸40、SEQ ID NO：4之胺基酸216、SEQ ID NO：4之胺基酸220、SEQ ID NO：4之胺基酸224、SEQ ID NO：4之胺基酸336、SEQ ID NO：4之胺基酸339、SEQ ID NO：4之胺基酸399、SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸409、SEQ ID NO：4之胺基酸599、SEQ ID NO：4之胺基酸603、SEQ ID NO：4之胺基酸1645、SEQ ID NO：4之胺基酸1711、SEQ ID NO：4之胺基酸1720、SEQ ID NO：4之胺基酸1725、SEQ ID NO：4之1900、SEQ ID NO：4之胺基酸1905、SEQ ID NO：4之胺基酸1910，及其任何組合。
E74.如實施例E70至E73中任一項之方法，其中將另一XTEN插入B域中或融合於C端。
E75.如實施例E74之方法，其中將該另一XTEN緊接地插 入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745或SEQ ID NO：4之胺基酸2332的胺基酸之下游。
E76.如實施例E70至E75中任一項之方法，其中至少一個XTEN包含一或多個插入該FVIII序列中之胺基酸的序列。
E77.如實施例E70至E76中任一項之方法，其中至少一個XTEN會增加該蛋白質之活體內半衰期。
E78.一種增加FVIII蛋白之半衰期的方法，其包括取代或缺失一或多個在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2、a3區或其任何組合中之胺基酸，並將至少一個XTEN插入該一或多個取代或缺失的胺基酸中，其中與未有至少一個XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2、a3區或其任何組合中之相應FVIII蛋白之表現相比，插入至少一個XTEN使得該FVIII蛋白之半衰期增加。
E79.如實施例E78之方法，其中根據儲存為DSSP資料庫之寄存編號2R7E的成熟因子VIII之二級結構，許可環含於表面暴露的可撓性環結構中，且其中A1-1位於β股1和β股2之間、A1-2位於β股11和β股12之間、A2-1位於β股22和β股23之間、A2-2位於β股32和β股33之間、A3-1位於β股38和β股39之間且A3-2位於β股45和β股46之間。
E80.如實施例E79之方法，其中包含A1-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸15至約胺基酸45的區域。
E81.如實施例E79之方法，其中A1-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸18至約胺基酸41的區域。
E82.如實施例E79至E81中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-1中。
E83.如實施例E82之方法，其中A1-1中該一或多個缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸19至22、胺基酸19至26、胺基酸19至32、胺基酸19至40、胺基酸23至26、胺基酸23至32、胺基酸23至40、胺基酸27至32、胺基酸27至40或胺基酸33至40。
E84.如實施例E82或E83之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E85.如實施例E82或E83之方法，其中將該XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII之在A1-1中的胺基酸18、胺基酸22、胺基酸26或胺基酸32的下游。
E86.如實施例E79之方法，其中包含A1-2之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸201至約胺基酸232的區域。
E87.如實施例E79之方法，其中A1-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸218至約胺基酸229的區域。
E88.如實施例E78至E87中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A1-2中。
E89.如實施例E88之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E90.如實施例E79之方法，其中包含A2-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸395至約胺基酸421的區域。
E91.如實施例E79之方法，其中A2-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸397至約胺基酸418的區域。
E92.如實施例E79至E91中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A2-1中。
E93.如實施例E92之方法，其中在A2-1中之該一或多個缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸400至403。
E94.如實施例E92或實施例E93之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E95.如實施例106或實施例107之方法，其中將該XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII之胺基酸399的下游。
E96.如實施例E79之方法，其中包含A2-2之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸577 至約胺基酸635的區域。
E97.如實施例E79之方法，其中A2-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸595至約胺基酸607的區域。
E98.如實施例E78至E97中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A2-2中。
E99.如實施例E98之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E100.如實施例E79之方法，其中包含A3-1之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1705至約胺基酸1732的區域。
E101.如實施例E79之方法，其中A3-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。
E102.如實施例E78至E101中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A3-1中。
E103.如實施例E102之方法，其中在A3-1中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1712至1720、胺基酸1712-1725或胺基酸1721-1725。
E104.如實施例E102或實施例E103之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E105.如實施例E102或實施例E103之方法，其中將該XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII之胺基酸1711或胺基酸1720的下游。
E106.如實施例E79之方法，其中包含A3-2之該表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1884至約胺基酸1917的區域。
E107.如實施例E79之方法，其中A3-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。
E108.如實施例E78至E107之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於A3-2中。
E109.如實施例E108之方法，其中在A3-2中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1901-1905、胺基酸1901-1910、胺基酸1906-1910、胺基酸1901-1905、胺基酸1901-1910或胺基酸1906-1910。
E110.如實施例E108或實施例E109之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E111.如實施例E108或實施例E109之方法，其中將該XTEN緊接地插入對應於原生人類FVIII之胺基酸1900或胺基酸1905的下游。
E112.如實施例E78至E111中任一項之方法，其中該一或多個取代或缺失的胺基酸處於該a3區中。
E113.如實施例E112之方法，其中在該a1區中之該一或多個取代或缺失的胺基酸包含對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1649至1689。
E114.如實施例E78或實施例E113之方法，其中將該XTEN插入A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2或該a3區中。
E115.如實施例E113或實施例E114之方法，其中將XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII的在a3區中之胺基酸1656之下游。
圖1. 包含FVIII多肽及XTEN插入之嵌合蛋白的半衰期。向DKO小鼠及HemA小鼠投與含有具有各種尺寸且在各種位置的XTEN插入之嵌合蛋白，且量測嵌合蛋白之半衰期。DKO小鼠中之測試VWF結合FVIII多肽(例如在FVIII胺基酸745-1685中無缺失之FVIII多肽)係與HemA小鼠中之測試VWF結合缺陷型FVIII多肽(例如不含胺基酸745-1685之FVIII多肽)相當。
圖2. 包含對VWF之結合減小的FVIII多肽及4個XTEN插入之嵌合蛋白的半衰期。向HemA小鼠投與嵌合蛋白pNL0044、pNL0049、pNL0050及pNL0051及重組型因子VIII，且量測該等蛋白質之半衰期。
圖3. XTEN尺寸及插入位點對嵌合蛋白半衰期之影響。向 DKO小鼠投與含有具有各種尺寸且在各種位置的XTEN插入之嵌合蛋白，且量測嵌合蛋白之半衰期。
圖4. 用以置換環A1-1之全部或部分的方法之實例。
圖5A-F. 示出了XTEN插入對包含FVIII多肽之嵌合構築體之半衰期影響的圖。圖5A示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，嵌合構築體pKY0038(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸220(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。圖5B示出了示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，嵌合構築體pKY0040(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸333(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。圖5C示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，pKY0044(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸403(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。圖5D示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，pKY0045(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸599(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。圖5E示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，pKY0047(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸1900(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。圖5F示出了與鹼基載體pNL0051之FVIII活性相比，pKY0050(編碼在胺基酸18(AE42)、胺基酸1720(AE42)、B域(AE144)、C端(AE288)及胺基酸2171(AE42)具有XTEN插入之FVIII多肽)之FVIII活性。各圖指示插入第五個42aa XTEN之嵌合蛋白的區域。
定義
應注意，術語「一個(種)」實體係指該實體中之一或多者；例如將「一個」核苷酸序列理解為表示一或多個核苷酸序列。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」與「至少一個(種)」可在本文中互換使用。
術語「多核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單數個核酸以及複數個核酸，且係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質 體DNA(pDNA)。在某些實施例中，多核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所見者)。術語「核酸」係指多核苷酸中存在之任何一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。「分離之」核酸或多核苷酸意欲為核酸分子，DNA或RNA，其已自其原生環境中移除。舉例而言，將載體中所含之編碼因子VIII多肽之重組型多核苷酸視為經分離，以達成本發明之目的。分離之多核苷酸的其他實例包括保持在異源宿主細胞中或自溶液中之其他多核苷酸(部分或實質上)純化之重組型多核苷酸。分離之RNA分子包括本發明之多核苷酸的活體內或活體外RNA轉錄物。根據本發明的分離之多核苷酸或核酸進一步包括此等合成製備之分子。另外，多核苷酸或核酸可包括調節性元件，諸如啟動子、強化子、核糖體結合位點或轉錄終止信號。
如本文所用，「編碼區」或「編碼序列」為由可轉譯成胺基酸之密碼子組成的多核苷酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不會轉譯成胺基酸，但可將其視為編碼區之部分，而任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似物不為編碼區之部分。編碼區之邊界通常由編碼所得多肽之胺基端的在5'端之起始密碼子以及編碼所得多肽之羧基端的在3'端之轉譯終止密碼子決定。兩個或兩個以上本發明之編碼區可存在於單一多核苷酸構築體中，例如在單一載體上，或在獨立多核苷酸構築體中，例如在獨立(不同)載體上。則由此得出，單一載體可僅含有單一編碼區，或包含兩個或兩個以上編碼區，例如單一載體可分別地編碼結合域A及結合域B，如下所述。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明之結合域的核酸融合或不融合之異源編碼區。異源編碼區包括(不限於)專門元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。
一旦穿過粗糙型內質網之生長中蛋白質鏈之出口已啟用，某些由哺乳動物細胞分泌之蛋白質便與自成熟蛋白質裂解之分泌性信號肽締合。一般熟習此項技術者知曉，信號肽通常與多肽之N端融合，且自完整或「全長」多肽裂解以產生多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，原生信號肽或該序列之功能衍生物保留引導與其可操作地締合之多肽之分 泌的能力。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，例如人類組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸酶信號肽，或其功能衍生物。
術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'的核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列涉及在轉錄起始點之後的序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。
術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'的核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列涉及位於編碼區之5'或轉錄起始點之序列。舉例而言，大多數啟動子位於轉錄起始位點之上游。
如本文所用，術語「調節區」係指位於編碼區之上游(5'非編碼序列)、之中或下游(3'非編碼序列)且影響所締合編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調節區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點及莖環結構。若編碼區意欲用於在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'處。
編碼基因產物(例如多肽)之多核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件。在可操作的締合中，基因產物(例如多肽)之編碼區係與一或多個調節區以一定方式締合以便使基因產物之表現處於調節區之影響或控制下。舉例而言，若啟動子功能之誘導使得編碼由編碼區編碼之基因產物的mRNA得到轉錄，且若在啟動子與編碼區之間的連接之性質不干擾啟動子引導基因產物表現之能力或不干擾待轉錄DNA範本之能力，則編碼區與啟動子為「可操作地締合的」。除啟動子之外，其他轉錄控制元件，例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。
熟習此項技術者已知多種轉錄控制區。其包括(不限於)在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如(但不限於)來自巨細胞病毒(與內含子-A結合之即刻早期啟動子)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))之啟動子及強化子區段。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因，諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白，以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列的轉錄控制 區。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及淋巴介質誘導性啟動子(例如可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，一般熟習此項技術者已知多種轉譯控制元件。其包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及來源於微小核醣核酸病毒之元件(特定言之為內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。
如本文所用，術語「表現」係指多核苷酸產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。其包括(不限於)多核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其他RNA產物，及mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如聚腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質次單元締合或解蛋白性裂解)之多肽。
「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒介物。載體可為另一核酸區段可連接以使連接區段得到複製之複製子。「複製子」係指用作活體內複製之自動單元，即能夠在其自身控制下複製的任何基因元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於將核酸引入活體外、體外或活體內細胞中之病毒與非病毒媒介物。大量載體為已知的且用於此項技術中，包括例如質體、經修飾之真核病毒或經修飾之細菌性病毒。將多核苷酸插入適合載體中可藉由將適當的多核苷酸片段接合至具有互補性黏性末端之所選載體之所選載體中來實現。
可對載體工程改造以編碼對已幷有載體之細胞提供選擇或識別的可選標記或報導子。可選標記或報導子之表現允許識別及/或選擇幷有且表現載體上所含之其他編碼區的宿主細胞。已知且用於此項技術中之可選標記基因的實例包括：提供對安比西林(ampicillin)、鏈黴素(streptomycin)、健他黴素(gentamycin)、康微素(kanamycin)、潮黴素(hygromycin)、雙丙胺膦除草劑(bialaphos herbicide)、磺醯胺及其類似物之抗性的基因；及用作表型標記之基因，即花青素調節基因、異芬太尼轉移 酶基因及其類似物。已知且用於此項技術中之報導子的實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白質(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、半乳糖苷酶(LacZ)、葡萄糖醛酸酶(Gus)及其類似物。亦可將可選標記視為報導子。
術語「質體」係指經常帶有如下基因之額外染色體元件：該基因不為細胞之中樞代謝之部分，且通常呈圓形雙股DNA分子形式。此等元件可為來源於任何來源之單股或雙股DNA或RNA之線性、圓形或超螺旋形自動複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中大量核苷酸序列已接合或再結合成獨特結構，其能夠將所選基因產物之啟動子片段及DNA序列以及適當的3'未轉譯序列引入細胞中。
可使用之真核病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒，例如痘瘡病毒載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。
「選殖載體」係指「複製子」，其為依次複製之核酸的單位長度且包含複製起點，諸如質體、噬菌體或黏質體，另一核酸區段可與其連接以使連接區段得到複製。某些選殖載體能夠在一個細胞類型(例如細菌)中複製且在另一例如真核細胞中表現。選殖載體通常包含一或多個可用於選擇包含載體之細胞的序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。
術語「表現載體」係指設計以在插入宿主細胞中之後使插入之核酸序列能夠表現之媒介物。將插入之核酸序列置為與上述調節區可操作地締合。
藉由此項技術熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如為轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE聚葡萄糖、磷酸鈣沈澱、脂轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體輸送體。
如本文所用，「培養」意謂在允許細胞生長或細胞分裂或維持細胞處於存活狀態之活體外條件下培育細胞。如本文所用，「經培養之細胞」意謂活體外增殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數的「多肽」以及複 數的「多肽」，且係指由藉由醯胺鍵(亦稱肽鍵)線性連接之單體(胺基酸)組成的分子。術語「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何鏈，且不指特定長度之產物。因此，用以指兩個或兩個以上胺基酸之鏈的肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或任何其他術語係包括於「多肽」之定義內，且術語「多肽」可代替此等術語中任一者使用或可與此等術語中任一者互換使用。術語「多肽」亦意欲指多肽之表現後修飾的產物，該等修飾包括(不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護基團/封端基團而衍生、解蛋白性裂解或藉由非天然存在之胺基酸進行修飾。多肽可來源於天然生物來源或所產生之重組型技術，但不一定自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式，包括藉由化學合成而產生。
「分離之」多肽或片段、其變異體或衍生物係指不在其天然環境中之多肽。不需要特定的純化程度。舉例而言，分離之多肽可簡單地自其原生或天然環境移除。將在宿主細胞中表現之重組產生之多肽及蛋白質視為分離的以達成本發明之目的，已藉由任何適合技術經分離、分級分離或者部分或實質上純化之原生或重組型多肽亦如此。
多肽之片段或變異體及其任何組合亦包括在本發明中。當提及本發明之多肽結合域或結合分子時，術語「片段」或「變異體」包括保留參考多肽之至少一些性質(例如對FcRn結合域或Fc變異體之FcRn結合親和力、對FVIII變異體之凝血活性，或對VWF片段之FVIII結合活性)之任何多肽。除本文別處討論之特異性抗體片段以外，多肽片段亦包括蛋白分解片段，以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本發明之多肽結合域或結合分子之變異體包括如上所述之片段，以及胺基酸序列因胺基酸取代、缺失或插入而改變之多肽。變異體可為天然或非天然存在的。可使用此項技術中已知之突變誘發技術產生非天然存在之變異體。變異型多肽可包含保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或添加。
「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、 酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支鏈側鏈(例如酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。胺基酸可基於其疏水性得到表徵。已開發出大量標度。一個實例為由Levitt,M等人，J Mol Biol(1976)104：59開發之標度，其係列於Hopp,TP等人，Proc Natl Acad Sci U S A(1981)78：3824中。「親水性胺基酸」之實例為精胺酸、離胺酸、酥胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸及絲胺酸，及甘胺酸。「疏水性胺基酸」之實例為色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸及纈胺酸。因此，若多肽中之胺基酸經來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則將該取代視為保守的。在另一實施例中，一系列胺基酸可經在側鏈家族之次序及/或組成方面不同的結構上類似之系列保守置換。
如此項技術中已知，藉由將一種多肽之胺基酸序列與第二多肽之序列相比來測定兩種多肽之間的「序列一致性」。當本文討論時，可使用此項技術中已知之方法及電腦程式/軟體測定任何特定多肽與另一多肽是否至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致，該等電腦程式/軟體諸如為(但不限於)BESTFIT程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，對於Unix為第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)之局部同源演算法以找到兩個序列之間的最好同源區段。當使用BESTFIT或任何其他序列比對程式以確定特定序列是否例如與根據本發明之參考序列95%一致時，設定參數，當然以允許在參考多肽序列之全長上計算一致性百分比且允許該參考序列中胺基酸總數之至多5%之同源性間隙。
如本文所用，藉由比對識別FVIII蛋白序列中之「對應於...之胺基酸」或「等效胺基酸」以最大化在第一FVIII序列與第二FVIII序列之間的一致性或相似性。用以識別第二FVIII序列中之等效胺基酸的編號係基於用以識別第一FVIII序列中之相應胺基酸的編號。
如本文所用，術語「插入位點」係指在FVIII多肽或其片段、 變異體或衍生物中之位置，其為可插入異源部分之位置之緊接的上游。以編號指定「插入位點」，該編號為在插入位置之緊接的N端之插入位點所對應之在成熟原生FVIII(SEQ ID NO：4)中胺基酸之編號。舉例而言，片語「在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656的插入位點包含XTEN之a3」表示異源部分位於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與胺基酸1657之兩個胺基酸之間。
如本文所用，片語「胺基酸之緊接的下游」係指在胺基酸之末端羧基的緊下一個位置。類似地，片語「胺基酸之緊接的上游」係指在胺基酸之末端胺基的緊下一個位置。因此，如本文所用，片語「在插入位點之兩個胺基酸之間」係指將XTEN或任何其他多肽插於兩個相鄰胺基酸之間的位置。因此，短語「緊接地插入胺基酸之下游」及「插於插入位點之兩個胺基酸之間」係與「在插入位點插入」同義使用。
如本文所用，「插入」或語法上相關之術語係指相對於在原生成熟人類FVIII中之類似位置，嵌合多肽中XTEN之位置。如本文所用，該等術語係指重組型FVIII多肽相對於原生成熟人類FVIII之特徵，且不指示、暗示或推斷製備嵌合多肽之任何方法或工藝。舉例而言，關於本文提供之嵌合多肽，片語「將XTEN插入FVIII多肽之殘基745之緊接的下游」意謂嵌合多肽包含在對應於原生成熟人類FVIII中胺基酸745之胺基酸之緊接的下游之XTEN，例如藉由對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸745及746之胺基酸而結合。
如本文所用，「內部XTEN」係指已插入FVIII序列中之XTEN序列。內部XTEN可藉由將XTEN序列插入FVIII序列中來構築，藉由在一個域中(「域內」)之兩個相鄰胺基酸之間或在FVIII之兩個域之間(「域間」)插入或其中以XTEN置換FVIII之部分內部序列來達成。
如本文所用，「末端XTEN」係指已融合於FVIII之N端或C端或融合於其中或在FVIII之N端或C端融合於解蛋白性裂解序列或連接子之XTEN序列。末端XTEN可融合於FVIII之原生端。或者，末端XTEN可置換FVIII之末端序列之一部分。
術語「XTEN釋放位點」係指嵌合FVIII-XTEN融合蛋白中 可由哺乳動物蛋白酶識別及裂解，從而實現XTEN或XTEN之一部分自嵌合FVIII-XTEN融合蛋白釋放之裂解序列。如本文所用，「哺乳動物蛋白酶」意謂通常存在於哺乳動物之體液、細胞或組織中的蛋白酶。可對XTEN釋放位元點工程改造以經各種哺乳動物蛋白酶(又名「XTEN釋放蛋白酶」)，諸如FXIa、FXIIa、血管舒素、FVIIIa、FVIIIa、FXa、FIIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP-20或在凝血事件期間存在之任何蛋白酶裂解。可利用能夠識別規定裂解位點之其他等效的蛋白酶(內源性或外源性)。可針對所用蛋白酶調整及定製裂解位點。
「融合」或「嵌合」蛋白包含連接於第二胺基酸序列之第一胺基酸序列，該等胺基酸序列在自然界中幷非天然連接。通常存在於獨立蛋白質中之胺基酸序列可集合於融合多肽中，或通常存在於同一蛋白質中之胺基酸序列可以新的排列置於融合多肽中，例如將本發明之因子VIII域與Ig Fc域融合。例如藉由化學合成或藉由產生及轉譯以所需關係編碼肽區之多核苷酸來產生融合蛋白。嵌合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽之活體內生物半衰期。半衰期可由投與受試者之量的一半自動物體內之循環及/或其他組織清除所需之時間表示。當隨時間構築既定多肽之清除曲線時，曲線通常為雙相的，具有快速α相及較久的β相。α相通常表示所投與之多肽在血管內空間與血管外空間之間的平衡且部分地由多肽尺寸決定。β相通常表示血管內空間中多肽之分解代謝。在一些實施例中，FVIII及包含FVIII之嵌合蛋白為單相的，因此不具有α相，但僅具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用之術語半衰期係指多肽在β相中之半衰期。人類抗體在人類體內之典型β相半衰期為21天。
如本文所用，術語「連接」係指使第一胺基酸序列或核苷酸序列分別地共價或非共價接合於第二胺基酸序列或核苷酸序列。可使第一胺基酸或核苷酸序列直接接合或幷接於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」意謂不僅使第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C端或N端融合，而且包括將整個第一胺 基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或分別地，第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，可藉由肽鍵或連接子將第一胺基酸序列連接於第二胺基酸序列。可藉由磷酸二酯鍵或連接子將第一核苷酸序列連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(針對多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(針對核苷酸鏈)或任何化學部分(針對多肽與多核苷酸鏈兩者)。術語「連接」亦由連字符(-)表示。
本文所用之術語「單體-二聚物混成體」係指包含藉由二硫鍵彼此締合之第一多肽鏈與第二多肽鏈之嵌合蛋白，其中第一鏈包含凝血因子，例如因子VIII，及第一Fc區，且第二鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：無凝血因子之第二Fc區。單體-二聚物混成體構築體因此為包含以下之混成體：僅具有一種凝血因子之單體態樣及具有兩個Fc區之二聚物態樣。
如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。某些酶促裂解位點包含細胞內加工位點。在一個實施例中，多肽具有由在凝血級聯期間活化之酶裂解的酶促裂解位點，以使此等位點之裂解出現在凝血形成之位點。例示性此等位點包括，例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別之位點。FXIa裂解位點包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：45)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：46)。例示性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：47)、TTKIKPR(SEQ ID NO：48)、LVPRG(SEQ ID NO：49)及ALRPR(SEQ ID NO：50之胺基酸1至5)。此項技術中已知其他酶促裂解位點。
如本文所用，止血病症意謂一種基因遺傳性或後天性病狀，其特徵在於由形成纖維蛋白凝塊之能力削弱或不能形成纖維蛋白凝塊造成之自發性或創傷導致性出血傾向。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏症)、B型血友病(因子IX缺乏症或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」及C型血友病(因子XI缺乏症，出血趨適度勢)。其他止血病症包括例如馮威里氏因子；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII之缺乏或結構異常；伯-蘇氏症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為 GPIb之缺陷或缺乏。GPIb，即VWF之受體可具有缺陷且導致缺乏主要凝塊形成(主要止血法)及增大之出血趨勢，及格蘭茨曼及內格利血小板無力症(thrombasthenia of Glanzman and Naegeli)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝功能衰竭(急性及慢性形式)中，肝產生之凝血因子不足；此可提高出血風險。
可預防性使用本發明之嵌合分子。如本文所用，術語「預防性治療」係指在出血事件之前投與分子。在一個實施例中，需要一般止血劑之受試者正在經歷或即將經歷手術。可在手術之前或之後投與本發明之嵌合蛋白作為預防劑。可在手術期間或之後投與本發明之嵌合蛋白以控制急性出血事件。手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除術、牙科程式或幹細胞移植。
本發明之嵌合蛋白亦用於按需治療。術語「按需治療」係指響應於出血事件之症狀或在可能引起出血之活動之前投與嵌合分子。在一個態樣中，當開始出血時，諸如在損傷之後，或當預期有出血時，諸如在手術之前，可給予受試者以按需治療。在另一態樣中，可在提高出血風險之活動(諸如接觸類運動)之前給予按需治療。
如本文所用，術語「急性出血」係指不論下伏原因如何之出血事件。舉例而言，受試者可能有創傷、尿毒癥、遺傳性出血病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症或由抗體針對凝血因子進化所造成之抗性。
如本文所用，「治療」係指例如降低疾病或病狀之嚴重度；減少疾病過程之持續時間；改善一或多個與疾病或病狀相關之症狀；向患有疾病或病狀之受試者提供有益效果，而不一定治癒該疾病或病狀，或預防一或多個與疾病或病狀相關之症狀。在一個實施例中，術語治療意謂藉由投與本發明之嵌合蛋白或VWF片段將受試者體內之FVIII最低含量維持為至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一實施例中，治療意謂將FVIII最低含量維持在1IU/dL與20IU/dL、約2IU/dL與約20IU/dL、約3IU/dL與約20IU/dL、約4IU/dL與約20IU/dL、約5IU/dL 與約20IU/dL、約6IU/dL與約20IU/dL、約7IU/dL與約20IU/dL、約8IU/dL與約20IU/dL、約9IU/dL與約20IU/dL或約10IU/dL與約20IU/dL之間。治療疾病或病狀亦可包括將受試者體內之FVIII活性維持在與非血友病受試者體內FVIII活性之至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%相當之程度。治療所需之最小最低含量可藉由一或多種已知方法量測且可針對每個人進行調整(增大或減小)。
因子VIII(FVIII)蛋白
除非另有規定，否則如本文所用之「FVIII蛋白」或「FVIII多肽」意謂在正常發揮凝血作用之功能性FVIII多肽。術語FVIII蛋白包括其保留全長野生型因子VIII在凝血路徑中之功能的功能性片段、變異體、類似物或衍生物。術語FVIII蛋白可與FVIII多肽(或FVIII蛋白)或FVIII互換使用。FVIII功能之實例包括(但不限於)活化凝血之能力、充當因子IX之輔因子的能力，或在Ca2+及磷脂(其接著將因子X轉化成活化形式Xa)存在下與因子IX形成tenase之能力。FVIII蛋白可為人類、豬、犬類、大鼠或鼠類FVIII蛋白。另外，在人類FVIII與其他物種之FVIII之間的比較已識別出功能可能需要之保守殘基(Cameron等人，Thromb.Haemost.79：317-22(1998)；US 6,251,632)。
在某些態樣中，本發明之FVIII多肽對馮威里氏因子(VWF)之親和力較小。下文較詳細地描述對VWF之親和力較小的例示性多肽。
大量測試可用來評估凝血系統之功能：活化部分凝血激素時間(aPTT)測試、顯色分析、ROTEM分析、凝血酶原時間(PT)測試(亦用以測定INR)、纖維蛋白原測試(經常藉由克勞斯法(Clauss method)進行)、血小板計數、血小板功能測試(經常藉由PFA-100進行)、TCT、出血時間、混合測試(若患者血漿與正常血漿混合，則異常得到校正)、凝血因子分析、抗磷脂抗體、D-二聚物、基因測試(例如因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間(dilute Russell's viper venom time；dRVVT)、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法(TEG或Sonoclot)、血栓彈力測定術(TEM®，例如ROTEM®或優球蛋白溶解時間(ELT)。
aPTT測試為效能指標，其量測「固有」(亦稱為接觸活化路徑)與常見凝血路徑之功效。此測試常用於量測市售重組型凝血因子(例如FVIII或FIX)之凝血活性。其係與量測外在路徑之凝血酶原時間(PT)組合使用。
ROTEM分析提供關於全部止血動力學之資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性及溶解。血栓彈力測定術中之不同參數視胞質凝血系統之活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響此等相互作用之許多因素而定。此分析可提供二次止血之全景圖。
此項技術中已知FVIII多肽及編碼FVIII多肽之多核苷酸序列，以及許多功能性片段、突變體及修飾型式。以全文引用的方式併入本文中之2013年2月15日申請之PCT/US2013/026521中提供了FVIII蛋白的實例。下文示出人類FVIII序列(全長)之其他實例。
表1. 全長因子VIII之胺基酸序列(全長FVIII(FVIII信號肽加下劃線；FVIII重鏈加雙下劃線；B域呈斜體字；且FVIII輕鏈呈純文本)
Figure 108113094-A0202-12-0034-1
表2. 編碼全長FVIII之核苷酸序列(SEQ ID NO：5)*
Figure 108113094-A0202-12-0035-2
Figure 108113094-A0202-12-0036-3
Figure 108113094-A0202-12-0037-4
FVIII多肽包括全長FVIII、在N端減去Met之全長FVIII、成熟FVIII(減去信號序列)、在N端具有另一Met之成熟FVIII，及/或完全或部分缺失B域之FVIII。在某些實施例中，FVIII變異體包括B域缺失，而不論為部分缺失或完全缺失。
將原生成熟人類FVIII之序列呈現為SEQ ID NO：4。原生FVIII蛋白具有下式：A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，其中A1、A2及A3為結構上相關之「A域」，B為「B域」，C1及C2為結構上相關之「C域」，且a1、a2及a3為酸性間隔區。參考SEQ ID NO：4中之一級胺基酸序列位置，人類FVIII之A1域自Ala1延伸至約Arg336、a1間隔區自約Met337延伸至約Val374、A2域自約Ala375延伸至約Tyr719、a2間隔區自約Glu720延伸至約Arg740、B域自約Ser741延伸至約Arg1648、a3間隔區自約Glu1649延伸至約Arg1689、A3域自約Ser1690延伸至約Leu2025、C1域自約Gly2026延伸至約Asn2072，且C2域自約Ser2073延伸至Tyr2332·除特異性解蛋白性裂解位點以外，在FVIII之各域及各區之間的邊界位置之名稱在不同參考文獻中可不同。因此藉由使用術語「約」來近似地指定在本文中提到之邊界。
分離人類FVIII基因且使其在哺乳動物細胞中表現(Toole,J.J.等人，Nature 312：342-347(1984)；Gitschier,J.等人，Nature 312：326-330(1984)；Wood,W.I.等人，Nature 312：330-337(1984)；Vehar,G.A.等人，Nature 312：337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；及美國專利第4,757,006號)。自如美國專利第4,965,199號中所示之cDNA推導出FVIII胺基酸序列。另外，美國專利第4,994,371及4,868,112號中示出B域部分或完全缺失之FVIII。在一些實施例中，人類FVIII B域經如美國專利第5,004,803號中所示之人類因子V B域置換。美國申請公開案第 2005/0100990號之SEQ ID NO：4及5中分別示出編碼人類因子VIII之cDNA序列及胺基酸序列。
Toole,J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942(1986)中公開了豬EVIII序列。此外，Healey,J.F.等人，Blood 88：4209-4214(1996)中已報導了對來自豬脾cDNA文庫之FVIII序列進行PCR擴增所得之完整豬cDNA序列。在Lollar及Runge之美國專利第5,364,771號中及在WO 93/20093中揭示了所有域、所有次單元及特異性胺基酸序列均經取代之雜合人類/豬FVIII。最近，WO 94/11503中報導了豬FVIII之A1及A2域及以豬A1及/或A2域取代相應人類域之嵌合FVIII的核苷酸及相應胺基酸序列。Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號亦揭示了豬cDNA及推導之胺基酸序列。美國專利第6,458,563號揭示了缺失B域之豬FVIII。
頒予Lollar,J.S.之美國專利第5,859,204號報導了具有較小抗原性及較小免疫反應性之FVIII的功能性突變體。頒予Lollar,J.S.之美國專利第6,376,463號亦報導了具有較小免疫反應性之FVIII的突變體。頒予Saenko等人之美國申請公開案第2005/0100990號報導了FVIII之A2域中的功能性突變。
在一個實施例中，FVIII(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與SEQ ID NO：6之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332(無信號序列)的FVIII胺基酸序列或SEQ ID NO：3之胺基酸1至19及SEQ ID NO：6之1至1438或SEQ ID NO：3之胺基酸1至19及SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332(有信號序列)的FVIII胺基酸序列至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致，其中FVIII具有凝血活性，例如活化作為輔因子之因子IX以將因子X轉化成經活化之因子X。FVIII(或嵌合蛋白之FVIII部分)可與SEQ ID NO：6之胺基酸1至1438或SEQ ID NO：4之胺基酸1至2332(無信號序列)的FVIII胺基酸序列一致。FVIII可進一步包含信號序列。
在一些實施例中，FVIII多肽對VWF之親和力較小。術語「對VWF之親和力較小」涵蓋因子VIII多肽，其中與野生型FVIII相比，對VWF之親和力減小了至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%或約100%。可藉由ELISA類分析或當直接結合於固定VWF時使用表面電漿共振來量測FVIII對VWF之結合。FVIII中之胺基酸1670-1684對於結合於VWF為重要的。因此，涉及此區域之FVIII點突變、缺失及/或插入可改進結合於vWF之能力。
在一個實施例中，對vWF之親和力較小的FVIII多肽不含胺基酸745-1685。在另一實施例中，對vWF之親和力較小的FVIII多肽不含胺基酸741-1689。在另一實施例中，對vWF之親和力較小的FVIII多肽不含胺基酸1680或含有胺基酸1680之點突變。減小對vWF之FVIII親和力的點突變之實例包括以下點突變：Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680C及E1682T。例如已在FVIII之C1及C2域中識別出減小對vWF之FVIII親和力的其他替代物。特定言之，例如在D'Oiron等人，Hemophilia 14：138-146(2008)中已討論了Gln2100、Try2105、Ser2119、Arg2150及Thr2154(在C1域內)及Pro2300、Arg2304及Arg2307(在C2域內)。已描述了在Glu2087、Arg2090、Ile2098、Asn2129及Pro2153之其他突變。參見上文。
下表3中示出對vWF之親和力較小的FVIII多肽之非限制例示性序列。表中示出了此等蛋白質中之每一者的「成熟」形式(不含信號肽)。然而，亦可使用含有信號肽(SEQ ID NO：3)之此等蛋白質的全長形式。
表3. 對vWF之親和力較小之FVIII多肽的胺基酸序列。
Figure 108113094-A0202-12-0040-5
Figure 108113094-A0202-12-0041-6
Figure 108113094-A0202-12-0042-7
Figure 108113094-A0202-12-0043-8
Figure 108113094-A0202-12-0044-9
Figure 108113094-A0202-12-0045-10
Figure 108113094-A0202-12-0046-11
如本文所用，FVIII之「B域」係與此項技術已知之B域相同，其由內部胺基酸序列一致性及解蛋白性裂解位點，例如全長人類FVIII之殘基Ser741-Arg1648所定義。其他人類FVIII域係由以下胺基酸殘基定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3；殘基Ser1690-Asn2019；C1，殘基Lys2020-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。通常將其餘序列，即殘基Glu1649-Arg1689稱為a3酸性區域。此項技術亦已知豬、小鼠及犬類FVIII之所有域(包括B域)之邊界位置。在一個實施例中，FVIII之B域缺失(「缺失B域之因子VIII」或「BDD FVIII」)。BDD FVIII之實例為REFACTO®(重組型BDD FVIII)，其具有與表4中序列之因子VIII部分相同之序列。(BDD FVIII重鏈加雙下劃線；B域呈斜體字；且BDD FVIII輕鏈呈純文本)。表5 中所示編碼BDD FVIII(SEQ ID NO：7)之核苷酸序列。
Figure 108113094-A0202-12-0047-12
Figure 108113094-A0202-12-0047-14
Figure 108113094-A0202-12-0048-15
「缺失B域之FVIII」可具有美國專利第6,316,226號、第6,346,513號、第7,041,635號、第5,789,203號、第6,060,447號、第5,595,886號、第6,228,620號、第5,972,885號、第6,048,720號、第5,543,502號、第5,610,278號、第5,171,844號、第5,112,950號、第4,868,112及第6,458,563 號所揭示之完全或部分缺失。在一些實施例中，本發明之缺失B域的FVIII序列包含美國專利第6,316,226號(亦在US 6,346,513中)之第4欄第4行至第5欄第28行及實例1-5中揭示之缺失中的任一者。在另一實施例中，缺失B域之因子VIII為S743/Q1638 B域缺失之因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如，胺基酸744至胺基酸1637缺失之因子VIII，例如具有SEQ ID NO：4之胺基酸1-743及胺基酸1638-2332之因子VIII，即SEQ ID NO：6)。在一些實施例中，本發明之缺失B域的FVIII具有美國專利第5,789,203號(亦在US 6,060,447、US 5,595,886及US 6,228,620中)之第2欄第26-51行及實例5-8中揭示之缺失。在一些實施例中，缺失B域之因子VIII具有在美國專利第5,972,885號之第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利第6,048,720號之第6欄第1-22行及實例1；美國專利第5,543,502號之第2欄第17-46行；美國專利第5,171,844號之第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利第5,112,950號之第2欄第55-68行、圖2及實例1；美國專利第4,868,112號之第2欄第2行至第19欄第21行及表2；美國專利第7,041,635號之第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行，及第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利第6,458,563號之第4欄第25-53行中所述之缺失。在一些實施例中，缺失B域之FVIII缺失大部分B域，但仍含有為將一級轉譯產物活體內解蛋白性加工成兩條多肽鏈所必需的B域之胺基端序列，如WO 91/09122中所揭示。在一些實施例中，經由缺失胺基酸747-1638，即實際上完全缺失B域來構築缺失B域之FVIII。Hoeben R.C.，等人，J.Biol.Chem.265(13)：7318-7323(1990)。缺失B域之因子VIII亦可含有FVIII之胺基酸771-1666或胺基酸868-1562的缺失。Meulien P.等人，Protein Eng.2(4)：301-6(1988)。作為本發明之部分的其他B域缺失包括：缺失胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton等人，Biochemistry(1986)25：8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公開之申請案第WO 87/04187號))、747-1560(Sarver等人，DNA(1987)6：553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請案第88/00831號))或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)第82期：16-25,EP 295597))。 在其他實施例中，BDD FVIII包括含有保留一或多個N連接糖基化位點，例如殘基757、784、828、900、963或視情況943(其對應於全長FVIII序列之胺基酸序列)之B域之片段的FVIII多肽。B域片段之實例包括B域之226個胺基酸或163個胺基酸，如Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)、Kasuda,A等人，J.Thromb.Haemost.6：1352-1359(2008)及Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)中所揭示(即保留B域之前226個胺基酸或163個胺基酸)。在其他實施例中，BDD FVIII進一步在殘基309處(Phe至Ser)包含點突變以改良BDD FVIII蛋白之表現。參見Miao,H.Z.等人，Blood 103(a)：3412-3419(2004)。在其他實施例中，BDD FVIII包括含有B域之一部分但不含有一或多個弗林蛋白酶(furin)裂解位點(例如Arg1313及Arg 1648)之FVIII多肽。參見Pipe,S.W.等人，J.Thromb.Haemost.9：2235-2242(2011)。可在任何FVIII序列中產生各前述缺失。
在一些實施例中，FVIII具有部分B域。在一些實施例中，具有部分B域之FVIII蛋白為FVIII198(SEQ ID NO：35)。
Figure 108113094-A0202-12-0051-17
Figure 108113094-A0202-12-0051-18
(SEQ ID NO：35)
FVIII198為含有單鏈FVIIIFc分子226N6之部分B域。226表示FVIII B域之N端226個胺基酸，且N6表示B域中之6個N糖基化位點。
在一個實施例中，FVIII緊在精胺酸之後在胺基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO：4中)、胺基酸754(在S743/Q1638 B域缺失之因子VIII或SEQ ID NO：6中)或對應精胺酸殘基(在其他變異體中)處裂解，藉此產生重鏈及輕鏈。在另一實施例中，FVIII包含重鏈及輕鏈，其藉由金屬離子介導性非共價鍵連接或締合。
在其他實施例中，FVIII為尚未緊在精胺酸之後在胺基酸1648(全長FVIII或SEQ ID NO：4)、胺基酸754(在S743/Q1638 B域缺失之FVIII或SEQ ID NO：6中)或對應精胺酸殘基(在其他變異體中)處裂解之單鏈FVIII。單鏈FVIII可包含一或多個胺基酸取代。在一個實施例中，胺基酸取代處於對應於全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1648、殘 基1645或兩者，或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO：6)之殘基754、殘基751或兩者的殘基。胺基酸取代可為除精胺酸以外之任何胺基酸，例如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酥胺酸、色胺酸、纈胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、脯胺酸、硒代半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸、組胺酸、鳥胺酸、吡咯離胺酸或牛磺酸。
FVIII可藉由凝血酶進一步裂解，接著活化成FVIIIa，從而用作經活化之因子IX(FIXa)的輔因子。且經活化之FIX連同經活化之FVIII一起形成Xase複合物且將因子X轉化成經活化之因子X(FXa)。對於活化，FVIII藉由凝血酶在3個精胺酸殘基之後在胺基酸372、740及1689(對應於缺失B域之FVIII序列中的胺基酸372、740及795)裂解，該裂解產生具有50kDa A1、43kDa A2及73kDa A3-C1-C2鏈之FVIIIa。在一個實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白為非活性FVIII。在另一實施例中，FVIII蛋白為經活化之FVIII。
具有FVIII之蛋白質可包含與SEQ ID NO：4或6至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之序列，其中該序列具有FVIII凝血活性，例如活化作為輔因子之因子IX以將因子X轉化成經活化之因子X(FXa)。
XTEN序列
如本文所用，「XTEN序列」係指具有主要由較小親水性胺基酸組成的非天然存在之實質上非重複序列之較長長度的多肽，其中該序列在生理學條件下具有低程度之二級或三級結構或不具有二級或三級結構。作為嵌合蛋白配偶體，XTEN可用作載體，從而當連接於FVIII序列以產生嵌合蛋白時賦予某些所需藥物動力學性質、物理化學性質及醫藥性質。此等所需性質包括(但不限於)增大之藥物動力學參數及溶解特徵。如本文所用，「XTEN」特定言之不包括諸如單鏈抗體或輕鏈或重鏈之Fc片段的抗體或抗體片段。
以全文引用的方式併入本文中之2013年2月15日申請之PCT/US2013/026521中提供了XTEN的實例。
在一些實施例中，XTEN序列為具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有大於約20至約3000個胺基酸殘基、大於30至約2500個殘基、大於40至約2000個殘基、大於50至約1500個殘基、大於60至約1000個殘基、大於70至約900個殘基、大於80至約800個殘基、大於90至約700個殘基、大於100至約600個殘基、大於110至約500個殘基或大於120至約400個殘基之肽或多肽。
在一些實施例中，較短XTEN序列當插入FVIII中之所選位置時會改良FVIII半衰期及/或活性，本文有較詳細描述。因此，在一些實施例中，插入之XTEN序列為具有36以72個殘基或42至78個殘基之肽或多肽。在一些實施例中，36至72個殘基的插入之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如288個殘基之XTEN序列)。在一些實施例中，42至78個殘基之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如294個殘基之XTEN序列)。在一些實施例中，36個殘基之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如288個殘基之XTEN序列)。在一些實施例中，42個殘基之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如294個殘基之XTEN序列)。在一些實施例中，72個殘基之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如288個殘基之XTEN序列)。在一些實施例中，78個殘基之XTEN序列對FVIII半衰期之改良大於插入相同位置之較長XTEN序列(例如294個殘基之XTEN序列)。
本發明之XTEN序列可包含一或多個具有9至14個與序列基元至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸殘基或胺基酸序列的序列基元，其中該基元包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：4至6個類型之選自由以下組成之群的胺基酸：甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)。 參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含不重疊之序列基元，其中約80%，或至少約85%，或至少約90%，或約91%，或約92%，或約93%，或約94%，或約95%，或約96%，或約97%，或約98%，或約99%或約100%的序列由選自以下之不重疊序列的多個單元組成：選自表6A之單一基元家族，從而產生家族序列。如本文所用，「家族」意謂XTEN具有僅選自表6A之單一基元種類即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN之基元，且選擇不來自家族基元之XTEN中的任何其他胺基酸以實現所需性質，諸如以允許藉由編碼核苷酸來幷入限制位點、幷入裂解序列，或實現對FVIII之較好連接。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含AD基元家族或AE基元家族或AF基元家族或AG基元家族或AM基元家族或AQ基元家族或BC家族或BD家族之不重疊序列基元的多個單元，使得所得XTEN顯示上述同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表6A之基元家族中之兩者或兩者以上的基元序列之多個單元。可選擇此等序列以實現所需的物理/化學特徵，包括諸如淨電荷、親水性、無二級結構或無重複性之性質，其為基元之胺基酸組成所賦予，下文有較完整描述。在本段落中所述之以上實施例中，可使用本文所述之方法來選擇及組裝幷入XTEN中之基元以實現具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。
表6A. 具有12個胺基酸之XTEN序列基元及基元家族
Figure 108113094-A0202-12-0055-21
˙表示當以各種排列一起使用時得到「家族序列」之個別基元序列
XTEN可具有不同長度以便插入FVIII中或與FVIII連接。在一個實施例中，基於欲在融合蛋白中實現之性質或功能來選擇XTEN序列之長度。視預定性質或功能而定，XTEN可為可用作載體之中短長度序列或較長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有約6至約99個胺基酸殘基之短區段、約100至約399個胺基酸殘基之中等長度，及約400至約1000個及至多約3000個胺基酸殘基之較長長度。因此，插入FVIII中或連接於 FVIII之XTEN的長度可為約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或至多約3000個胺基酸殘基。在其他實施例中，XTEN序列之長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000或約2000至約3000個胺基酸殘基。插入FVIII中或連接於FVIII之XTEN的確切長度可變化而不會不利地影響FVIII活性。在一個實施例中，一或多個本文所用之XTEN具有36個胺基酸、42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸的長度且可選自XTEN家族序列即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD中之一或多者。
在一些實施例中，本發明中所用之XTEN序列係與選自由以下組成之群的序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE36、AG36、AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908及AG2004。參見US 2010-0239554 A1。
在一個實施例中，XTEN序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE36(SEQ ID NO：22)、AE42(SEQ ID NO：36)、AE72(SEQ ID NO：23)、AE144_2A(SEQ ID NO：25)、AE144_3B(SEQ ID NO：26)、AE144_4A (SEQ ID NO：27)、AE144_5A(SEQ ID NO：28)、AE144_6B(SEQ ID NO：29)、AG144_A(SEQ ID NO：30)、AG144_B(SEQ ID NO：31)、AG144_C(SEQ ID NO：32)、AG144_F(SEQ ID NO：33)、AE864(SEQ ID NO：43)、AE576(SEQ ID NO：41)、AE288(SEQ ID NO：39)、AE288_2(SEQ ID NO：34)、AE144(SEQ ID NO：37)、AG864(SEQ ID NO：44)、AG576(SEQ ID NO：42)、AG288(SEQ ID NO：40)、AG144(SEQ ID NO：38)及其任何組合。在另一實施例中，XTEN序列為選自由以下組成之群：AE36(SEQ ID NO：22)、AE42(SEQ ID NO：36)、AE72(SEQ ID NO：23)、AE144_2A(SEQ ID NO：25)、AE144_3B(SEQ ID NO：26)、AE144_4A(SEQ ID NO：27)、AE144_5A(SEQ ID NO：28)、AE144_6B(SEQ ID NO：29)、AG144_A(SEQ ID NO：30)、AG144_B(SEQ ID NO：31)、AG144_C(SEQ ID NO：32)、AG144_F(SEQ ID NO：33)、AE864(SEQ ID NO：43)、AE576(SEQ ID NO：41)、AE288(SEQ IDNO：39)、AE288_2(SEQ ID NO：34)、AEI44(SEQ ID NO：37)、AG864(SEQ ID NO：44)、AG576(SEQ ID NO：42)、AG288(SEQ ID NO：40)、AG144(SEQ ID NO：38)及其任何組合。表6B中示出了本發明之某些XTEN序列的胺基酸序列。
Figure 108113094-A0202-12-0057-22
Figure 108113094-A0202-12-0058-23
Figure 108113094-A0202-12-0059-24
Figure 108113094-A0202-12-0060-25
在XTEN之小於100%的其胺基酸由4、5或6個類型之選 自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之胺基酸組成，或小於100%之序列由表6A之序列基元或表6B之XTEN序列組成的一些實施例中，XTEN之其他胺基酸殘基係選自其他14種天然L-胺基酸中之任一者，但優先地選自親水性胺基酸以使XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%親水性胺基酸。可將除甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)以外之個別胺基酸或胺基酸短序列幷入XTEN中以實現所需性質，諸如以允許藉由編碼核苷酸幷入限制位點，或有助於連接於FVIII或另一半衰期延長組分，或併入裂解序列。
預期嵌合FVIII-XTEN實施例之XTEN序列實質上為不重複的。通常，重複胺基酸序列傾向於聚集或形成高序結構，如由諸如膠原蛋白及白胺酸拉煉之天然重複序列所例示。此等重複胺基酸亦可傾向於形成接觸，從而產生結晶或偽晶結構。相比之下，非重複序列之較低聚集趨勢可實現設計具有相對低頻之帶電胺基酸之長序列XTEN，而否則若序列為重複的，則其可能聚集。可藉由評估以下特徵中之一或多者來觀測主題XTEN之不重複性。在一個實施例中，「實質上不重複的」XTEN序列意謂(i)除非胺基酸為絲胺酸，否則XTEN不含三個鄰接的相同胺基酸；(ii)至少約80%之XTEN序列由不重疊的序列基元組成，各序列基元包含約9至約14個由四至六個選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之胺基酸組成之胺基酸殘基，其中任何兩個鄰接胺基酸殘基均不會在各不重疊序列基元中出現兩次以上；或(iii)XTEN序列之子序列評分小於10。可根據由方程式1給出之式子計算XTEN序列之子序列評分： 子序列評分
Figure 108113094-A0202-12-0061-26
其中：
m=(多肽之胺基酸長度)-(子序列之胺基酸長度)+1：且
计数 i =序列 i 內各獨特子序列之累積出現數目
嵌合FVIII蛋白中所用之XTEN序列的選擇會影響物理性質或化學性質，因為XTEN可顯示以下有利性質中之一或多者：構形可撓性、水溶性提高、蛋白酶抗性程度高、低免疫原性、對哺乳動物受體之弱結台或流體動力學(或斯托克斯)半徑增大。在一個特定實施例中，連接於本發明中之FVIII蛋白的XTEN序列會提高藥物動力學性質，諸如終末半衰期較長或曲線下面積(AUC)增大，以使本文所述之嵌合蛋白在活體內停留之時段比野生型FVIII有增加。在其他實施例中，本發明中所用之XTEN序列會提高藥物動力學性質，諸如終末半衰期較長或曲線下面積(AUC)增大，以使FVIII蛋白在活體內停留之時段比野生型FVIII有增加。
可採用多種方法及分析以測定包含XTEN序列之蛋白質的物理性質/化學性質。此等方法包括(但不限於)分析性離心、EPR、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、逆相HPLC、光散射、毛細管電泳、圓二色性、差示掃描量熱法、螢光、離子交換HPLC、尺寸排阻HPLC、IR、NMR、拉曼光譜學(Raman spectroscopy)、折射測定法及UV/可見光譜學。Amau等人，Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中揭示了其他方法。
XTEN序列之其他實例可根據本發明使用且揭示於美國專利公開案第2010/0239554 A1號、第2010/0323956 A1號、第2011/0046060 A1號、第2011/0046061 A1號、第2011/0077199 A1號或第2011/0172146 A1號，或國際專利公開案第WO 2010091122 A1號、第WO 2010144502 A2號、第WO 2010144508 A1號、第WO 2011028228 A1號、第WO 2011028229 A1號或第WO 2011028344 A2號中。
嵌合蛋白
本文提供之嵌合蛋白包含FVIII多肽及一或多個XTEN序列。在一個實施例中，嵌合蛋白包含FVIII多肽及插入之XTEN序列。在另一實施例中，插入可為多個插入，例如大於二、三、四、五、六、七、八、九或十個插入。
此等XTEN序列可與FVIII蛋白之C端或N端融合或插於FVIII蛋白中兩個胺基酸殘基中之一或多者之間，同時保留FVIII凝血活性或FVIII功能。在一個實施例中，該等插入會改良FVIII蛋白之藥物動力學 性質(例如半衰期)。
在一些實施例中，將短XTEN(例如小於144個胺基酸之XTEN)插入FVIII多肽中之特定位置。
舉例而言，可將具有36至78個胺基酸之XTEN插入A1、A2或A3域中及/或插在FVIII多肽之任何此等域之間。在一些實施例中，將具有36至78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的胺基酸之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、1720及/或1900。在一些實施例中，將具有36至78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的胺基酸之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403及/或1720。在一些實施例中，將具有36至78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的胺基酸之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及/或1720。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403、745、1720、1900及/或2332之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、745、1720、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1720之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一 些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、745、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及1720之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及403之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403及1720之下游的具有36至78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
另外，可將具有36或42個胺基酸之XTEN插入A1、A2或A3域中及/或插在FVIII多肽之任何此等域之間。在一些實施例中，將具有36或42個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的插入點之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、1720及/ 或1900。在一些實施例中，將具有36或42個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的插入點之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403及/或1720。在一些實施例中，將具有36或42個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的插入點之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及/或1720。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18之下游的具有36或42個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403、745、1720、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403之下游的具有36或42個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、745、1720、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1720之下游的具有36或42個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、745、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及1720之下游的具有36或42個胺 基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及403之下游的具有36或42個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403及1720之下游的具有36或42個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
另外，可將具有72或78個胺基酸之XTEN插入A1、A2或A3域中及/或插在FVIII多肽之任何此等域之間。在一些實施例中，將具有72或78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的插入點之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、1720及/或1900。在一些實施例中，將具有72或78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的插入點之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403及/或1720。在一些實施例中，將具有72或78個胺基酸之XTEN緊接地插入選自由以下組成之群的胺基酸之下游：對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及/或1720。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403、745、1720、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、745、1720、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸1720之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含三個其他XTEN插入。在一些實施例中，三個其他XTEN插入係在選自對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18、403、745、1900及/或2332之插入點之緊接的下游。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及1720之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟 FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸18及403之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
在一些實施例中，嵌合蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸403及1720之下游的具有72或78個胺基酸之XTEN。在一些實施例中，嵌合蛋白進一步包含兩個其他XTEN插入，例如在對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸745及2332之緊接的下游之插入。在一些實施例中，在胺基酸745及2332之緊接的下游之至少兩個其他XTEN插入分別長144及288個胺基酸。在一些實施例中，FVIII多肽對vWF具有較小親和力(例如無胺基酸745-1685)。
其他插入位點之實例包括(但不限於)列於表7、8、9、10、11、12、13、14、15中之位點或其任何組合。熟習此項技術者應瞭解，如本文所述，可選擇具有規定長度(例如36、42、72、78、144個或144個以上胺基酸)及/或組成之插入FVIII序列內於前述表之插入位點的XTEN以實現所需之半衰期增加。
以全文引用的方式併入本文中之2013年2月15日申請之PCT/US2013/026521中提供了XTEN插入的實例。
連接於一或多個XTEN序列之FVIII蛋白可表示為FVIII (a→b) -X-FVIII (c→d) ，其中FVIII (a→b) 包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：自胺基酸殘基「a」至胺基酸殘基「b」之FVIII蛋白的第一部分；FVIII (c→d) 包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：自胺基酸殘基「c」至胺基酸殘基「d」之FVIII蛋白的第二部分；
a 為FVIII蛋白之第一部分的N端胺基酸殘基，
b 為FVIII蛋白之第一部分的C端胺基酸殘基，而且為插入XTEN序列之插入位點之兩個胺基酸的N端胺基酸殘基，
c 為FVIII蛋白之第二部分的N端胺基酸殘基，而且為插入XTEN序列之插入位點之兩個胺基酸的C端胺基酸殘基，且
d 為FVIII蛋白之C端胺基酸殘基，且
其中FVIII蛋白之第一部分與FVIII蛋白之第二部分彼此不一致，且在一起具有足夠長度以使FVIII蛋白具有FVIII凝血活性。
在一個實施例中，FVIII蛋白之第一部分及FVIII蛋白之第二部分為SEQ ID NO：4[全長成熟FVIII序列]或SEQ ID NO：6[缺失B域之FVIII]或SEQ ID NO：1、2及12-21中任一者[對vWF之親和力較小的FVIII序列]之片段，例如分別為N端部分及C端部分。在某些實施例中，FVIII蛋白之第一部分包含FVIII蛋白之A1域及A2域。FVIII蛋白之第二部分包含A3域、C1域及視情況選用之C2域。在其他實施例中，FVIII蛋白之第一部分包含A1域及A2域，且FVIII蛋白之第二部分包含B域、A3域、C1域及視情況選用之C2域的一部分。在其他實施例中，FVIII蛋白之第一部分包含A1域、A2域及FVIII蛋白之B域之一部分，且FVIII蛋白之第二部分包含A3域、C1域及視情況選用之C2域。在其他實施例中，FVIII蛋白之第一部分包含A1域、A2域，及FVIII蛋白之B域的第一部分。FVIII蛋白之第二部分包含B域、A3域、C1域及視情況選用之C2域的第二部分。在一些實施例中，兩個胺基酸(「b」及「c」)可為表7、8、9、10、11、12、13、14及15中所示之胺基酸殘基插入位點中之任一或多者。舉例而言，「b」可為該位點之緊接的上游之胺基酸殘基，其中一或多個XTEN序列為插入或連接的，且「c」可為該位點之緊接的下游之胺基酸殘基，其中一或多個XTEN序列為插入或連接的。在一些實施例中，「a」为FVIII蛋白之第一成熟胺基酸序列，且「d」为FVIII蛋白之末個胺基酸序列。舉例而言，FVIII (a→b) 可為與SEQ ID NO：6[缺失B域之FVIII胺基酸序列]或SEQ ID NO：4[全長FVIII]之胺基酸1至745至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且FVIII (c→d) 可分別為SEQ ID NO：6之746至1438或SEQ ID NO：4之1641至2332。
在一些態樣中，FVIII蛋白中之插入位點位於FVIII蛋白之一或多個域中，其為N端、A1域、A2域、A3域、B域、C1域、C2域、 C端或其兩者或兩者以上之組合，或位於FVIII蛋白之兩個域之間，其為A1域與a1酸性區域，及a1酸性區域與A2域、A2域與a2酸性區域、a2酸性區域與B域、B域與A3域及A3域與C1域、C1域與C2域，或其任何組合。举例而言，可插入XTEN序列之插入位點係选自由以下组成之群：N端与A1域、N端与A2域、N端与A3域、N端与B域、N端与C1域、N端与C2域、N端与C端、A1与A2域、A1与A3域、A1与B域、A1与C1域、A1与C2域、A1域与C端、A2与A3域、A2与B域、A2与C1域、A2与C2域、A2域与C端、A3与B域、A3与C1域、A3与C2域、A3域与C端、B与C1域、B与C2域、B域与C端、C1与C2域、C1与C端、C2域，及C端，及其两者或兩者以上之组合。插入位點之非限制性实例係列於表7、8、9、10、11、12、13、14及15中。
在一個實施例中，將XTEN序列插入FVIII蛋白中一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之緊接的下游或連接於C端或N端之FVIII嵌合蛋白在連接於XTEN序列或插入XTEN序列之後保留野生型FVIII之一些或所有活性。XTEN序列可插入FVIII蛋白中一次或一次以上、兩次、三次、四次、五次或六次，以使該等插入不會不利地影響FVIII活性(即FVIII蛋白仍保留凝血性質)。在一些實施例中，嵌合蛋白包含四個XTEN序列。
適用於本發明之FVIII蛋白可藉由視情況選用之連接子在FVIII蛋白之N端或C端連接於一或多個XTEN多肽，或藉由一或多個視情況選用之連接子緊接地插入FVIII蛋白中一或多個胺基酸(例如一或多個XTEN插入位點)之下游。在一個實施例中，經插入XTEN序列之兩個胺基酸殘基或XTEN序列所連接之胺基酸殘基對應於SEQ ID NO：4[全長成熟FVIII]之兩個或一個胺基酸殘基，其選自由表7、表8、表9及表10中之殘基組成之群及其任何組合。
在其他實施例中，將至少一個XTEN序列插入本文揭示之任一或多個XTEN插入位點或其任何組合。在一個態樣中，將至少一個XTEN序列插入表7中揭示之一或多個胺基酸中揭示之一或多個XTEN插入位點。
Figure 108113094-A0202-12-0071-27
Figure 108113094-A0202-12-0072-28
Figure 108113094-A0202-12-0073-29
Figure 108113094-A0202-12-0074-30
在一些實施例中，將一或多個XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905或1910或其任何組合的上游或下游之約六個胺基酸中。
Figure 108113094-A0202-12-0074-31
*距插入殘基之距離係指離指定插入殘基(殘基「0」)(其中可進行插入)之N端(負數)或C端(正數)的相對胺基酸數。名稱「-x」係指在指定插入殘基之N端側距離x個胺基酸之插入位點。類似地，名稱「+x」係指在指定插入殘基之C端側距離x個胺基酸之插入位點。
舉例而言，「-1,+2」表示在指定為-1、0、+1或+2之胺基酸殘基的N端或C端進行插入。
在其他實施例中，將一或多個XTEN序列緊接地插入對應於全長成熟人類FVIII之一或多個胺基酸之下游，該一或多個胺基酸選自由表9中之一或多個插入位點組成之群。
Figure 108113094-A0202-12-0075-32
在其他實施例中，將一或多個XTEN插入FVIII之B域中。在一個實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸740與1640之間，其中在胺基酸740與1640之間的FVIII序列視情況不存在。在另一實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸741與1690之間，其中在胺基酸740與1690之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸741與1648之間，其中在胺基酸741與1648之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸743與1638之間，其中在胺基酸743與1638之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1656之間，其中在胺基酸745與1656 之間的FVIII序列視情況不存在。在一些實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1657之間，其中在胺基酸745與1657之間的FVIII序列視情況不存在。在某些實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1667之間，其中在胺基酸745與1667之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745與1686之間，其中在胺基酸745與1686之間的FVIII序列視情況不存在。在一些其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸747與1642之間，其中在胺基酸747與1642之間的FVIII序列視情況不存在。在其他實例中，將XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸751與1667之間，其中在胺基酸751與1667之間的FVIII序列視情況不存在。
在一些實施例中，將一或多個XTEN插入一或多個在選自由表10中之胺基酸殘基組成之群的插入位點之胺基酸之緊接的下游之胺基酸中。
表10：FVIII XTEN插入位點及構築體名稱
Figure 108113094-A0202-12-0077-33
Figure 108113094-A0202-12-0078-34
在一個實施例中，該一或多個XTEN插入位點位於FVIII蛋白之一或多個表面暴露之可撓性環結構(例如許可環)中。舉例而言，可將至少一個XTEN序列插入各FVIII「A」域中，該「A」域包含至少兩個「許可環」，其中可插入至少一個XTEN多肽，而不消除重組蛋白之促凝血活性，或重組蛋白在宿主細胞中活體內或活體外表現之能力。許可環為允許插入至少一個除其他屬性以外亦具有高表面或溶劑暴露及高構形可撓性之XTEN序列的區域。A1域包含許可環-1(A1-1)區及許可環-2(A1-2)區、A2域包含許可環-1(A2-1)區及許可環-2(A2-2)區，A3域包含許可環-1(A3-1)區及許可環-2(A3-2)區。
在一個態樣中，FVIII A1域(A1-1)中之第一許可環位於β股1與β股2之間，且FVIII A2域(A1-2)中之第二許可環位於β股11與β股12之間。FVIII A2域(A2-1)中之第一許可環位於β股22與β股23之間，且FVIII A2域(A2-2)中之第二許可環位於β股32與β股33之間。FVIII A3域(A3-1)中之第一許可環位於β股38與β股39之間，且FVIII A3域(A3-2) 中之第二許可環位於β股45與β股46之間。在某些態樣中，包含A1-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸15至約胺基酸45，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸18至約胺基酸41的區域。在其他態樣中，包含A1-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸201至約胺基酸232，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸218至約胺基酸229的區域。在其他態樣中，包含A2-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸395至約胺基酸421，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸397至約胺基酸418的區域。在其他實施例中，包含A2-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸577至約胺基酸635，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸595至約胺基酸607的區域。在某些態樣中，包含A3-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1705至約胺基酸1732，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。在其他態樣中，包含A3-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1884至約胺基酸1917，例如自SEQ ID NO：4之約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。
在另一實施例中，經插入至少一個XTEN序列之該一或多個胺基酸位於a3域內，例如對應於全長成熟FVIII多肽之胺基酸1649至1689。在一個特定實施例中，將XTEN序列插於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1656與1657之間。在一個特定實施例中，包含緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游之XTEN序列的FVIII蛋白進一步包含對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1656的缺失。
在一些實施例中，用於一或多個XTEN插入之一或多個插入位點係在選自由以下組成之群的一或多個胺基酸之緊接的下游：
(1)胺基酸3、(2)胺基酸18、(3)胺基酸22、
(4)胺基酸26、(5)胺基酸32、(6)胺基酸40、
(7)胺基酸60、(8)胺基酸65、(9)胺基酸81、
(10)胺基酸116、(11)胺基酸119、(12)胺基酸130、
(13)胺基酸188、(14)胺基酸211、(15)胺基酸216、
(16)胺基酸220、(17)胺基酸224、(18)胺基酸230、
(19)胺基酸333、(20)胺基酸336、(21)胺基酸339、
(22)胺基酸375、(23)胺基酸399、(24)胺基酸403、
(25)胺基酸409、(26)胺基酸416、(26)胺基酸442、
(28)胺基酸487、(29)胺基酸490、(30)胺基酸494、
(31)胺基酸500、(32)胺基酸518、(33)胺基酸599、
(34)胺基酸603、(35)胺基酸713、(36)胺基酸745、
(37)胺基酸1656、(38)胺基酸1711、(39)胺基酸1720、
(40)胺基酸1725、(41)胺基酸1749、(42)胺基酸1796、
(43)胺基酸1802、(44)胺基酸1827、(45)胺基酸1861、
(46)胺基酸1896、(47)胺基酸1900、(48)胺基酸1904、
(49)胺基酸1905、(50)胺基酸1910、(51)胺基酸1937、
(52)胺基酸2019、(53)胺基酸2068、(54)胺基酸2111、
(55)胺基酸2120、(56)胺基酸2171、(57)胺基酸2188、
(58)胺基酸2227、(59)胺基酸2277，及
(60)其兩者或兩者以上之組合。
在一個實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白包含兩個XTEN序列，即插入第一XTEN插入位點之第一XTEN序列及插入第二XTEN插入位點之第二XTEN。將第一XTEN插入位點及第二XTEN插入位點之非限制性實例列於表11中。
表11. 兩個XTEN之例示性插入位點
Figure 108113094-A0202-12-0081-35
Figure 108113094-A0202-12-0082-36
插入或連接於FVIII蛋白之兩個XTEN可相同或不同。在一些實施例中，適用於本發明之FVIII蛋白包含插入FVIII蛋白中之兩個XTEN序列，即緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游的第一XTEN序列，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游(C端)的第二XTEN序列。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、40、1656或1720的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403的下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸599的下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO： 4之胺基酸1656的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、40、399、403、1725、1720、1900、1905或2332的下游。在某些實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40的下游。在一些實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸399的下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26或40的下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720的下游，且將第二XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18的下游。在一個特定實施例中，FVIII蛋白包含兩個XTEN序列，即緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游的第一XTEN序列，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游的第二XTEN序列，其中該FVIII蛋白進一步缺失對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1685、在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1680有突變或取代，例如Y1680F，在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648有突變或取代，例如R1648A，或在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648(例如R1648A)及對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1680(例如Y1680F)處有至少兩個突變或取代。在一個特定實施例中，FVIII蛋白包含兩個XTEN序列，即緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游的第一XTEN，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游的第二XTEN，其中該FVIII蛋白進一步缺失對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1656。
在某些實施例中，FVIII蛋白包含三個XTEN序列，即插入第一XTEN插入位點之第一XTEN序列、插入第二XTEN插入位點之第二XTEN序列，及插入第三XTEN插入位點之第三XTEN序列。第一、第二或第三XTEN序列可相同或不同。第一、第二及第三插入位點可選自本文所揭示之插入位點中任一項之群。在一些實施例中，包含三個XTEN序列 之FVIII蛋白可進一步包含突變或取代，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648，例如R1648A。舉例而言，將第一、第二及第三XTEN插入位點之非限制性實例列於表12中。
Figure 108113094-A0202-12-0084-37
在一些實施例中，FVIII蛋白包含三個XTEN序列，即緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游的第一XTEN序列、緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游的第二XTEN序列，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656、1720或1900之下游的第三XTEN序列。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游、將第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游，且將第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720或1900之下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游、將第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游，且將第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游。在其他實施例中，將第一XTEN 序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游、將第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游，且將第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720或1900之下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403或1656之下游、將第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720之下游，且將第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游。在其他實施例中，將第一XTEN序列緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18、26、40、399、403、1711、1720、1725、1900、1905或1910之下游、將第二XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游，且將第三XTEN序列插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332之下游。
在其他實施例中，本發明中之FVIII蛋白包含四個XTEN序列，即插入第一插入位點之第一XTEN序列、插入第二插入位點之第二XTEN序列、插入第三插入位點之第三XTEN序列，及插入第四插入位點之第四XTEN序列。第一、第二、第三及第四XTEN序列可相同、不同或為其組合。在一些實施例中，包含四個XTEN序列之FVIII蛋白可進一步包含突變或取代，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1648，例如R1648A。將第一、第二、第三及第四XTEN插入位點之非限制性實例列於表13中。
表13. 四個XTEN之例示性插入位點
Figure 108113094-A0202-12-0086-38
Figure 108113094-A0202-12-0087-39
Figure 108113094-A0202-12-0088-40
在一些實施例中，FVIII蛋白包含五個XTEN序列，即插入第一插入位點之第一XTEN序列、插入第二插入位點之第二XTEN序列、插入第三XTEN插入位點之第三XTEN序列、插入第四XTEN插入位點之第四XTEN序列，及插入第五XTEN插入位點之第五XTEN序列。第一、第二、第三、第四或第五XTEN序列可相同、不同或為其組合。將第一、第二、第三、第四及第五插入位點之非限制性實例列於表14中。
Figure 108113094-A0202-12-0088-41
在某些實施例中，FVIII蛋白包含六個XTEN序列，即插入第一XTEN插入位點之第一XTEN序列、插入第二XTEN插入位點之第二XTEN序列、插入第三XTEN插入位點之第三XTEN序列、插入第四XTEN插入位點之第四XTEN序列、插入第五XTEN插入位點之第五XTEN序列，及插入第六XTEN插入位點之第六XTEN序列。第一、第二、第三、第四、第五或第六XTEN序列可相同、不同或為其組合。六個XTEN插入位點之 實例包括(但不限於)表15中所列之插入位點。
Figure 108113094-A0202-12-0089-42
在一個特定實例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間，且將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4(全長成熟FVIII)之胺基酸1720與1721之間。在另一實例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間，且將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在一些實例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間、將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且將第三XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實施例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間、將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且將第三XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在其他實施例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸403與404之間、將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間，且將第三XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間。在某些實施例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間、將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間，且將第三XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900與1901之間。在一些實施例中，將第一XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26與27之間、將第二XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656與1657之間、將第三XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1720與1721之間，且將第四XTEN插於對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900與1901之間。
在一個特定實施例中，將XTEN序列插於全長因子VIII之胺基酸745與746之間或缺失B域之因子VIII之對應插入位點之間。
以XTEN置換許可環
本發明亦描述一或多個許可環、a3區或其部分可在包含XTEN之FVIII蛋白中經取代或缺失，且含有該取代或缺失之FVIII具有促凝血活性。取代或缺失許可環或a3區之一部分包括取代或缺失一或多個在許可環或a3區中之胺基酸。如前所述，FVIII「A」域包含至少兩個「許可環」，其中可插入XTEN而不消除重組蛋白之促凝血活性，或重組蛋白在宿主細胞中活體內或活體外表現之能力。參見以全文引用的方式併入本文中之2013年2月15日申請之PCT/US2013/026521。許可環為除其他屬性以外亦具有高表面或溶劑暴露及高構形可撓性之區域。儘管「許可位點」傾向於在許可環中群聚，但在所識別之許可環之外存在其他可經插入XTEN而不消除重組蛋白之促凝血活性，或重組蛋白在宿主細胞中活體內或活體外表現之能力的許可位點。術語「許可位置」係指許可環與許可位點兩者。A1域包含許可環-1區(A1-1)及許可環-2區(A1-2)，A2域包含許可環-1區(A2-1)及許可環-2區(A2-2)，且A3域包含許可環-1區(A3-1)及許可環-2區(A3-2)。參見以全文引用的方式併入本文中之2013年2月15日申請之PCT/US2013/026521。
本發明之嵌合FVIII蛋白可在各FVIII A域區中或在a3區中之一或多個許可環中包含取代或缺失且可進一步允許插入XTEN，同時具有促凝血活性且仍能夠藉由宿主細胞活體內或活體外表現。已測定了FVIII之各種結晶結構的不同解析度。將FVIII及FVIIIa之由X射線結晶學及分子動態模擬測定之此等結構用以產生FVIII可達表面積及構形可撓性模型。舉例而言，Shen等人，Blood 111：1240-1247(2008)及Ngo等人，Structure 16：597-606(2008)已測定了人類FVIII之結晶結構。用於此等結構之資料係可分別以寄存編號2R7E及3CDZ獲自蛋白質資料庫(pdb.org)。
在某些實施例中，FVIII之A域中之表面暴露的可撓性環結構中含有許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1及A3-2。根據儲存為PDB資料庫之寄存編號2R7E(PDB：2R7E)的成熟FVIII之二級結構，A1-1位於β 股1和β股2之間、A1-2位於β股11和β股12之間、A2-1位於β股22和β股23之間、A2-2位於β股32和β股33之間、A3-1位於β股38和β股39之間且A3-2位於β股45和β股46之間。根據DSSP程式(Kabsch及Sander,Biopolymers,22：2577-2637(1983))，PDB寄存編號2R7E之二級結構對應於標準化二級結構指定。可訪問在DSSP資料庫，於swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/(Joosten等人，39(增刊1)：D411-D419(2010))可得儲存為PDB寄存編號2R7E之成熟FVIII的DSSP二級結構。
在某些態樣中，包含A1-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸15至約胺基酸45的區域。在某些態樣中，A1-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸18至約胺基酸41的區域。在某些態樣中，包含A1-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸201至約胺基酸232的區域。在某些態樣中，A1-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸218至約胺基酸229的區域。在某些態樣中，包含A2-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸395至約胺基酸421的區域。在某些態樣中，A2-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸397至約胺基酸418的區域。在某些態樣中，包含A2-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸577至約胺基酸635的區域。在某些態樣中，A2-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸595至約胺基酸607的區域。在某些態樣中，包含A3-1之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1705至約胺基酸1732的區域。在某些態樣中，A3-1對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1711至約胺基酸1725的區域。在某些態樣中，包含A3-2之表面暴露的可撓性環結構對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1884至約胺基酸1917的區域。在某些態樣中，A3-2對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1899至約胺基酸1911的區域。在其他態樣中，a3區對應於原生成熟人類FVIII中自SEQ ID NO：4之約胺基酸1649至約胺基酸1689的區域。
在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一或多個插入FVIII之一或多個許可環或a3區或兩者中之XTEN，其中在FVIII之該一或多個許可環中或a3區或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。欲插入之XTEN包括(但不限於)(i)增加FVIII之半衰期或活體內或活體外穩定性之XTEN，(ii)清除受體，或(iii)有助於嵌合FVIII蛋白之可視化或定位的部分。下文較詳細地討論XTEN。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，整個許可環中之一或多者可經取代或缺失。在其他態樣中，該一或多個許可環之僅一部分係經取代或缺失。在一些態樣中，為了製備嵌合FVIII蛋白之目的，在一或多個許可環中或在a3區中之取代或缺失的任何組合均為可能的。
在某些態樣中，將至少一個XTEN插入嵌合FVIII蛋白之許可環或a3區中，例如在取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中至少一者插入許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2或a3區或其任何組合中，其中一或多個胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，兩個XTEN中之每一者均插入FVIII蛋白之許可環中及/或a3區中，例如在取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入含有取代、缺失或其組合之FVIII蛋白之許可環中(例如A1-1)，例如在取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2)中之一者中或a3區中。在其他態樣中，其他許可環及a3區不含有任何取代或缺失。在一些態樣中，第一XTEN與第二XTEN可相同或不同。在其他態樣中，其他許可環中之一或多者及a3區含有取代、缺失或其組合。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少三個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中將三個XTEN中之至少一者插 入許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或a3區中，其中一或多個在許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或在a3區中之胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。三個XTEN可相同或不同。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少四個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中將四個XTEN中之至少一者插入許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或a3區中，其中一或多個在許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或在a3區中之胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。四個XTEN可相同或不同。如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少五個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中將五個XTEN中之至少一者插入許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或a3區中，其中一或多個在許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或在a3區中之胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。五個XTEN可相同或不同。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少六個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中將六個XTEN中之至少一者插入許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或a3區中，其中一或多個在許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或在a3區中之胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。六個XTEN可相同或不同。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入a3區中。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如對應於SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中，例如插入兩個不同許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或a3區中之XTEN，其中兩個不同許可環中之每一者的一或多個胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿 主細胞中活體內或活體外表現。或者，如上所述之嵌合FVIII蛋白可包含兩個或兩個以上插入單一許可環中之XTEN而無插入其他許可環中之XTEN，其中一或多個在單一許可環中之胺基酸係經取代及/或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白可包含至少一個插入如上所述之許可環中之至少一者中的XTEN，且可進一步包含一或多個插入a3中之XTEN，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白可包含三、四、五、六個或六個以上插入一或多個許可環中或a3中之XTEN，其中一或多個在該一或多個許可環中或在該a3區中之胺基酸係經取代或缺失，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。
Figure 108113094-A0202-12-0094-43
在表17中識別可經取代或缺失之許可環區(定義I或定義II)。將可經取代或缺失之一或多個胺基酸之胺基酸殘基配合物列於表17中(缺失-定義I及缺失-定義II)。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白中之該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸19至40(A1-1)、胺基酸219至228(A1-2)、胺基酸398至417(A2-1)、胺基酸596至606(A2-2)、胺基酸1712至1724(A3-1)、胺基酸1900至1910(A3-2)、胺基酸1649至1689(a3區)或其任何組合中。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸16至44(A1-1)、胺基酸202至231(A2-2)、胺基酸396至420(A2-1)、胺基酸578至634(A2-2)、 胺基酸1706至1731(A3-1)、胺基酸1885至1916(A3-2)或胺基酸1649至1689(a3區)或其任何組合中。在一些態樣中，A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2之整個許可環係經取代或缺失。在其他態樣中，許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2之一部分係經缺失或取代。
在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含插入一或多個許可環或a3域中任一處，例如在一或多個取代或缺失的胺基酸之上游或下游，例如在對應於成熟原生人類FVIII中一或多個胺基酸之一或多個胺基酸之緊接的下游之XTEN，該一或多個胺基酸包括(但不限於)：SEQ ID NO：4之胺基酸19至40或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸18；SEQ ID NO：4之胺基酸23至40或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸22；SEQ ID NO：4之胺基酸27至40或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸19至25或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸26；SEQ ID NO：4之胺基酸19至39或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸40；SEQ ID NO：4之胺基酸217至228或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸216；SEQ ID NO：4之胺基酸221至228或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸217至219或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸220；SEQ ID NO：4之胺基酸225至228或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸217至223或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸224；SEQ ID NO：4之胺基酸400至417或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸398經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸399；SEQ ID NO：4之胺基酸404至417或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸398至402經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸403；SEQ ID NO：4之胺基酸410至417或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸398至408或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸409；SEQ ID NO：4之胺基酸600至606或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸596至598或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸599；SEQ ID NO：4之胺基酸603至606或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸596至602或其部分 經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸603；SEQ ID NO：4之胺基酸1649至1655或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸1657至1689或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸1656；SEQ ID NO：4之胺基酸1712至1724或其部分經取代或缺失之胺基酸1711；SEQ ID NO：4之胺基酸1721至1724或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸1712至1719或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸1720；SEQ ID NO：4之胺基酸1712至1724或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1725；SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1910或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1900；SEQ ID NO：4之胺基酸1906至1910或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1904或其部分經取代或缺失或符合上述兩者的SEQ ID NO：4之胺基酸1905；SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1909或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1910；或其任何組合。在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含插入a3域中之XTEN，例如在一或多個經取代、突變或缺失的胺基酸之上游或下游，該一或多個胺基酸可為對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1649至1689，例如在以下胺基酸之緊接的下游：SEQ ID NO：4之胺基酸1649至1648或其部分經取代或缺失、SEQ ID NO：4之胺基酸1650至1689或其部分經取代或缺失或其組合的SEQ ID NO：4之胺基酸1656。
在一些態樣中，取代或缺失一或多個胺基酸與插入XTEN均在同一許可環中或在a3區中。在其他態樣中，取代或缺失一或多個胺基酸係在一個許可環中，且插入XTEN係在另一許可環中或在a3區中。在其他態樣中，取代或缺失一或多個胺基酸係在a3區中，且插入XTEN係在許可環中。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A1-1中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸19至22、胺基酸19至26、胺基酸19至32、胺基酸19至40、胺基酸23至26、胺基酸23至32、胺基酸23至40、胺基酸27至32、 胺基酸27至40或胺基酸33至40中。在某些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入A1-1中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入A1-1區中對應於原生人類FVIII之胺基酸18、胺基酸22、胺基酸26或胺基酸32的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A1-1中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A1-1中，例如在A1-1中之取代或缺失之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A1-1中，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中或與FVIII蛋白之C端融合。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A1-2中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸218至229中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入A1-2中，例如在該一或多個取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入A1-2區中對應於原生人類FVIII之胺基酸216或220的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A1-2中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A1-2中，例如在A1-2中之取代或缺失之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A1-2中，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A2-1中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸400至403中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入A2-1中，例如在A2-1中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸399的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A2-1中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A2-1中，例如在A2-1中之取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A2-1中，例如在A2-1中之取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A1-2、A2-2、A3-1、A3-2)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之至少一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A2-2中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸595至607中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入A2-2中，例如在A2-2中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸599或603的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A2-2中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A2-2中，例 如在A2-2中之取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A2-2中，例如在A2-2中之取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A3-1、A3-2)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之至少一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A3-1中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1712至1720、胺基酸1712至1725或胺基酸1721至1725中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入A3-1中，例如在A3-1中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1711或胺基酸1720的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A3-1中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A3-1中，例如在A3-1中之取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A3-1中，例如在A3-1中之取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2或A3-2)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之A3-2中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類 FVIII之胺基酸1901至1905、胺基酸1901至1910、胺基酸1906至1910、胺基酸1901至1905、胺基酸1901至1910或胺基酸1906至1910中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入A3-2中，例如在A3-2中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1900或胺基酸1905的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入A3-2中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者插入A3-2中，例如在A3-2中之取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入A3-2中，例如在A3-2中之取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2或A3-1)中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在某些態樣中，在嵌合FVIII蛋白中之a3區中的一或多個胺基酸係經取代或缺失，其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性。在一些態樣中，含有取代或缺失之嵌合FVIII蛋白係在宿主細胞中活體內或活體外表現。在其他態樣中，該一或多個取代或缺失的胺基酸係在對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1649至1689中。在某些態樣中，將至少一個XTEN插入a3區中，例如在a3區中該一或多個經取代或缺失之胺基酸的上游或下游。在一些態樣中，將至少一個XTEN緊接地插入對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1656的下游。在某些態樣中，如上所述之嵌合FVIII蛋白包含至少兩個插入FVIII蛋白中之XTEN，其中兩個XTEN中之至少一者經插入a3區中，且其中嵌合FVIII蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。在一個態樣中，將兩個XTEN中之每一者均插入a3區中，例如在a3區中取代、缺失或其組合之上游或下游。在另一態樣中，將第一XTEN插入a3區中，例如在a3區中之取代、缺失或其組合之上游或下游，且將第二XTEN插入其他許可環(例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-1) 中之一者中或a3區中。在某些態樣中，其他許可環中之一者不含有取代或缺失。在其他態樣中，可將至少一個XTEN進一步插入B域中，例如SEQ ID NO：4之胺基酸745，或與FVIII蛋白之C端融合，例如SEQ ID NO：4之胺基酸2332。
在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含插入一或多個胺基酸係經取代或缺失之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2或a3區中之第一XTEN，且將第二XTEN插入B域，例如在對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之緊接的下游。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含緊接地插入SEQ ID NO：4之胺基酸403之下游的第一XTEN及緊接地插入SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游的第二XTEN，其中對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸404至417的一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含緊接地插入對應於成熟FVIII序列(即SEQ ID NO：4)之胺基酸1900之下游的第一XTEN，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游的第二XTEN，其中對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1901至1910的一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸18之下游的第一XTEN，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745之下游的第二XTEN，其中一或多個對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸19至22、胺基酸19至26、胺基酸19至32、胺基酸19至40、胺基酸23至26、胺基酸23至32、胺基酸23至40、胺基酸27至32、胺基酸27至40或胺基酸33至40的胺基酸係經取代或缺失。
在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游的第一XTEN，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900之下游的第二XTEN，其中對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1901至1910中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸26之下游的第一XTEN、緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之下游的第二XTEN，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1900 之下游的第三XTEN，其中對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸27至40或對應於原生成熟人類FVIII之胺基酸1901至1910中的一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，第一與第二XTEN為相同的。在其他態樣中，第一XTEN為不同的。
在一些實施例中，本發明之FVIII蛋白可為包含FVIII重鏈(HC)及FVIII輕鏈之雙鏈FVIII，或單鏈FVIII。
在一些態樣中，除在許可環或a3區中取代或缺失一或多個胺基酸以外，較之未將至少一個XTEN插入許可環中或a3區中之嵌合FVIII蛋白的表現程度，將至少一個XTEN插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)或a3區之許可環中會得表現程度提高。在一些態樣中，藉由活性分析測定表現程度之提高。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個XTEN，該兩個XTEN中之第一者插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)之許可環中之一或多者中或a3區中，其中該一或多個許可環及a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失，且該兩個XTEN中之第二者插入a3區中。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個XTEN，該三個XTEN中之第一及第二者插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)之許可環中之一或多者中或a3區中，其中該一或多個許可環及a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失，且該三個XTEN中之第三者插入a3區中。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個以上XTEN，該三個以上XTEN中之第一者插入a3區中，且該三個以上XTEN中之其餘者插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)之許可環中之一或多者中或a3區中，其中該一或多個許可環及a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在一些態樣中，由將至少一個XTEN插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)之許可環中或a3區中(其中該一或多個許可環或a3區中之一或多個胺基酸為取代或缺失的)所引起之表現程度的提高為：當較之未將至少一個XTEN插入該一或多個許可環中或a3區中之嵌合FVIII蛋白的表現程度，提高至少約10%、至少約20%、 至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，由將至少一個XTEN插入A域(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)之許可環中或a3區中(其中該一或多個許可環或a3區中之一或多個胺基酸為取代或缺失的)所引起之表現程度的提高為：當較之未將其他XTEN插入該一或多個許可環中或a3區中之嵌合FVIII蛋白的表現程度，提高至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含多個XTEN插入，例如超過二、三、四、五、六、七、八、九或十個插入，其中插入位點包括(但不限於)表18至25中所列之位點或其任何組合，且其中該等插入位點中之至少一者位於許可環，例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中，或位於a3區中，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在一個態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個XTEN，其中該兩個XTEN中之至少一者或該兩個XTEN均插入許可環中或a3區中，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中之至少一者中或a3區中之一或多個胺基酸經取代或缺失。第一與第二XTEN可相同或不同。包含兩個XTEN之嵌合FVIII蛋白之非限制性實例列於表19中。在一個實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中，且將第二XTEN插入環A2-1中，其中A1-1、A2-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中，且將第二XTEN插入許可環A2-2中，其中A1-1、A2-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-1中，且將第二XTEN插入許可環A3-2中，其中A3-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中，且將第二XTEN插入a3區中，其中A1-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中，且將第二XTEN插入a3區中，其中A2-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可 環A2-2中，且將第二XTEN插入a3區中，其中A2-2中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-1中，且將第二XTEN插入a3區中，其中A3-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中，且將第二XTEN插入許可環A3-2中，其中A1-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中，且將第二XTEN插入許可環A3-2中，其中A2-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-2中，且將第二XTEN插入a3區中，其中A3-2中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中，且將第二XTEN插入許可環A3-1中，其中A1-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中，且將第二XTEN插入許可環A3-1中，其中A2-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在另一態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個XTEN，其中該三個XTEN中之至少一者插入許可環中或a3區中，該三個XTEN中之至少二者插入兩個許可環中及/或a3區中或其任何組合中，或三個XTEN插入三個許可環中、a3區中或其任何組合中，且其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。第一、第二或第三XTEN可彼此相同或不同。第一、第二及第三XTEN為相同或不同的。包含三個XTEN之嵌合FVIII蛋白的非限制性實例在表20或表21中。在一個實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中，且將第三XTEN插入a3區中，其中A1-1、A2-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中，且將第三XTEN插入許可環A3-1中，其中A1-1、A2-1、A3-1或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A3-1中，且將第三XTEN插入許可環A3-2中，其中A1-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中， 將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中，且將第三XTEN插入許可環A3-1中，其中A2-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中，且將第三XTEN插入許可環A3-2中，其中A2-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入a3區中、將第二XTEN插入許可環A3-1中，且將第三XTEN插入許可環A3-2中，其中A3-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入B域中，且將第三XTEN插入羧基端位置(CT)，其中A1-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入B域中，且將第三XTEN插入CT，其中A2-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-1中、將第二XTEN插入B域中，且將第三XTEN插入CT，其中A3-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-2中、將第二XTEN插入B域中，且將第三XTEN插入CT，其中A3-2中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些實施例中，包含三個XTEN之FVIII蛋白對vWF之親和力較小或含有對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1685或對應於SEQ ID NO：4之胺基酸745至胺基酸1656的缺失，或在胺基酸1648(例如R1648A)、1680(Y1680F)之突變或取代，或兩者，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在另一態樣中，嵌合FVIII蛋白包含四個XTEN，其中該四個XTEN中之至少一者插入許可環或a3區中、該四個XTEN中之至少二者插入兩個許可環、a3區或其任何組合中、該四個XTEN中之至少三者插入三個許可環、a3區或其任何組合中，或所有該四個XTEN均插入四個許可環、a3區或其任何組合中，其中許可環中之至少一個或一個以上或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。包含四個XTEN之嵌合FVIII蛋白的非限制性實例列於表22或表23中。第一、第二、第三或第四XTEN為相同或不同的。在一個實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二 XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中，且將第四XTEN插入許可環A3-1中，其中A1-1、A2-1、A3-1或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中，且將第四XTEN插入許可環A3-2中，其中A1-1、A2-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入A3-1區中，且將第四XTEN插入許可環A3-2中，其中A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中，且將第四XTEN插入許可環A3-2中，其中A1-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中，且將第四XTEN插入許可環A3-2中，其中A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A3-1中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A3-2中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A3-2中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入許可環A3-1中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A2-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN 插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入許可環A3-2中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A2-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A3-1中、將第二XTEN插入許可環A3-2中、將第三XTEN插入B域中，且將第四XTEN插入CT，其中A3-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中，且將第四XTEN插入CT，其中A2-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-2中，且將第四XTEN插入CT，其中A2-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入a3區中、將第二XTEN插入許可環A3-1中、將第三XTEN插入許可環A3-2中，且將第四XTEN插入CT，其中A3-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入許可環A3-1中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入許可環A3-2中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-1或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-2中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-2或兩者中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A3-1中、將 第三XTEN插入許可環A3-2中，且將第四XTEN插入CT，其中A1-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在另一態樣中，嵌合FVIII蛋白包含五個XTEN，其中該五個XTEN中之至少一者插入許可環或a3區中、該五個XTEN中之至少二者插入兩個許可環、a3區或其任何組合中、該五個XTEN中之至少三者插入三個許可環、a3區或其任何組合中、該五個XTEN中之至少四者插入四個許可環、a3區或其任何組合中，或所有該五個XTEN均插入五個許可環、a3區或其任何組合中，其中許可環中之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。第一、第二、第三、第四及第五XTEN為相同或不同的。包含五個XTEN之嵌合FVIII蛋白的非限制性實例在表24中。在一個實例中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中、將第四XTEN插入許可環A3-1中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-2或其任何組台中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入許可環A3-1中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入a3區中、將第三XTEN插入許可環A3-1中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將 第三XTEN插B域中、將第四XTEN插入許可環A3-1中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插B域中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入B域中、將第三XTEN插入許可環A3-1中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A1-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A2-1中、將第二XTEN插入B域中、將第三XTEN插入許可環A3-1中、將第四XTEN插入許可環A3-2中，且將第五XTEN插入CT，其中A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在另一態樣中，嵌合FVIII蛋白包含六個XTEN，其中該六個XTEN中之至少一者插入許可環或a3區中、該六個XTEN中之至少二者插入兩個許可環、a3區或其任何組合中、該六個XTEN中之至少三者插入三個許可環、a3區或其任何組合中、該六個XTEN中之至少四者插入四個許可環、a3區或其任何組合中、該六個XTEN中之至少五者插入五個許可環、a3區或其任何組合中，或所有該六個XTEN均插入六個許可環、a3區或其任何組合中，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。第一、第二、第三、第四、第五及第六XTEN為相同或不同的。包含六個XTEN之嵌合FVIII蛋白的實例包括(但不限於)表25。在一個實例中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入a3區中、將第四XTEN插入許可環A3-1中、將第五XTEN插入許可環A3-2中，且將第六XTEN插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一態樣中，將第一XTEN插入許可環A1-1中、將第二XTEN插入許可環A2-1中、將第三XTEN插入B域中、將第四XTEN插入許可環A3-1中、將第五XTEN插入許可環A3-2中，且將第六XTEN 插入CT，其中A1-1、A2-1、A3-1、A3-2或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一個緊接地插入選自由表18中胺基酸組成之群的胺基酸之下游之XTEN：其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個緊接地插入兩個胺基酸之下游的XTEN，該兩個胺基酸中之每一者選自選自由表18中之胺基酸組成之群，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將兩個XTEN插入兩個選自由表19中之插入位點組成之群的插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個緊接地插入三個胺基酸之下游的XTEN，該三個胺基酸中之每一者選自選自由表18中之胺基酸組成之群，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將三個XTEN插入三個選自由表20及表21中之插入位點組成之群的插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含四個緊接地插入四個胺基酸之下游的XTEN，該四個胺基酸中之每一者選自選自由表18中之胺基酸組成之群，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將四個XTEN插入四個選自由表22及表23中之插入位點組成之群的插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含五個緊接地插入五個胺基酸之下游的XTEN，該五個胺基酸中之每一者選自選自由表18中之胺基酸組成之群，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將五個XTEN插入五個選自由表24中之插入 位點組成之群的插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含六個緊接地插入六個胺基酸之下游的XTEN，該六個胺基酸中之每一者選自選自由表18中之胺基酸組成之群，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將六個XTEN插入六個選自由表25中之插入位點組成之群的插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2中或在a3區中或其任何組合中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一個緊接地插入對應於成熟原生人類FVIII中SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1720或SEQ ID NO：4之胺基酸1900的胺基酸位置之下游的XTEN，及另一緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656的胺基酸之下游的XTEN，其中胺基酸27至40、胺基酸404至417、胺基酸1721至1724或其任何組合之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個緊接地插入對應於成熟原生人類FVIII中SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1720或SEQ ID NO：4之胺基酸1900的兩個胺基酸位置之下游的XTEN，及另一緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656的胺基酸之下游的XTEN，其中胺基酸27至40、胺基酸404至417、胺基酸1721至1724、胺基酸1901至1910或其任何組合之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個緊接地插入對應於成熟原生人類FVIII中SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1720或SEQ ID NO：4之胺基酸1900的三個胺基酸位置之下游的XTEN，及另一緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656的胺基酸之下游的XTEN，其中胺基酸27至40、胺基酸404至417、胺基酸1721至1724、胺基酸1901至1910或其任何組合之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含至少一個單獨或與一或 多個插入A域之許可環(例如，如上所述之A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1或A3-2)或a3區中之XTEN組合插入FVIII之a3區中(例如，對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656的插入位點)的XTEN，其中在A域之許可環中或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，FVIII蛋白包含兩個XTEN。在一些態樣中，FVIII蛋白包含三個XTEN。在一些態樣中，FVIII蛋白包含四個XTEN。在一些態樣中，FVIII蛋白包含五個XTEN。在一些態樣中，FVIII蛋白包含六個XTEN。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一或多個在許可環，例如A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2內或在a3區或其任何組合內之插入位元點的XTEN序列，其中在許可環中或在a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A1-1中，其中A1-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在另一實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A1-2中，其中A2-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A2-1中，其中A2-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A2-2中，其中A2-2中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A3-1中，其中A3-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些實施例中，將該一或多個XTEN序列插入A3-2中，其中A3-1中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在某些實施例中，將該一或多個XTEN序列插入a3區中，其中a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。
在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一個插入表18中所列之插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個插入表18中所列之兩個插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將兩個XTEN序列插入表19中所列之兩個插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者中或在a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其 他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個插入表18中所列之三個插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定態樣中，將三個XTEN序列插入表20、表21或該兩個表中所列之三個插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者中或在a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在其他態樣中，嵌合FVIII蛋白包含四個插入表18中所列之四個插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定態樣中，將四個XTEN序列插入表22、表23或該兩者中所列之四個插入位點，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含五個插入表18中所列之五個插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定態樣中，將五個XTEN序列插入表24中所列之五個插入位點，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在某些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含六個插入表18中所列之六個插入位點的XTEN序列，其中A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者或a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一個特定實施例中，將六個XTEN序列插入表25中所列之六個插入位點，其中在A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1、A3-2中之至少一者中或在a3區中之一或多個胺基酸係經取代或缺失。在一些態樣中，所有插入之XTEN序列均相同。在其他態樣中，插入之XTEN序列中之至少一者不同於所插入之XTEN序列中之其餘部分。
在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含一個緊接地插入對應於以下胺基酸之胺基酸位置之下游的XTEN序列：SEQ ID NO：4之胺基酸27至40或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸404至417或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1721至1724或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1720，或SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1910或其部分經取代 或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1900，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之胺基酸的下游之另一XTEN序列。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含兩個緊接地插入對應於以下胺基酸之兩個胺基酸位置之下游的XTEN序列：SEQ ID NO：4之胺基酸27至40或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸404至417或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1721至1724或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1720，或SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1910或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1900，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之胺基酸的下游之另一XTEN序列。在一些態樣中，嵌合FVIII蛋白包含三個緊接地插入對應於以下胺基酸之三個胺基酸位置之下游的XTEN序列：SEQ ID NO：4之胺基酸27至40或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸26、SEQ ID NO：4之胺基酸404至417或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸403、SEQ ID NO：4之胺基酸1721至1724或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1720，或SEQ ID NO：4之胺基酸1901至1910或其部分經取代或缺失的SEQ ID NO：4之胺基酸1900，及緊接地插入對應於SEQ ID NO：4之胺基酸1656之胺基酸的下游之另一XTEN序列。
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Figure 108113094-A0202-12-0116-46
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Figure 108113094-A0202-12-0118-49
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Figure 108113094-A0202-12-0122-55
Figure 108113094-A0202-12-0123-56
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表23：包含四個XTEN插入之其他FVIII變異體的凝血活性分析之結果
Figure 108113094-A0202-12-0124-59
Figure 108113094-A0202-12-0125-60
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表24：包含五個XTEN插入之FVIII變異體
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Figure 108113094-A0202-12-0127-63
嵌合蛋白：組合對VWF之較小結合與所選XTEN插入及組合的屬性以延長FVIII蛋白之半衰期
在一個態樣中，本發明係關於使用插入FVIII多肽中之所選XTEN序列來延長因子VIII蛋白之半衰期，其中因子VIII多肽對VWF之結合較小。已發現，可藉由減少或消除VWF受體對嵌合蛋白之清除，同時將規定長度之XTEN選擇性幷入某些插入位點來進一步增加FVIII與XTEN之嵌合蛋白的半衰期，藉此組合相互不同之性質以產生藥物動力學性質增強之FVIII嵌合蛋白。
內源性VWF係與非共價複合物中約95%至約98%之內源性FVIII締合。儘管內源性VWF為FVIII半衰期限制因素，但亦已知結合於FVIII蛋白之內源性VWF會以各種方式保護FVIII。舉例而言，全長VWF(呈具有約250kDa之多聚物形式)可保護FVIII以免蛋白酶裂解及FVIII活化、穩定化FVIII重鏈及/或輕鏈，且預防清除受體對FVIII之清除。但同時，內源性VWF藉由防止胞飲作用且藉由經VWF清除路徑清除來自系統之FVIII-VWF複合物來限制FVIII半衰期。鹹信，儘管不受理論束縛，但內源 性VWF為防止與半衰期延長劑融合之FVIII蛋白之半衰期長於野生型FVIII之約兩倍的半衰期限制因素。因此，本發明係關於使用對VWF之親和較小的FVIII蛋白來預防或抑制在內源性VWF與FVIII蛋白之間的相互作用，接著藉由使用一個XTEN序列或二、三或至少四個XTEN序列來增加此FVIII蛋白之半衰期，其中至少一個XTEN序列之長度小於144個胺基酸或長度不超過72或78個胺基酸。與野生型FVIII相比，所得FVIII嵌合蛋白具有由XTEN序列所賦予之半衰期延長的完整益處。
在一些實施例中，將本文提供之嵌合蛋白設計以減小受FVIII結合劑之結合，藉此增加投與受試者之FVIII的終末半衰期，同時仍保留促凝血活性。鹹信嵌合蛋白具有相對較高及/或持續之如下實現的活性：藉由向FVIII凝血因子添加未結構化之XTEN來減小該分子之活性清除。自循環移除FVIII之清除機制有待完整闡明。凝血蛋白之吸收、消除及去活可在循環系統中以及在血管外空間中發生。凝血因子為與大量其他蛋白質、脂質及受體相互作用之複合蛋白，且許多此等相互作用可有助於CF自循環消除。VWF為結合於FVIII之FVIII結合劑的一個實例。FVIII與vWF係以緊密的非共價連接複合物之形式在血液中循環，其中VWF充當可能有助於保護FVIII免受活性裂解機制影響之載體，然而會對FVIII之終末半衰期產生限制。舉例而言：(i)vWF會穩定化FVIII之雜二聚結構；(ii)vWF藉由磷脂結合性蛋白酶狀活化之蛋白質C及活化之FX(FXa)來保護FVIII以免解蛋白性降解；(iii)VWF會干擾FVIII對暴露於經活化之血小板內的帶負電之磷脂表面的結合；(iv)VWF會抑制FVIII對經活化之FIX(FIXa)的結合，藉此防止FVIII接近FX活化性複合物；及(v)VWF會防止細胞吸收FVIII(Lenting,P.J.等人，J Thrombosis and Haemostasis(2007)5(7)：1353-1360)。儘管VWF-FVIII相互作用具有高親和力(<1nM)，但複合物仍處於動態平衡，以使FVIII分子之較小但重要的部分(5-8%)以遊離蛋白質之形式循環(Leyte A等人，Biochem J(1989)257：679-683；Noe DA.Haemostasis(1996)26：289-303)。因此，原生FVIII之一部分未由VWF保護，從而允許活性清除機制自循環中移除未受保護之FVIII。
在另一態樣中，本發明提供與VWF締合，然而針對活性清 除vWF受體之保護增強的FVIII嵌合蛋白。在一個實施例中，本發明提供具有增強之藉由將四個或四個以上XTEN併入FVIII分子內四個或四個以上位置所賦予之保護的FVIII嵌合蛋白，其中XTEN會干擾嵌合蛋白與彼等vWF清除受體之相互作用，因而較之不與XTEN連接之相應FVIII，嵌合蛋白之藥物動力學性質得到增強。在另一實施例中，本發明提供嵌合蛋白，其具有小至少5%或約10%，或小約20%，或約40%，或約50%，或約60%，或約70%之減小的與VWF之結合親和力，但仍組態以具有增強之藉由將XTEN併入FVIII分子內一或多個位置或FVIII分子內四個或四個以上位置所賦予之保護以免活性清除受體之影響，其中XTEN會干擾因子VIII與彼等受體之相互作用。在前述實施例中，較之不與XTEN連接之FVIII，嵌合蛋白具有至少約12小時，或24小時，或48小時，或72小時，或96小時，或120小時，或144小時，或7天，或10天，或14天，或21天之增加的終末半衰期。本文亦提供一種產生清除率減小之嵌合蛋白的方法，其中使用本文所述之活體外結合分析或活體內藥物動力學模型或此項技術中已知之其他分析且選擇顯示結合減小但仍保留促凝血FVIII活性之彼等者，較之不與XTEN連接之FVIII而評價用多個XTEN插入產生之嵌合蛋白對結合於清除受體之抑制。本文提供因子VIII序列內之XTEN插入點的非限制性實例。使用此等插入點，嵌合蛋白可具有含多個插入XTEN之組態，其中嵌合蛋白之FVIII組分的約100，或約200，或約300，或約400，或約500個胺基酸分隔至少四個XTEN以進一步增大針對活性清除機制之保護，因此增加FVIII之終末半衰期。不受特定理論束縛，期望具有高淨電荷之嵌合FVIII組成(例如包含AE家族XTEN之嵌合蛋白)之XTEN與各種帶負電之表面(諸如血管、組織或各種受體)的非特異性相互作用較小，其將進一步有助於活性清除率減小。相反地，期望具有低(或無)淨電荷之嵌合蛋白之XTEN(例如包含AG家族XTEN之嵌合蛋白)與表面具有較高程度之相互作用，其儘管有助於活性清除，但鑑於細胞(例如血小板)及血管表面對凝血過程及凝血因子活化強度之已知貢獻，可加強經締合之凝血因子的活性(Zhou,R.等人，Biomaterials(2005)26(16)：2965-2973；London,F.等人，Biochemistry(2000)39(32)：9850-9858)。本發明部分地利用以下事實：可藉 由經插入之形成XTEN之無規捲曲阻斷受體位點，從而減小結合來實現因吸附速率減小或脫附速率增大而對清除受體之結合減小的某些配體。可藉由本文所揭示之方法測試嵌合蛋白之特定組態的選擇以確定減小對清除受體之結合程度的彼等組態以實現降低之活性清除速率。在一個實施例中，嵌合蛋白包含具有一或多個插入XTEN之FVIII-XTEN序列，其中較之不與XTEN連接之FVIII，該嵌合蛋白之終末半衰期增加至少約兩倍，或至少約三倍，或至少約四倍，或至少約五倍，或至少約六倍，或至少約八倍，或至少約十倍，或至少約二十倍。
間隔子
在一些實施例中，嵌合蛋白包含在XTEN序列與FVIII序列之間的間隔子。
因此，在一些實施例中，嵌合蛋白具有下式： (XTEN)t-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)u-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)v-(S)c-(B)-(S)d-(XTEN)w-(S)d-(A3)-(S)e-(XTEN)x-(S)e-(C1)-(S)f-(XTEN)y-(S)f-(C2)-(S)g-(XTEN)z
其中每次出現時獨立地，A1為FVIII之A1域；A2為FVIII之A2域；A3為FVIII之A3域；B為FVIII之B域，其可為B域之片段或剪接變異體且可存在或不存在；C1為FVIII之C1域；C2為FVIII之C2域；S為具有1至約50個胺基酸殘基之間隔序列，其可視情況包括裂解序列或與限制位點相容之胺基酸；a為0或1；b為0或1；c為0或1；d為0或1；e為0或1；f為0或1；g為0或1；t為0或1；u為0或1；v為0或1；w為0或1；x為0或1；y為0或1；z為0或1；，限制條件為t+u+v+w+x+y+z
Figure 108113094-A0202-12-0130-75
1；且XTEN為如本文所述之延長重組型多肽。在一些實施例中，間隔子序列為甘胺酸或選自表16之序列。
表16：與限制位點相容之間隔序列
Figure 108113094-A0202-12-0131-64
在另一態樣中，本發明提供組態成具有一或多個間隔序列之嵌合蛋白，該一或多個間隔序列係幷入XTEN中或與XTEN相鄰、設計以為嵌合蛋白中幷入或增強官能基或性質，或作為融合蛋白組成之組裝或製造的輔助物。此等性質包括(但不限於)納入裂解序列以允許組件釋放、納入與核苷酸限制位點相容之胺基酸以允許XTEN編碼核苷酸連接於FVIII編碼核苷酸或有助於表現載體之構築，及設計以減小嵌合融合蛋白之區域中之位阻的連接子。
在一個特定實施例中，嵌合蛋白包含一或多個連接於FVIII多肽與該一或多個幷入嵌合蛋白中之XTEN之間的接合點之間隔序列，其中該等間隔序列包含與編碼限制位點之核苷酸相容的胺基酸。在另一實施例中，嵌合蛋白包含一或多個連接於FVIII多肽與幷入嵌合蛋白中之再一個XTEN之間的接合點的間隔序列，其中間隔序列包含與編碼限制位點之核苷酸相容的間隔序列，且胺基酸及再一個間隔序列胺基酸係選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)。在另一實施例中，嵌合蛋白包含一或多個連接於FVIII多肽與幷入嵌合蛋白中之再一個XTEN之間的接合點之間隔序列，其中間隔序列包含與編碼限制位點之核苷酸相容的胺基酸，且再一個間隔序列係選自表16之序列。將各間隔序列之確切序列選擇為與用於特定嵌合構築體之表現載體中之選殖位點相容。 在一個實施例中，間隔序列具有與XTEN相容之性質。在一個實施例中，間隔序列為GAGSPGAETA(SEQ ID NO：93)。對於幷入FVIII序列內部之XTEN序列，各XTEN可側接兩個包含與限制位點相容之胺基酸的間隔序列，而連接於N端或C端之XTEN可在兩個組件之接合點處僅具有單個間隔序列且在相反端具有另一間隔序列以便幷入載體中。如對熟習此項技術者顯而易知，當以合成方式產生整個嵌合基因時，構築體中可省去包含與FVIII內部之限制位點相容之胺基酸的間隔序列。
一旦選擇了編碼具有所需長度及性質之XTEN的基因，便藉由將該基因選殖於與編碼FVIII之基因相鄰且同框，或者在編碼FVIII之相鄰域的核苷酸之間，或者在編碼既定FVIII域之序列內，或者與編碼與末端XTEN連接之間隔/裂解序列之核苷酸同框的構築體中而使該基因於所需位置與編碼FVIII多肽之核苷酸遺傳融合。間隔子多核苷酸可視情況包含編碼裂解序列之序列。如將對熟習此項技術者顯而易知，可能多次排列FVIII域及插入之XTEN。
在一些實施例中，間隔序列包含其他XTEN胺基酸。舉例而言，在本文提供之某些工作實例中，經由在XTEN序列之各端上的一個間隔子使36個胺基酸XTEN序列(即36AE；SEQ ID NO：22)與FVIII連接。XTEN序列之N端的間隔子之胺基酸序列為GAP，且XTEN序列之C端的胺基酸序列為ASS。此等間隔序列包含其他XTEN胺基酸。因此，可將該嵌合蛋白視為具有42個胺基酸XTEN序列(即SEQ ID NO：36之42AE XTEN)或可視為具有經由在XTEN各端之3-胺基酸間隔子與FVIII連接之36個胺基酸XTEN序列(即SEQ ID NO：22之36 AE XTEN)。
類似地，嵌合蛋白可包含在XTEN之N端具有3個胺基酸間隔子且在XTEN之C端具有3個胺基酸間隔子的72個胺基酸XTEN，其中兩個間隔子均包含其他XTEN胺基酸。可將此嵌合蛋白視為具有78個胺基酸XTEN序列(即SEQ ID NO：24之78AE XTEN)或可視為具有經由在XTEN各端之3-胺基酸間隔子與FVIII連接之72個胺基酸XTEN序列(即SEQ ID NO：23之72 AE XTEN)。
Ig恆定區或其部分
嵌合FVIII蛋白可進一步包含Ig恆定區或其部分。Ig恆定區或其部分可進一步改良嵌合FVIII蛋白之藥物動力學或藥力學性質。在某些實施例中，Ig恆定區或其部分會延長與Ig恆定區或其部分融合之分子的半衰期。
Ig恆定區包含指定為CH(恆定重)域之域(CH1、CH2等)。視同型而定(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，恆定區可包含三或四個CH域。一些同型(例如IgG)恆定區亦含有鉸鏈區。參見Janeway等人，2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y.。
用於產生嵌合FVIII蛋白之Ig恆定區或其部分可獲自大量不同來源。在一些實施例中，Ig恆定區或其部分來源於人類Ig。然而應瞭解，Ig恆定區或其部分可來源於另一哺乳動物物種，包括例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種之Ig。此外，Ig恆定區或其部分可來源於任何Ig類別，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何Ig同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一個實施例中，使用人類同型IgG1。
多種Ig恆定區基因序列(例如人類恆定區基因序列)可以公開可得之寄存物的形式得到。恆定區域序列可選擇為具有特定效應功能(或無特定效應功能)或具有減小免疫原性之特定修飾。已公開抗體及抗體編碼基因之許多序列，且可使用此項技術公認的技術自此等序列得到適合之Ig恆定區序列(例如鉸鏈、CH2及/或CH3序列或其部分)。接著可改變或合成使用任一前述方法獲得之遺傳物質以獲得本發明之多肽。應進一步瞭解，本發明之範疇涵蓋恆定區DNA序列之對偶基因、變異體及突變。
可例如使用聚合酶鏈反應及選擇以擴增相關域之引子來選殖Ig恆定區或其部分之序列。為了選殖來自抗體之Ig恆定區或其部分的序列，可自融合瘤、脾或淋巴細胞分離mRNA、反向轉錄至DNA中，且藉由PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳述於美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號；第4,965,188號；及例如「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」Innis等人編，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等人，1989.Gene 77：51；Horton等人，1993.Methods Enzymol. 217：270)中。可藉由共同恆定區引子或藉由更具特異性之引子基於公開之重鏈及輕鏈DNA及胺基酸序列來引發PCR。PCR亦可用以分離編碼抗體輕鏈及重鏈之DNA純系。在此情況下，可藉由共同引子或諸如小鼠恆定區探針之較大同系探針來篩選文庫。此項技術中已知衆多適用於抗體基因擴增之引子組(例如基於以下之5'引子：純化抗體之N端序列(Benhar及Pastan.1994.Protein Engineering 7：1509)；cDNA末端之快速擴增(Ruberti,F.等人，1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗體前導序列(Larrick等人，1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250)。以引用的方式幷入本文中之於1995年1月25日申請之Newman等人的美國專利第5,658,570號中進一步描述了抗體序列之選殖。
本文所用之Ig恆定區可包括所有域及鉸鏈區或其部分。在一個實施例中，Ig恆定區或其部分包含CH2域、CH3域及鉸鏈區，即Fc區或FcRn結合配偶體。
如本文所用，術語「Fc區」係定義為對應於原生Ig之Fc區的多肽之部分，即如藉由其兩條重鏈之各別Fc域之二聚締合來形成。原生Fc區形成具有另一Fc區之同源二聚物。相反地，如本文所用，術語「基因融合之Fc區」或「單鏈Fc區」(scFc區)係指包含基因連接在單條多肽鏈內(即編碼在單個鄰接基因序列中)之Fc域的合成二聚Fc區。
在一個實施例中，「Fc區」係指僅在木瓜酶裂解位點(即，IgG中之殘基216，其中將重鏈恆定區之第一個殘基視為114)之上游的鉸鏈區中開始且終止於該抗體之C端的單條Ig重鏈之部分。因此，完整Fc域至少包含鉸鏈域、CH2域及CH3域。
視Ig同型而定，Ig恆定區之Fc區可包括CH2、CH3及CH4域，以及鉸鏈區。包含Ig之Fc區的嵌合FVIII蛋白給予嵌合FVIII蛋白以若干所需性質，包括穩定性提高、血清半衰期增加(參見Capon等人，1989,Nature 337：525)以及對諸如新生兒Fc受體(FcRn)之Fc受體的結合(美國專利第6,086,875號、第6,485,726號、第6,030,613號；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，其以全文引用的方式併入本文中。
Ig恆定區或其部分可為FcRn結合性配偶體。FcRn在成體 上皮組織中具有活性且在腸腔、肺氣管、鼻面、陰道面、結腸及直腸面表現(美國專利第6,485,726號)。FcRn結合配偶體為結合於FcRn之Ig的一部分。
已自若干哺乳動物物種(包括人類)分離FcRn受體。已知人類FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列(Story等人，1994,J.Exp.Med.180：2377)。FcRn受體在相對較低pH值下會結合IgG(而非其他Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD及IgE)、於內腔向漿膜方向積極地跨細胞運輸IgG，接著在間隙液中所見之相對較高pH值下釋放IgG。其在成體上皮組織(美國專利第6,485,726號、第6,030,613號、第6,086,875；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺及腸上皮(Israel等人，1997,Immunology 92：69)、腎近端管狀上皮(Kobayashi等人，2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282：F358)以及鼻上皮、陰道面及膽系表面表現。
適用於本發明之FcRn結合配偶體涵蓋可由FcRn受體特異性結合之分子，包括全IgG、IgG之Fc片段及包括FcRn受體之完整結合區的其他片段。已基於X射線結晶學描述了結合於FcRn受體之IgG之Fc部分的區域(Burmeister等人，1994,Nature 372：379)。Fc與FcRn之主要接觸區域靠近CH2與CH3域之接合點。Fc-FcRn觸點均在單條Ig重鏈內。FcRn結合配偶體包括全IgG、IgG之Fc片段，及包括FcRn受體之完整結合區的IgG之其他片段。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314，及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。對Ig或Ig片段或區域之胺基酸編號的提及均基於Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。
結合於FcRn之Fc區或FcRn結合配偶體可藉由FcRn有效穿過上皮障壁，因此提供全身性投與所需治療分子之非侵入性手段。另外，包含Fc區或FcRn結合配偶體之融合蛋白由表現FcRn之細胞內吞。但幷非因降解而顯著，此等融合蛋白經再循環而再次進入循環中，從而增加了此等蛋白質之活體內半衰期。在某些實施例中，Ig恆定區之部分為通常經由二硫鍵及其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合配偶體締合 以形成二聚物及較高級多聚物之Fc區或FcRn結合配偶體。
兩個FcRn受體可結合單一Fc分子。結晶資料表明各FcRn分子結合Fc同源二聚物之單一多肽。在一個實施例中，使FcRn結合配偶體，例如IgG之Fc片段與生物活性分子連接提供了經口、經頰、舌下、經直腸、經陰道、以經鼻投與之氣霧劑形式或經由經肺途徑或經由經眼途徑來傳遞生物活性分子之手段。在另一實施例中，可用侵入方式，例如皮下、靜脈內投與嵌合蛋白。
FcRn結合配偶體區為可由FcRn受體特異性結合，隨後由Fc區之FcRn受體主動運輸的分子或其部分。特異性結合係指兩個分子形成在生理學條件下相對較穩定之複合物。特異性結合之特徵在於高親和力及低容量至適度容量，其不同於通常具有低親和力與適度容量至高容量之非特異性結合。通常，當親和力常數KA高於106 M-1或高於108 M-1時，將結合視為特異性。必要時，可藉由改變結合條件來減小非特異性結合而不實質上影響特異性結合。熟習此項技術者可使用習知技術來最佳化諸如分子濃度、溶液之離子強度、溫度、結合允許時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等之適當結合條件。
在某些實施例中，嵌合FVIII蛋白包含一或多個截斷Fc區，該一或多個截斷Fc區仍足以賦予Fc受體(FcR)以對Fc區之結合性質。舉例而言，結合於FcRn之Fc區的部分(即FcRn結合部分)包含IgG1之約胺基酸282-438，EU編號(主要接觸位點為CH2域之胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314，及CH3域之385-387、428及433-436。因此，本發明之Fc區可包含FcRn結合部分或由FcRn結合部分組成。FcRn結合部分可來源於任何同型(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之重鏈。在一個實施例中，使用來自人類同型IgG1之抗體的FcRn結合部分。在另一實施例中，使用來自人類同型IgG4之抗體的FcRn結合部分。
在另一實施例中，「Fc區」包括Fc域之胺基酸序列或來源於Fc域。在某些實施例中，Fc區包含以下至少一者：鉸鏈(例如上鉸鏈區、中鉸鏈區及/或下鉸鏈區)域(根據EU編號，抗體Fc區之約胺基酸216-230)、CH2域(根據EU編號，抗體Fc區之約胺基酸231-340)、CH3域(根據EU 編號，抗體Fc區之約胺基酸341-438)、CH4域，或其變異體、部分或片段。在其他實施例中，Fc區包含完整Fc域(即鉸鏈域、CH2域及CH3域)。在一些實施例中，Fc區包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與CH3域(或其部分)融合之鉸鏈域(或其部分)、與CH2域(或其部分)融合之鉸鏈域(或其部分)、與CH3域(或其部分)融合之CH2域(或其部分)、與鉸鏈域(或其部分)及CH3域(或其部分)均融合之CH2域(或其部分)。在其他實施例中，Fc區不含CH2域之至少一部分(例如CH2域之全部或部分)。在一個特定實施例中，Fc區包含對應於EU編號221至447之胺基酸或由其組成。
在本文中指定為F、F1或F2之Fc區可獲自大量不同來源。在一個實施例中，多肽之Fc區來源於人類Ig。然而應瞭解，Fc區可來源於另一哺乳動物物種，包括例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)或非人類靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種之Ig。此外，Fc域或其部分之多肽可來源於任何Ig類別，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何Ig同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在另一實施例中，使用人類同型IgG1。
在某些實施例中，Fc變異體使藉由包含該野生型Fc域之Fc區所賦予的至少一種效應功能發生變化(例如，Fc區結合於Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q)或引發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC)之能力發生改良或減小)。在其他實施例中，Fc變異體提供經工程改造之半胱胺酸殘基。
Fc區可為此項技術中公認之Fc變異體，已知其會在效應功能及/或FcR或FcRn結合方面賦予變化(例如增強或減小)。特定言之，本發明之結合分子可包括例如在以下所揭示之胺基酸位置中之一或多處的變化(例如取代)：國際PCT公開案WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2 及WO06/085967A2；美國專利公開案第US2007/0231329號、第US2007/0231329號、第US2007/0237765號、第US2007/0237766號、第US2007/0237767號、第US2007/0243188號、第US20070248603號、第US20070286859號、第US20080057056號；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956及7,317,091，其各自以引用的方式併入本文中。在一個實施例中，可對所揭示之胺基酸位置中之一或多者進行特異性改變(例如，對此項技術中所揭示之一或多個胺基酸的特異性取代)。在另一實施例中，可在所揭示之胺基酸位置中之一或多處產生不同變化(例如，對此項技術中所揭示之一或多個胺基酸位置的不同取代)。
IgG之Fc區或FcRn結合配偶體可根據公認程式(諸如定點突變誘發及其類似程式)修飾以得到將由FcRn結合的經修飾之IgG或Fc片段或其部分。此等修飾包括遠離FcRn接觸位點之修飾以及在接觸位點內之保持或甚至增強對FcRn之結合的修飾。舉例而言，人類IgG1 Fc(Fc γ1)中之以下單一胺基酸殘基可經取代而不顯著損失Fc對FcRn之結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中例如P238A表示在位置編號238經丙胺酸取代之野生型脯胺酸。舉例而言，特定實施例幷有N297A突變，從而移除高度保守 之N糖基化位點。除丙胺酸以外，其他胺基酸可取代野生型胺基酸之上述位置。可將突變單獨引入Fc中，從而得到超過100個不同於原生Fc之Fc區。另外，此等個別突變中之二者、三者或三者以上之組合可一起引入，從而再得到數百個Fc區。此外，本發明之構築體的Fc區中之一者可突變且構築體之其他Fc區根本不突變，或其兩者均可突變但突變不同。
某些上述突變可對Fc區或FcRn結合配偶體賦予新功能。舉例而言，一個實施例幷有N297A，從而移除高度保守之N糖基化位點。此突變之作用在於減小免疫原性，藉此增加Fc區之循環半衰期，且使得Fc區不能結合於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIA而不損害對FcRn之親和力(Routledge等人，1995,Transplantation 60：847；Friend等人，1999,Transplantation 68：1632；Shields等人，1995,J.Biol.Chem.276：6591)。作為自如上所述之突變出現的新功能之另一實例，在一些情況下，對FcRn之親和力可增大至高於野生型之親和力。此增大之親和力可反映增大之「吸附」速率、減小之「脫附」速率，或增大之「吸附」速率與減小之「脫附」速率兩者。鹹信賦予對FcRn增大之親和力的突變之實例包括(但不限於)T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人，2001,J.Biol.Chem.276：6591)。
另外，至少三個人類Fcγ受體似乎識別在IgG上在下鉸鏈區內通常在胺基酸234-237之結合位點。因此，新功能和潛在減小之免疫原性的另一實例可由此區域的突變而產生，例如將人類IgG1「ELLG」之胺基酸233-236置換至IgG2「PVA」之相應序列(缺失一個胺基酸)。已示出，當已引入此等突變時，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII和FcγRIII將不結合於IgG1。Ward及Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2：77及Armour等人，1999,Eur.J.Immunol.29：2613。
在一個實施例中，Ig恆定區或其部分，例如Fc區為包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：52)且視情況進一步包括選自HQSLGTQ(SEQ ID NO：53)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：54)、HQNISDGK(SEQ ID NO：55)或VISSHLGQ(SEQ ID NO：56)(美國專利第5,739,277號)之序列的多肽。
在另一實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分在鉸鏈區或其部分中包含與另一免疫球蛋白恆定區或其部分形成一或多個二硫鍵之胺基酸序列。鉸鏈區或其部分可進一步與CH1、CH2、CH3之一或多個域、其片段及其任何組合連接。在一個特定實施例中，免疫球蛋白恆定區或其部分為鉸鏈區及CH2。
在某些實施例中，Ig恆定區或其部分為半糖基化的。舉例而言，包含兩個Fc區或FcRn結合配偶體之嵌合蛋白可含有第一糖基化Fc區(例如糖基化CH2區)或FcRn結合配偶體及第二無糖基化Fc區(例如無糖基化CH2區)或FcRn結合配偶體。在一個實施例中，連接子可插入糖基化與無糖基化Fc區之間。在另一實施例中，Fc區或FcRn結合配偶體係經完整糖基化，即所有Fc區均經糖基化。在其他實施例中，Fc區可經無糖基化，即無一Fc部分經糖基化。
在某些實施例中，嵌合FVIII蛋白在Ig恆定區或其部分(例如Fc變異體)包含改變Ig恆定區之抗原獨立性效應功能，特定言之改變蛋白質之循環半衰期的胺基酸取代。
當與不含此等取代之蛋白質相比時，此等蛋白質顯示對FcRn之結合增大或減小，因此在血清中之半衰期分別增加或減少。預期對FcRn之親和力改良的Fc變異體具有較長血清半衰期，且此等分子適用於治療哺乳動物之需要所投與之多肽具有長半衰期的方法中，例如以治療慢性疾病或病症(參見例如美國專利7,348,004、7,404,956及7,862,820)。相反地，預期FcRn結合親和力降低之Fc變異體具有較短半衰期，且此等分子亦適用於例如向哺乳動物投與，其中循環時間縮短可能有利，例如以便活體內診斷成像，或適用於起始多肽當長時期存在於循環中時具有毒副作用之情況。FcRn結合親和力降低之Fc變異體亦不太可能穿過胎盤，因此亦適用於治療孕婦之疾病或病症。另外，可能需要減小之FcRn結合親和力的其他應用包括需要腦、腎及/或肝定位之彼等應用。在一個例示性實施例中，本發明之嵌合蛋白顯示自血管穿過腎小球上皮的輸送減少。在另一實施例中，本發明之嵌合蛋白顯示自腦部穿過血腦障壁(BBB)進入血管空間之輸送減少。在一個實施例中，FcRn結合經改變的蛋白質包含至少一個在Ig恆定 區之「FcRn結合環」內具有一或多個胺基酸取代之Fc區或FcRn結合配偶體(例如一或二個Fc區或FcRn結合配偶體)。FcRn結合環包含野生型全長Fc區之胺基酸殘基280-299(根據EU編號)。在其他實施例中，本發明的嵌合蛋白中FcRn結合親和力經改變之Ig恆定區或其部分包含至少一個在15
Figure 108113094-A0202-12-0141-76
FcRn「接觸區」內具有一或多個胺基酸取代之Fc區或FcRn結合配偶體。如本文所用，術語15
Figure 108113094-A0202-12-0141-77
FcRn「接觸區」包括在野生型全長Fc部分之以下位置的殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在其他實施例中，FcRn結合親和力經改變的本發明的Ig恆定區或其部分包含至少一個在對應於任一以下EU位置之胺基酸位置具有一或多個胺基酸取代之Fc區或FcRn結合配偶體：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)及438。以引用的方式幷入本文中之國際PCT公開案第WO05/047327號中揭示了改變FcRn結合活性之例示性胺基酸取代。
Fc區或FcRn結合配偶體亦可包含此項技術中公認的改變嵌合蛋白之糖基化的胺基酸取代。舉例而言，嵌合FVIII蛋白之Fc區或FcRn結合配偶體可包含具有引起糖基化(例如N或O連接糖基化)減少之突變的Fc區，或可包含野生型Fc部分之改變的糖形(例如低海藻糖或無海藻糖聚糖)。
在一個實施例中，未處理的嵌合FVIII蛋白可包含具有兩個或兩個以上各自獨立地選自本文所述之Ig恆定區或其部分的其組成性Ig恆定區或其部分之基因融合Fc區(即scFc區域)。在一個實施例中，二聚Fc區之Fc區為相同的。在另一實施例中，Fc區中之至少兩者為不同的。舉例而言，本發明之蛋白質的Fc區或FcRn結合配偶體包含相同數目之胺基酸殘基或其長度可不同，相差一或多個胺基酸殘基(例如約5個胺基酸殘基(例如1、2、3、4或5個胺基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其他實施例中，本發明之蛋白質的Fc區或FcRn結合配偶體的序列可在一或多個胺基酸位置不同。舉例而言，Fc區或FcRn結合配偶體中之至少兩者可在約5個胺基酸 位置(例如，1、2、3、4或5個胺基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置或約50個位置不同。
連接子
本文提供之嵌合FVIII蛋白可進一步包含一或多個連接子。一種類型的連接子為可裂解連接子，其當活體內投與受試者，例如投與凝血位點時可由各種蛋白酶裂解。在一個實施例中，可裂解連接子允許來自的部分(例如XTEN)裂解。另一類型的連接子為可處理連接子，其含有細胞內裂解位點，因此可由宿主細胞中之細胞內處理酶裂解，從而允許方便地表現多肽且形成嵌合蛋白。
在嵌合蛋白中之任何兩個蛋白質之間均可存在一或多個連接子。在一個實施例中，嵌合蛋白包含(i)XTEN序列及(ii)FVIII蛋白，其中XTEN序列係通過連接子(例如可裂解連接子)與FVIII蛋白連接。
在某些實施例中，嵌合蛋白包含(i)XTEN序列、(ii)Ig恆定區或其部分(例如Fc區)，及(iii)FVIII蛋白，其中XTEN序列係藉由視情況選用之連接子(例如可裂解連接子)與FVIII蛋白及/或Ig恆定區或其部分連接。FVIII蛋白亦可藉由連接子(例如可裂解連接子)與Ig恆定區或其部分連接。
適用於本文提供之嵌合FVIII蛋白的連接子可包含任何有機分子。在一個實施例中，連接子包含聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或羥乙基澱粉(HES)。在另一實施例中，連接子包含胺基酸序列。連接子可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。連接子可包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸或900-1000個胺基酸。
此項技術中熟知連接子之實例。在一個實施例中，連接子包含序列Gn。連接子可包含序列(GA)n。連接子可包含序列(GGS)n。在其他實施例中，連接子包含(GGGS)n(SEQ ID NO：57)。在其他實施例中，連接子 包含序列(GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO：58)。在此等情況下，n可以為整數1-100。在其他情況下，n可以為整數1-20，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。連接子之實例包括(但不限於)GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO：59)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：60)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：61)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：62)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：63)。連接子不會消除或減弱因素VIII之凝血活性。視情況，連接子會增強因素VIII蛋白之活性。
在一個實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子為15-25個胺基酸長。在另一實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子為15-20個胺基酸長。在一些實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子為10-25個胺基酸長。在其他實施例中，適用於嵌合蛋白之連接子為15個胺基酸長。在其他實施例中，嵌合蛋白之連接子為(GGGGS)n(SEQ ID NO：64)，其中G表示甘胺酸，S表示絲胺酸且n為整數1-20。
裂解位點
連接子亦可幷有能夠化學裂解(例如，酯鍵水解)、酶促裂解(即，併有蛋白酶裂解序列)或光解裂解(例如，發色團如3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP))之部分以自另一分子釋放一個分子。
在一個實施例中，連接子為可裂解連接子。可裂解連接子可在N端或C端或此兩者處包含一或多個裂解位點。在另一實施例中，可裂解連接子基本上由一或多個可裂解位點組成或由一或多個可裂解位點組成。在其他實施例中，可裂解連接子包含本文所述之異源胺基酸連接子序列或聚合物及一或多個可裂解位點。
在某些實施例中，可裂解連接子包含一或多個可在宿主細胞(即細胞內處理位點)中裂解之裂解位點。裂解位點之非限制性實例包括RRRR(SEQ ID NO：9)、RKRRKR(SEQ ID NO：10)及RRRRS(SEQ ID NO：11)。
在其他實施例中，可裂解連接子包含一或多個在將包含可裂解連接子之嵌合蛋白投與受試者之後由蛋白酶裂解之裂解位點。在一個實 施例中，裂解位點係由選自由以下組成之群的蛋白酶裂解：因子XIa、因子XIIa、血管舒素、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP-13、MMP-17及MMP-20。在另一實施例中，裂解位點係選自由以下組成之群：FXIa裂解位點(例如KLTR↓AET(SEQ ID NO：65))、FXIa裂解位點(例如DFTR↓VVG(SEQ ID NO：66))、FXIIa裂解位點(例如TMTR↓IVGG(SEQ ID NO：67))、血管舒素裂解位點(例如SPFR↓STGG(SEQ ID NO：68))、FVIIa裂解位點(例如LQVR↓IVGG(SEQ ID NO：69))、FIXa裂解位點(例如PLGR↓IVGG(SEQ ID NO：70))、FXa裂解位點(例如IEGR↓TVGG(SEQ ID NO：71))、FIIa(凝血酶)裂解位點(例如LTPR↓SLLV(SEQ ID NO：72))、彈性蛋白酶-2裂解位點(例如LGPV↓SGVP(SEQ ID NO：73))、顆粒酶-B裂解(例如VAGD↓SLEE(SEQ ID NO：74))、MMP-12裂解位點(例如GPAG↓LGGA(SEQ ID NO：75))、MMP-13裂解位點(例如GPAG↓LRGA(SEQ ID NO：76))、MMP-17裂解位點(例如APLG↓LRLR(SEQ ID NO：77))、MMP-20裂解位點(例如PALP↓LVAQ(SEQ ID NO：78))、TEV裂解位點(例如ENLYFQ↓G(SEQ ID NO：79))、腸激酶裂解位點(例如DDDK↓IVGG(SEQ ID NO：80))、蛋白酶3C(PRESCISSIONTM)裂解位點(例如LEVLFQ↓GP(SEQ ID NO：81))，及分選酶A裂解位點(例如LPKT↓GSES)(SEQ ID NO：82)。在某些實施例中，FXIa裂解位點包括(但不限於)例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：83)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：84)。非限制性例示性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：85)、TTKIKPR(SEQ ID NO：86)或LVPRG(SEQ ID NO：87)，及包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之序列：ALRPR(SEQ ID NO：51)(例如ALRPRVVGGA(SEQ ID NO：88))。
在一個特定實施例中，裂解位點為TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO：8)。
多核苷酸、載體及宿主細胞
本發明亦提供一種多核苷酸，其編碼(a)FVIII多肽及XTEN序列，其中FVIII多肽對vWF之親和力減小或(b)FVIII多肽及至少四個XTEN序列。
在一些實施例中，包含兩條多肽鏈或三條多肽鏈之嵌合蛋白可由單一多核苷酸鏈編碼，接著處理成二或三條(或以上)多肽鏈。在其他實施例中，包含此等多肽鏈之嵌合蛋白可由二或三條多核苷酸鏈編碼。
如本文所用，表現載體係指當引入適當宿主細胞中時含有所插入之編碼序列的轉錄及轉譯所必要之元件，或在RNA病毒載體的情況下含有複製及轉譯所必要之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。
本發明之表現載體將包括編碼本文所述之嵌合蛋白的多核苷酸。在一個實施例中，FVIII多肽、XTEN或兩者之編碼序列中之一或多者可操作地連接於表現控制序列。如本文所用，當兩個核酸序列以一定方式共價連接以允許各組分核酸序列保留其功能時，兩個核酸序列得到可操作的連接。當編碼序列與基因表現控制序列以一定方式共價連接以使編碼序列之表現或轉錄及/或轉譯受基因表現控制序列之影響或控制時，稱該編碼序列與該基因表現控制序列經可操作地連接。如果5'基因表現序列中之啟動子的誘導使得編碼序列得到轉錄，且如果在兩個DNA序列之間的連接之性質不會(1)導致引入框移突變、(2)干擾啟動子區域引導編碼序列轉錄之能力，或(3)干擾相應RNA轉錄物轉譯至蛋白質中之能力，那麽稱兩個DNA序列可操作地連接。因此，如果基因表現序列能夠實現該編碼核酸序列之轉錄以使所得轉錄物轉譯至所需蛋白質或多肽中，那麽基因表現序列可操作地連接於編碼核酸序列。
如本文所用之基因表現控制序列為任何調節性核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-強化子組合，其有助於其可操作地連接之編碼核酸的有效轉錄及轉譯。基因表現控制序列可為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括(但不限於)以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性地起作用之例示性病毒啟動子包括例如來自以下之啟動子：巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、巨細胞病毒、莫洛尼氏白血病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)及其他反轉錄病毒，及皰疹單純型病毒之胸苷激酶啟動子。熟習此項技術者已知其他組成性啟動子。適用作本發明之基因表現序列的啟動子亦包括誘導性啟動子。在誘導劑存在下表現誘導性啟動子。舉例而言，誘導金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。熟習此項技術者已知其他誘導性啟動子。
通常，基因表現控制序列必要時應包括起始轉錄和轉譯分別涉及之5'非轉錄和5'非轉譯序列，諸如TATA箱、封端序列、CAAT序列及其類似物。特定言之，此等5'非轉錄序列將包括啟動子區域，該啟動子區域包括用於轉錄控制可操作地接合之編碼核酸的啟動子序列。必要時，基因表現序列視情況包括強化子序列或上游活化序列。
病毒載體包括(但不限於)來自以下病毒之核酸序列：反轉錄病毒，諸如莫洛尼鼠類白血病病毒、哈維鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒及勞氏肉瘤病毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒屬；艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；痘瘡病毒；脊髓灰質炎病毒；及RNA病毒，諸如反轉錄病毒。可容易地採用此項技術中熟知之其他載體。某些病毒載體係基於非細胞病的真核病毒，其中非必需基因已經相關基因置換。非細胞病性病毒包括反轉錄病毒，其生命週期涉及基因組病毒RNA反轉錄至DNA中，隨後前病毒整合至宿主細胞DNA中。已批準反轉錄病毒用於人類基因療法試驗。最適用的為彼等複製缺陷型反轉錄病毒(即，能夠直接合成所需蛋白質，但不能製造感染粒子)。此等在基因上改變之反轉錄病毒表現載體通用於基因的活體內高效轉導。Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology,第7卷，Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)中提供了用於產生複製缺陷型反轉錄病毒之標準方案(包括以下步驟：將外源性遺傳物質幷入質體中、用質體轉染包裝細胞株、藉由包裝細胞株產生重組型反轉錄病毒、自組織培養基收集病毒粒子，及用病毒粒子感染目標細胞)。
在一個實施例中，病毒為腺相關病毒、雙股DNA病毒。腺相關病毒可經工程改造為複製缺陷型且能夠感染大量細胞類型及物種。其 進一步具有以下優勢：諸如熱穩定性及脂質溶劑穩定性；在不同譜系的細胞(包括造血細胞)中之高轉導頻率；且無重複感染抑制，因此允許多個系列的轉導。據報導，腺相關病毒可以位元點特異性方式整合至人類細胞DNA中，藉此最小化插入性突變誘發之可能性及反轉錄病毒感染之插入基因表現特徵的可變性。另外，已在無選擇性壓力存在下在組織培養物中追蹤了大於100個繼代的野生型腺相關病毒感染，表明腺相關病毒基因組整合為相對較穩定的事件。腺相關病毒亦可以染色體外方式起作用。
其他載體包括質體載體。質體載體已廣泛描述於此項技術中且為熟習此項技術者所熟知。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。近幾年，已發現質體載體尤其有利於將基因傳遞至活體內細胞中，因為其不能在宿主基因組內複製且不能整合至宿主基因組中。然而，具有與宿主細胞相容之啟動子的此等質體可表現來自在質體內可操作地編碼之基因的肽。可獲自商業供應商之一些常用質體包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40及pBlueScript。特異性質體之另一實例包括pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/myc-His，目錄號V86320；及pBudCE4.1，目錄號V53220，所有均來自Invitrogen(Carlsbad,CA.)。一般熟習此項技術者熟知其他質體。另外，可使用標準分子生物學技術以移除及/或增加特異性DNA片段來定製設計質體。
在可用以產生本發明之蛋白質的一種昆蟲表現系統中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus；AcNPV)用作載體以表現外來基因。使病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。可將編碼序列選殖於病毒之非必需區域(例如多面體基因)中且將其置於ACNPV啟動子(例如多面體啟動子)之控制下。成功插入編碼序列將引起多面體基因不活化且產生非封閉型重組病毒(即，不含由多面體基因編碼之蛋白性包衣的病毒)。接著將此等重組病毒用以感染草地貪夜蛾細胞，其中所插入之基因得到表現。(參見例如Smith等人，(1983)J Virol 46：584；美國專利第4,215,051號)。此表現系統之其他實例可見於 Ausubel等人編(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience。
可用以表現本發明之蛋白質的另一系統為麩醯胺酸合成酶基因表現系統，其亦稱為「GS表現系統」(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)。此表現系統詳述於美國專利第5,981,216號中。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用大量病毒基表現系統。在將腺病毒用作表現載體之情況下，編碼序列可接合於腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如晚期啟動子和三聯體前導序列。接著可通過活體外或活體內重組將此嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必需區域(例如區域E1或E3)將產生存活且能夠在感染宿主中表現肽之重組病毒。參見例如Logan及Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：3655)。或者，可使用牛痘7.5 K啟動子。參見例如Mackett等人，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：7415；Mackett等人，(1984)J Virol 49：857；Panicali等人，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：4927。
為了提高製造效率，多核苷酸可設計以編碼本發明蛋白質之由酶促裂解位點分隔的多個單元。可將所得多肽裂解(例如藉由用適當的酶處理)以回收多肽單元。此可提高由單一啟動子驅動之多肽的產率。當用於適當病毒表現系統中時，在轉錄物中內部引導由mRNA編碼之各多肽的轉譯；例如藉由內部核糖體入口位點IRES來進行。因此，多順反子構築體引導單一大型多順反子mRNA之轉錄，其又引導多個個別多肽之轉譯。此方法消除了聚合蛋白質之產生和酶促處理且可明顯提高由單一啟動子驅動的多肽之產率。
用於轉型之載體通常含有用以識別轉化子之可選標記。在細菌系統中，此可包括抗生素抗性基因，諸如安比西林(ampicillin)或康微素(kanamycin)。用於經培養之哺乳動物細胞中之可選標記包括賦予耐藥(諸如新黴素、潮黴素和甲胺喋呤)性之基因。可選標記可為可擴增之可選標記。一種可擴增的可選標記為二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。Simonsen C C等人，(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：2495-9。Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.回顧了可選標記，且可選 標記之選擇係充分在一般熟習此項技術者之水準內。
可將可選標記與相關基因同時引入細胞中於獨立質體上，或其可引入同一質體上。若在同一質體上，則可選標記和相關基因可處於不同啟動子或相同啟動子之控制下，後一佈置會產生雙順反子消息。此項技術中已知此類型之構築體(例如美國專利第4,713,339號)。
表現載體可編碼允許重組產生之蛋白質易於純化的標簽。實例包括(但不限於)載體pUR278(Ruther等人，(1983)EMBO J 2：1791)，其中待表現之蛋白質之編碼序列可接合至與lac z編碼區同框之載體中，以產生有標簽之融合蛋白；pGEX載體可用以表現具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽的本發明之蛋白質。此等蛋白質通常具有可溶性且可易於藉由吸附於麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒，接著在遊離麩胱甘肽存在下溶離而自細胞純化。載體包括裂解位點(凝血酶或因子Xa蛋白酶或PRESCISSION PROTEASETM(Pharmacia,Peapack,N.J.))以便在純化之後容易地移除標簽。
接著將表現載體或載體轉染或共轉染於適合的目標細胞中，該目標細胞將表現多肽。此項技術中已知之轉染技術包括(但不限於)磷酸鈣沈澱(Wigler等人，(1978)Cell 14：725)、電穿孔(Neumann等人，(1982)EMBO J 1：841)及基於脂質體之試劑。多種宿主表現載體系統可用於表現本文所述之蛋白質，包括原核細胞與真核細胞。其包括(但不限於)用含有適當編碼序列之重組型噬菌體DNA或質體DNA表現載體轉型之微生物，諸如細菌(例如大腸桿菌)；用含有適當編碼序列之重組型酵母或真菌表現載體轉型之酵母或絲狀真菌；用含有適當編碼序列之重組型病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用重組型病毒表現載體(例如花椰菜花葉病毒屬或煙草花葉病毒屬)感染或用含有適當編碼序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統；或動物細胞系統，包括哺乳動物細胞(例如HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11及BHK細胞)。
在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞。如本文所用，真核細胞係指具有胚乳原核之任何動物或植物細胞。動物真核細胞包括脊椎動物(例如哺乳動物)細胞，及無脊椎動物(例如昆蟲)細胞。植物真核細胞特定言之可包括(不限於)酵母細胞。真核細胞不同於原核細胞，例如細菌。
在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞為來源於哺乳動物之任何細胞。哺乳動物細胞特定言之包括(但不限於)哺乳動物細胞株。在一個實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在另一實施例中，哺乳動物細胞為HEK 293細胞，其為人類胚腎細胞株。HEK 293細胞係作為CRL-1533自美國典型培養物保藏中心，Manassas,VA可得，且作為293-H細胞(目錄號11631-017)或293-F細胞(目錄號11625-019)自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)可得。在一些實施例中，哺乳動物細胞為PER.C6®細胞，其為來源於視網膜之人類細胞株。PER.C6®細胞可獲自Crucell(Leiden,The Netherlands)。在其他實施例中，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可獲自美國典型培養物保藏中心，VA.(例如CHO-K1；CCL-61)。在其他實施例中，哺乳動物細胞嬰兒倉鼠腎(BHK)細胞。BHK細胞可獲自美國典型培養物保藏中心，Manassas,Va.(例如CRL-1632)。在一些實施例中，哺乳動物細胞為HKB11細胞，其為HEK293細胞與人類B細胞株之雜交細胞株。Mei等人，Mol.Biotechnol.34(2)：165-78(2006)。
在一個實施例中，將編碼包含FVIII多肽及XTEN及可選標記(例如zeocin抗性)之嵌合蛋白的質體轉染於HEK 293細胞中以便產生嵌合蛋白。
在一個實施例中，將編碼包含對VWF之親和力較小之FVIII多肽以及XTEN及可選標記(例如zeocin抗性)之嵌合蛋白的質體轉染於HEK 293細胞中以便產生嵌合蛋白。
在一個實施例中，將編碼包含FVIII多肽及至少四個XTEN及可選標記(例如zeocin抗性)之嵌合蛋白的質體轉染於HEK 293細胞中以便產生嵌合蛋白。
在其他實施例中，穩定轉染經轉染之細胞。可使用熟習此項技術者已知之習知技術選擇此等細胞且使其保持為穩定細胞株。
含有蛋白質之DNA構築體之宿主細胞在適當生長培養基中生長。如本文所用，術語「適當生長培養基」意謂含有細胞生長所需的營養素之培養基。細胞生長所需之營養素可包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因子。視 情況培養基可含有牛的小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實施例中，培養基基本上不含IgG。一般將藉由例如藥物選擇或必需營養素之缺乏來為含有DNA構築體之細胞選擇生長培養基，該藥物選擇或必需營養素之缺乏由位於DNA構築體上或與DNA構築體共轉染之可選標記補充。所培養之哺乳動物細胞通常生長在市售含血清或無血清之培養基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實施例中，培養基為CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一實施例中，培養基為CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。適於所用特定細胞株之培養基的選擇係在熟習此項技術者的水準內。
如本文所用，培養係指活體外維持活細胞至少明確的時間。維持可包括，但無需包括增大活細胞群體。舉例而言，維持在培養物中之細胞可處於群體靜態，但仍存活且能夠產生所需產物，例如重組蛋白或重組型融合蛋白。適用於培養真核細胞之條件為此項技術中所熟知且包括適當選擇培養基、培養基補充物、溫度、pH值、氧飽和度及其類似條件。出於商業目的，培養可包括使用各種類型之規模擴大系統中之任一者，包括震蕩燒瓶、滾瓶、中空纖維生物反應器、攪拌槽生物反應器、氣升式生物反應器、Wave生物反應器及其他。
在一個態樣中，本發明係關於一種表現、製備或產生本發明之嵌合蛋白的方法，其包括a)轉染包含編碼嵌合蛋白之多核苷酸的宿主細胞及b)在培養基中在適用於表現嵌合蛋白之條件下培養宿主細胞，其中嵌合蛋白得到表現。
在其他實施例中，含有與XTEN序列連接之FVIII蛋白的蛋白質產物分泌於培養基中。將培養基與細胞分離、濃縮、過濾，接著在二或三個親和柱(例如蛋白質A柱及一或兩根陰離子交換列)上通過。
在某些態樣中，本發明涉及藉由本文所述之方法產生的嵌合蛋白。
活體外製造允許擴大規模以得到大量所需之經改變的本發明之多肽。在組織培養條件下進行哺乳動物細胞培養之技術為此項技術中已知且包括均質懸浮液培養物，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌器反應器中，或固定或裏入之細胞培養物，例如在中空纖維、微膠囊中、在瓊 脂糖微珠或陶瓷筒上。必要及/或需要時，多肽溶液可藉由慣用層析方法純化，該等方法例如為凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用層析(HIC，DEAE-纖維素層析)，或親和力層析。
醫藥組合物
含有本文提供之嵌合蛋白的組合物可含有適合的醫藥學上可接受之載劑。舉例而言，其可含有有助於將活性化合物加工成設計以傳遞至作用位點的製劑之賦形劑及/或輔助劑。
可將醫藥組合物調配成藉由彈丸注射進行非經腸投與(即靜脈內、皮下或肌肉內)。注射用調配物可以單位劑型呈現，例如在安瓿中或在多劑量容器中，添加有防腐劑。組合物可呈諸如在油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式，且含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成分可呈散劑形式以便用適合的媒劑(例如無熱原水)復原。
適用於非經腸投與之調配物亦包括呈可溶於水的形式之活性化合物水溶液，例如水溶鹽。另外，可投與呈適當油性注射懸浮液形式之活性化合物懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇及聚葡萄糖。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。脂質體亦可用以封裝本發明之分子以便傳遞至細胞或胞間隙中。例示性醫藥學上可接受之載劑為生理學上相容的溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物。在一些實施例中，組合物包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇)、山梨醇或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含醫藥學上可接受之物質，諸如潤濕劑或較少量之輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其會增大活性成分之保質期或有效性。
組合物可呈多種形式，包括例如液體(例如可注射且不熔的溶液)、分散物、懸浮液、半固體及固體劑型。較佳形式視投藥模式及治療應用而定。
可將組合物調配成溶液、微乳液、分散物、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。可藉由將活性成分以所需量與上文列舉之成分中之一者或其組合按需一起幷入適當溶劑中，接著進行過濾殺菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，分散物係藉由將活性成分幷入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及來自上文列舉成分之所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其得到活性成分加上來自其先前無菌過濾之溶液之任何其他所需成分的散劑。溶液之適當流動性可例如藉由使用塗層(諸如卵磷脂)、在分散物情況下藉由維持所需粒度及藉由使用介面活性劑來維持。可注射組合物之長久吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
可用控制釋放調配物或裝置來調配活性成分。此等調配物及裝置之實例包括植入物、經皮貼片及微封裝之傳遞系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。此項技術中已知製備此等調配物之方法及裝置。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可藉由在可生物降解之聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成微封裝之藥物基質來製備可注射儲槽式調配物。視藥物與聚合物之比率及所用聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他例示性可生物降解之聚合物為聚原酸酯及聚酸酐。儲槽式可注射調配物亦可藉由將藥物裏入脂質體或微乳液中來製備。
可將補充性活性化合物幷入組合物中。在一個實施例中，用另一凝血因子或其變異型、片段、類似物或衍生物調配本發明之嵌合蛋白。舉例而言，凝血因子包括(但不限於)因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、馮威里氏因子或重組型可溶性組織因子(rsTF)或任一前述物質之活化形式。止血劑之凝血因子亦可包括抗纖溶性藥物，例如ε-胺基-己酸、胺甲環酸。
可調整給藥方案以提供最佳的所需反應。舉例而言，可投與 單次推注，可隨時間流逝投與若干分次劑量，或可如治療情況之急迫性所示而按比例減小或增大劑量。以劑量單位形式調配非經腸組合物是有利的以便於劑量之投與及均勻性。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)。
除活性化合物以外，液體劑型亦可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及失水山梨醇脂肪酸酯。
適合醫藥載劑之非限制性實例亦描述於E.W.Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之一些實例包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似物。組合物亦可含有pH值緩衝劑，及濕潤劑或乳化劑。
對於經口投與，醫藥組合物可採用藉由習知方法製備之錠劑或膠囊之形式。亦可將組合物製備成液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包括懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化之可食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水媒劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或經分級分離之植物油)及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯，或山梨酸)。該等製劑亦可包括調味劑、著色劑及甜味劑。或者，組合物可以乾燥產品之形式呈現以便用水或另一適合的媒劑復原。
對於經頰投與，組合物可採用根據習知方案製備之錠劑或口含錠之形式。
對於吸入投與，根據本發明使用之化合物宜以有或無賦形劑之霧化氣霧劑的形式或以來自加壓包或噴霧器之含視情況選用的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適合氣體)之氣霧噴霧劑的形式傳遞。在加壓氣霧劑之情況下，可藉由設置閥門以傳遞計量之量來確定劑量單位。例如用於吸入器或吹入器之明膠的膠囊及藥筒可調配成含有化合物與適合散劑基劑(諸如乳糖或澱粉)之散劑混合物。
亦可將醫藥組合物調配成栓劑或保留灌腸劑以便直腸投與，該栓劑或保留灌腸劑例如含有習知栓劑基劑，諸如可哥脂或其他甘油酯。
在一個實施例中，醫藥組合物包含嵌合蛋白、編碼嵌合蛋白之多核苷酸、包含多核苷酸之載體，或包含載體之宿主細胞，及醫藥學上可接受之載劑。嵌合蛋白中之FVIII蛋白與無該一或多個XTEN序列之野生型FVIII蛋白或相應FVIII蛋白相比具有延長之半衰期。在一個實施例中，其中FVIII蛋白之半衰期比野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。在另一實施例中，因子VIII之半衰期當投與受試者時為為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在一個實施例中，受試者為小鼠。在另一實施例中，受試者為狗。在另一實施例中，受試者為人類。
在一些實施例中，藉由選自由以下組成之群的途徑投與組合物：表面投與、眼內投與、非經腸投與、鞘內投與、硬膜下投與及經口投與。非經腸投與可為靜脈內或皮下投與。
在其他實施例中，將組合物用以治療有需要之受試者的出血疾病或病狀。該出血疾病或病狀係選自由以下組成之群：出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何組合。在其他實施例中，受試者預定要經歷手術。在其他實施例中，治療為預防性的或按需的。
基因療法
可在哺乳動物(例如人類患者)中活體內產生本發明之嵌合蛋白，從而使用治療選自由以下組成之群的出血疾病或病症之基因治療方 法將為治療有益的：出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血及髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血疾病或病症為血友病。在另一實施例中，出血疾病或病症為A型血友病。在一個實施例中，本發明提供一種基因治療方法，其中在受試者體內有效表現經編碼之FVIII嵌合蛋白的條件下向受試者投與與適合的表現控制序列操作性連接之適合的嵌合蛋白編碼核酸且其中FVIII嵌合蛋白具有足以治療受試者之促凝血活性。在某些實施例中，將此等序列幷入病毒載體中。適用於此基因療法之病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、昆蟲桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒載體、牛痘病毒載體、單純性皰疹病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。病毒載體可為複製缺陷型病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中具有缺失。當使用腺病毒載體時，哺乳動物可能不暴露於編碼可選標記基因之核酸。在其他實施例中，將序列幷入熟習此項技術者已知之非病毒載體中。
使用嵌合蛋白之方法
本發明係關於一種使用本文所述之嵌合蛋白以增加FVIII多肽之半衰期的方法。
在一個態樣中，本文提供之方法係關於藉由使FVIII上之VWF結合位點突變來預防或抑制FVIII與內源性VWF相互作用，且同時使用XTEN序列來延長FVIII蛋白之半衰期。在另一態樣中，本文提供之方法係關於使用至少四個XTEN序列來延長FVIII蛋白之半衰期，其中XTEN序列中之至少一者的長度不超過72個胺基酸。
在另一實施例中，本文提供之方法係關於構築半衰期長於野生型FVIII之FVIII蛋白。在一個實施例中，XTEN序列或至少四個XTEN序列延長FVIII多肽之半衰期。適用於本文提供之方法的嵌合蛋白包括任何一或多種本文所述之嵌合蛋白。
本發明之另一態樣包括一種向有需要之受試者投與包含FVIII多肽及XTEN序列或至少四個XTEN序列之嵌合蛋白的方法，其中該 方法包括向受試者投與本文所述之嵌合蛋白。
在一個實施例中，本發明係關於一種使用XTEN序列以延長FVIII多肽(例如對VWF之結合較小的FVIII多肽)之半衰期的方法。在某些實施例中，與XTEN序列連接之FVIII蛋白具有減小之清除率或不經VWF清除受體清除。
亦提供一種增加FVIII蛋白之半衰期的方法，其包括向有需要之受試者投與本文所述之嵌合蛋白。
與一或多個XTEN序列連接之FVIII蛋白之半衰期可延長至比不含XTEN之相同FVIII蛋白的半衰期長至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
與至少四個XTEN序列連接之FVIII蛋白之半衰期可延長至比不含XTEN序列之相同FVIII蛋白的半衰期長至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
包含與至少四個XTEN序列(其中至少一個XTEN序列之長度不超過72個胺基酸)連接之FVIII之嵌合蛋白的半衰期可延長至比除長度不超過72個胺基酸之XTEN序列經較長XTEN序列(例如288個胺基酸之XTEN序列)置換以外相同的嵌合蛋白長至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
在其他實施例中，嵌合FVIII蛋白之半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在其他實施例中，嵌合蛋白之半衰期為約15小時至約2周、約16小時至約1周、 約17小時至約1周、約18小時至約1周、約19小時至約1周、約20小時至約1周、約21小時至約1周、約22小時至約1周、約23小時至約1周、約24小時至約1周、約36小時至約1周、約48小時至約1周、約60小時至約1周、約24小時至約6天、約24小時至約5天、約24小時至約4天、約24小時至約3天或約24小時至約2天。
在一些實施例中，投與受試者之嵌合FVIII蛋白的平均半衰期為約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時(1天)、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時(2天)、約54小時、約60小時、約72小時(3天)、約84小時、約96小時(4天)、約108小時、約120小時(5天)、約6天、約7天(1周)、8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天，或約14天。在一個實施例中，受試者為小鼠。在另一實施例中，受試者為狗。在另一實施例中，受試者為人類。
另外，本發明提供一種治療或預防出血疾病或病症之方法，其包括投與有效量之嵌合蛋白。在一個實施例中，該出血疾病或病症係選自由以下組成之群：出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血及髂腰肌鞘出血。在一個特定實施例中，出血疾病或病症為A型血友病。
本文所述之嵌合蛋白具有許多如為熟習此項技術者所公認的用途，包括(但不限於)治療患有止血病症之受試者的方法及治療需要一般止血劑之受試者的方法。在一個實施例中，本發明係關於一種治療患有止血病症之受試者的方法，其包括投與治療有效量之嵌合蛋白。
嵌合蛋白中之FVIII蛋白部分藉由充當帶負電的磷脂表面上之因子IX的輔因子，藉此形成Xase複合物來治療或預防止血病症。經活化之凝血因子結合於磷脂表面將此過程局部化於血管損害位點。在磷脂表 面上，因子VIIIa將因子X由因子IXa活化之最大速度增大約200,000倍，從而引起凝血酶繼代之第二次大型激增。
嵌合蛋白可用以治療任何止血病症。可藉由投與本發明之嵌合蛋白治療的止血病症包括(但不限於)A型血友病，以及與因子VIII有關之缺乏症或結構異常。在一個實施例中，止血病症為A型血友病。
可預防性使用嵌合蛋白以治療患有止血病症之受試者。嵌合蛋白可用以治療患有止血病症之受試者的急性出血事件。在另一實施例中，止血病症可由缺陷型凝血因子(例如馮威里氏因子)導致。在一個實施例中，止血病症為遺傳病症。在另一實施例中，止血病症為後天性病症。後天性病症可由下伏之繼發性疾病或病狀引起。無關的病狀可為例如但不限於癌症、自體免疫性疾病或妊娠。後天性病症可由老齡或由治療下伏繼發性病症之藥物(例如癌症化學療法)引起。
本發明亦關於治療不患有先天性止血病症，但患有繼發性疾病或病狀而導致獲得止血病症(例如由抗FVIII抗體進化或手術造成)之受試者的方法。本發明因此係關於一種治療需要一般止血劑之受試者的方法，其包括投與治療有效量之藉由本發明之方法製備的嵌合蛋白。
本發明亦關於減小FVIII之免疫原性或誘導對FVIII之較小免疫原性的方法，其包括投與有效量之本文所述之嵌合蛋白或編碼其之多核苷酸。
在一個實施例中，需要一般止血劑之受試者正在經歷或即將經歷手術。可在手術之前、期間或之後投與本發明之嵌合蛋白作為預防療法。可在手術之前、期間或之後投與本發明之嵌合蛋白以控制急性出血事件。
嵌合蛋白可用以治療具有急性出血事件之不患有止血病症的受試者。急性出血事件可由嚴重創傷，例如手術、車禍、傷口、挫裂性槍擊(laceration gun shot)或任何其他導致出血不受控制之創傷事件引起。出血事件之非限制性實例包括出血性凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、 腹膜後間隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何組合。
在預防性應用中，向尚未處於疾病狀態之患者投與一或多種含有嵌合蛋白之組合物或其混合物以增強患者抵抗力或減輕與疾病或病症相關之症狀。此量係定義為「預防性有效劑量」。在治療性應用中，有時需要在相對較短間隔下之相對較高劑量(例如每劑約1mg/kg至400mg/kg多肽，其中5mg至25mg之劑量較常用於輻射免疫接合物且更高劑量較常用於細胞毒素-藥物經修飾之多肽)直至疾病進展減小或終止為止，且直至患者顯示病徵部分或完全改善為止。此後，可向患者施予預防性方案。
在一些實施例中，將嵌合蛋白或組合物用於按需治療，其包括治療出血事件、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創傷、創傷頭癬(頭部創傷)、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術預防、圍手術期管理或手術治療。此等手術包括例如小手術、大手術、拔牙、扁桃體切除術、腹股溝赫尼亞切開術、滑膜切除術、總膝置換、開顱術、骨縫合術、創傷手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術或關節置換術。
在一個實施例中，靜脈內、皮下、肌肉內或經由任何黏膜表面，例如經口、舌下、經頰、經鼻、經直腸、經陰道或經由肺部途徑投與嵌合蛋白。可將嵌合蛋白植入生物聚合物固體支撐物中或與生物聚合物固體支撐物連接，從而允許嵌合蛋白緩慢釋放至出血位點，或將其植入綳帶/敷料中。嵌合蛋白之劑量將視受試者及所用特定投藥途徑而變化。劑量可在0.1μg至100,000μg/kg體重之範圍內。在一個實施例中，給藥範圍為0.1-1,000μg/kg。在另一實施例中，給藥範圍為0.1-500μg/kg。可連續投與或以特定定時間隔投與蛋白質。可採用活體外分析以確定投藥之最佳劑量範圍及/或時程。量測凝血因子活性之活體外分析為此項技術中已知，例如STA-CLOT VIIa-rTF凝血分析或ROTEM凝血分析。另外，可自獲自動物模型(例如血友病的狗)之劑量-反應曲線外推有效劑量(Mount等人，2002,Blood 99(8)：2670)。
現已詳述了本發明，藉由參考以下實例將更清楚地理解本發 明，僅出於說明之目的而非意欲限制本發明而將該等實例包括於本文中。本文提及之所有專利、公佈及文章均以引用的方式明確且具體地幷入本文中。
實例
遍及該等實例，除非另有說明，否則使用以下材料及方法。
材料及方法
一般而言，除非另有規定，否則本發明之實踐採用習知的化學技術、生物物理技術、分子生物學技術、重組DNA技術、免疫學技術(特定言之，例如抗體技術)及標準電泳技術。參見例如Sambrook、Fritsch及Maniatis,Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow等人，CS.H.L.Press,Pub.(1999)；及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，John Wiley & Sons(1992)。
實例1：識別半衰期增加至少2倍之FVIII分子
已經顯示具有較小VWF結合之FVIII分子的半衰期短於野生型FVIII。已顯示XTEN序列會增加蛋白質之半衰期，但亦已觀測到在一些情況下，包含FVIII分子及多個XTEN序列之嵌合蛋白在HemA小鼠體內的半衰期大約不超過野生型FVIII之半衰期的兩倍。為了確定是否可增加此有限的半衰期，將各種尺寸之XTEN序列插入具有較小VWF結合之FVIII分子之多個位置。
構築具有較小VWF結合之FVIII分子。特定言之，FVIII中缺失胺基酸745-1685。FVIII中之酪胺酸1680對於VWF結合為必需的。缺乏胺基酸745-1685之FVIII分子不具有此重要的酪胺酸1680，因此VWF結合削弱。
將具有不同長度之多個XTEN插入缺乏胺基酸745-1685之FVIII蛋白中之不同位置以產生名為PNL049、PNL050及PNL051的FVIII蛋白構築體。此等嵌合蛋白中之XTEN插入的尺寸及位置概述於圖1中。 本實例中測試之所有嵌合蛋白均在FVIII殘基745之後含有144個胺基酸XTEN插入(在圖1中符號表示為「B」插入)以及在FVIII殘基2332之後含有288個胺基酸XTEN插入(在圖1中符號表示為「CT」插入)。其他XTEN插入之尺寸及位置是不同的，如圖1中所示。
所得的嵌合FVIII-XTEN蛋白係在HEK293細胞中表現，且藉由顯色分析來監測在細胞培養基中之FVIII活性。將細胞培養基濃縮且用於量測FVIII-XTEN分子之半衰期。
當在HemA小鼠中測試時，所有三個分子均超過由VWF結合所造成之半衰期限度的2倍。PNL049、PNL050及PNL051之半衰期分別為22、23及22小時(圖1及圖2)。此等構築體中之每一者均在因子VIII之胺基酸18及/或1720處含有42個胺基酸XTEN插入。值得注意地，與在因子VIII之胺基酸18或1720處含有三個XTEN插入，但不含有42個胺基酸插入之PNL044的半衰期相比，此等蛋白質中之三者的半衰期增加。此等結果說明在PNL044中之胺基酸18或1720處增加另一42aa XTEN可顯著改良FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期。
亦在FVIII/VWF DKO小鼠中測試了另一嵌合蛋白LSD62.001。LSD62.001中之XTEN位置係與PNL051中之XTEN位置相同。然而，在LSD62.001中FVIII之胺基酸18處的XTEN插入(即144個胺基酸)大於在PNL051中相同位置之XTEN插入(即42個胺基酸)。此差異導致LSD62.001之半衰期為14小時，而PNL051之半衰期為22小時。
此等資料表明插入FVIII中位置18及1720之較短XTEN序列與較長B域及C端XTEN之組合可比在所有插入位點之較長XTEN序列提供更好的半衰期延長。
實例2：XTEN插入長度對FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期的影響
為了識別FVIII中XTEN插入之最佳長度，將長度在42個胺基酸至288個胺基酸範圍內之XTEN插入引入FVIII-XTEN嵌合蛋白之FVIII A域中，該嵌合蛋白含有(i)在FVIII之胺基酸745處之144個胺基酸AE XTEN插入及(ii)在FVIII之胺基酸2332處之288個胺基酸AE XTEN。
FVIII-XTEN嵌合蛋白係在HEK293細胞中表現，且藉由 FVIII顯色分析來測試細胞培養基之活性。使用濃縮細胞培養基在DKO小鼠中測試FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期。
觀測到在FVIII活性與FVIII A域中XTEN插入之長度之間的反相關(參見圖3)。
亦觀測到在FVIII半衰期與在FVIII胺基酸18及1720處之XTEN插入之長度之間的反相關(參見圖3)。在FVIII胺基酸403處之XTEN插入的長度對FVIII半衰期之影響不太顯著。FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期因作為FVIII胺基酸1900之XTEN插入的XTEN尺寸多達144個胺基酸而增大，但在將同一插入位點之XTEN長度進一步增至288個胺基酸時半衰期會大幅下降。
當與較長B域及C端插入組合時(例如在FVIII之胺基酸745及2332之後插入)，以下XTEN之半衰期會極大地增加：(i)在FVIII胺基酸18之後插入之42個胺基酸XTEN、(ii)在FVIII胺基酸403之後插入之42或144個胺基酸XTEN、(iii)在FVIII胺基酸1720之後插入之42個胺基酸XTEN，及(iv)在FVIII胺基酸1900之後插入之72或144個胺基酸XTEN。
此等資料表明XTEN尺寸對半衰期之影響視插入位點而定。
實例3：多個短XTEN插入對FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期的影響
為了確定多個短XTEN插入對具有較小vWF親和力之FVIII分子之半衰期的影響，製造下表中所列之嵌合蛋白。
表26：含有五個XTEN之嵌合蛋白
Figure 108113094-A0202-12-0164-65
此等嵌合蛋白中之每一者均包含缺乏胺基酸745-1685之FVIII多肽。另外，各自含有以下四個XTEN插入：緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18之下游的AE42、緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1720之下游的AE42、緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基0745之下游的AE144，及緊接地插入對應於成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基2332之下游的AE288。各嵌合蛋白亦含有第五XTEN插入AE42，但此插入之位置會變化，如表中所示。
在HEK293細胞中表現此等蛋白質，且藉由FVIII顯色分析來測試細胞培養基之活性。使用濃縮細胞培養基在HemA小鼠中測試FVIII-XTEN嵌合蛋白之半衰期。在尤其適用之插入位點含有短AE42 XTEN之構築體具有長半衰期及高活性。
實例4：用可變長度之XTEN序列完全或部分置換許可環
如表18中所說明，FVIII可緊接地在位置18、22、26及40之後容納XTEN AE42及XTEN AE144插入而不消除其促凝血活性。已將跨越成熟FVIII之主要序列中殘基18至40之此區域指定為許可環A1-1。因為此環內之插入不會消除FVIII活性，所以解釋了為何此環對於FVIII功能為非必需的，且用AE42 XTEN置換所有此環之部分可產生保留促凝血活性之FVIII變異體。圖4中提供了用以置換環A1-1之全部或部分的方法之一個實例。在本文中，編碼具有緊接地在殘基18之後插入之AE42 XTEN序 列之FVIII的質體，及編碼具有緊接地在殘基40之後插入之AE42 XTEN序列之FVIII的質體各自係以裂解兩種質體中AE42 XTEN之5'端的限制酶AscI消化，且以裂解在各質體內之獨特位點之AE42插入物之下游(3')的限制酶AfIII消化。接著接合所得的DNA片段以使AE42 XTEN序列置換在位置19至40之胺基酸殘基。儘管此方法用以置換整個A1-1環，但其可藉由邏輯延長而用以置換A1-1環之較小片段，諸如跨越殘基19-22、19-26、19-32、23-26、23-32、23-40、27-32、27-40及33-40之片段，如關於表28中之構築體pOM001至pOM010所述。
此方法可較廣泛地應用於用不同長度之XTEN序列置換FVIII許可環A1-1之類似區域。表27中之構築體pOM011至pOM020表示FVIII變異體，其中A1-1環之相應區段係經AE144 XTEN置換。對於用AE42或AE144 XTEN置換A1-1許可環之全部或部分，受體質體與供體質體均用AscI及AflII消化，後者為在3'方向最接近A1-1環之獨特限制位點。
此通用方法可類似地應用於置換許可環A2-1、A3-1及A3-2之全部或部分。如表27中所示，關於在3'方向最接近XTEN插入位點之獨特限制位點的一致性，此等許可環中之每一者彼此不同。因此，儘管AscI用以裂解初始XTEN插入之5’端，但將不同限制酶用以裂解下游位點，即許可環A2-1之BamHI、許可環A3-1之PflMI及許可環A3-2之ApaI。
表27：所有個別許可環之部分均經各種長度之XTEN序列置換的FVIII構築體。
Figure 108113094-A0202-12-0166-66
實例5：用XTEN完全或部分置換許可環或部分缺失許可環
FVIII表現構築體具有若干相對於整個FVIII表現質體獨特之限制酶位點。因此，側接特定許可環之任何獨特的限制位點對均可用以幫助編碼插入性FVIII序列之合成DNA構築體的插入，該FVIII序列係以XTEN置換缺失序列而完全或部分缺失其特定許可環。舉例而言，為了置換許可環A1-1中之殘基19-40，將合成一種DNA片段，其自其5'及其3'端包含：自BsiWI位點至編碼殘基18之DNA序列的FVIII表現構築體之原生序列、編碼XTEN之DNA序列、以編碼殘基40之DNA序列開始直至且包括獨特AflII限制位點的FVIII表現構築體之原生序列。將將此合成DNA構築體用BsiWI及AflII自其宿主質體除去，且插入已用相同限制酶消化之FVIII表現構築體的相應位點。在本文別處揭示了XTEN序列之實例。此等插入可幷入側接XTEN插入之獨特限制位點以便較易於亞選殖。或者，可將此等合成DNA序列併入FVIII序列中之胺基酸取代中，其包括用XTEN取代許可環中之非原生胺基酸序列(突變)。或者，XTEN插入可與 環內之缺失或取代相鄰或不相鄰。表27中給出FVIII許可環A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1及A3-2之部分及完全缺失以及其以XTEN置換的實例。表28亦給出適於產生此等構築體之獨特限制酶對之實例。同樣可將多個插入及置換，以及在其他環中具有部分或完全缺失的特定環中之XTEN插入/置換之組合幷入單一FVIII構築體中。
Figure 108113094-A0202-12-0167-67
實例6：FVIII充分耐受多個域內42aa XTEN插入
藉由對HEK293細胞進行短暫轉染來評價表26中提供之FVIII-XTEN構築體之蛋白質表現。將各構築體之1ug質體DNA用於4mL培養物。轉染後第5天收集細胞培養基，且通過FVIII顯色分析量測各樣本 之FVIII活性。表29概括了各構築體之轉染後細胞培養物FVIII活性，所觀測到之FVIII活性均處於++++程度，除了1個構築體處於+++程度。
Figure 108113094-A0202-12-0168-68
存在6個可耐受FVIII A-域內插入XTEN的許可環(A1-1、A1-2、A2-1、A2-2、A3-1及A3-2；參見上文實例4)。表26之鹼基構築體pNL0051在A1-1(18)、A3-1(1720)、FVIII B域及C端含有代表性插入(表29第2行)。FVIII充分耐受鹼基構築體之XTEN插入組合，如由所得的++++細胞培養物FVIII活性證明。亦充分耐受在其他四個許可環中任一者中增加 第五個域內AE42 XTEN插入，如由pKY0037.016(環A1-2)、pKY0043.001(環A2-1)、pKY0045.008(環A2-2)及pKY0047.001(環A3-2)之細胞培養物FVIII活性所表明，如表29中所示。除許可環以外，FVIII亦充分耐受圍繞A1域(pKY0040.002)之酸性區域及C1、C2域(PKY0050.007)之接合點的XTEN插入。與表23及表24中之含有多個144aa域內XTEN插入的構築體相比，表29之較短42aa XTEN插入產生顯著更高的FVIII細胞培養物活性，表明FVIII充分耐受此等插入。
實例7：42aa XTEN域內插入之組合達成FVIII半衰期延長3至4倍
使用細胞培養濃縮物在HemA小鼠中評價表26中之所選FVIII-XTEN構築體的半衰期。藉由靜脈內注射以200IU/kg對動物進行給藥，且在注射後5分鐘、24小時、72小時及96小時採集血漿樣本。藉由FVIII顯色分析來量測血漿樣本中之FVIII活性，且藉由Phoenix程式估算各分子之半衰期。
表30中列出各構築體之半衰期。鹼基構築體PNL0051之半衰期量測為24小時。與鹼基構築體相比，當將第五個42aa XTEN插入A1-2環、A2-1環、A3-2環或A1酸性區域中時觀測進一步改良之各種程度。藉由此方法達成的最長半衰期為30小時，其表示比重組型BDD-FVIII改良了4倍。在環A2-2中或在C1-C2接合點之第五個XTEN插入不具有其他半衰期益處。
為了更清楚地證明第五個XTEN插入對半衰期之影響，相對於鹼基載體作具有來自各插入環的最好半衰期之構築體的PK曲線，如圖5中所示，其中在各圖中由實心倒三角表示pNL0051曲線。藉由來自具有插入A1-2環、A2-1環、A3-2環，及A1域之酸性區域中的第五個42aa XTEN之構築體的加速PK曲線清楚地證明瞭其他半衰期益處。
表30：FVIII-XTEN構築體在HemA小鼠中之半衰期
Figure 108113094-A0202-12-0170-69
* * *
特定實施例之前述描述因此將完整揭示本發明之一般性質，以使其他人可藉由應用此項技術範圍內之知識，在無不當實驗之情況下針對各種應用容易地修改及/或改適此等特定實施例而不脫離本發明之一般概念。因此，依據本文呈現之教義及指導，此等改適及修改意欲處於所揭示之實施例的等效體之含義及範圍內。應瞭解，本文中之措詞或術語係用於描述而非限制之目的，以使熟習此項技術者根據該等教義及指導來解釋本說明書之術語或措詞。
在考慮本文揭示之發明說明及實踐後，本發明之其他實施例將對熟習此項技術者顯而易知。意欲將說明書及實例視為僅具有例示性， 而本發明之真實範疇及精神係由以下申請專利範圍指示。
本文所引用之所有專利及公開案均以全文引用的方式完全併入本文中。

Claims (14)

  1. 一種嵌合蛋白，其包含：(i)因子VIII(FVIII)多肽及(ii)XTEN，其中該FVIII多肽對於馮威里氏(Willebrand)因子(VWF)具降低之親和力，且其中該FVIII多肽欠缺對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之胺基酸746-1685且其中相較於欠缺XTEN之對應FVIII多肽，該嵌合蛋白展現延長之半衰期，且其中該嵌合蛋白保留促凝血(procoagulant)活性。
  2. 如請求項1之嵌合蛋白，其中該XTEN緊接著插入選自由下列組成之群組的殘基下游：
    (a)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18；
    (b)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基333；
    (c)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基336；
    (d)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基339；
    (e)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基403；
    (f)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1720；
    (g)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基1900；及
    (h)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基2332。
  3. 如請求項1之嵌合蛋白，其包含至少二個XTEN，其中該至少二個XTEN緊接著插入對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745及2332下游。
  4. 如請求項1至3中任一項之嵌合蛋白，其包含至少三個XTEN，其中該至少三個XTEN緊接著插入選自由下列組成之群組的殘基下游：
    (a)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745及2332；
    (b)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1720及2332；
    (c)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1900及2332。
  5. 如請求項1至4中任一項之嵌合蛋白，其包含至少四個XTEN，其中該至少四個XTEN緊接著插入選自由下列組成之群組的殘基下游：
    (a)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745、1900及2332；
    (b)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基745、1720、1900及2332；
    (c)對應至成熟FVIII多肽(SEQ ID NO：4)之殘基18、745、1720及2332。
  6. 如請求項1至5中任一項之嵌合蛋白，其中該XTEN選自由下列組成之群組：SEQ ID NO：22(36AE)、SEQ ID NO：36(42AE)、SEQ ID NO：23(72AE)、SEQ ID NO：24(78AE)、SEQ ID NO：37(144AE)、SEQ ID NO：38(144AG)、SEQ ID NO：98(150AE)及SEQ ID NO：99(150AG)。
  7. 如請求項1之嵌合蛋白，其中該FVIII多肽連接於至少四個XTEN，其中該至少四個XTEN包含：
    (a)緊接著插入殘基18下游之SEQ ID NO：22(36AE)的XTEN、緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：37(144AE)的XTEN、緊接著插入殘基1900下游之SEQ ID NO：37(144AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基2332下游之SEQ ID NO：39(288AE)的XTEN；
    (b)緊接著插入殘基18下游之SEQ ID NO：36(42AE)的XTEN、緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：98(150AE)的XTEN、緊接著插入殘基1900下游之SEQ ID NO：98(150AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基 2332下游之SEQ ID NO：100(294AE)的XTEN；
    (c)緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：37(144AE)或SEQ ID NO：39(288AE)的XTEN、緊接著插入殘基1720下游之SEQ ID NO：22(36AE)的XTEN、緊接著插入殘基1900下游之SEQ ID NO：37(144AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基2332下游之SEQ ID NO：39(288AE)的XTEN；
    (d)緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：98(150AE)的XTEN、緊接著插入殘基1720下游之SEQ ID NO：36(42AE)的XTEN、緊接著插入殘基1900下游之SEQ ID NO：98(150AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基2332下游之SEQ ID NO：100(294AE)的XTEN；
    (e)緊接著插入殘基18下游之SEQ ID NO：22(36AE)的XTEN、緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：37(144AE)的XTEN、緊接著插入殘基1720下游之SEQ ID NO：22(36AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基2332下游之SEQ ID NO：39(288AE)的XTEN；或
    (f)緊接著插入殘基18下游之SEQ ID NO：36(42AE)的XTEN、緊接著插入殘基745下游之SEQ ID NO：98(150AE)的XTEN、緊接著插入殘基1720下游之SEQ ID NO：36(42AE)的XTEN，以及緊接著插入殘基2332下游之SEQ ID NO：100(294AE)的XTEN。
  8. 如請求項1至7中任一項之嵌合蛋白，其又包含FcRn結合夥伴。
  9. 如請求項1至8中任一項之嵌合蛋白，其又包含Fc區域。
  10. 一種多核苷酸或一組多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項之嵌合蛋白。
  11. 一種載體，其包含如請求項10之多核苷酸與一或多個操作性連接至多核苷酸之啟動子。
  12. 一種宿主細胞，其包含如請求項10之多核苷酸或如請求項11之載體。
  13. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項之嵌合蛋白、如請求項10之多核苷酸、如請求項11之載體或如請求項12之宿主細胞，與醫藥上可接受之載劑。
  14. 如請求項1至9中任一項之嵌合蛋白、如請求項10之多核苷酸、如請求項11之載體、如請求項13之醫藥組成物或如請求項12之宿主細胞，其用於治療有需要之個體的出血性疾病或病狀。
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