CN104411716B - 适用于治疗血友病的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适用于治疗凝血疾病的VWF化合物以及组合物。

Description

适用于治疗血友病的化合物

技术背景

本发明涉及血友病的治疗和/或预防。

背景

经静脉内给予凝血因子的蛋白质替代疗法目前用于治疗血友病患者。对于患者的方便性和依从性而言，血管外(例如，皮下(s.c.)或皮内)给药优于现有的静脉内(i.v.)注射。血管外给予还具有潜在的安全性优势，因为许多患者能够避免静脉内端口手术以及这类导管插入相关的感染和凝血风险。

在FVIII缺乏的小鼠中经皮下给予FVIII，公开于Shi等人, Haemophilia, 2012,DOI：10.1111/j.1365-2516.2011.02735.x。FVIII的生物利用度在此文中据报告为低(大约1%)。

经皮下给予FVIII和VWF另外公开于WO08151817，但未公开FVIII剂量和所达到的循环FVIII浓度间的剂量反应关系。在W0815817中，VWF与FVIII的(单位)比率大于5:1，相当于VWF蛋白浓度比FVIII浓度有150-250倍摩尔过量。然而，从实践和经济上的观点看，这种类型的比例并不理想。在WO08151817中，进一步证明了当将FVIII与VWF共同配制时，经皮下给予FVIII的小鼠的免疫原性明显降低。

在WO10062768中，公开了FVIII的聚乙二醇化可以改进经皮下注射给小鼠的FVIII的生物利用度，而与VWF共同配制却没有改进FVIII的生物利用度。

本领域需要这样的化合物和/或药物组合物：其适用于经血管外给予，以在有或无抑制剂时治疗和/或预防患有凝血疾病例如A型血友病的患者，和/或治疗和/或预防患有冯维勒布兰德氏病的患者，因为这样的给予形式将会减轻经静脉内治疗的负担，这两者的静脉内治疗都同样涉及到输注并且也涉及到因植入便携式导管所致的感染风险。这样的化合物和组合物优选是安全的(即具有低的免疫原性风险)和/或具有高生物利用度和/或优选是在生产和配制过程中容易处理的。

概述

本发明涉及包含1200个或更少氨基酸的重组VWF片段，例如，TIL’结构域或TIL’/E’结构域(Zhou等人. Blood 2012；120(2)：449-458)。本发明还涉及包含以下的药物组合物：(i) 本发明的VWF片段，和(ii) FVIII分子(全长/截短的B结构域/缀合的)。本发明还涉及它们在治疗血友病中的用途，例如经血管外给予。这样的化合物和组合物当经血管外共同给予FVIII时将优选导致相对高的FVIII生物利用度和/或相对低的FVIII免疫原性风险。

描述

本发明的一方面，与具有延长的体内循环半寿期的FVIII分子共同给予的本发明的VWF片段在经血管外(例如皮下)给予时具有令人惊奇的高生物利用度。

本发明的发明人还惊奇地发现了以下观察结果：在与类似摩尔量的本发明的VWF片段血管外共同给予后，可以明显改善FVIII分子的生物利用度。或者，可通过血管外共同给予FVIII分子库，以达到高生物利用度，在所述分子库中，大部分所述FVIII分子与本发明的VWF片段结合。有趣的是，全长VWF对FVIII的生物利用度没有积极影响。优选地，VWF应当呈VWF片段的形式，其包含TIL’或TIL’/E’结构域。因此，本发明的化合物和组合物可在有或无抑制剂时用于治疗和预防血友病患者(尤其是A型血友病患者)，以及在有抑制剂时用于血友病患者的免疫耐受诱导(ITI)。

附图简述

图1：在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予10000 U/kg “N8-GP”后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。“N8-GP”是如WO2009108806的实施例1+2所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII分子。

图2：在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予10000 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图3：在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予2500 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图4：在有或无共同给予相对于N8-GP而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予2500 U/kg N8-GP后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图5：在有或无共同给予相对于FVIII而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下分别给予5000或20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。“N8”/”turocotog alfa”是如WO2009108806的实施例1中所述而制备的B结构域截短的FVIII分子。

图6：在有或无共同给予相对于FVIII而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予5000或20000 IU/kg wt FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图7：在有或无共同给予相对于FVIII而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的FVIII抗原。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图8：在有或无共同给予相对于FVIII而言的7.7倍摩尔剂量的VWF TIL’/E’/D3/A1时，在皮下给予5000 IU/kg FVIII (N8, turoctocog alfa)后，血浆中的FVIII活性。数据是在每一时间点来自n=2 FVIII KO小鼠的测量的平均值和标准差。

图9：在20˚C与FVIII (N8, turoctocog alfa)结合的VWF变体(764-865 SEQ IDNO 5)。上图面显示每次滴定后释放热量的原始数据。下图面显示得自积分原始数据的结合等温线。数据分析表明VWF变体(SEQ ID NO 5)在放热反应中与FVIII结合，其化学计量学为1.14，ΔH为-5.82 kcal/mole，ΔS为9.8 cal/mol/deg和K_d为0.33 µM。“F8/N8/turoctocogalfa”是如WO2009108806的实施例1中所公开而制备的B结构域截短的FVIII分子。

图10：经皮下给予的N8-GP在体内能有效止血。左图面显示在尾巴横切前24小时经皮下N8-GP或溶媒治疗，或在尾巴横切前5分钟经静脉内治疗的FVIIIKO小鼠中的血液损失。N8-GP”是如WO2009108806的实施例1+2中所述而制备的糖-聚乙二醇化FVIII分子。右图面显示在来自小鼠离体全血中的凝血时间，使用ROTEM。

图11：在25℃，FVIII、TIL’/E’/D3/A1 III、以及FVIII和TIL’/E’/D3/A1 III的混合物在155 mM NaCl、10 mM乙酸钙、10 %异丙醇中的SEC-UV (280 nm)色谱图。

图12：在25℃，FVIII、TIL’/E’/D3 II、以及FVIII和TIL’/E’/D3 II的混合物在155mM NaCl、10 mM乙酸钙、10%异丙醇中的SEC-UV (280 nm)色谱图。

定义

本文使用的术语“治疗”指任何有需要的人或其他脊椎动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医生或兽医进行的身体检查，医生或兽医已给出试验性或明确的诊断，表明使用所述特定治疗对治疗所述人或其他脊椎动物的疾病有益。根据受试者健康状况，所述治疗的时机和目的可因个体的不同而异。因此，所述治疗可以是预防性的、缓和性的、对症的和/或治愈性的。

给药方式：本发明的化合物和药物组合物可经胃肠外给予，例如，经静脉内或血管外(例如，皮内、肌内、皮下等)给予。本发明的化合物和药物组合物可以是预防性和/或治疗性地给予和/或按需要给予。根据本发明，血管外给予本发明的化合物/药物组合物具有若干优势。血管外给予对所有患者的可能益处、尤其是对儿童和小婴儿的特定益处是，更容易、简单，更少疼痛，更少麻烦和并发症(并因此可能带来较好的依从性)。

联合治疗/共同给予：可以以许多不同方式完成两种或更多种活性化合物(例如，FVIII和具有与FVIII结合能力的本发明的VWF/VWF片段)的联合给予。在一个实施方案中，两种活性化合物可以在单个组合物中一起给予。在另一个实施方案中，两种活性化合物可以在单独组合物中给予，作为联合治疗的组成部分。例如，第一种化合物可以在第二种化合物之前、之后或同时给予。在FVIII和VWF片段作为两种单独的药物组合物经血管外(例如，皮下)给予的情况下，它们优选地是靠近地给予，以便得益于这两种类型的化合物同时给予时所获得的改进的生物利用度(即注射部位应当间隔不超过5 cm、优选地不超过4 cm、优选地不超过3 cm、优选地不超过2 cm和最优选地不超过1 cm)。两种化合物还应当优选地在大约1小时内、优选大约30分钟内、优选大约15分钟内、和最优选地大约5分钟内注射。

因子VIII：因子VIII (FVIII)是主要由肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。人FVIII包含2351个氨基酸，包括信号肽，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。通过ニ价金属离子结合将链连接在一起。A1-A2-B链命名为重链(HC)，而A3-C1-C2命名为轻链(LC)。A1 (a1区)和A2 (a2区)的小的酸性区C-末端和A3结构域的N-末端(a3区)在其与其它凝血蛋白质的相互作用中起到重要作用，所述其它凝血蛋白质包括凝血酶和冯维勒布兰德因子(von Willebrandt Factor) (VWF)，FVIII的载体蛋白。

内源VIII分子以具有不同尺寸的B-结构域的分子库(最短的具有在位置740的C-末端，即在A2-a2的C-末端，并因此不含B结构域)在体内循环。这些具有不同长度的B结构域的FVIII分子都具有全部促凝血活性。一旦用凝血酶活化，在位置372的A1-a1的C-末端、在位置740的A2-a2的C-末端、和在位置1689的介于a3和A3之间切割FVIII，后一切割释放a3区，同时失去对VWF的亲和力。活化的FVIII分子称为FVIIIa。活化允许FVIIIa与磷脂表面样活化的血小板和活化的因子IX (FIXa)相互作用，即形成tenase复合物，允许有效活化因子X (FX)。

术语“因子VIII(a)”和“FVIII(a)”包括FVIII和FVIIIa两者。同样，术语“因子VIII”和“FVIII”可包括FVIII和FVIIIa两者。本文使用的“因子VIII”或“FVIII”是指作为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。“野生型(wt)/天然FVIII”是源自如SEQ ID NO：1 (氨基酸1-2332)所示的全长序列的人FVIII分子。“FVIII(a)”包括可以在个体之间存在并出现的FVIII(a)的天然等位变体。FVIII(a)可以是血浆衍生的或经重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其它翻译后修饰的程度和位置可以随所选择的宿主细胞及其生长环境的不同而变。

本发明的药物组合物可包含这样的天然的或B结构域-截短的FVIII分子：其中剩余结构域接近相当于如SEQ ID NO：3的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。在这类分子中，以及在包含全长B结构域氨基酸序列的FVIII中，可以引入突变。可将氨基酸修饰例如取代、插入和缺失引入分子中，以便修饰FVIII与多种其他组分的结合能力，所述多种其他组分例如低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和相关受体、多种其他受体、其他凝血因子、细胞表面、糖基化位点的引入和/或取消等。不取消FVIII活性的其它突变也可在本文的FVIII分子中提供。

本文的FVIII分子(分子/变体/衍生物/类似物/缀合物)在凝血级联中能够起作用，其方式在功能上类似于或等同于wt/内源FVIII，导致FXa的形成(经由与活化血小板上的FIXa相互作用)和支持血凝块的形成。可使用本领域众所周知的技术，在体外评价FVIII活性。凝血分析、FX活化测定法(通常称为显色测定法)、凝血酶产生测定法和全血血栓-弹性成像是这类体外技术的实例。本发明的FVIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII的至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、100%或甚至超过100%。

将内源全长FVIII合成为单链前体分子。在分泌之前，将前体切割为重链和轻链。可从两种不同的策略产生重组B结构域缺失或截短的FVIII。将无B-结构域的重链和轻链单独合成为两条不同的多肽链(两条链策略)，或将B-结构域缺失或截短的FVIII合成为单一前体多肽链(单条链策略)，其以与全长FVIII前体相同的方式被切割为重链和轻链。

在经单条链策略产生的B结构域缺失或截短的FVIII前体多肽中，通常通过接头分开重链和轻链部分。为了使在B结构域缺失的FVIII中导入免疫原性表位的风险最小化，接头的序列优选来源于FVIII B结构域。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648组成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII活化时导致接头移除的凝血酶切割位点位于重链中。因此，接头的尺寸和氨基酸序列不太可能影响通过凝血酶活化将其从残余FVIII分子中移除。B结构域的缺失/截短对于产生FVIII是有利的。然而，可在接头中包含部分B结构域而不降低生产能力。B结构域对生产能力的负面效应不能归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。

SEQ ID NO：1：wt人FVIII (Ser750残基以黑体和下划线显示)

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

FVIII的B结构域跨越SEQ ID NO：1的氨基酸741-1648。B-结构域在若干不同位点上被切割，在循环的血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B-结构域的确切功能未知。所知道的是B结构域在凝血级联中对FVIII活性是非必要的。因此经常以B结构域缺失/截短的变体形式产生重组FVIII。在一个优选的实施方案中，由编码包含具有以下序列的21个氨基酸残基L (接头)序列的FVIII分子的表达载体产生FVIII分子：SEQ ID NO 2：SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (O-聚糖连接到下划线的S)。或者，优选的B结构域接头序列可以缺乏SEQ ID NO 2所示的一个或多个氨基酸残基，例如SEQ ID NO 2中的C-末端R。优选的FVIII分子是B结构域缺失/截短的变体，其包含连接到SEQ ID NO 1中所示的Ser 750残基的O-聚糖，任选经由该O-聚糖缀合到聚合物(半寿期延长)部分上。

本发明的发明人惊奇地发现了以下观察结果：与例如具有整个B结构域完整的FVIII以及没有或仅有少数氨基酸(例如，15-30个氨基酸)完整的FVIII分子相比，本发明的具有以下长度的B结构域的B结构域缺失FVIII分子当经血管外(例如皮下)给予时，具有惊人高的生物利用度：大约100至大约400个氨基酸((优选150-650、更优选150-600、更优选150-550、更优选150-500、更优选150-450、更优选150-400、更优选150-350、更优选200-700、更优选200-600、更优选200-500、更优选200-400、更优选200-300、和最优选大约200-250)。这样的分子可以包含或可以不包含SEQ ID NO 1的Ser750残基。因此提供了在皮下/皮内给予后具有改善的生物利用度的FVIII的简单而安全的生产方式。通过将所述变体与半寿期延长部分缀合/融合可延长具有100至大约400个氨基酸的B结构域的FVIII的体内循环半寿期是似乎合理的。包含226个氨基酸的B结构域的FVIII分子的实例见SEQ ID NO 3：

SEQ ID NO 3：(226个氨基酸的B结构域变体):

atrryylgavelswdymqsdlgelpvdarfpprvpksfpfntsvvykktlfveftdhlfniakprppwmgllgptiqaevydtvvitlknmashpvslhavgvsywkasegaeyddqtsqrekeddkvfpggshtyvwqvlkengpmasdplcltysylshvdlvkdlnsgligallvcregslakektqtlhkfillfavfdegkswhsetknslmqdrdaasarawpkmhtvngyvnrslpgligchrksvywhvigmgttpevhsifleghtflvrnhrqasleispitfltaqtllmdlgqfllfchisshqhdgmeayvkvdscpeepqlrmknneeaedydddltdsemdvvrfdddnspsfiqirsvakkhpktwvhyiaaeeedwdyaplvlapddrsyksqylnngpqrigrkykkvrfmaytdetfktreaiqhesgilgpllygevgdtlliifknqasrpyniyphgitdvrplysrrlpkgvkhlkdfpilpgeifkykwtvtvedgptksdprcltryyssfvnmerdlasgligpllicykesvdqrgnqimsdkrnvilfsvfdenrswylteniqrflpnpagvqledpefqasnimhsingyvfdslqlsvclhevaywyilsigaqtdflsvffsgytfkhkmvyedtltlfpfsgetvfmsmenpglwilgchnsdfrnrgmtallkvsscdkntgdyyedsyedisayllsknnaieprsfsqnsrhpstrqkqfnattipendiektdpwfahrtpmpkiqnvsssdllmllrqsptphglslsdlqeakyetfsddpspgaidsnnslsemthfrpqlhhsgdmvftpesglqlrlneklgttaatelkkldfkvsstsnnlistipsdnlaagtdntsslgppsmpvhydsqldttlfgkksspltesggplslseenndskllesglmnsqesswgknvshhhhhhsqnppvlkrhqreitrttlqsdqeeidyddtisvemkkedfdiydedenqsprsfqkktrhyfiaaverlwdygmsssphvlrnraqsgsvpqfkkvvfqeftdgsftqplyrgelnehlgllgpyiraevednimvtfrnqasrpysfysslisyeedqrqgaeprknfvkpnetktyfwkvqhhmaptkdefdckawayfsdvdlekdvhsgligpllvchtntlnpahgrqvtvqefalfftifdetkswyftenmerncrapcniqmedptfkenyrfhaingyimdtlpglvmaqdqrirwyllsmgsnenihsihfsghvftvrkkeeykmalynlypgvfetvemlpskagiwrvecligehlhagmstlflvysnkcqtplgmasghirdfqitasgqygqwapklarlhysgsinawstkepfswikvdllapmiihgiktqgarqkfsslyisqfiimysldgkkwqtyrgnstgtlmvffgnvdssgikhnifnppiiaryirlhpthysirstlrmelmgcdlnscsmplgmeskaisdaqitassyftnmfatwspskarlhlqgrsnawrpqvnnpkewlqvdfqktmkvtgvttqgvkslltsmyvkeflisssqdghqwtlffqngkvkvfqgnqdsftpvvnsldpplltrylrihpqswvhqialrmevlgceaqdly

冯维勒布兰德因子(VWF)是涉及到止血的一种血液糖蛋白。在最常见的遗传性出血障碍冯维勒布兰德氏病中该因子缺乏或有缺陷。VWF是存在于血浆中的大的多聚体糖蛋白，在内皮、巨核细胞和内皮下结缔组织中组成型地产生。基本VWF单体是2050个氨基酸的蛋白。每个单体含有具有特定功能的许多特定结构域，包括与FVIII结合的TIL’或TIL’/E’结构域(Zhou等人. Blood 2012；120(2)：449-458)。FVIII与VWF结合，同时在循环中失活并通过凝血酶作用从VWF中释放。不与VWF结合的FVIII(a)被快速清除和/或降解。本文证明了，全长VWF没有显著增加血管外共同给予的FVIII的生物利用度的能力，尽管它具有固有的FVIII保护作用。

因此全长VWF分子是非常复杂的蛋白质。前原VWF (prepro VWF)由2813个氨基酸残基(SEQ ID NO 22)组成。在分泌期间，氨基酸残基1-22的信号肽和氨基酸残基23-763的前肽被切割，得到2050个氨基酸残基的成熟VWF。因此氨基酸编号通常是根据前原VWF，因此氨基酸S764是成熟分子中的第一个氨基酸。认为成熟分子含有12个Asn-连接的和10个Thr/Ser连接的寡糖侧链。此外该分子可以形成二聚体、三聚体等，多聚体分子量至多达几百万道尔顿。在人体中已发现不同的等位VWF变体，因此可以理解，本发明的VWF片段可以源自这些天然发生的变体的任一个。

对于VWF的药物组合物而言，全长分子的糖基化异质性，以及多聚体形成性能，使得构建表达系统和下游纯化过程颇具挑战性。

对VWF中的组织和结构域边界的理解尚未完成。仅仅所谓A结构域被良好表征并测定了它们的晶体结构。VWF内的二硫化物的化学安排是有限的。然而，近期对VWF中的结构域与其它蛋白中的结构域的同源性的研究表明可以形成若干二硫键。Zhou等人. Blood2012；120, 449-458所述的VWF的结构域定义用于本文中。

本发明涉及VWF片段，其优选比全长分子更容易产生。本文的VWF片段还更优选地具有增加经皮下共同给予的FVIII的生物利用度的能力。本发明的VWF片段包含TIL’结构域/亚结构域(跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-778)或TIL’结构域/亚结构域(跨越SEQ IDNO 22的氨基酸764-828或SEQ ID NO 22的氨基酸764-829)或TIL’/E’结构域/亚结构域(跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-865)的至少15个N-末端氨基酸并且尺寸小于1500个氨基酸、优选小于1400个氨基酸、优选小于1300个氨基酸、优选小于1200个氨基酸、优选小于1100个氨基酸、优选小于1000个氨基酸、优选小于900个氨基酸、优选小于800个氨基酸、优选小于700个氨基酸、优选小于600个氨基酸、优选小于500个氨基酸、优选小于400个氨基酸、优选小于300个氨基酸、优选小于275个氨基酸、优选小于250个氨基酸、优选小于225个氨基酸、优选小于200个氨基酸、优选小于175个氨基酸、优选小于150个氨基酸、优选小于125个氨基酸、优选小于100个氨基酸、优选小于95个氨基酸、优选小于90个氨基酸、优选小于85个氨基酸、或优选小于80个氨基酸、或优选小于75个氨基酸、或优选小于70个氨基酸、或优选小于65个氨基酸、或优选小于60个氨基酸、或优选小于55个氨基酸、或优选小于50个氨基酸、或优选小于45个氨基酸、或优选小于40个氨基酸、或优选小于35个氨基酸、或优选小于30个氨基酸、或优选小于25个氨基酸、或优选小于20个氨基酸、或优选小于15个氨基酸。本发明的VWF片段优选地包含TIL’/E’/D3结构域(其中D3分为亚结构域VWD3-C8-3-TIL-3-E3)，其跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-1250或氨基酸764-1261或氨基酸764-1268。本发明的VWF片段优选地包含TIL’、TIL’或TIL’/E’结构域(SEQ ID NO 22的氨基酸764-778、764-828或氨基酸764-865)的至少15个N-末端氨基酸。本发明的VWF片段还可以含有较少潜在抗原性区。本发明的VWF片段二聚体的分子量可以自然是单体片段的大约两倍(本发明的二聚体因此可包含至多大约2400个氨基酸，如果单体尺寸是1200个氨基酸的话)。

优选地，本发明的VWF片段包含至少氨基酸764-828 (SEQ ID NO 4)，或至少氨基酸764-865 (SEQ ID NO 5)，或至少氨基酸764-1035 (SEQ ID NO 6)，或至少氨基酸764-1041 (SEQ ID NO 7)，或至少氨基酸764-1045 (SEQ ID NO 8)，或至少氨基酸764-1128(SEQ ID NO 9)，或至少氨基酸764-1198 (SEQ ID no 10)，或至少氨基酸764-1250 (SEQID NO 11)，或至少氨基酸764-1261 (SEQ ID NO 14)，或至少氨基酸764-1268 (SEQ ID NO22)。

在一个实施方案中，在本发明的VWF片段中的C1099和/或C1142半胱氨酸可以突变。这些半胱氨酸残基据信负责VWF蛋白的寡聚化/二聚化。具有这两个半胱氨酸的VWF片段可以形成二聚体和同型寡聚物。这两个半胱氨酸的修饰可以导致产生由单体VWF片段组成的产物，而一个或另一个的缺失可以导致二聚体VWF片段或可能导致寡聚物VWF片段。以上两种情况都可导致比全长蛋白更简单的产物纯化过程。

在另一个实施方案中，C1099和C1142半胱氨酸两者都保持完整，其可以导致优选的二聚体VWF片段。包括C1099和C1142半胱氨酸的天然序列可具有安全性优势。

惊奇的是，与FVIII和全长VWF分子的共同配制相比，本发明的FVIII和VWF片段的共同配制显示了改进的生物利用度。本发明的共同配制显示了经皮下注射的因子VIII的增加的生物利用度。本发明的VWF片段包含D’结构域(跨越SEQ ID NO：22的氨基酸764-865/866)，其被认为是主要的FVIII结合部位，其中FVIII可以通过静电偶极-偶极样相互作用停靠在D’。本发明的VWF片段优选地包含D’结构域和/或D3-结构域(D3结构域跨越SEQ ID NO：15的氨基酸865/866-1250/1261/1268)。根据本文的发现，可能D’和D’D3结构域两者都具有与FVIII结合的能力。本发明的VWF片段没有任何明显程度地(即优选小于5%、更优选小于4%、优选小于3%、优选小于2%、更优选小于1%)形成多聚体(即具有超过两个单元，例如寡聚物)，因为多聚体装配所必需的半胱氨酸(C1099和C1142)不存在或已经突变/取代。本发明的一些VWF片段在任何明显程度上不再形成二聚体，尤其是其中C1099和/或C1142半胱氨酸不存在的那些。

然而，在某些情况下，形成二聚体的VWF片段也可用于本发明，TIL’/E’/D3/A1二聚体例如已经证明具有比单体更高的FVIII亲和力。VWF片段二聚体还可以是相对同质的产物，其可被相对容易地生产。

本发明的VWF片段的一个优势就是在工业规模上更容易生产作为相对同质产物的所述化合物，因为低程度的多聚化和因为以下事实：与全长VWF相比，所述化合物是具有较少的翻译后修饰的较小的化合物。这意味着更容易达到高表达水平和/或因分子更简单而导致纯化方法将会更简单。另外，与在哺乳动物细胞系中的生产相比，在简单生物体例如酵母中的重组肽和蛋白质的产生是更快和更便宜的生产方法，本发明的某些VWF片段可以在酵母中生产。

本发明的VWF片段可以呈单链VWF片段的形式(例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-1459的完整TIL’/E’/D3/A1区)或呈多组来自VWF的连续氨基酸融合在一起并因此缺失中间片段的形式(例如，跨越SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+764-865的TIL’和TIL’/E’结构域的“融合物”)。另一实例可以是SEQ ID NO 22的氨基酸764-828+1127-1197。本发明的VWF片段或者还可以呈重复序列的形式。可将同源或异源“间隔基(spacer)”序列引入融合的VWF片段/序列之间(例如，TIL’/E’结构域的多重融合物，例如TIL’/E’TIL’/E’TIL’/E’)。本发明的VWF片段还可以在VWF衍生的序列中包含一个或多个氨基酸交替(alternation)(例如，取代、缺失、添加)。

可以通过将FVIII与至少一个半寿期延长部分缀合而进一步改进经血管外共同给予FVIII和本发明的VWF片段时的FVIII的生物利用度。因此，包含TIL’和/或TIL’/E’结构域的VWF片段和与至少一个半寿期延长部分缀合的FVIII分子的血管外共同给予与相对高的FVIII生物利用度有关。

本发明的VWF片段的实例(使用来自Zhou等人的结构域注释)如以下SEQ ID NO 4-21中所示。TIL’/E’/VWD3 I、TIL’/E’/VWD3 II和TIL’/E’/VWD3 III表示3种形式(不同长度)的TIL’/E’/VWD3。

SEQ ID NO 4：氨基酸764-828 (TIL’):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCP

SEQ ID NO 5：氨基酸764-865 (TIL’/E’):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDA

SEQ ID NO 6：氨基酸764-1035 (TIL’/E’/VWD3 I):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR

SEQ ID NO 7：氨基酸764-1041 (TIL’/E’/VWD3 II):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDS

SEQ ID NO 8：氨基酸764-1045 (TIL’/E’/VWD3 III):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPAT

SEQ ID NO 9：氨基酸764-1128 (TIL’/E’/VWD3/C8-3) -半胱氨酸1099用黑体标明。该半胱氨酸可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQ

SEQ ID NO 10：氨基酸764-1198 (TIL’/E’/VWD3/C8-3/TIL-3) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPV

SEQ ID NO 11：氨基酸764-1250 (TIL’/E’/D3 I) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDA

SEQ ID NO 12：氨基酸864-1250 (D3 I)-半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDA

SEQ ID NO 13：氨基酸864-1268 (D3 II) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

ATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD

SEQ ID NO 14：氨基酸764-1261(TIL’/E’/D3 II) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVED

SEQ ID NO 15：氨基酸764-1264 (TIL’/E’/D3 III) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEP

SEQ ID NO 16：氨基酸764-1268 (TIL’/E’/D3 IV) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHD

SEQ ID NO 17：氨基酸764-1459 (TIL’/E’/D3/A1 I) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCD

SEQ ID NO 18：氨基酸764-1463 (TIL’/E’/D3/A1 II) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPE

SEQ ID NO 19：氨基酸764-1464 (TIL’/E’/D3/A1 III) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEA

SEQ ID NO 20：氨基酸764-1683 (TIL’/E’/D3/A1/A2) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGE GLQIPTLSPA

SEQ ID NO 21：氨基酸764-1873 (TIL’/E’/D3/A1/A2/A3) -半胱氨酸1099和1142用黑体标明。这两个半胱氨酸中的一个或两个可以被另一氨基酸例如Ser取代:

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCS

SEQ ID NO 22：根据UniProtKB/Swiss-Prot数据库的野生型人VWF (登录P04275)- 位置1099和1142的半胱氨酸残基用黑体标明：

MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRVTGCPPFDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK

FVIII分子/变体/衍生物/类似物：本文使用的术语“FVIII”意图指具有FVIII活性的任何FVIII分子，包括wt FVIII、B结构域缺失/截短的FVIII分子、表现出与wt FVIII基本相同的或改进的生物活性的FVIII变体和FVIII相关多肽，其中已经通过例如以下方式对母肽的一个或多个氨基酸进行了化学修饰：蛋白:蛋白融合、烷基化、聚乙二醇化、HES化、PAS化、PSA化、酰化、酯形成或酰胺形成等(缀合到半寿期延长部分)。

半寿期延长部分/延长基(protractive group)：术语“半寿期延长部分”在本文中理解为是指经由例如-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2或一个或多个N-和/或O-聚糖结构与FVIII共价连接的一个或多个化学基团，例如亲水聚合物，例如PEG和/或多糖，所述基团当与这些蛋白缀合时可以增加体内循环半寿期。适合与本发明的FVIII缀合的延长基/半寿期延长部分的实例包括：生物相容性的脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于磷酸胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximers、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)等)、Fc结构域、Fc受体、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽及其任意组合。一般而言，与无半寿期延长部分的FVIII相比，FVIII与一个或多个半寿期延长部分(例如，亲水性聚合物)的缀合当与本发明的VWF片段经皮下/皮内共同给予时通常具有更好的生物利用度。

本发明的聚乙二醇化FVIII分子可具有连接到FVIII蛋白包括任何氨基酸残基或碳水化合物部分的任何部分上的一个或多个聚乙二醇(PEG)分子。可以使用化学和/或酶促方法将PEG或其它聚合物基团（半寿期延长部分）与FVIII上的聚糖缀合。酶促缀合过程的实例描述于例如WO03031464。聚糖可以是天然发生的，或者可使用本领域众所周知的方法，通过例如插入N-连接的和/或O-连接的聚糖而将聚糖插入。本发明的“半胱氨酸-聚乙二醇化FVIII”具有缀合到FVIII中存在的半胱氨酸的巯基上的一个或多个PEG分子。本发明的“半胱氨酸-酰化的FVIII”具有缀合到FVIII中的半胱氨酸的巯基上的一个或多个疏水性半寿期延长部分(例如，脂肪酸)，可通过遗传工程引入该半胱氨酸残基或者该半胱氨酸可以是天然氨基酸序列的一部分。还有可能将半寿期延长部分与其它氨基酸残基连接。

融合蛋白：本发明的融合蛋白是通过将两个或更多个最初编码FVIII和融合配偶体的DNA序列的框内连接而产生的蛋白。该融合蛋白DNA序列的翻译将产生具有来源于各最初蛋白或肽的功能性质的单一蛋白序列。编码融合蛋白的DNA序列可通过标准生物学方法(例如重叠PCR或DNA连接)经人工产生，并进行装配，不包括最初5’-端DNA序列的终止密码子而保留3’端DNA序列的终止密码子。可将所得融合蛋白DNA序列插入到合适的表达载体中，所述载体支持异源融合蛋白在标准宿主生物体中的表达。

融合蛋白可含有将限定融合蛋白的蛋白或肽部分分隔开的接头或间隔基肽序列。接头或间隔基肽序列可促进单个蛋白或肽部分的正确折叠并且使得单个蛋白或肽部分保留其各自的功能性更加成为可能。可在组成完整融合蛋白DNA序列的单个DNA片段的框内装配期间即在重叠PCR或DNA连接期间将接头或间隔基肽序列插入到融合蛋白DNA序列。包含FVIII和融合配偶体的融合蛋白的实例参见WO2011101284。

Fc融合蛋白：术语“Fc融合蛋白”在本文中是指包含与源自任何抗体同种型的Fc结构域融合的FVIII。由于IgG抗体的相对长的循环半寿期，通常将优选IgG Fc结构域。此外，为了调节某些效应子功能(例如补体结合和/或与某些Fc受体结合)，可修饰Fc结构域。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合，通常将导致延长的体内循环半寿期。IgG Fc结构域中的位置234、235和237的突变通常将导致与FcγRI受体(亦可为FcγRIIa和FcγRIII受体)的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合，FcRn受体通过内吞再循环途径促进长的循环体内半寿期。优选地，本发明融合蛋白的修饰的IgG Fc结构域包含一种或多种下述突变，所述突变将分别导致与某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和Clq介导的补体结合降低(A330S和P331S)。或者，Fc结构域可以是IgG4 Fc结构域，优选地包含S241P/S228P突变。

(FVIII的)生物利用度：术语“生物利用度”描述了在血管外给予后吸收到血液中的化合物百分率，计算为经血管外给予化合物后浓度时间曲线下面积。这是根据相对于经静脉内给予后浓度曲线下面积除以同样的FVIII化合物的剂量，经皮下给予后FVIII浓度曲线下面积除以剂量而计算。按照本发明，FVIII分子的生物利用度(经皮下/皮内共同给予FVIII和本发明的VWF片段)为至少3%、优选地至少5%、优选地至少6%、优选地至少7%、优选地至少8%、优选地至少9%、优选地至少10%、优选地至少11%、优选地至少12%、优选地至少13%、优选地至少14%、优选地至少15%、优选地至少16%、优选地至少17%、优选地至少18%、优选地至少19%、优选地至少20%、优选地至少21%、优选地至少22%、优选地至少23%、优选地至少24%、优选地至少25%、优选地至少26%、优选地至少27%、优选地至少28%、优选地至少29%、优选地至少30%、优选地至少31%、优选地至少32%、优选地至少33%、优选地至少34%、优选地至少35%、优选地至少36%、优选地至少37%、优选地至少38%、优选地至少39%、优选地至少40%、优选地至少41%、优选地至少42%、优选地至少43%、优选地至少44%、优选地至少45%、优选地至少46%、优选地至少47%、优选地至少48%、优选地至少49%、优选地至少50%、优选地至少55%、优选地至少60%、优选地至少65%、优选地至少70%、和最优选地至少75%。生物利用度可以如本文所述地测定。优选地，本发明制剂的FVIII生物利用度(FVIII抗原和/或活性)将会足够高，以在正常活性条件下发挥预防作用，当所述制剂经血管外(例如，皮下或皮内)给予例如每天1次或2次或每周1、2或3次时。优选地，FVIII剂量可比得上经静脉内给予FVIII所用的剂量，优选是后者的2倍，更优选3倍、更优选4倍、更优选大约10倍、更优选大约15倍、更优选大约20倍、和最优选大约25倍。对于剂量的确定，可以考虑安全性和成本上的考虑。

FVIII对本发明VWF片段的饱和：FVIII对VWF片段的饱和/与VWF结合或复合的FVIII的相对量/与VWF结合的FVIII的量除以FVIII的总量。该计算是基于FVIII与所述蛋白之间结合的KD值。对于FVIII与VWF片段的结合，所测KI值用作KD。

以下(二次)方程式可用于根据总浓度[A]t [B]t计算FVIII (A)与另一蛋白(B)结合的浓度。

药物组合物：本发明提供包含VWF片段和优选也包含FVIII的组合物。因此，本发明的一个目标就是提供包含浓度40 IU/ml至25,000 IU/ml的FVIII分子的药物组合物，和其中所述组合物的pH为2.0-10.0。在一个优选的实施方案中，FVIII分子与VWF片段共同给予。因此，本发明的药物组合物可包含以下浓度的FVIII：40 IU/ml至25,000 IU/ml，例如50-25,000 IU/ml、100-25,000 IU/ml、250-25,000 IU/ml、500-25,000 IU/ml、1000-25,000IU/ml、2000-25,000 IU/ml、3000-25,000 IU/ml、4000-25,000 IU/ml、5000-25,000 IU/ml、6000-25,000、7000-25,000、8000-25,000、9000-25,000、10,000-25,000 IU/ml、50-20,000 IU/ml、100-20,000 IU/ml、250-20,000 IU/ml、500-20,000 IU/ml、1000-20,000 IU/ml、2000-20,000 IU/ml、3000-20,000 IU/ml、4000-20,000 IU/ml、5000-20,000 IU/ml、6000-20,000 IU/ml、7000-20,000 IU/ml、8000-20,000 IU/ml、9000-20,000 IU/ml、10,000-20,000 IU/ml、50-15,000 IU/ml、100-15,000 IU/ml、250-15,000 IU/ml、500-15,000IU/ml、1000-15,000 IU/ml、2000-15,000 IU/ml、3000-15,000 IU/ml、4000-15,000 IU/ml、5000-15,000 IU/ml、6000-15,000 IU/ml、7000-15,000 IU/ml、8000-15,000 IU/ml、9000-15,000 IU/ml、10,000-15,000 IU/ml、50-10,000 IU/ml、100-10,000 IU/ml、250-10,000 IU/ml、500-10,000 IU/ml、1000-10,000 IU/ml、2000-10,000 IU/ml、3000-10,000IU/ml、4000-10,000 IU/ml、5000-10,000 IU/ml、50-5000 IU/ml、100-5000 IU/ml、250-5000 IU/ml、500-5000 IU/ml和1000-5000 IU/ml。本发明的组合物还可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如，缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂或表面活性剂及其多种组合。防腐剂、等张剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员众所周知的。参考文献可见Remington：The Science and Practice ofPharmacy, 第19版, 1995。

在一个实施方案中，药物组合物是水性组合物。这类组合物通常是溶液剂或混悬剂，但也可包括胶剂、分散剂、乳剂和多相材料。术语“水性组合物”定义为包含至少50% w/w水的组合物。同样，术语“水性溶液剂”定义为包含至少50% w/w水的溶液剂，术语“水性混悬剂”定义为包含至少50% w/w水的混悬剂。

在另一个实施方案中，药物组合物是冻干组合物，在使用前由医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。

又一方面，药物组合物包含这类抗体和缓冲剂的水性溶液剂，其中所述抗体的浓度为1 mg/ml或以上，和其中所述组合物的pH为大约2.0至大约10.0。

本发明的药物组合物优选地是在凝血疾病的预防性/治疗性治疗中适用于经血管外给予(例如，经皮下或皮内给予)。

“FVIII:VWF的比例”：根据本发明，FVIII和VWF/VWF片段的优选比例包括0.5:1至1:50的FVIII/VWF比例(摩尔比)，例如，1:1至1:50、例如，1:1至1:25、例如，1:1至1:20、或1:1至1:15、或1:1至1:10、或1:1至1:7,5、或1:7至1:8、或1:6至1:8、或1:6至1:9、或1:5至1:10。因此优选的比例包括：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:5,5；1:6；1:6,5、1:7；1:7,1；1:7,2；1:7,3；1:7,4；1:7,5；1:7,6；1:7,7；1:7,8；1:7,9、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45和1:50。优选的比例包括：0.5:1；0.6:1；0.7:1；0.8:1；0.9:1；1:1；1.1:1；1.2:1；1.3:3；1.4:1和1.5:1。接近1:1的摩尔比通常具有使活性物的所需量最小化的优势。根据VWF变体对讨论中的FVIII种类的结合亲和力，可通过计算在某些蛋白浓度时结合的FVIII:VWF的量来测定在共同配制的混合物中的FVIII和VWF片段的最佳比例。可通过例如ELISA、SPR或通过ITC来确定结合亲和力。

“血友病”：血友病/凝血疾病是一组遗传性遗传障碍，其损害了机体控制血液凝固或凝血的能力(“出血障碍”)，该能力用于在血管遭到破坏时止血。A型血友病(凝血因子VIII缺乏)是这类障碍的最常见的形式，在5,000–10,000个男性出生时有大约1例。对于本发明，术语“血友病”包括冯维勒布兰德氏病。

实施方案列表：

1. 包含至多1500、1400、1300或1200个氨基酸的VWF片段，其中所述VWF片段包含TIL’结构域。所述片段可包含经肽键连接的不同的或重复的VWF序列。

2. 本发明的VWF片段，其中所述片段包含TIL’和E’结构域。

3. 由TIL’或TIL’/E’结构域组成的VWF片段。

4. (本发明的)VWF片段，其中所述片段包含SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21的任一个的氨基酸序列。

5. 本发明的VWF片段，其中所述VWF片段不含SEQ ID NO 22的位置1099和/或1142的半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基可以通过氨基酸取代和/或缺失而缺失。

6. 本发明的VWF片段，其中所述片段包含SEQ ID NO 9，其中1099半胱氨酸残基被例如以下的另一氨基酸取代：组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸和酪氨酸。

7. 本发明的VWF片段，其中1099半胱氨酸残基被丝氨酸取代。

8. 本发明的VWF片段，其中所述片段包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21，其中1099和1142半胱氨酸残基被例如以下的另一氨基酸取代：组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸和/或酪氨酸。

9. 本发明的VWF片段，其中1099和1142半胱氨酸残基被丝氨酸取代。

10. 包含本发明的VWF片段的药物组合物，其中小于10%、优选小于9%、优选小于8%、优选小于7%、优选小于6%、优选小于5%、优选小于4%、优选小于3%、优选小于2%、优选小于1%的所述VWF片段呈寡聚物和/或多聚体形式。

11. 本发明的VWF片段，其中所述VWF片段是二聚体的一部分。二聚体形成的百分率可以是至少5%、优选地至少10%、优选地至少15%、优选地至少20%、优选地至少25%、优选地至少30%、优选地至少35%、优选地至少40%、优选地至少45%、优选地至少50%、优选地至少55%、优选地至少60%、优选地至少65%、优选地至少70%、优选地至少75%、优选地至少80%、优选地至少85%、优选地至少90%、最优选地至少95%。

12. 包含FVIII和VWF片段的药物组合物，其中在血管外(例如，皮下/皮内)给予所述药物制剂后，FVIII生物利用度为至少5%。

13. 包含FVIII和VWF片段的药物组合物，其中在血管外(例如，皮下/皮内)给予所述药物制剂后，FVIII生物利用度为至少5%，其中FVIII和VWF片段的比例为大约0.5:1 - 1:50。优选地，所述比例为大约0.5:1、1:1或1:2。

14. VWF片段，其中所述VWF片段的氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 12、SEq ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20和SEQ IDNO 21。

15. 药物组合物，包含：(i) 本发明的VWF片段；和(ii) FVIII，优选重组FVIII。或者，所述组合物可包含本发明的2、3、4、5或更多种不同的VWF片段和/或2、3、4或5种不同的FVIII分子。

16. 本发明的药物组合物，其中所述FVIII分子包含长度为5-700个氨基酸的截短的B结构域，例如长度为5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、10-700、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-700、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-25、50-700、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-700、100-500、100-400、100-300、100-200、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、75或100个氨基酸。

17. 本发明的药物组合物，其中所述截短的B结构域的氨基酸序列源自wt FVIIIB结构域氨基酸序列。

18. 本发明的药物组合物，其中所述FVIII分子是B结构域截短的FVIII分子，其中所述B结构域包含连接到SEQ ID NO 1中所示的Ser 750残基的O-聚糖。优选地，所述FVIII分子在截短的B结构域中包含一个O-连接的聚糖，其中所述O-连接的聚糖连接到SEQ ID NO1所示的Ser 750残基。

19. 本发明的药物组合物，其中所述FVIII分子包含具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的B结构域。或者，从SEQ ID NO 2中缺失B结构域中的一个或多个氨基酸，例如，N-末端Ser残基和/或C-末端Arg残基。

20. 本发明的药物组合物，其中FVIII B结构域的氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID NO 1的氨基酸741-857 + 1637-1648；氨基酸741-914 +1637-1648；氨基酸741-954 + 1637-1648；氨基酸741-965 + 1637-1648；氨基酸741-965 +1637-1648；氨基酸741-1003 + 1637-1648；氨基酸741-1003 + 1637-1648；氨基酸741-1020 + 1637-1648；氨基酸741-1079 + 1637-1648；氨基酸741-1206 + 1637-1648；氨基酸741-1261 + 1637-1648；氨基酸741-1309 + 1637-1648；氨基酸741-914 + 1637-1648；氨基酸741-954 + 1637-1648；氨基酸741-968 + 1637-1648；氨基酸741-1003 + 1637-1648；氨基酸741-1018 + 1637-1648；氨基酸741-1070 + 1637-1648；氨基酸741-1230 + 1637-1648；氨基酸741-1301 + 1637-1648；氨基酸741-965 + 1637-1648；氨基酸741-965 +1637-1648；氨基酸741-965 + 1637-1648；和氨基酸741-965 + 1637-1648。

21. 本发明的药物组合物，其中所述FVIII分子与至少一个半寿期延长部分缀合。优选地，所述半寿期延长部分是水溶性聚合物。优选PEG和/或多糖。

22. 本发明的药物组合物，其中至少一个水溶性聚合物与B结构域中存在的聚糖共价连接，优选O-聚糖，优选连接到SEQ ID NO 1中所示的Ser750氨基酸残基的O-聚糖。

23. 本发明的药物组合物，其中所述水溶性聚合物选自：PEG、PSA、HES、HEP和HSA。

24. 本发明的药物组合物，其中使用编码包含SEQ ID NO 2所示的FVIII B结构域的FVIII分子的表达载体，产生所述FVIII分子。

25. 本发明的药物组合物，其中所述FVIII分子的生物利用度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10%。优选地，生物利用度测定为皮下给予后的FVIII血浆水平的曲线下面积，使用抗原测定法或凝血测定法。

26. 本发明的药物组合物，其中FVIII和VWF间的比例为1:50、1:34、1:25、1:20：1:15、1:10、1:7,5，优选0.5:1、1:1或1:2。

27. 本发明的药物制剂，其中FVIII浓度为至少大约100、150、200、250、300、350、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或30,000 IU/ml。

28. 本发明的药物制剂，其中与VWF片段结合的FVIII的量占所述制剂中的FVIII总量的至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95%。

29. 本发明的化合物或本发明的药物组合物在经血管外、优选皮下给予而治疗血友病中的用途。本发明的药物组合物也可经皮内给予。本发明的药物组合物还可经静脉内给予。

30. 治疗血友病的方法，其中所述方法包括皮下给予有需要的患者治疗有效量的本发明化合物或本发明的药物组合物。

31. 增加FVIII的生物利用度的方法，其中所述方法包括血管外(例如皮下/皮内)共同给予FVIII和本发明的VWF片段的步骤，其中所述FVIII和所述VWF片段的比例为大约1:1 – 1:50，优选0.5:1、1:1、1:2、1:10、1:20或1:34。

32. 编码本发明的VWF片段的DNA分子。

33. 包含本发明的DNA分子的表达载体。

34. 包含本发明表达载体的宿主细胞。

35. 制备本发明的VWF片段的方法，其中所述方法包括在合适条件下在合适培养基中孵育宿主细胞，随后回收所述重组VWF片段。

36. 本发明的药物组合物，其中所述组合物包含本发明的一个或多个VWF片段。

37. 包含本发明的一个或多个VWF片段的药物组合物。

38. 治疗冯维勒布兰德氏病的方法，其中所述方法包括血管外(例如，皮下)给予有需要的患者治疗有效量的本发明的药物组合物。

39. VWF片段或VWF-样多肽，其包含TIL’序列764-778的15个N末端氨基酸或更多。相对小的本发明的VWF片段可构成任何来源（包括非VWF来源）的架构多肽序列的部分，或“嵌入”或移植到其中。

40. 本发明的VWF片段，其中所述VWF片段与SEQ ID NO 1所示的FVIII氨基酸序列的残基C1858-Q1874、S2063-D2074和V2125-A2146相互作用/与其结合。

41. 本发明的VWF片段，其中所述片段与半寿期延长部分缀合。

42. 本发明的VWF片段，其中所述片段与半寿期延长部分经由N-和/或O-连接的聚糖而缀合。

43. 本发明的VWF片段，其中对于所述VWF片段与FVIII的结合，所述VWF片段减少了抗原呈递细胞对FVIII的摄取。

可以理解，本发明的所有方面和实施方案可以合并并且不应以任何限制性方式理解它们。

实施例

尽管本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但是对于本领域技术人员而言可进行许多修改、取代、改变和等同方案。因此，可以理解，所附权利要求书意图覆盖所有这些落入本发明真实精神内的修改和改动。

实施例1：

在FVIII敲除小鼠中的皮下给予(1):

制备了2种试验化合物：

a) 糖聚乙二醇化FVIII，即“N8-GP” (基本上按照WO2009108806的实施例1+2中公开的而制备) 2000 U FVIII/ml，经显色活性测定，根据蛋白含量相当于1.2 µM。

b) 糖聚乙二醇化FVIII，即N8-GP (2000 U FVIII/ml或1.2 µM, 与0.74 mg/mlVWF片段TIL’/E’/D3/A1 (相当于9.3 µM)共同配制。

将这两种试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5 mg/ml L-组氨酸、0.1 mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl₂, pH 7.3中。

将12只FVIII KO小鼠(在C57Bl/6和SV129的混合背景中外显子16敲除，在TaconicM&B (B6.129S4-F8tm1Kaz/J)繁育，体重大约22 g)，在侧面经皮下给予10000IU/kg FVIII或FVIII/VWF，每种测试化合物6只小鼠。

在给药后1、3、7、17、24、30、48、72和96小时采集血液样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛(retroorbital plexus)麻醉小鼠。每只小鼠采集三个样品。血液(45 µl)用5µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µl FVIII coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1%BSA、环丙沙星10 mg/L，pH 7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将上清液立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

在Ovlisen K等人. J. Thromb. Haemost, 2008, 6：969-975所述的显色测定法中，并在FVIII LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法(Luminescence oxygen channellingimmunoassay))中通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品的FVIII活性。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用先前在FVIII KO小鼠中的N8-GP的经静脉内药代动力学研究，评价生物利用度。

FVIII活性的循环分布图见图1所示，FVIII抗原的循环浓度见图2。

在本实验中，糖聚乙二醇化FVIII单用的生物利用度经计算为27% (根据活性)和19% (根据抗原)。与VWF的共同配制将生物利用度分别增加至40和47%。

实施例2:

在FVIII敲除小鼠中的皮下给予(2):

制备了2种试验化合物：

a)糖聚乙二醇化FVIII (500 IU FVIII/ml，经显色活性测定相当于0.3 µM)

b)糖聚乙二醇化FVIII (500 IU FVIII/ml或0.3 µM, 与0.185 mg/ml VWF片段TIL’/E’/D3/A1 (相当于2.3 µM)共同配制

根据所测的1.5 nM VWF片段对FVIII的IC50并假定所测的IC50 等于K_d，在该组合物中99%的FVIII应当与VWF结合。

将这两种试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5 mg/ml L-组氨酸、0.1 mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl2 (pH ~7.3)中。

将12只FVIII KO小鼠(在C57Bl/6和SV129的混合背景中外显子16敲除，在TaconicM&B (B6.129S4-F8tm1Kaz/J)繁育，体重大约22 g)，在侧面经皮下给予2500 IU/kg FVIII或FVIII/VWF，每种测试化合物6只小鼠。

在给药后1、3、7、17、24、30、48、72和96小时采集血液样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛麻醉小鼠。每只小鼠采集三个样品。45 µl血液用5 µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µl FVIII coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1% BSA、环丙沙星10 mg/L, pH7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将样品立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

在Ovlisen K等人. J. Thromb. Haemost, 2008, 6：969-975所述的显色测定法中，并在FVIII LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品的FVIII活性。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用先前在FVIII KO小鼠中的N8-GP的经静脉内药代动力学研究，评价生物利用度。

FVIII活性的循环分布图见图3所示，FVIII抗原的循环浓度见图4。

在本实验中，糖聚乙二醇化FVIII单用的生物利用度经计算为29% (根据活性)和14% (根据抗原)。与VWF的共同配制将生物利用度增加至36% (抗原测定)。

实施例3:

经皮下给予的共同配制的FVIII化合物和VWF化合物的止血功效：

研究概述:

动物：FVIII k/o小鼠，8-18周龄，雄性和雌性

尾巴出血：n=6-12/时间点/组

血栓-弹性成像：n=2-4/时间点/组

给药途径：经皮下在颈部或侧面(对于对照组，在尾静脉经静脉内)

剂量体积1-10ml/kg

分组：

在损伤前24小时给予溶媒对照

在损伤前5分钟经静脉内给予对照

在损伤前5分钟、1、3、5、12、24、48、72、96、120、144或168小时经皮下给予与VWF化合物共同配制的FVIII化合物。

程序：

将目标化合物在缓冲液(10 mM L-组氨酸、8.8 mM蔗糖、0.01 %聚山梨酯80、308mM NaCl、1.7 mM CaCl2 (二水合物)、0.37 mM L-甲硫氨酸, pH 6.9)中制备为介于40和10000U/ml之间的浓度并贮存于-80℃直到使用。

在尾巴横切前，小鼠用异氟烷麻醉并放在加热垫上。

将尾巴放在37℃预热的盐水中10 min。

在损伤前5 min、24或48hr经静脉内注射对照。

在距离尾尖4 mm处切断尾巴。

就在切断尾巴之前从眼眶周丛(peri-orbital plexus)抽取20 µl血液样品，用于FVIII测定。

在30 min内采集血液并通过分光光度法在550 nm处测定血红蛋白浓度。

平行动物用于血液采样和它们的凝血参数的后续分析(离体功效)。

结果:

在皮下给予后某时间点(5min到168hr)，在30min研究周期期间将血液损失与以下相比，确定共同配制的预防效果：1，溶媒对照，和2，经静脉内给予FVIII或糖聚乙二醇化FVIII的对照组。图10显示糖聚乙二醇化FVIII在经皮下给予2500 U/kg后24 hr能有效止血，正如血液损失减少和离体凝血时间缩短所示。对于与VWF片段共同配制的FVIII观察到类似效果。

实施例4:

FVIII的生物利用度的评价：

可以根据在实施例1和2中所述的PK实验中对生物利用度的效果的评价以及在实施例3中所述的预防效果的评价，测定本发明的FVIII和VWF/VWF片段的共同组合物(co-composition)的生物利用度。

根据组合物中的FVIII化合物的浓度并根据评价VWF片段化合物与FVIII化合物的结合亲和力的实验例如表面等离子体共振实验，可以测定与一定浓度的VWF片段共同配制的FVIII化合物的生物利用度，所述一定浓度的VWF片段能够使注射组合物中的大部分FVIII与VWF片段化合物结合。

实施例5:

FVIII:VWF共同组合物的剂量测定：

可以按照实施例1-3中公开进行剂量测定。简而言之，在FVIII k/o小鼠中经皮下给予70、100、150、280、500、1000和2500IU/kg (FVIII单位)剂量单用或与VWF片段联用后，评价FVIII的血浆浓度。

实施例6:

FVIII化合物和VWF化合物间的比例的测定：

可以按照类似于实施例1和2的实验中公开的和实施例3中描述的，进行FVIII和VWF间的比例的测定。

对于PK评价，280、500、1000或2500IU/kg剂量的FVIII化合物将与VWF片段共同配制，其摩尔比为1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:7.7或至多1:100 (FVIII比VWF片段)，并在经皮下给予后在FVIII k/o小鼠中评价FVIII的血浆浓度。根据所述片段与讨论中的FVIII化合物的结合亲和力测定VWF片段对于FVIII的最大摩尔过量；所用的最高摩尔过量将是导致至少99%的所用FVIII与VWF片段结合的摩尔过量。

对于预防效果，在功效模型例如实施例3所述的尾巴出血中评价来自PK实验的候选组合物。

实施例7:

VWF对FVIII免疫原性的作用

相对于单用野生型FVIII和FVIII化合物而言，评价与FVIII化合物共同配制的VWF的免疫调节作用。

在给予后某时间点，在体内，根据FVIII结合抗体效价和中和抗体(抑制剂)水平的测定来评价相对免疫原性。用于测定FVIII结合抗体的测定法是放射免疫测定法(RIA)。简而言之，来自样品的抗FVIII抗体与放射性¹²⁵I-标记的rFVIII结合。免疫球蛋白和免疫复合物与蛋白G-琼脂糖结合并通过离心而沉淀。测定沉淀物中的放射性，这与样品中的抗FVIII抗体的量成比例。结果表示为所加入的放射性总量的百分率，即%结合/总量(%B/T)。

使用显色测定法，对于抗FVIII抗体呈阳性的样品，分析FVIII中和抗体的存在。简而言之，将样品与1 IU/ml FVIII孵育1小时。通过加入FIX、FX、凝血酶、CaCl₂和磷脂，测定剩余FVIII活性。孵育后，通过加入显色底物S-2760并测定光密度(OD)的变化，测定所产生的FXa的量。OD的变化与样品中的FVIII活性成比例，并将其与含有已知量的FVIII和无抑制剂的样品进行比较。与未添加抑制剂/抗FVIII抗体的参考样品相比，计算试验样品中%剩余活性。此外，通过ELISA，使用与鼠VWF无交叉反应的单克隆或多克隆的抗人VWF抗体，测定抗VWF抗体的存在。如果检测到强烈抗VWF反应，可以预期这会干扰VWF与FVIII的结合并使用鼠VWF片段重复体内分析。

在首次用于实验的小鼠中，在FVIII k/o小鼠中，以及在耐受人FVIII的小鼠中，重复(例如每周1次共4周，或每周1次共3周)经皮下给予所述化合物后，评价抗药物抗体的表现。在第一次和/或最后一次给予后的某个时间点(例如，1、2、3、4、5、6、7或8周)，读出的是具有阳性效价的动物比例。给FVIII k/o小鼠每周注射例如1000IU/kg FVIII单用或与VWF联用，其摩尔比确保至少例如87%的FVIII与VWF结合。对于每天给药，FVIII剂量较低并根据FVIII-VWF复合物的生物利用度。给耐受hFVIII的小鼠每周注射例如共8周经皮下给予例如1000 IU/kg FVIII，有或无VWF，并且在某些实验中包括第一次注射用完全弗氏佐剂(CFA)的额外攻击，随后用不完全弗氏佐剂(IFA)每周攻击。

此外，在人CD4+ T细胞测定法中，在体外评价VWF与VWF片段以及野生型FVIII与同VWF共同配制的FVIII化合物的相对免疫原性。这使用耗尽CD8+ T细胞的外周血单核细胞(PBMC)而完成。将FVIII加入到细胞培养物中，例如达8天。在测定过程中评价T细胞增殖，即通过例如用³H-胸苷在来自培养物的亚样品中脉冲18小时并随后测定³H-胸苷的掺入。在测定结束时，使用来自例如R&D Systems的ELISPOT IL-2试剂盒，按照制造商的说明书，测定白介素2的产生。将测定中得到的数据转化为“刺激指数”，描述经化合物刺激的细胞与未经刺激的细胞之间的比例。

使用HLA-结合性质的计算机分析(in silico analysis)，已经评价了VWF的HLA结合能力。对经修饰VWF中的序列的强烈结合可能指示新的T细胞表位，尽管计算机分析工具预测可不被天然存在的蛋白酶加工的表位。为了预测Cys->Ser突变是否会导致VWF-突变体中的免疫原性降低的风险，将VWF蛋白序列应用于计算机上的肽/HLA-II结合预测软件。肽/HLA-II结合预测软件是基于2种不同算法：NetMHCIIpan 2.1 (NetMHCIIpan-2.0 – 改进的泛特异性HLA-DR预测，使用新的并行比对和权重优化训练程序(Nielsen M, LundegaardC, Justesen S, Lund O,和Buus S. Immunome Res. 2010 Nov 13；6(1):9)进行泛特异性HLA-DR预测)，以及NetMHCII 2.0 (NN-align – 一种基于神经网络的比对算法，用于MHCII类肽结合预测(Nielsen M和Lund O. BMC Bioinformatics. 2009 Sep 18；10:296)进行HLA-DP/DQ预测)。

在位置12具有突变点的23个氨基酸长度的肽用作算法的输入。经优化处理的肽被假定为15聚体肽，其具有与HLA-II结合的9个氨基酸核心肽。输出是15个氨基酸长度的肽，其具有9个氨基酸长度的核心肽(与HLA-II接触)和预测的结合亲和力为毫微摩尔级别。

VWF突变肽的预测的结合亲和力的范围与野生型序列的结合亲和力范围相同(数据未显示) – 并且因为预测了所述肽以相对差的亲和力与HLA-II分子结合，所以认为导致新的CD4+ T细胞表位的风险非常低。

注意，在计算机上的肽/HLA-II结合预测是基于实验性的肽/HLA-II结合数据，其中测试富含半胱氨酸的肽是非常具有挑战性的(因为所述肽的性质)。因此，富含半胱氨酸的肽在用于训练不同的预测算法的数据组中未被充分代表。因此，这些富含半胱氨酸的VWF肽的肽/HLA-II结合预测是不确定的，应当使用其他免疫原性预测平台(等，体外肽/HLA-II结合测定法或离体T细胞测定法)对其做进一步分析。

实施例8:

在FVIII敲除小鼠中的皮下给予(3):

制备了2种试验化合物：

A) B-结构域截短的FVIII (“turoctocog alfa”/”N8” –基本上按照WO2009108806的实施例1中公开的而制备) (4000 IU FVIII/ml，经显色活性测定法测定，相当于2.4 µM)

B) B-结构域截短的FVIII (turoctocog alfa) (1000 IU FVIII/ml，经显色活性测定法测定，相当于0.6 µM)与0.37 mg/ml VWF片段TIL’/E’/D3/A1 (相当于4.6 µM)共同配制

根据所测的1.5nM VWF片段与FVIII的结合亲和力，在该组合物中99%的FVIII应当与VWF结合。

将这两种试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5 mg/ml L-组氨酸、0.1 mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl₂, pH ~7.3中。

将12只FVIII KO小鼠(在C57Bl/6和SV129的混合背景中外显子16敲除，在TaconicM&B (B6.129S4-F8tm1Kaz/J)繁育，体重大约22 g)，在侧面经皮下给予10000 IU/kg FVIII或FVIII/VWF，每种测试化合物6只小鼠。

在给药后1、3、7、17、24、30、48、72和96小时采集血液样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛麻醉小鼠。每只小鼠采集三个样品。45 µl血液用5 µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µl FVIII coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1% BSA、环丙沙星10 mg/L、pH7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将上清液立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

在Ovlisen K等人. J. Thromb. Haemost, 2008, 6：969-975所述的显色测定法中，并在FVIII LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品的FVIII活性。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用先前在FVIII KO小鼠中的N8-GP的经静脉内药代动力学研究，评价生物利用度。

FVIII活性的循环分布图见图5所示，抗原水平见图6。

在本实验中，B-结构域截短的FVIII单用的生物利用度经计算为0,9% (根据活性)。与VWF片段的共同配制将生物利用度增加至11%。

实施例9:

在FVIII敲除小鼠中的皮下给予(4):

制备了2种试验化合物：

A) 226个氨基酸B结构域变体(1000 IU FVIII/ml，经显色活性测定法测定，相当于2.4 µM)

B) 226个氨基酸B结构域变体(1000 IU FVIII/ml，经显色活性测定法测定，相当于0.6 µM)与0.37 mg/ml VWF片段TIL’/E’/D3/A1 (相当于4.6 µM)共同配制

根据所测的1.5 nM VWF片段与FVIII的结合亲和力，在该组合物中99%的FVIII应当与VWF结合。

将这两种试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5 mg/ml L-组氨酸、0.1 mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl₂, pH ~7.3中。

将12只FVIII KO小鼠(在C57Bl/6和SV129的混合背景中外显子16敲除，在TaconicM&B (B6.129S4-F8tm1Kaz/J)繁育，体重大约22 g)，在侧面经皮下给予10000 IU/kg FVIII或FVIII/VWF，每种测试化合物6只小鼠。

在给药后1、3、7、17、24、30、48、72和96小时采集血液样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛麻醉小鼠。每只小鼠采集三个样品。45 µl血液用5 µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µl FVIII coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1% BSA、环丙沙星10 mg/L, pH7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将上清液立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

在Ovlisen K等人. J. Thromb. Haemost, 2008, 6：969-975所述的显色测定法中，并在FVIII LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品的FVIII活性。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用先前在FVIII KO小鼠中的N8-GP的经静脉内药代动力学研究，评价生物利用度。

在本实验中，226个氨基酸B结构域FVIII分子单用的生物利用度类似于与VWF共同配制所得的生物利用度。因此，对于具有较长B-结构域的该变体而言，VWF不增加生物利用度。

实施例10

编码FVIII分子的表达载体的构建

具有编码F8-500 FVIII分子(F8-500相当于turoctocog alfa/N8编码序列)的插入序列的质粒用于产生FVIII。在N-端开始，F8-500载体编码无B结构域的FVIII重链(氨基酸1-740)、21个氨基酸接头 (SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR – SEQ ID NO 2)和FVIII轻链 (全长野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)。该21个氨基酸接头的序列源自FVIII B结构域并由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。从全长FVIII cDNA扩增FVIIIcDNA的片段并插入到F8-500编码质粒中，得到编码BDD FVIII的DNA构建体。

如下所述，建立了编码F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-hFc(IgG1)、F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-mFc(IgG2A)和F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-白蛋白的构建体。通过定点诱变，消除了F8-500编码DNA中的内部BamHI位点(aa 604-606)，并将编码柔性(GGGS)₆接头的DNA插入到编码区的3’。在接头-编码DNA的3’端引入新BamHI位点，以便在BamHI和NotI位点之间容易克隆C-末端融合配偶体。因此，产生了编码F8-500-C2-连接的-(GGGS)6的构建体。扩增了编码人Fc (IgG1)、小鼠Fc (IgG2a)和人血清白蛋白的DNA。

将PCR产物插入到F8-500-C2-连接的-(GGGS)6编码载体的BamHI和Not I位点之间，得到编码F8-500-C2-连接的-(GGGS)6-hFc(IgG1)、F8-500-C2-连接的-(GGGS)6-mFc(IgG2A)和F8-500-C2-连接的-(GGGS)6-白蛋白的构建体。将来自后一构建体的SphI/ClaI限制片段转入F8-500D-His编码构建体，以产生F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-hFc(IgG1)-、F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-mFc(IgG2A)-和F8-500D-HIS-C2-连接的-(GGGS)6-白蛋白的编码构建体。

对于实施例11中所述的瞬时表达，使用由哺乳动物表达载体pTT5以及编码BDDFVIII的插入序列组成的DNA构建体。对于制备BDD FVIII的稳定细胞系的产生，使用载体pTSV7。该载体编码二氢叶酸还原酶，允许选择经转染的具有二氢叶酸还原酶系统的细胞。将来自编码F8-500D-His的pTT5-衍生的载体的SpeI/AgeI限制片段转入编码F8-500的pTSV7-衍生的载体，导致由pTSV7以及编码F8-500D-His的插入序列组成的构建体#1917。

实施例11

FVIII的瞬时表达

密度为0.9 – 1.1 x 10⁶的HKB11细胞用质粒(0.7 mg/l或1.0 mg/l)和转染剂293Fectin (Invitrogen) (1.0 ml/l或1.4 ml/l)的复合物转染。通过分别稀释质粒和转染剂，将这两种溶液混合并在室温下将混合物孵育20分钟，制备转染复合物。将复合混合物加入到细胞悬液中并将悬液在振荡器培养箱中在36.5℃或37℃和5%或8% CO₂中孵育4或5天。通过实施例14所述的显色FVIII测定法分析细胞培养收获物和/或将细胞培养收获物在0.22µm膜滤器上过滤并用于按照实施例13所述进行FVIII纯化。

实施例12

表达FVIII的稳定的细胞系

适应无血清的CHO-DUKX-B11细胞用实施例10所述的并编码FVIII F8-500D-His的表达质粒构建体#1917转染。转染后的细胞用二氢叶酸还原酶系统选择并通过有限稀释而克隆。通过ELISA和显色活性测定法来筛选产生FVIII的克隆。选择克隆GedT019A用于扩大规模(upscaling)。将细胞移至生物反应器。按照实施例13所述，从细胞培养收获物中纯化F8-500D-His蛋白。

实施例13

FVIII的纯化

给柱填装树脂VIIISelect (GE Healthcare)，其尺寸为：直径1.6cm和床高4cm，共8mL，并将柱用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80+250mM NaCl, pH7.3以500cm/h平衡。将按照实施例3所述制备的培养物滤液上柱，然后先用平衡缓冲液洗涤柱子，再用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80+1.5M NaCl, pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 + 1M乙酸铵 + 6.5M丙二醇, pH7.3以90cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80, pH7.3进行1:10稀释，然后上样到填装有F25-琼脂糖的柱上(Thim等人., Haemophilia, 2009)。柱尺寸为直径1.6cm和床高2cm，柱体积4mL。上样前，柱子用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ +0.01% Tween80 + 150mM NaCl + 1M 甘油, pH7.3以180cm/h平衡。上样后，先用平衡缓冲液洗涤柱子，再用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 + 650mM NaCl, pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 + 2.5M NaCl + 50%(v/v)乙二醇, pH7.3以30cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂+ 0.01% Tween80, pH7.3进行1:15稀释，除了缺失a3结构域的FVIII-变体之外，其在相同缓冲液中进行1:45稀释。将稀释的合并液上样到填装有Poros 50HQ (PerSeptiveBiosystem)的柱子上，柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm，柱体积lmL。上样前，柱子用20mM咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 + 50mM NaCl + 1M甘油, pH7.3以300cm/h平衡。柱子用平衡缓冲液洗涤，然后用从平衡缓冲液至以下溶液的在5倍柱体积内的线性梯度洗脱：20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 + 1M NaCl + 1M甘油, pH7.3。合并含有FVIII的流分并将合并液贮存于-80℃直至使用。

基本上如上所述地纯化具有HIS-标签的FVIII分子，然而第二纯化步骤(F25-琼脂糖)替换为装有2倍柱体积的1M NiSO₄的螯合琼脂糖FF (GE Healtcare)。柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm，柱体积1mL。上样前，柱子用30mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80 +1.5M NaCl, pH7.3以180cm/h平衡。上样后，柱子用30倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，然后用在5倍柱体积内至以下溶液的线性梯度洗脱：250mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01% Tween80+ 1.5M NaCl, pH7.3。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑 + 10mM CaCl₂ + 0.01%Tween80, pH7.3进行1:30稀释。最终的纯化步骤(Poros 50HQ)如上所述地进行。

实施例14

通过显色测定法而测定的细胞培养收获物中的FVIII活性

在显色FVIII测定法中，使用Coatest SP试剂(Chromogenix)如下评价rFVIII化合物的FVI11活性(FVIII:C)：将rFVIII样品和FVIII标准品(Coagulation reference,Technoclone)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris、150 mM NaCl、1 % BSA, pH 7.3, 含防腐剂)中稀释。将50µl样品、标准品和缓冲液阴性对照加入到96孔微量滴定板(Spectraplates MB, Perkin Elmer)。所有样品都以1:100、1:400、1:1600和1:6400稀释度测定。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂按照5:1:3 (体积比)混合，并取75µl加入到孔中。在室温下孵育15 min之后，加入50µl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下孵育5 min，然后加入25 µl 1 M柠檬酸, pH3。在Envision微量滴定板读板器(Perkin Elmer)上测定在405 nm处的吸光度，并用在620nm处的吸光度用作参考波长。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。存在的FVIII相对于F8-500蛋白的收率见表1。

实施例15

通过显色测定法而测定的纯化样品中的FVIII活性

在显色FVIII测定法中，使用Coatest SP试剂(Chromogenix)如下评价rFVIII化合物的FVI11活性(FVIII:C)：将rFVIII样品和FVIII标准品(例如，针对来自NIBSC的第7次国际FVIII标准品而标定的纯化的野生型rFVIII)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris、150 mMNaCl、1 % BSA、pH 7.3、含防腐剂)中稀释。将50µl样品、标准品和缓冲液阴性对照加入到96孔微量滴定板(Nunc)，一式两份。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂按照5:1:3 (体积比)混合，并取75µl加入到孔中。在室温下孵育15 min之后，加入50µl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下孵育10 min，然后加入25 µl 1 M柠檬酸, pH 3。在Spectramax微量滴定板读板器(Molecular Devices)上测定在415 nm处的吸光度，并用在620 nm处的吸光度用作参考波长。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经HPLC测得的蛋白质浓度而计算比活。对于HPLC，通过将色谱图中对应于轻链的峰下面积积分确定样品浓度，并与在野生型rFVIII的平行分析中的相同峰的面积比较，其中通过氨基酸分析确定浓度。结果见表1。

实施例16

通过一期凝血测定法(one-stage clot assay)而测定的纯化样品中的FVIII活性

在一期凝血测定法中，如下所述地进一步评价rFVIII化合物的FVIII活性(FVIII:C)：将rFVIII样品和FVIII标准品(例如，针对来自NIBSC的第7次国际FVIII标准品而标定的纯化的野生型rFVIII)在HBS/BSA缓冲液(20 mM hepes、150 mM NaCl, pH 7.4，含1% BSA)中稀释至大约10 U/ml，接着在含有VWF的FVIII-缺乏的血浆(Dade Behring或Siemens)中进行10倍稀释。随后将样品在HBS/BSA缓冲液中稀释。使用单因素程序，在ACL300R或ACL9000仪器(Instrumentation Laboratory)上测量APTT凝血时间。含有VWF的FVIII-缺乏的血浆(Dade Behring或Siemens)用作测定血浆，并将SynthASil (HemosIL^TM,Instrumentation Laboratory)用作aPTT试剂。在凝血仪器中，将稀释的样品或标准品在37℃与FVIII-缺乏的血浆、aPTT试剂混合。测定氯化钙并通过浊度确定至凝血形成的时间。基于FVIII标准品稀释物的凝血形成时间的标准曲线，计算样品中的FVIII活性。结果见表1。

表1: 不同的BDD FVIII分子(“His-标记的”以便更容易纯化)的收率和比活。

实施例17

编码VWF片段的表达载体的构建

通过聚合酶链式反应(PCR)，使用质粒pLC095作为模板(质粒pLLC095描述于实施例26)，产生DNA片段，其编码VWF信号肽、接着是不同的C-末端截短的形式、VWF D’结构域和VWF D3结构域、Ala-Leu-Ala间隔基和HPC4标签。在所有PCR反应中，引物JP1000用作正向引物，连同反向引物JP1001- JP1008，见表2。

表2

正向引物	正向引物序列(5’-3’)
		JP1000 VWF-HindIII S	CTAAGCGTAAGCTTGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGG (SEQ ID NO 23)
反向引物	反向引物序列(5’-3’)
		JP1001 VWF 764-828	TGGTCCTCAGCTAGCGCGGGACACCTTTCCAGGGCCACAC (SEQ ID NO 24)
JP1002 VWF 764-865	TGGTCCTCAGCTAGCGCGGCATCACACACATGGTCTGTGC (SEQ ID NO 25)
		JP1003 VWF 764-1035	TGGTCCTCAGCTAGCGCTCTGGTGTCAGCACACTGCGAGCTC (SEQ ID NO 26)
JP1004 VWF 764-1041	TGGTCCTCAGCTAGCGCTGAGTCCAGAGGCACTTTTCTGG (SEQ ID NO 27)
		JP1005 VWF 764-1045	TGGTCCTCAGCTAGCGCGGTGGCAGGGGATGAGTCCAGAG (SEQ ID NO 28)
JP1006 VWF 764-1250	TGGTCCTCAGCTAGCGCGGCATCTGTGGGAGGCACCACC (SEQ ID NO 29)
		JP1007 VWF 764-1261	TGGTCCTCAGCTAGCGCGTCCTCCACATACAGAGTGGTG (SEQ ID NO 30)
JP1008 VWF 764-1268	TGGTCCTCAGCTAGCGCATCGTGCAACGGCGGTTCCGAG(SEQ ID NO 31)

使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，将PCR产物用HindIII和NheI消化，随后克隆到经HindIII和NheI消化的pJSV164载体中。pJSV164是基于pTT5的表达载体(Yves Durocher, CNRC, Montreal, Canada)，其含有CD33信号肽和HPC4标签。用HindIII和NheI消化pJSV164，去除了CD33信号肽并允许将目标基因与HPC4标签在读框内克隆，以产生编码C-末端HPC4标记的目标基因的表达盒，其中目标基因和HPC4标签被Ala-Leu-Ala接头肽间隔开来。将连接反应物转化Top10细胞(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA)。

所得8个质粒命名如表3。所产生的蛋白质的氨基酸序列概述于SEQ ID NO 4、5、6、7、8、11和16。

表3

载体名称	插入序列
		pJSV343	VWF 764-828-HPC4 (SEQ ID NO 4)
pJSV344	VWF 764-865-HPC4 (SEQ ID NO 5)
		pJSV345	VWF 764-1035-HPC4 (SEQ ID NO 6)
pJSV346	VWF 764-1041-HPC4 (SEQ ID NO 7)
		pJSV347	VWF 764-1045-HPC4 (SEQ ID NO 8)
pJSV348	VWF 764-1250-C1099/1142S-HPC4 (SEQ ID NO 11)
		pJSV349	VWF 764-1261-C1099/1142S-HPC4 (SEQ ID NO 14)
pJSV350	VWF 764-1268-C1099/1142S-HPC4 (SEQ ID NO 15)

实施例18：

编码VWF片段的表达载体的构建(2)

通过连接非依赖性克隆(LIC)，使用pJSV348 (参见实施例17)作为模板，产生了3个额外的HPC4标记的截短的VWF变体。3次独立PCR反应在pJSV438上进行，使用表4中所示的引物。

表4

这3个PCR片段VWF(864-1250)-HPC4、VWF(764-1128)-HPC4和VWF(764-1198)-HPC4在大小上分别为5685/5610/5817 bp。PCR片段经DpnI处理后除去甲基化模板DNA。随后从凝胶上纯化PCR片段并通过LIC自我连接，使用In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech,Mountain View, CA, USA)以产生环状DNA片段，然后转化到Top10细胞(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA)。

所得3个质粒的名称见表5。所产生的蛋白质的氨基酸序列概述于SEQ ID NO 12、9和10。

表5

载体名称	插入序列
		pJSV405	VWF(864-1250)-C1099/1142S-HPC4单体(SEQ ID NO 12)
pJSV406	VWF(764-1128)-C1099S-HPC4单体(SEQ ID NO 9)
		pJSV407	VWF(764-1198)-C1099/1142S-HPC4单体(SEQ ID NO 10)

实施例19：

VWF片段的瞬时表达

密度为0.9 – 1.1 x 10⁶细胞/ml的人胚肾293 6E悬浮细胞用编码VWF片段的质粒(0.7 mg/l或1.0 mg/l)和转染剂293Fectin (Invitrogen) (1.0 ml/l或1.4 ml/l)的复合物转染。通过分别稀释质粒和转染剂，将这两种溶液混合并在室温下将混合物孵育20分钟，制备转染复合物。将复合混合物加入到细胞悬液中并将悬液在振荡器培养箱中在36.5℃或37℃和5%或8% CO₂中孵育5天。将细胞培养收获物在0.22µm膜滤器上过滤并用于按照实施例22所述进行VWF片段纯化。

实施例20：

VWF片段的二聚体形式的制备

在天然全长VWF分子(SEQ ID NO 22)中，认为在分子的N-末端部分的2个半胱氨酸残基参与VWF的二聚化和/或多聚化：Cys1099和Cys1142。

在序列(SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO20和SEQ ID NO 21)的所有单体片段中，两个半胱氨酸残基(Cys1099和Cys1142)突变为其它氨基酸残基，使得所表达的分子不能形成二聚体/多聚体。通过使Cys 1099突变为另一氨基酸残基，产生SEQ ID NO 9的单体片段。

在某些情况下，想要VWF片段的二聚体形式。这可以以若干方式来实现：

实现二聚体形成的一种方法是使位置1099和位置1142的两个残基保持为半胱氨酸。为了制备重组二聚体分子，编码所需VWF片段的cDNA包括VWF的前序列，例如VWF的D1D2序列(SEQ ID NO 22的氨基酸残基23-763)。在高尔基体中加工期间，这将会对齐指定VWF片段的两个单体，其构型允许用两个二硫键形成二聚体分子，其中单体1中的Cys1099与单体2中的Cys1099连接，而单体1中的Cys1142与单体2中的Cys1142连接。

实现二聚体形成的另一种方法是避免包括前序列(SEQ ID NO 22的氨基酸残基23-763)和仅允许具有位置1099和1142的Cys的重组VWF片段形成二聚体分子。这在原则上可以产生一系列不同的二聚体，例如：

Cys1099-Cys1099/Cys1142-Cys1142 (两个二硫键 – 如上)

Cys1099-Cys1142/Cys1099-Cys1142 (两个二硫键)

Cys1099-Cys1099 (一个二硫键)

Cys1142-Cys1142 (一个二硫键)

Cys1099-Cys1142 (一个二硫键)

实现二聚体形成的再一种方法可以是用其它氨基酸残基(例如，丝氨酸、精氨酸)取代半胱氨酸残基1099或1142中的一个。

如果Cys1099被非-半胱氨酸残基取代，则所述分子可以通过在单体1中的Cys1142与单体2中的Cys1142之间建立二硫键而形成二聚体。

如果Cys1142被非-半胱氨酸残基取代，则所述分子可以通过在单体1中的Cys1099与单体2中的Cys1099之间建立二硫键而形成二聚体。

用或不用VWF的D1D2前序列(SEQ ID NO 22的氨基酸残基23-763)，都可构建上述二聚体形式。

不同的单体形式和二聚体形式在与FVIII结合、生产的容易性、和对FVIII生物利用度的影响(当共同配制并经皮下注射时)方面具有不同性质。

实施例21：

使用竞争ELISA，评价VWF和VWF片段与FVIII的结合

为了研究不同的VWF片段与FVIII的结合，使用以下方法。简而言之，用人VWF包被微量滴定板并在4℃孵育过夜。封闭后，将含有预孵育的FVIII (1nM)和VWF/VWF-片段的溶液加入到板中，然后用生物素化抗FVIII抗体和链霉抗生物素-过氧化物酶S-POD (1:20000)进行检测。在450/620nm处测定吸光度。IC50值见表6。

表6:

化合物编号	结构域/注释	VWF片段序列	衍生自SEQ ID NO	IC50 (Ki)
					2304	TIL’E’	VWF(764-865)-ALA-HPC4单体	5	2.0 µM
2306	TIL’/E’/VWD3 II	VWF(764-1041)-ALA-HPC4单体	7	2.2 µM
					2307	TIL’/E’/VWD3 III	VWF(764-1045)-ALA-HPC4单体	8	2.0 µM
2308	TIL’/E’/D3 I	VWF(764-1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	11	12 nM
					2309	TIL’/E’/D3 II	VWF(764-1261)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	14	10 mM
2310	TIL’/E’/D3 III	VWF(764-1268)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	16	15 nM
					0170	TIL’/E’/D3/A1 III	VWF(764-1464)-C1099/1142S-HPC4单体	19	12 nM
0194	TIL’/E’/D3/A1 III	VWF(764-1464)-C1099S-HPC4单体	19	8.0 nM
					0240	TIL’/E’/D3/A1 III二聚体	VWF(764-1464)-HPC4二聚体	19	0.7 nM
					0001	D3 I	VWF(864-1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	12	20 µM
0003	TIL’/E’/VWD3/C8-3/TIL-3	VWF(764-1198)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	10	28 nM
0314	血浆衍生的全长VWF	VWF (764-2813)	22	1.1 nM

不同片段之间的FVIII结合的这些差异能够指示共同配制的经皮下给予的FVIII的不同效果。IC50值也用于确定共同配制混合物中的最佳VWF和FVIII浓度。

实施例22：

HPC4-标记的VWF片段的纯化和表征

克隆和表达了一些VWF片段，其具有C-末端HPC4标签：EDQVDPRLIDGK (SEQ ID NO37)。有时将具有ALA序列的额外接头引入VWF片段和HPC4标签之间。克隆、表达和细胞培养后，向细胞培养基中加入CaCl₂至终浓度1mM。使培养基通过抗HPC4柱。该柱用20mM HEPES、100mM NaCl、1mM CaCl₂, pH=7.5平衡。细胞培养基上样后，将柱子用20mM HEPES、1M NaCl、1mM CaCl₂, pH=7.5洗涤，随后HPC4-标记的VWF片段用20mM HEPES、100mM NaCl、5mM EDTA,pH=7.5洗脱。向来自抗HPC4柱的合并液中加入3倍体积的水以降低电导率并上样到Mono Q柱。上样之前，将Mono Q柱用20mM HEPES、100mM NaCl、5mM EDTA, pH=7.5平衡。Mono Q柱用20mM HEPES、100mM NaCl, pH=7.5洗涤，VWF片段用从100mM NaCl至2M NaCl的20mM HEPES、10mM CaCl₂, pH=7.5的梯度洗脱。

纯化的蛋白经以下方法表征：1) SDS-凝胶电泳，2)分析型HPLC，和3) 氨基酸序列分析。

无标记的VWF片段的纯化和表征

克隆、表达和细胞培养后，使细胞培养基通过抗VWF柱。抗VWF抗体识别VWF (SEQID NO 5)的氨基酸残基编号764-865。该柱用20mM HEPES、100mM NaCl, pH=7.5平衡。细胞培养基上样后，将柱子用20mM HEPES、1M NaCl, pH=7.5洗涤，随后VWF片段用50mM乙酸、100mM NaCl, pH=4.0洗脱。将来自抗VWF柱的合并液调节至 pH=7.5并上样到Mono Q柱。上样之前，将Mono Q柱用20mM HEPES、100mM NaCl、pH=7.5平衡。Mono Q柱用20mM HEPES、100mM NaCl, pH=7.5洗涤，VWF片段用从100mM NaCl至2M NaCl的20mM HEPES, pH=7.5的梯度洗脱。

纯化的VWF片段经以下方法表征：1) SDS-凝胶电泳，2)分析型HPLC，和3) 氨基酸序列分析。

实施例23：

通过使用等温滴定量热法，评价VWF片段与VWF的结合

所有蛋白样品在50 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl、10 mM CaCl₂缓冲液中透析。每次iTC实验都包括用FVIII (大约250 µL)填充iTC池并注射VWF变体(大约40 µL)。温度按需要来设定，允许在指定实验条件下平衡蛋白样品(大约10分钟)。典型地，向含有FVIII的池中注射17 – 20次(2 – 2.5 µL) VWF变体。第一次注射通常为0.2 µL并将其从最终数据分析中弃去，以负责平衡步骤期间的扩散。搅拌速度设定在700 – 1000 rpm。数据采集的过滤周期为5秒，按照高反馈模式设定。每次滴定间隔120秒。进行合适的对照实验。原始数据经处理以设定基线并积分以获得最终的等温线。将该结合等温线拟合到单位点模型，得到K_d、化学计量学(n)、ΔH和ΔS值，以完成与FVIII结合的VWF变体的表征。结合等温线的实例见图9。这些数据被用于确定共同配制并经皮下给予的FVIII和VWF片段的最佳浓度。

实施例24

在FVIII敲除小鼠中的皮下给予

试验化合物制备如下：将试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5mg/ml L-组氨酸、0.1 mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl2, pH ~7.3中。对于含有VWF或VWF片段的试验制剂而言，计算在共同配制中的VWF所结合的% FVIII，使用以上实施例21(表6)所述的可得的IC50 (Ki)值，假定K_i=K_d或如实施例23中所述而得到的K_d值。

FVIII KO小鼠(在C57Bl/6和SV129的混合背景中外显子16敲除，在Taconic M&B(B6.129S4-F8tm1Kaz/J)繁育，体重大约22 g)，在侧面经皮下给予FVIII以及不同的蛋白质，每种测试化合物6-9只小鼠。剂量体积为5ml/kg或0.25ml/kg，如果表7中指明的话。

在稀疏的采样方案中，在从0至96小时的9个时间点采集血液样品，n= 2-3只小鼠/时间点，每只小鼠采集3份血液样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛麻醉小鼠。45 µl血液用5 µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µl FVIII Coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1% BSA、环丙沙星10 mg/L, pH 7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将上清液立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

按照Ovlisen K等人. J. Thromb. Haemost, 2008, 6：969-975所述，并在FVIIILOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品的FVIII显色活性。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用先前在FVIII KO小鼠品系中的N8或N8-GP的经静脉内药代动力学研究，评价生物利用度。

试验化合物的经皮下FVIII生物利用度见下表7和图7和8。

表7. 一系列不同的FVIII分子和FVIII/VWF片段共同配制并经皮下给予FVIII k/o小鼠所得的FVIII生物利用度值。左栏“FVIII”是指本实验所用的FVIII化合物。标为“FVIII剂量”的一栏是指本实验中所用的FVIII剂量(IU/kg)，标为“共同配制蛋白”的一栏是指本实验所用的共同配制的蛋白(如果有的话)。标为“摩尔比”的一栏是指共同配制中的FVIII与蛋白的摩尔比。标为“FVIII饱和度”的一栏是指在实验所用浓度时与共同配制的蛋白结合的FVIII的计算部分。标为“F%”的一栏是指实验中得到的FVIII的生物利用度。

与VWF片段共同配制的FVIII的经皮下生物利用度看来依赖于共同配制中的FVIIIVWF结合部位的饱和度，而不是VWF片段长度。最短的VWF片段(其中达到>80%的FVIII饱和度)是764-865 – 该配制显示出FVIII生物利用度为4.3% (对VWF片段而言的34摩尔过量的N8/turoctocog alfa)。在有关饱和度的类似条件下所测的最长VWF片段是764-1464片段，其导致FVIII生物利用度为7.3%。764-1464的二聚体形式以0.25ml/kg的较低体积给予，导致FVIII生物利用度为8.4%。

短于764-1250的片段(其不含完整D3区)与FVIII结合的IC50 (K_i)大于较长片段。因此，FVIII和短于764-1250的VWF片段的1比1摩尔的配制表现出较低的FVIII生物利用度，即为小于4%。

因此可以得到本发明VWF片段的经皮下FVIII生物利用度的改善效果，即通过FVIII VWF结合部位的VWF-片段的饱和。因此，具有相对低FVIII结合亲和力的短VWF片段应当以高于具有较好的FVIII结合性能的较长VWF片段的比例来使用，以得到高度的生物利用度。

当与764-1464 VWF片段共同配制时，衍生自全长序列的FVIII (Kogenate^®)表现出与具有截短的B结构域的FVIII (turoctocog alfa/N8)相同程度的生物利用度。这表明高FVIII生物利用度不依赖于与turoctocog alfa/N8的共同配制，而依赖于VWF片段的存在。

FVIII (turoctocog alfa/N8)与全长血浆衍生的人VWF的共同配制，导致FVIII生物利用度为大约0%，由此证明仅VWF片段能够增强FVIII的生物利用度。全长VWF缺乏效果的原因可能是因为A3结构域中的胶原结合部位的存在，其可导致结合和捕获。因此，本发明的优选的VWF片段不包含A3结构域。或者或另外，全长VWF的多聚化能力产生大的多聚体，其因复合物的尺寸而限制了系统吸收。数据表明比表7中测试的那些更长的VWF片段(优选无A3结构域)对FVIII生物利用度亦将具有相同的有益效果。

血清白蛋白不改善FVIII (turoctocog alfa/N8)的经皮下生物利用度。因此，在FVIII配制中的额外蛋白的存在看来不增加FVIII的经皮下生物利用度，除非该蛋白是本发明的VWF片段。

VWF剂量对FVIII经皮下生物利用度而言并非至关重要，正如在FVIII:VWF片段的摩尔比在1:1和1:7.7时所观察到的。因此，达到高FVIII生物利用度的关键性因素看来是与VWF片段的高度的FVIII饱和度(结合)。在包括N8的计算饱和度为至少86.8%的这些实验中的所有组合物因此都得到类似的生物利用度。本发明的VWF片段因此可以在皮下注射部位保护FVIII。

具有226个氨基酸(aa) B结构域的FVIII (SEQ ID NO 3)，表现出比turoctocogalfa/N8更高的经皮下FVIII生物利用度。然而，这种具有226个aa B-结构域的FVIII的生物利用度可比得上turoctocog alfa/N8，当与VWF-片段764-1464 (TIL’/E’/D3/A1)单体一起经皮下共同给予时。因此，可以推断，当经血管外给予它们时，在226 aa B-结构域中的额外氨基酸(与turoctocog alfa/N8相比)可以保护FVIII的清除部位，意味着这样的FVIII分子可用于经皮下给予(有或无本发明的VWF)。

FVIIIK1804C-HEP157，表现出生物利用度为50% (当与VWF-片段764-1464 (TIL’/E’/D3/A1)单体共同给予时)和生物利用度为27% (当单用时)。PSA40Kd-O-聚糖-N8，表现出生物利用度为8.8% (当与VWF-片段764-1464 (TIL’/E’/D3/A1)单体共同给予时)和6.11%(当单用时)。因此可以推断，FVIII分子与Heparosan聚合物和/或聚唾液酸聚合物的缀合在皮下组织保护FVIII免于分解/摄取或者增强经皮下的吸收。Heparosan比唾液酸聚合物在增强经皮下生物利用度上更有效。当与VWF片段共同给予时，这两种FVIII变体都表现出更高的生物利用度。

N8-GP和FVIIIK1804C-HEP157 + 764-1464 (TIL’/E’/D3/A1)单体和二聚体，导致得到最高的生物利用度。因此可以通过增加共同配制中的剂量或浓度，而增加N8-GP的生物利用度。在所有剂量中，剂量体积是5ml/kg，因此在剂量溶液中的N8-GP浓度在20000 IU/kg中比在10000IU/kg中高2倍。这分别导致28%和19%的生物利用度。

764-1464二聚体VWF片段不含任何突变。764-1464二聚体VWF片段与Turoctocogalfa和N8-GP结合更强(表6)，但导致的FVIII生物利用度类似于所述片段的单体形式。这表明取代本发明的VWF片段中的Cys1099和/或Cys1142不影响FVIII的生物利用度。另外，VWF片段与N8-GP的结合亲和力不影响对N8-GP的生物利用度的效果，只要在共同配制中超过80%的FVIII分子与VWF片段复合。另外，因为VWF片段764-1464的二聚体形式改善了生物利用度，所以，所需VWF片段的最大分子量可以是等于或大于158.8 KDa。

N8-GP与透明质酸酶的共同配制不增加FVIII生物利用度，表明皮下组织中的胞外基质中的透明质酸酶网络不阻碍FVIII进入血流。同样，以在体内抑制凝血酶活性的水平给予的水蛭素不影响N8-GP生物利用度。FVIII的凝血酶活化因此看来不影响经皮下FVIII生物利用度。

抗体4F30 (在WO2012035050中进一步表征)(其与C1结合并抑制FVIII的细胞摄取)不改善N8-GP的生物利用度。在该配制中，将2000 IU/ml N8-GP与1 mg/ml 4F30共同配制，这意味着在体内稀释后99.6% FVIII与mAb结合，假定K_d为0.6 nM，体内稀释20x，FVIII(turoctocog alfa/N8)的分子量为170000 g/mol，对于turoctocog alfa/N8的比活为10000 IU/mg，4F30的分子量为150000 g/mol。另外，具有K2092A+F2093A突变的聚乙二醇化FVIII表现出减少的细胞摄取，但与N8-GP相比，所述突变不改善生物利用度。因此对细胞FVIII摄取的抑制看来不是共同配制的VWF片段导致FVIII经皮下生物利用度增加的机制。

实施例25：

在新西兰白兔中的皮下给予

将试验化合物配制在18 mg/ml NaCl、3 mg/ml蔗糖、1.5 mg/ml L-组氨酸、0.1mg/ml聚山梨酯80、0.25 mg/ml CaCl₂, pH ~7.3中。对于含有VWF或VWF片段的试验配方而言，使用可得的IC50值(表6)，假定IC50=K_i=K_d，计算VWF所结合的% FVIII。

体重大约2-3 kg的雌性新西兰白兔用于研究。让动物自由进食和饮水。兔子在大腿上经皮下给予FVIII以及不同蛋白，每种测试化合物4-5只兔子。剂量体积为0.2ml/kg或1ml/kg。

在从0至96小时的11个时间点采集血液样品，n= 4-5只兔子/时间点。在每个采样时间点，使用21G针头和EDTA包被的管，从耳动脉采集1ml血液。将各管在采血后10分钟内在4000 G离心5分钟并分离血浆。将样品立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。在FVIII LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中，通过FVIII抗原分析，使用2种FVIII轻链抗体(4F45和4F11)，分析样品。

通过非室分析来分析平均血浆浓度与时间数据，使用WinNonlin Phoenix(Pharsight Corporation)评价指定的药代动力学参数。使用经静脉内给予兔子的FVIII(turoctocog alfa/N8)和N8-GP的药代动力学，评价生物利用度。

所得生物利用度见表8。

表8:

FVIII	FVIII剂量/剂量体积	共同配制蛋白	共同配制蛋白:FVIII的摩尔比	FVIII对共同配制的蛋白的饱和度(%)	F%
						FVIII (turoctocogalfa/N8) +VWF	2000/0.2ml/kg	TIL’/E’/D3/A1	3	99	6.2
N8-GP	700/0.2ml/kg	-	-	-	40
						N8-GP+VWF	700/0.2ml/kg	TIL’/E’/D3/A1	3	99	59
N8-GP+VWF	500/ 1ml/kg	TIL’/E’/D3/A1	3	82	34

剂量体积为0.2ml/kg的N8-GP和与VWF片段TIL’/E’/D3/A1共同配制的N8-GP的兔子经皮下生物利用度分别为40和59%。剂量体积为1 ml/kg的N8-GP + VWF的生物利用度为34%。N8-GP的生物利用度因此可以受到种类或者受到剂量体积(在小鼠中为5ml/kg，在兔子中为0.2ml/kg或1ml/kg)的差异的影响。相对于人类，0.2 ml/kg是最接近的给药体积。与VWF片段TIL’/E’/D3/A1共同给予的FVIII (turoctocog alfa/N8)在兔子中表现出与在小鼠中类似的生物利用度，尽管给予浓度更高。

实施例26：

编码VWF片段的表达载体的构建

由pZEMHygro载体以及包含野生型人VWF cDNA的插入序列组成的质粒#796用作起点，用于产生表达截短的人VWF蛋白的DNA构建体。

通过聚合酶链式反应(PCR)，使用质粒#796作为模板，正向引物oLLC089 VWF正向和反向引物oLLC092 VWF A1 HPC4反向，产生DNA，其编码VWF信号肽、接着是VWF TIL’E’结构域、VWF D3结构域、VWF A1结构域和HPC4标签。这些引物分别含有Nhe I和Not I限制位点。将所得PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。从这里，用Nhe I和Not I限制酶切割VWF(TIL’/E’/D3/A1)-HPC4编码DNA并插入到已用同样限制酶消化的pZEM219b中。因此，建立了pLLC089构建体，其由pZEM219b以及编码VWF(TIL’/E’/D3/A1)-HPC4的插入序列组成。

通过pLCC089的定点诱变，使用QuikChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene)和oLLC101-f、oLLC102-r、oLLC103-f和oLLC104-r诱变引物，引入核苷酸取代，导致pLLC089编码的VWF VWF(TIL’/E’/D3/A1)-HPC4蛋白中的氨基酸取代C1099/1142S。定点诱变产生pLLC095载体，其由pZEM219b以及编码VWF (TIL’/E’/D3/A1)C1099/1142S-HPC4的插入序列组成。

表9：用于产生VWF片段编码DNA构建体的寡核苷酸引物

实施例27：

表达VWF片段的稳定的细胞系

在含10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基上生长的幼仓鼠肾(BHK)细胞，用pLL095转染，使用Genejuice转染试剂(Merck)。通过用1.5 μM甲氨蝶呤选择，产生转染的细胞库，得到产生VWF (TIL’/E’/D3/A1)C1099/1142S-HPC4的非克隆的BHK细胞系。将细胞接种在生物发酵器中，并且如实施例22所述，从细胞培养上清液中纯化VWF (TIL’/E’/D3/A1)C1099/1142S-HPC4蛋白。

通过电穿孔，用pLLC095转染在悬浮液中生长的CHO-DUKX-B11悬浮细胞。通过在无核苷培养基中适应生长，产生转染的细胞库。随后，所述库在100 mM甲氨蝶呤存在时适应生长，得到产生VWF (TIL’/E’/D3/A1)C1099/1142S-HPC4的非克隆的CHO-DUKX-B11细胞系MBML001。将细胞接种在生物发酵器中，并且如实施例22所述，从细胞培养上清液中纯化VWF(TIL’/E’/D3/A1)C1099/1142S-HPC4蛋白。

实施例28：

VWF片段保护FVIII以免被细胞摄取

在人单核细胞衍生的巨噬细胞或树突细胞(两者均为抗原呈递细胞)或U87 MG细胞中，评价了血浆衍生的(pd) VWF和VWF片段对FVIII细胞摄取的作用。U87 MG细胞得自ATCC (HTB-14)。将细胞在补充有10%热灭活FCS的EMEM中，在纤连蛋白-包被的24-孔板上，在37℃在5% CO₂中培养48小时。细胞用缓冲液A (10 mM HEPES、150 mM NaCl、4 KCl、11 mM葡萄糖, pH 7.4)仔细洗涤并与缓冲液B (补充有5 mM CaCl₂和1 mg/ml BSA的缓冲液A)一起孵育15分钟。将放射性标记的FVIII (¹²⁵I-FVIII, 终浓度1 nM)单独孵育或与不同浓度的pdVWF (American Diagnostica, 终浓度0.001 nM – 50 nM，根据单体含量)或TIL’/E’/D3/A1 (终浓度0.25 nM – 500 nM或1000 nM)预混合10分钟，然后加入到U87 MG细胞中并与细胞在37℃孵育1小时，以允许结合和内在化。随后细胞用冰冷的缓冲液B洗涤3次。通过将细胞在含有100 µg/ml胰蛋白酶、50 µg/ml蛋白酶K、5 mM EDTA (pH 7.4)的PBS中在冰上孵育1小时，切去表面结合的蛋白。将脱附的细胞转移至管中并离心以沉淀细胞。将表现出细胞结合FVIII的上清液转移至新管中。在gamma计数器中定量测定具有上清液(结合的FVIII)和细胞沉淀物(内在化的FVIII)的各管中的放射性，并且基于¹²⁵I-FVIII，使用标准曲线，计算FVIII浓度值。在VWF不存在时的结合的¹²⁵I-FVIII设定为100%。

根据制造商的说明书，使用磁性抗CD14-珠(Miltenyi Biotec)和MACS柱(Miltenyi Biotec)，通过磁性分离，从血沉棕黄层中分离的单核细胞中，分化出树突细胞和巨噬细胞。将单核细胞(0.5×10⁶细胞/ml)接种在T-75组织培养瓶中并在含有10% FBS、1%青霉素/链霉素和3.3 ng/ml M-CSF (R&D Systems)的IMDM培养基(GIBCO)中培养，以便将细胞分化为巨噬细胞。培养3天后加入额外的3.3 ng/ml M-CSF。或者，可通过用40 ng/mlGM-CSF (R&D Systems)和40 ng/ml IL-4刺激5天，将单核细胞分化为树突细胞。将树突细胞在缓冲液B中洗涤并移入低结合的Nunc管中，0.5 ×10⁶细胞/管。加入荧光标记的FVIII，例如，Oregon-Green FVIII (例如，30和100 nM)并在37℃孵育1小时。将细胞洗涤1次并通过流式细胞术分析，使用LRS Fortessa仪器(BD)。巨噬细胞在培养6天后用PBS洗涤，并在4℃与含有5% FCS的2.5 mM EDTA的PBS孵育10-20分钟，以使细胞脱附。将巨噬细胞(7×10⁵/well)接种在纤连蛋白-包被的96孔玻璃底组织培养板(Perkin Elmer ViewPlate Black)。接种后24小时，将细胞用缓冲液B洗涤1次，然后单独或在增加浓度(15-240 nM)的pdVWF(American Diagnostica)或TIL’/E’/D3/A1存在时加入30 nM荧光标记的FVIII (例如，OregonGreen-FVIII)。将巨噬细胞在37℃孵育1小时。随后，将细胞用缓冲液B洗涤2次，以去除非内在化材料，然后加入含有2.5 µg/ml Hoechst33342 (Molecular Probes)的PBS，以观察细胞核。然后立即在Operetta®高内涵筛选系统(Perkin Elmer, Hamburg)上，以宽场荧光模式，使用20X高的NA物镜，对板成像。每孔成像10个视野并进行分析。在Harmony®软件中的图像分析方法是根据统计核(Hoechst通道)，然后结构分析(FVIII通道)，使用“findparticle”方法，以测定小泡的FVIII。根据核碎片和/或FVIII与质膜的过量结合，从分析中去掉死亡或凋亡细胞。为了定量测定内在化的FVIII，计算小泡FVIII信号的积分的荧光强度并针对时间作图。

对U87 MG细胞和巨噬细胞的FVIII结合和内在化的抑制的IC50值见表10。pdVWF和TIL’/E’/D3/A1两者都能抑制这两种细胞类型的FVIII细胞结合/摄取，只要使用足够高的浓度。

因为抗原呈递细胞的摄取是将FVIII呈递给免疫系统的初始步骤，所以数据可表明在FVIII与VWF片段共同配制后可以实现降低的免疫应答。

表10. pdVWF和TIL’/E’/D3/A1片段对U87 MG细胞的FVIII结合和内在化以及巨噬细胞的摄取的作用。

实施例29:

在皮下给予后，与VWF变体共同配制的FVIII化合物的功效：

将FVIII缺乏的、FVIII-KO小鼠(12-16周龄，雄性和雌性)分为3组，每组12只动物。在每组中，8只动物经历尾巴出血和4只动物平行使用，用于离体功效测试，使用ROTEM分析。

在尾巴横切前24小时，经皮下给予糖聚乙二醇化FVIII或溶媒。作为阳性对照，在损伤前5分钟，经静脉内给予糖聚乙二醇化FVIII。皮下注射在颈部进行，静脉内注射在侧尾静脉进行。剂量体积为5 ml/kg。

将糖聚乙二醇化FVIII在缓冲液(10 mM L-组氨酸、8.8 mM蔗糖、0.01 %聚山梨酯80、308 mM NaCl、1.7 mM CaCl₂ (二水合物)、0.01%聚山梨酯80 0.1 mg/ml, pH 6.9)中制备为40和500 U/ml的浓度并贮存于-80℃直到使用。

在尾巴横切前，小鼠用异氟烷麻醉并放在加热垫上。将尾巴放在37℃预热的盐水中10 min。在距离尾尖4 mm处切断尾巴。

就在切断尾巴之前从眼眶周丛抽取20 µl血液样品，用于FVIII测定。

在30 min内采集血液并通过分光光度法在550 nm处测定血红蛋白浓度。

平行动物用于血液采样和它们的凝血参数的后续分析(离体功效)。用20 µL毛细管从眼眶周丛抽取血液样品，无添加剂。将血液样品在0.13M柠檬酸钠中稀释1:10并小心混合并贮存于室温，并用于通过ROTEM进行立即血栓弹性成像。通过加入7 µL CaCl₂到小杯(StarTEM)中将血液样品再次钙化。然后，将105 µL血液加入到小杯中并混合。进行分析，直到达到最大振幅。

结果:

在皮下给予后24小时，在30min研究周期期间将血液损失与以下相比，确定经皮下给予FVIII的预防效果：1) 溶媒对照组和2) 用糖聚乙二醇化FVIII的经静脉内对照组。在经皮下给予糖聚乙二醇化FVIII组的血液损失与经静脉内给予的组的血液损失相当(图10，左图面)。测定凝血参数例如凝血时间的离体功效平行研究支持了血液损失数据(图10，右图面)。

结论是，经皮下给予FVIII看来具有止血活性，根据PK分布图和来自离体活性的结果。因此，与VWF片段共同配制的经皮下给予的FVIII被认为也具有止血活性，这可根据其药代动力学分布图来预测。

实施例30:

经皮下给予的FVIII ± VWF片段在FVIII-缺乏的小鼠中的效果。

试验化合物：将试验化合物在10 mM L-组氨酸(1.55 mg/ml)、8.8 mM蔗糖(3.0mg/ml)、308 mM NaCl (18 mg/ml)、1.7 mM CaCl2二水合物(0.25 mg/ml)、0.01%聚山梨酯80 (0.1 mg/ml), pH 7.3中制备。

动物：使用F8敲除(FVIII k/o)小鼠组(129/C57BL/6或C57BL/6, 外显子16已破坏)，进行实验。将12-18周龄，体重大约18 – 25克的动物包括在实验中。每组包括12-15只动物。

试验化合物的给予：试验化合物经皮下给予(或静脉内给予用于对照)，使用剂量体积最大为10 ml/kg (或5 ml/kg用于对照)。

出血模型：在完全异氟烷麻醉下用小鼠进行尾静脉横切(TVT)出血模型。简而言之，麻醉后，出血攻击包括在尾巴直径2.7 mm处的侧尾静脉的模板定向横切。将尾巴浸入37℃盐水，允许直观记录出血达60 min，其中在血液分离后，通过如“实施例3”所述测定血红蛋白浓度，测定血液损失。当可行和经调整后，采集血液样品，用于如上所述地评价血浆中的FVIII活性(FVIII:C)。

剂量反应：在TVT前，在指定时间点经皮下注射不同剂量的FVIII或与VWF片段共同配制的FVIII (例如，N8-GP/VWF)。包括了溶媒和静脉内对照组/治疗组，分别用于无效果和最大效果。

作用持续时间：经皮下注射FVIII或FVIII/VWF，以鉴定治疗后的延长的效果，即改进的出血表型。在给药后的若干时间点，例如24、48、72、96小时，进行TVT。

重复剂量：经皮下给予FVIII或FVIII/VWF片段，每天一次，共若干天。在不同的时间点进行TVT以评价出血表型中的任何改进。

数据处理和分析：在整个实验中物理地记录数据。然后，在GraphPad Prism第5版(GraphPad Software, Inc, CA, USA)分析之前使用MS Excel (Microsoft, WA, USA)汇集数据，用于分析。

实施例31:

经皮下FVIII ± VWF片段在其它FVIII-缺乏的物种中的效果。

在其它物种中进行额外的药效动力学实验，以证实在A型血友病的非鼠动物模型例如大鼠和狗中，在皮下给予后的效果。在评价离体效果之前，在诱导出血攻击之前，或作为治疗或预防自发出血的方法，经皮下注射FVIII或FVIII/VWF。

试验化合物：将试验化合物在10 mM L-组氨酸(1.55 mg/ml)、8.8 mM蔗糖(3.0mg/ml)、308 mM NaCl (18 mg/ml)、1.7 mM CaCl2二水合物(0.25 mg/ml)、0.01%聚山梨酯80 (0.1 mg/ml), pH 7.3中制备。

动物：在患有A型血友病的青春期大鼠(~12周龄)或狗(6+月龄)中进行实验。

试验化合物的给予：试验化合物经皮下给予(或静脉内给予用于对照)，使用剂量体积最大为10 ml/kg (或5 ml/kg，对于对照)。

狗的效果模型：在患有A型血友病的狗中，离体评价效果，使用替代标记，例如先前所述的血栓弹性成像(Knudsen等人, 2011；Haemophilia, 17, 962–970)，或在体内评价效果，例如按照所述(Scola等人, 2011；Ultrasound in Med. & Biol., 37(12), 2126–2132)，使用通过声力辐射力脉冲(acoustic force radiation force impulse，ARFI)超声而监测的标准化的出血攻击。能力允许，给予测试化合物以治疗自发出血的狗。通过评价临床表现的解决来监测效果，与经静脉内治疗的历史数据进行比较。

大鼠的效果模型：在患有A型血友病的大鼠中，离体评价效果，使用替代标记，例如如上所述用于小鼠和狗的血栓弹性成像，或者在体内评价效果，例如，使用如用于小鼠所述的标准化的出血攻击。能力允许，给予测试化合物以治疗自发出血的大鼠。通过评价临床表现的解决来监测效果，与经静脉内治疗的历史数据进行比较。

在其它物种中进行额外的药效动力学实验，以证实在A型血友病的非鼠动物模型例如大鼠和狗中，在皮下给予后的效果。

实施例32：

编码VWF片段的表达载体的构建

通过基于PCR的定点诱变，使用VWF 1099C S和VWF 1099C AS引物(表P)，引入核苷酸取代，产生实施例17中所述的pJSV348编码的VWF(764-1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4蛋白中的氨基酸取代S1142C。这产生pGB237载体，其由pTT5以及编码VWF(764-1250)-C1099S-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 11)的插入序列组成。位置1142的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述。

同样，通过基于PCR的定点诱变，使用VWF 1142C S和VWF 1142C AS引物(表P)，引入核苷酸取代，产生实施例17中所述的pJSV348编码的VWF(764-1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4蛋白中的氨基酸取代S1099C。这产生pGB238载体，其由pTT5以及编码VWF(764-1250)-C1142S-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 11)的插入序列组成。位置1099的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述。

以类似方式，将S1099C氨基酸取代引入实施例18中所述的pJSV406编码的VWF(764-1128)-C1099S-HPC4蛋白，得到pGB249载体，其由pTT5以及编码VWF(764-1128)-HPC4(SEQ ID NO 9)的插入序列组成。位置1099的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述。

经PCR扩增编码人VWF氨基酸1-1250的cDNA，使用质粒#796 (描述于实施例26)作为模板，正向引物JP1000 VWF-HindIII S (表2)，和反向引物JP1006 VWF764-1250 (表2)。引物JP1006 VWF764-1250含有Nhe I位点。将所得PCR产物插入到pCR4BLUNT-TOPO载体(Invitrogen)的Pme I限制位点的下游。从这里，用Pme I和Nhe I限制酶切割vWF(1-1250)编码DNA并插入到实施例17中所述的pJSV164中，产生pGB242载体，其由pTT5以及编码vWF(1-1250)-ALA-HPC4的插入序列组成。位置1099和1142的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述，并且前序列的蛋白水解去除将产生vWF(764-1250)-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 11)。

pJSV348的DNA序列(描述于实施例17)和构建体#796 (描述于实施例26)经PCR逆向扩增，使用重叠引物。扩增pJSV348序列，使用引物2764pJSV348和1202pJSV348R (表P)，同时扩增构建体#796序列，使用引物221#796F和3537#796R (表P)。从琼脂糖凝胶中切下来自pJSV348 (受体)和构建体#796 (供体)的扩增产物，并通过连接非依赖性克隆(LIC)将其连接在一起，使用In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech)，得到环状DNA，随后转化到Stellar感受态细胞(Clontech)。所得表达载体称为pGB252，是由PTT5以及编码VWF(1-1128)-ALA-HPC4的插入序列组成。位置1099的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述，并且前序列的蛋白水解去除将产生vWF(764-1128)-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 9)。

同样，使用pJSV348 (描述于实施例17)作为模板，使用引物2764pJSV348和1202pJSV348R (表P)进行扩增，并且使用#796 (描述于实施例26)作为模板，使用引物221#796F和3747#796R (表P)进行扩增，产生pJSV348 (受体)和构建体#796 (供体)扩增产物，其也从琼脂糖凝胶中切下来并通过连接非依赖性克隆(LIC)将其连接在一起，使用In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech)，得到环状DNA，随后转化到Stellar感受态细胞(Clontech)。所得表达载体称为pGB253，是由PTT5以及编码VWF(1-1198)-ALA-HPC4的插入序列组成。位置1099和1142的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述，并且前序列的蛋白水解去除将产生vWF(764-1198)-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 10)。

以类似方式，pJSV348的DNA序列(描述于实施例17)和构建体#796 (描述于实施例26)经PCR逆向扩增，使用重叠引物。扩增pJSV348序列，使用引物2764pJSV348和2420pJSV348R (表11)，同时扩增构建体#796序列，使用引物3666#796F和5203#796R (表P)。从琼脂糖凝胶中切下来自pJSV348 (受体)和构建体#796 (供体)的扩增产物，并通过连接非依赖性克隆(LIC)将其连接在一起，使用In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech)，得到环状DNA，随后转化到Stellar感受态细胞(Clontech)。所得表达载体称为pGB250，是由PTT5以及编码VWF(764-1873)-C1099/1142C-ALA-HPC4 (SEQ ID NO 20)的插入序列组成。

将从构建体#796 (描述于实施例26)扩增的人VWF cDNA序列合并，产生pLLC122载体，其由pZEM219b以及编码vWF (1-1464)-HPC4的插入序列组成。位置1099和1142的半胱氨酸允许蛋白二聚化，如实施例20所述，并且前序列的蛋白水解去除将产生vWF(764-1464)-HPC4 (SEQ ID NO 19)。

表11：用于产生VWF片段编码DNA构建体的寡核苷酸引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		VWF 1099C S	GGGGACTGCGCCTGCTTCTGCGACACC (SEQ ID NO 44)
VWF 1099C AS	GGTGTCGCAGAAGCAGGCGCAGTCCCC (SEQ ID NO 45)
		VWF 1142C S	GAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATA (SEQ ID NO 46)
VWF 1142C AS	TATAGCGCCACTCACACTCATACCCGTTC (SEQ ID NO 47)
		2764pJSV348F	GCGCTAGCTGAGGACCAAGTAGATCCGCGGCTCATTGATGGG (SEQ ID NO 48)
1202pJSV348R	GGGCCAGAGCAAGCAGCACCCCGGCAAATCTGGCAGG (SEQ ID NO 49)
		221#796F	CCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCC (SEQ ID NO 50)
3537#796R	TACTTGGTCCTCAGCTAGCGCCTGGGGGCACAATGTGGCCGTCCTCC (SEQ ID NO 51)
		3747#796R	TACTTGGTCCTCAGCTAGCGCCACTGGACAGTCTTCAGGGTCAACGC (SEQ ID NO 52)
2420pJSV348R	GGCTCAGGGTGCTGACACGTGACTTGACAGGCAGGTGC (SEQ ID NO 53)
		3666#796F	GCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCC (SEQ ID NO 54)
5203#796R	TACTTGGTCCTCAGCTAGCGCTGCAGGGGAGAGGGTGGGGATCTGC (SEQ ID NO 55)

实施例33

VWF片段抑制人树突细胞的FVIII摄取。

如实施例28所述，制备人单核细胞-衍生的树突细胞。通过流式细胞术控制树突细胞标记CD209和CD86的表达，使用LRS Fortessa仪器(BD)。将荧光标记的FVIII (Oregongreen- FVIII, 30 nM终浓度)与不同浓度的血浆衍生的VWF或VWF片段预混合，然后在37℃与树突细胞一起孵育1小时。活/死细胞试剂盒(Invitrogen # L10119, APC-Cy7)用于门控活树突细胞，并且定量测定该细胞群内的FVIII摄取。每一单个实验的数据经标准化处理。无VWF样品中的信号定义为100% FVIII摄取，而具有最高浓度的血浆衍生的VWF (240 nM，根据单体含量)的样品中的信号定义为0%。将来自3-5次实验的值合并并在Prism软件中使用非线性回归(log(抑制剂) vs. 反应 – 可变斜率(4个参数))计算IC50值。所得IC50值见表12。数据表明所有所测VWF片段都能抑制树突细胞的FVIII摄取，只要使用足够高的浓度。因为抗原呈递细胞的FVIII摄取是将FVIII呈递给免疫系统的初始步骤，所以数据表明FVIII与足够高浓度的VWF片段的共同配制可能具有降低FVIII的免疫原性的潜力。

表12. 血浆衍生的VWF和VWF片段对树突细胞的FVIII摄取的影响。

结构域/注释	VWF片段序列	IC50 (nM)*
			TIL’/E’/VWD3	VWF(764-1041)-ALA-HPC4单体	570 (400-820)
TIL’/E’/D3	VWF(764-1250)-C1099/1142S-ALA-HPC4单体	31 (25-39)
			TIL’E’/D3/A1单体	VWF(764-1464)-C1099/1142S-HPC4单体	31 (18-52)
TIL’E’/D3/A1二聚体	VWF(764-1464)-HPC4二聚体**	16 (11-22)
			血浆衍生的VWF	VWF (764-2813)	9.8 (7.6-13)

*)来自3-5次实验的数据的最佳拟合值和95%置信区间

**)基于二聚体的摩尔浓度的IC50值，意即将IC50乘以2，反映了基于VWF单体片段含量的IC50值。

实施例34:

在动物中的经皮下FVIII ± VWF片段的效果，使用针对FVIII的抑制性抗体。

目标是使用针对FVIII的抑制剂，评价药物组合物治疗A型血友病患者的潜力。我们将FVIII单用或与VWF片段共同配制，经皮下给予首次进行实验的FVIII-KO小鼠或FVIII-KO小鼠，其中在用所述组合物治疗前通过重复皮下或静脉内给予FVIII，或通过注射多克隆或单克隆抗FVIII抗体，而诱导抑制剂。在麻醉的小鼠中在侧尾静脉横切后评价治疗效果。将尾巴放在37℃预热的盐水中并观察出血达60分钟。实验期间的血液损失就是组合物效果的度量。

实施例35:

将VWF片段给予VWF敲除小鼠:

测试化合物：

鼠VWF片段TIL’/E’/D3/A1 1.829 nmol/ml, 0.015mg/ml

将测试化合物配制在20mM咪唑，150mM NaCl、0.02% Tween80、1.1M甘油、10 mMCaCl2, pH 7.3中

6只VWF敲除小鼠(体重大约25 g)在尾巴经静脉内给予9.48 nmol/kg鼠VWF片段TIL’/E’/D3/A1。

在稀疏的样品设计中，在给药前和在给药后0.08、0.33、0.5、1、2、4、7、18和24小时采集血液样品，每一时间点对2只小鼠采集样品。采血前用异氟烷/O₂/N₂O经由眼眶后丛麻醉小鼠。每只小鼠采集三个样品。血液(45 µl)用5 µl柠檬酸钠(0.13 M)稳定并加入200 µlFVIII coatest SP缓冲液(50mM TRIS-HCl、1% BSA、环丙沙星10 mg/L, pH 7.3)。在室温下在4000 g离心5分钟后，将上清液立即在干冰上冷冻，然后贮存于-80℃，然后进行分析。

在抗原LOCI测定法(发光氧通道免疫测定法)中分析样品的FVIII浓度。

相对于预剂量值，分析平均血浆浓度与时间数据。

给药后相对平均FVIII浓度随时间的变化见表13。

表13. 在VWF KO小鼠中，鼠D’D3A1 IV对FVIII血液浓度的效果。

时间(h)	FVIII增加(%预剂量)
		0.08	174
0.33	190
		0.5	176
1	163
		2	274
4	250
		7	330
18	225
		24	207

在静脉内给予VWF片段后，FVIII浓度随时间逐渐增加，Tmax在7小时后。该发现支持VWF片段用于治疗VWF疾病以及血友病障碍的潜力。

实施例36:

通过vWF片段TIL’/E’/D3/A1、TIL’/E’/D3、TIL’E’和TIL’/E’/VWD3对Turoctocogalfa (FVIII)以及Turoctocog alfa (FVIII)对vWF片段TIL’/E’/D3/A1的HX-MS进行相互关系作图

HX-MS介绍

HX-MS技术利用蛋白的氢交换(HX)可以容易地接着质谱法(MS)。通过将含氢的含水溶剂替换为含氘的含水溶剂，在蛋白质中的给定位点处的氘原子掺入将引起1 Da质量的增加。这种质量增加可以在交换反应的猝灭样品中通过质谱法作为时间的函数进行监控。通过在猝灭条件下用胃蛋白酶消化和接下来所得肽的质量增加，氘标记的信息可被亚定位至蛋白质中的区域。

HX-MS的一个用途是通过鉴定在蛋白质-蛋白质复合物形成后具有减少的氢交换的区域，探测涉及分子相互作用的位点。通常，由于溶剂的立体排阻，将通过氢交换中的显著减少而揭示结合界面。简单地通过测量在各自结合配偶体的存在和不存在下作为时间的函数的掺入任一蛋白质成员中的总氘量，可以通过HX-MS检测蛋白质-蛋白质复合物形成。HX-MS技术使用天然组分，即蛋白质和抗体或Fab片段，并且在溶液中执行。因此，HX-MS提供了用于模拟体内条件的可能性(关于HX-MS技术的近期综述，参见Wales和Engen, MassSpectrom. Rev. 25, 158 (2006))。

材料

所用的蛋白批号是：

所用的FVIII蛋白批号是：

FVIII (N8, Turoctocog alfa, SEQ ID NO 2)批号0155-0000-0004-37A

vWF片段

D’D3A1 (SEQ ID NO 19；Cys1099Ser；Cys1142Ser)批号0129-0000-0170-6B；2304(SEQ ID NO 5)批号0129-0000-2304-1B；2307 (SEQ ID NO 8)批号0129-0000-2307-1B；2308 (SEQ ID NO 11)批号0129-0000-2308 2B。

所有蛋白质都缓冲液交换到在实验前调整至pH 7.3的20 mM咪唑、500 mM NaCl、10 mM CaCl2中。

方法：HX-MS实验

仪器使用和数据记录

HX实验在nanoACQUITY UPLC系统上进行，用HDX技术(Waters Inc.)联合SynaptG2质谱仪(Waters Inc.)。Waters HDX系统含有由LeapShell软件(Leap TechnologiesInc./Waters Inc.)操作的Leap自动仪(H/D-x PAL；Waters Inc.)，其执行氘交换反应的起始、反应时间控制、猝灭反应、注射到UPLC系统上和消化时间控制。Leap自动仪配备有分别维持在20℃用于贮存缓冲液和HX反应以及维持在2℃用于贮存蛋白质和猝灭溶液的两个温度控制堆。Waters HDX系统还含有温度控制室，其将前置和分析柱、和LC管道系统和切换阀维持在1℃。单独的温度控制室将胃蛋白酶柱维持在25℃。对于在线胃蛋白酶消化，装载含有100 pmol hIL-21的100 µL猝灭的样品并通过放置在25℃的Poroszyme®固定化胃蛋白酶柱(2.1 × 30 mm (Applied Biosystems))，使用等度流速为100 µL/min (0.1%甲酸:CH₃CN 95:5)。在VanGuard前置柱BEH C18 1.7 µm (2.1 × 5 mm (Waters Inc.))上捕获所得肽并对其脱盐。随后，将阀切换到使前置柱置于与分析柱UPLC-BEH C18 1.7 µm (1 ×100 mm (Waters Inc.))联机，并且使用以120 μL/分钟递送的8 min的8-45% B梯度，从nanoAQUITY UPLC system (Waters Inc.)上分离肽。移动相由A: 0.1%甲酸和B: 0.1%甲酸的CH₃CN溶液组成。使用Synapt G2质谱仪(Waters Inc.)，以阳离子模式获得ESI MS数据和单独的升高能量(MS^E)的实验。亮氨酸-脑啡肽用作锁定质量(以m/z 556.2771的[M+H] ⁺离子)，并且以连续集模式收集数据(有关进一步描述，参见Andersen和Faber, Int. J. MassSpec., 302, 139–148(2011))。

数据分析

使用标准MS^E方法在单独实验中鉴定消化性肽，在所述方法中使用Synapt G2(Waters Inc.)的离子迁移性质，进一步比对肽和片段。使用ProteinLynx Global Server第2.5版(Waters Inc.)处理MS^E数据。在DynamX软件(Waters Inc.)中处理HX-MS原始数据文件。DynamX自动进行锁定质量校正和氘掺入测定，即氘化肽的质心测定。此外，通过软件手工检查所有肽，以确保正确的峰和氘分配。

表位作图实验

通过在vWF片段(即D’D3A1、2308、2307或-2304)不存在或存在时，在零时将FVIII10倍稀释在20 mM咪唑、150 mM NaCl、10 mM CaCl2, pH 7.3 (未校正值)中，在随后的时间点稀释在相应氘化缓冲液(即 20 mM咪唑、150 mM NaCl、10 mM CaCl2，在D₂O中制备, 最终98% D₂O, pH 7.3 (未校正值))中，开始酰胺氢/氘交换(HX)。所有HX反应都在20℃进行，并且在4.5 μM vWF片段不存在或存在时含有3 μM FVIII，因此得到1.5倍摩尔过量的vWF片段结合配偶体。在范围为10秒至240秒的合适的时间间隔，通过50 μl冰冷的猝灭缓冲液(1.36M TCEP、2 M尿素)猝灭50 μl HX反应的等分试样，导致最终pH为2.5(未校正的值))。

结果和讨论

2304和2307对FVIII的相互作用作图

在vWF片段2304或2307不存在或存在时监测191种肽(覆盖FVIII的83%的一级结构)的HX时间进程达10、20、30、40、60、120和240秒。

vWF片段2304和2307都诱导FVIII交换特性的相同改变并且在本文中可一起描述。在2304/2307存在或不存在时，在时间点(即10、20、30、40、60、120和240秒)观察到的交换模式可分为不同组：一组肽表现出交换模式不受2304/2307结合的影响。相比之下，FVIII中的另一组肽表现出在2304/2307结合后保护其不进行交换。

在2304/2307结合后表现出保护作用的区域包括覆盖残基1855-1875、1857-1875、2062-2070、2125-2147、2125-2148、2127-2147、2275-2291、2275-2302、2275-2305、2292-2305和2293-2312的肽(表14)。然而，通过比较结合2304/2307后每种肽中的交换保护作用的相对量和这些区域内的重叠和相邻肽中的表位效应的缺乏，表现出减少的氘掺入的区域可缩窄至残基1862-1875、2062-2070、2125-2147和2285-2299。

D’D3A1和2308对FVIII的相互作用作图

在vWF片段D’D3A1或2308不存在或存在时监测185种肽(覆盖FVIII的79%的一级结构)的HX时间进程达10、20、30、40、60、120和240秒。

vWF片段D’D3A1和2308都诱导FVIII交换特性的相同改变并且在本文中将会一起描述。

在D’D3A1或2308结合后表现出保护作用的区域包括覆盖残基1669-1680、1738-1765、1743-1765、1856-1869、1870-1874、2061-2074、2063-2074、2123-2146和2260-2280的肽(表15)。

然而，通过比较结合D’D3A1或2308后每种肽中的交换保护作用的相对量和这些区域内的重叠和相邻肽中的表位效应的缺乏，表现出减少的氘掺入的区域可缩窄至残基1671-1680、1745-1754、1858-1874、2063-2074、2125-2146、2262-2280。

FVIII对D’D3A1的相互关系作图

在FVIII不存在或存在时监测82种肽(覆盖VWF片段D’D3A1的58%的一级结构)的HX时间进程达10、20、30、40、60、120和240秒。

在FVIII结合后表现出交换保护作用的区域包括覆盖残基768-778的肽(表16)。

然而，通过比较结合FVIII后每种肽中的交换保护作用的相对量和这些区域内的重叠和相邻肽中的表位效应的缺乏，表现出减少的氘掺入的区域可缩窄至残基770-778。

结论

当2304或2307结合后，FVIII的所有区域都表现出类似的反应。在早期时间点，同一组肽受到vWF片段结合的影响。

此外，已经发现，在2304/2307结合后经鉴定的这些受影响的区域与在结合至D’D3A1/2308后FVIII结构域A3和C1中的受到影响的区域有重叠。

因为缺乏在2304/2307结合的HX-MS时间进程进行的消化性肽图谱的序列覆盖，所以对于残基1671-1680，交换特征是不可能的。因此不能证实2304/2307结合是否导致对该区的交换保护作用，如D’D3A1/2308结合后所鉴定的。

FVIII结合后，覆盖D’D3A1的残基770-778的区域显示出交换保护作用。通过进行FVIII结合的HXMS分析的消化性肽提供的D’D3A1的58%的所得序列覆盖，不允许忽略D’D3A1/2308中存在更多相互作用位点。

结论

当作图到晶体结构PDB：2R7E时，在与vWF片段D’D3A1、2308、2304或2307结合后显示出保护作用的FVIII的经鉴定的区域，在结构上位于远程距离。这使得以下成为高度不可能：可将它们都指派到由FVIII和vWF片段D’D3A1、2308、2304或2307之间的结合界面所诱导的保护作用上。HX-MS分析不能区分由结合界面所导致的交换保护作用以及由快速构象变化所导致的交换保护作用。

因此，可能合理的是，结合界面和FVIII的构象变化这两者诱导了在与vWF片段D’D3A1、2308、2304或2307结合后显示出交换保护作用的所观察的区域。

FVIII与vWF片段D’D3A1、2308、2304或2307结合的HXMS研究揭示了结构域A3和C1内的重叠区，因此与FVIII的该部分的复合物结合与对于所研究的vWF片段而言是相同的。

在结构域C2中观察到的差异表明FVIII的该部分在与vWF-片段的复合物形成后经历了构象变化。此外，所得结果表明D’D3A1/2308和2304/2307之间的截短差异导致结构域C2的不同构象变化。相比之下，2304和2307之间的截短差异看来不影响C2的构象定向，因为对于与这些vWF-片段种类的结合，观察到了结构域C2的相同交换特性。

众所周知，结构域C1和C2对FVIII的膜结合亲和力是必不可少的。可以推断，FVIII的这些部分的构象变化将会降低FVIII的膜结合能力。与VWF片段结合的FVIII复合物的结构域C1和C2的构象位置可能不利于FVIII的膜结合亲和力。此外，高度可能的是，在与FVIII的复合物中的片段将遮蔽FVIII的膜结合亲和力，因为对于与内源VWF结合的FVIII复合物的膜结合特征，这是已经被确定的。与游离FVIII相比，与VWF片段结合的FVIII复合物的膜结合亲和力的降低，将会导致FVIII与免疫系统(例如抗原呈递细胞)的细胞膜结合的减少。这会减少MHC II类上的FVIII-衍生的肽的呈递，并且因此可以推断与VWF片段结合的FVIII复合物将会比游离FVIII具有更低的免疫原性。

表14：与vWF片段2304 (SEQ ID 5)或2307 (SEQ ID 8)结合的FVIII (Turoctocogalfa；seq. no. 使用wt FVIII) (SEQ ID 2)的HXMS分析。在氘交换反应后。用胃蛋白酶消化FVIII，得到本发明的消化性肽，其经鉴定显示出在2304或2307存在时的交换保护作用。

序列	结构域	2304	2307
				L1855-E1875	A3	EX	EX
V1857-E1875	A3	EX	EX
				W2062-W2070	A3	EX	EX
V2125-R2147	C1	EX	EX
				V2125-Y2148	C1	EX	EX
F2127-R2147	C1	EX	EX
				F2275-T2291	C2	EX	EX
F2275-L2302	C2	EX	EX
				F2275-Y2305	C2	EX	EX
P2292-Y2305	C2	EX	EX
				V2293-S2312	C2	EX	EX

实例：在2304或2307结合后FVIII残基的交换保护作用表明相互作用区(在D2O中40秒孵育, > 0.4 Da)。

表15：与vWF片段D’D3A1 (SEQ ID 19；Cys1099Ser；Cys1142Ser)或2308 (SEQ ID11；Cys1099Ser；Cys1142Ser)结合的FVIII (Turoctocog alfa；seq. no. 使用wt FVIII)(SEQ ID 2)的HXMS分析。在氘交换反应后。用胃蛋白酶消化FVIII，得到本发明的消化性肽，其经鉴定显示出在D’D3A1或2308存在时的交换保护作用。

序列	结构域	D’D3A1	2308
				S1669-Y1680	a3	EX	EX
F1738-E1765	A3	EX	EX
				F1743-E1765	A3	EX	EX
L1856-R1869	A3	EX	EX
				Q1870-Q1874	A3	EX	EX
A2061-D2074	C1	EX	EX
				S2063-D2074	C1	EX	EX
L2123-A2146	C1	EX	EX
				F2260-V2280	C2	EX	EX

实例：在D’D3A1或2308结合后FVIII残基的交换保护作用表明相互作用区(在D2O中40秒孵育, > 0.4 Da)。

表16：与FVIII (Turoctocog alfa (SEQ ID 2)结合的vWF片段D’D3A1 (SEQ ID19；Cys1099Ser；Cys1142Ser)的HXMS分析。在氘交换反应后。用胃蛋白酶消化D’D3A1，得到本发明的消化性肽，其经鉴定显示出在FVIII存在时的交换保护作用。

序列	结构域	FVIII
			R768-A778	D’	EX

实例：在FVIII结合后D’D3A1残基的交换保护作用表明相互作用区(在D2O中40秒孵育, > 0.4 Da)。

实施例37

通过SEC-UV分析FVIII (SEQ ID 2)与TIL’/E’/D3/A1 III (SEQ ID 19；Cys1099Ser；Cys1142Ser)的复合物形成以及FVIII (SEQ ID 2)与TIL’/E’/D3 II (SEQ ID14；Cys1099Ser；Cys1142Ser)的复合物形成。

材料

所用的蛋白批号是：

所用的FVIII蛋白批号是：

FVIII (N8, Turoctocog alfa, SEQ ID NO 2)批号0155-0000-0004-37A；TIL’/E’/D3/A1 III (SEQ ID NO 19；Cys1099Ser；Cys1142Ser)批号0129-0000-0170-6B；TIL’/E’/D3 II (SEQ ID 14；Cys1099Ser；Cys1142Ser)批号0129-0000-2309-1B。

方法

在25℃，在Waters Biosuite, 4.6 X 300mm柱上进行大小排阻色谱，使用流速为0.3 ml/min和运行缓冲液为155 mM NaCl、10 mM乙酸钙、10 %异丙醇。通过UV检测器在280nm处监测流出液的吸光度。进行FVIII、TIL’/E’/D3/A1 III、TIL’/E’/D3 II、和FVIII –TIL’/E’/D3/A1 III的1:2复合物以及FVIII - TIL’/E’/D3 II的1:2复合物的SEC-UV表征。制备FVIII 10 µM、TIL’/E’/D3/A1 III 20 µM、TIL’/E’/D3 II 20 µM的样品和在复合物中的样品，并将15 µL上样到柱上。

结果和结论

FVIII - TIL’/E’/D3/A1 III和FVIII - TIL’/E’/D3 II的混合物的SEC-UV显示复合物的重要流份，将其从柱上完全洗脱下来。预计复合物将比FVIII稍微早一点洗脱下来；在两个实例中也都观察到这一点。

Claims (25)

1.药物组合物，包括：(i) 包含少于800个氨基酸的VWF片段，其中所述VWF片段包含SEQID NO: 5所示的序列；和(ii) FVIII分子，其中所述FVIII分子包含截短的B结构域。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述VWF片段少于600个氨基酸。

3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段还包含重复序列。

4.权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段包含C1099和/或C1142中的一个或两个氨基酸取代。

5.权利要求1或2的药物组合物，其中小于5%的所述VWF片段呈寡聚物和/或多聚体的形式。

6.权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段是二聚体的一部分。

7.权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段是单体。

8. 权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ IDNO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19。

9. 权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段包含SEQ ID NO 9，其中1099半胱氨酸残基被另一氨基酸取代。

10.权利要求9的药物组合物，其中1099半胱氨酸残基被丝氨酸取代。

11. 权利要求1或2的药物组合物，其中所述VWF片段包含选自以下的氨基酸序列：SEQID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQID NO 18和SEQ ID NO 19，其中1099和1142半胱氨酸残基被另一氨基酸取代。

12.权利要求11的药物组合物，其中1099和1142半胱氨酸残基被丝氨酸取代。

13.权利要求1或2的药物组合物，其中所述截短的B结构域的长度为5-700个氨基酸。

14.权利要求13的药物组合物，其中所述B结构域包含15-30个氨基酸。

15.权利要求1或2或14的药物组合物，其中所述截短的B结构域的氨基酸序列源自SEQID NO 1所示的wt FVIII B结构域氨基酸序列。

16.权利要求15的药物组合物，其中所述B结构域包含与SEQ ID NO 1的Ser 750氨基酸残基连接的O-聚糖。

17.权利要求1或2的药物组合物，其中所述FVIII分子与至少一个半寿期延长部分缀合。

18.权利要求17的药物组合物，其中至少一个半寿期延长部分与FVIII B结构域中存在的O-聚糖共价连接。

19.权利要求1或2的药物组合物，其中所述FVIII分子在皮下给予后的生物利用度为至少5%。

20.权利要求1或2的药物组合物，其中FVIII和VWF的摩尔比为1:1。

21.权利要求1或2的药物组合物，其中FVIII的浓度为至少500 IU/ml。

22.权利要求1或2的药物组合物，其中FVIII与VWF片段结合的量占所述药物组合物中的FVIII总量的至少70%。

23.权利要求1-22中任一项的药物组合物在制备用于治疗血友病的药物中的用途，其中所述药物组合物用于经皮下给予。

24.药物组合物，其中所述组合物包含VWF片段，其中所述VWF片段的氨基酸序列选自：SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19。

25.权利要求1-22中任一项或权利要求24的药物组合物在制备用于治疗冯维勒布兰德氏病的药物中的用途，其中所述药物组合物经静脉内或皮下给予。