CN107787328B - 用于治疗血友病的截短的血管性血友病因子多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗凝血障碍的包含截短的血管性血友病因子(von Villebrand Factor，VWF)的多肽，其中所述多肽携带半衰期延长部分，并且以相对于因子VIII和/或内源性VWF摩尔过量施用。

Description

用于治疗血友病的截短的血管性血友病因子多肽
发明领域
本发明涉及用于改善凝血障碍治疗的产品和方法。
发明背景
存在由凝血因子缺陷引起的各种出血性障碍。最常见的障碍是血友病A和B，分别由凝血因子VIII(FVIII)和IX的缺陷引起。另一种已知的出血性障碍是血管性血友病(vonWillebrand's disease，VWD)。
在血浆中，FVIII主要作为血管性血友病因子(von Willebrandfactor，VWF)的非共价复合物存在，其凝血功能是加速因子Ⅸa依赖性X因子转化为Xa。
经典血友病或血友病A是遗传性出血性障碍。它是由凝血FVIII的染色体X连锁缺陷引起的，几乎完全影响每10,000人发生的1至2个个体的男性。X染色体缺陷由本身不患血友病的女性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向增加。
在进行预防性治疗的严重血友病A患者中，FVIII必须每周静脉内(i.v.)约3次施用，因为FVIII的血浆半衰期短，约12至14小时。每次i.v.施用麻烦，与疼痛相关，并且具有感染的风险，特别是因为这主要由患者自己或已被诊断患有血友病A的儿童的父母在家进行。
因此，非常希望增加FVIII的半衰期，使得含有这样的FVIII的药物组合物能够不必太过频繁地施用。
已经进行若干尝试以延长非活化的FVIII的半衰期：通过减少其与细胞受体的相互作用(WO 03/093313A2、WO 02/060951A2)，通过将聚合物共价连接到FVIII(WO 94/15625、WO 97/11957和US4970300)，通过包封FVIII(WO 99/55306)，通过引入新的金属结合位点(WO 97/03193)，通过肽键(WO 97/40145和WO 03/087355)或二硫键(WO 02/103024A2)将A2结构域共价连接到A3结构域或通过将A1结构域共价连接到A2结构域(WO2006/108590)。
增强FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通过FVIII的聚乙二醇化(WO 2007/126808、WO 2006/053299、WO 2004/075923)或通过VWF的聚乙二醇化(WO 2006/071801)。聚乙二醇化VWF增加的半衰期将间接地也增加存在于血浆中FVIII的半衰期。还已经描述了FVIII的融合蛋白(WO 2004/101740、WO2008/077616和WO2009/156137)。
VWF(其在不同形式的血管性血友病(VWD)中缺失、功能缺陷或仅以减少量可用)是存在于哺乳动物血浆中的具有多种生理功能的多聚体粘附糖蛋白。在初期止血期间，VWF作为血小板表面上的特异性受体和细胞外基质成分如胶原蛋白之间的介质。此外，VWF作为促凝血因子FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列公开于Collins et al.1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397中。前体多肽pre-pro-VWF由N-末端22个残基的信号肽、接着741个残基的肽原(pro-peptide)和成熟血浆VWF中发现的2050个残基的多肽组成(Fischer et al.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽切割后，在VWF的两个单体之间形成C-末端二硫桥。在通过分泌途径的进一步运输期间，添加了12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，VWF二聚体通过N-末端二硫桥多聚化，741个氨基酸长度的肽原在晚期高尔基体中被酶PACE/弗林蛋白酶切割掉。
一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13可以在VWF的A1结构域内切割高分子量VWF多聚体。因此，血浆VWF由从500kDa的单个二聚体到由至多20多个分子量超过10,000kDa的二聚体组成的多聚体的全范围的多聚体组成。这里的VWF-HMWM具有最强的止血活性，可以在瑞斯托菌素辅因子活性(VWF:RCo)中测定。VWF:RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。
在血浆中，FVIII以高亲和力结合VWF，其保护其免于过早的清除，因此，除了其在初期止血中的作用外，起到稳定FVIII、调节FVIII血浆水平的关键作用，因此也是控制第二期止血的核心因素。结合VWF的非活化FVIII的半衰期在血浆中约为12至14小时。在3型血管性血友病中，不存在或几乎不存在VWF，FVIII的半衰期仅为约2至6小时，由于FVIII的浓度降低，导致这种患者的轻度至中度血友病A的症状。VWF对FVIII的稳定作用也已经用于帮助在CHO细胞中重组表达FVIII(Kaufman et al.1989,Mol Cell Biol 9:1233-1242)。
已经描述了VWF衍生的多肽(特别是VWF片段)用于在体外和体内稳定FVIII。WO2013/106787A1涉及包含某些VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白。FVIII和VWF-片段的那些嵌合异二聚体确实具有1:1的VWF与FVIII的固定摩尔比。WO 2014/198699A2和WO2013/083858A2描述了VWF片段及其在治疗血友病中的用途。发现与类似摩尔量的VWF片段的血管外共同施用FVIII可以显著改善FVIII的生物利用度。据认为，相对于FVIII的高摩尔过量的VWF是不希望的，并且在用FVIII与VWF片段共同s.c.施用的实验中，发现VWF剂量对FVIII生物利用度不是至关重要的。因此，VWF片段与FVIII的摩尔比被限制为最大50:1，优选范围为最大1.5:1。WO2011/060242A2公开了包含某些VWF片段和抗体Fc区的融合多肽，其提出VWF片段与FVIII之间的比摩尔比至多10:1。WO2013/093760A2描述了一种制备蛋白质的方法，其包括用重组α-2,3-唾液酸转移酶共表达FVIII或VWF多肽，包括截短形式的VWF。Yee etal.(2014)Blood 124(3):445-452发现含有D'D3结构域的VWF片段足以稳定VWF缺陷小鼠中的因子VIII。然而，尽管VWF D'D3-Fc融合蛋白在输注入FVIII-缺陷小鼠时显示出显著延长的存活，但是VWF D'D3-Fc融合蛋白没有延长共同输注的FVIII的存活。为了延长共同施用的FVIII的体内半衰期，现有技术没有公开施用的VWF片段相对于内源性VWF的超过一定比例的益处。
存在增加FVIII和FVIII产物的半衰期而降低施用频率的方法的持续需要。
发明概述
本发明人已经发现，通过共同施用高摩尔过量的截短的VWF多肽(本发明的多肽)可以延长因子VIII的体内半衰期。截短的VWF优选包含半衰期延长部分。高摩尔过量可能相对于共同施用的因子VIII的浓度或相对于存在于治疗的受试者中的内源性VWF的浓度。不希望受到任何理论的束缚，据信重要的是实现施用截短的VWF的高剩余量和优选半衰期延长的截短的VWF以最小化共同施用的FVIII与内源性VWF的结合，与截短的VWF相比，内源性VWF的分子结构较大可能导致分解代谢增加。如果截短的VWF不仅以相对于共同施用的因子VIII的比例在大于50的比例施用，而且包含半衰期延长部分，则该技术效果甚至更显著。
因此，本发明涉及以下实施方案[1]至[73]：
[1]一种多肽，其包含截短的血管性血友病因子(VWF)，该多肽用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和因子VIII(FVIII)，其中该多肽能够与所述FVIII结合，并且其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于50。
[2]根据项[1]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于100。
[3]根据项[1]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于为至少200。
[4]根据项[1]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于为至少300。
[5]根据项[1]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于为至少400。
[6]根据项[1]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于为至少500。
[7]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。
[8]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于1。
[9]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于2。
[10]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于4。
[11]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于5。
[12]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于7。
[13]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于10。
[14]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于25。
[15]根据项[1]至[6]中任一项所述的多肽，其中，所述待施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于50。
[16]一种多肽，其包含截短的血管性血友病因子(VWF)，该多肽用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和因子VIII(FVIII)，其中该多肽能够与所述FVIII结合，其中所施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。
[17]根据项[16]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于10。
[18]根据项[16]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于20。
[19]根据项[16]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于40。
[20]根据项[16]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于50。
[21]根据项[16]所述的多肽，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于100。
[22]根据前述项中任一项所述的多肽，其以与小于1nM的解离常数KD表征的亲和力结合FVIII。
[23]根据项[22]所述的多肽，其中KD的范围为1pM至500pM。
[24]根据项[22]所述的多肽，其中KD的范围为10pM至200pM。
[25]根据项[22]所述的多肽，其中KD的范围为60pM至100pM。
[26]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽静脉内施用。
[27]根据项[1]至[25]中任一项所述的多肽，其中该多肽皮下施用。
[28]根据项[1]至[25]中任一项所述的多肽，其中该多肽肌内施用。
[29]根据前述项中任一项所述的多肽，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：4的氨基酸776至805或(b)与SEQ ID NO：4的氨基酸776至805具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[30]根据前述项中任一项所述的多肽，其中截短的VWF包含(a)SEQ ID NO：4的氨基酸766至864或(b)与SEQ ID NO：4的氨基酸766至864具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[31]根据前述项中任一项所述的多肽，其中截短的VWF包含SEQID NO：4的氨基酸764至1242。
[32]根据前述项中任一项所述的多肽，其中截短的VWF由(a)SEQ ID NO：4的氨基酸764至1242，(b)与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或(c)(a)或(b)的片段组成。
[33]根据前述项中任一项所述的多肽，其中截短的VWF缺乏SEQID NO：4的氨基酸1243至2813。
[34]根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽包含半衰期延长部分。
[35]根据项[34]所述的多肽，其中半衰期延长部分是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。
[36]根据项[35]所述的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含或由选自以下的多肽组成：免疫球蛋白恒定区及其部分，如Fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C-末端肽，称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(HAP)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，白蛋白，α白蛋白(afamin)，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。
[37]根据项[34]中任一项所述的多肽，其中所述半衰期延长部分与该多肽缀合。
[38]根据项[37]所述的多肽，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，聚唾液酸(PSA)，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链，及其组合。
[39]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽是包含N-聚糖的糖蛋白，并且其中至少75％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
[40]根据项[39]所述的多肽，其中至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
[41]根据项[39]所述的多肽，其中至少95％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
[42]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽包含N-聚糖，其中小于35％，优选小于34％，优选小于33％，优选小于32％，优选小于31％，优选小于30％，优选小于29％，优选小于28％，优选小于27％，优选小于26％，优选小于25％，优选小于24％，优选小于23％，优选小于22％，优选小于21％，优选小于20％，优选小于19％，优选小于18％，优选小于17％，优选小于16％，优选小于15％，优选小于14％，优选小于13％，优选小于12％，优选小于11％，优选小于10％，优选小于9％，优选小于8％，优选小于7％，优选小于6％以及优选小于5％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。
[43]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽包含N-聚糖，其中小于6％，优选小于5％，优选小于4％，优选小于3％，优选小于2％，以及优选小于1％的所述N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。
[44]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽是二聚体。
[45]根据项[44]所述的多肽，其中形成二聚体的两个单体通过由截短的VWF内的半胱氨酸残基形成的一个或多个二硫桥彼此共价连接。
[46]根据项[45]所述的多肽，其中形成一个或多个二硫桥的半胱氨酸残基选自Cys-1099，Cys-1142，Cys-1222，Cys-1225，Cys-1227及其组合，其中氨基酸编号参考SEQ IDNO：4。
[47]根据项[44]至[46]中任一项所述的多肽，其中所述二聚体对FVIII的亲和力大于单体多肽对所述FVIII的亲和力，所述单体多肽具有与二聚多肽的单体亚单位相同的氨基酸序列。
[48]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与参考治疗相比，通过共同施用该多肽来增加FVIII的平均停留时间(MRT)和/或终末半衰期，其中所述参考治疗与所述治疗相同，除了在所述参考治疗中以等摩尔量施用该多肽和FVIII。
[49]根据项[48]所述的多肽，其中MRT和/或终末半衰期的所述增加为至少50％。
[50]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与单独使用FVIII的参考治疗相比，通过共同施用该多肽来增加FVIII的平均停留时间(MRT)和/或终末半衰期。
[51]根据项[50]所述的多肽，其中MRT和/或终末半衰期的所述增加为至少50％。
[52]根据项[50]所述的多肽，其中MRT和/或终末半衰期的所述增加为至少100％。
[53]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与单独使用FVIII的参考治疗相比，通过共同施用该多肽来降低FVIII的清除率。
[54]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与参考治疗相比，通过共同施用该多肽来降低FVIII的清除率，其中所述参考治疗与所述治疗相同，除了在所述参考治疗中以等摩尔量施用该多肽和FVIII。
[55]根据项[53]或[54]所述的多肽，其中所述降低为至少25％。
[56]根据项[53]或[54]所述的多肽，其中所述降低为至少50％。
[57]根据项[53]或[54]所述的多肽，其中所述降低为至少100％。
[58]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与单独使用FVIII的参考治疗相比，通过共同施用该多肽来增加FVIII的体内回收。
[59]根据前述项中任一项所述的多肽，其中与单独使用FVIII的治疗相比，FVIII的施用频率降低。
[60]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期大于参考多肽的MRT和/或血浆半衰期，其中所述参考多肽是内源性VWF。
[61]根据前述项中任一项所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期大于参考多肽的MRT和/或血浆半衰期，所述参考多肽与所述多肽相同，除了其缺少半衰期延长部分。
[62]根据项[60]或[61]所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期比参考多肽的MRT和/或血浆半衰期大至少25％。
[63]根据项[60]或[61]所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期比参考多肽的MRT和/或血浆半衰期大至少50％。
[64]根据项[60]或[61]所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期比参考多肽的MRT和/或血浆半衰期大至少75％。
[65]根据项[60]或[61]所述的多肽，其中该多肽的MRT和/或血浆半衰期比参考多肽的MRT和/或血浆半衰期至少大100％。
[66]根据前述项中任一项所述的多肽，其中受试者是人。
[67]一种药物组合物，其包含(i)FVIII和(ii)如项[1]至[66]中任一项所定义的多肽，其中组合物中多肽与FVIII的摩尔比大于50。
[68]一种药物组合物，其包含(i)FVIII和(ii)如项[1]至[66]中任一项所定义的用于治疗凝血障碍的多肽，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和FVIII，其中施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。
[69]一种药盒，其包含(i)FVIII和(ii)如项[1]至[66]中任一项所定义的多肽，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和FVIII，其中施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。
[70]一种药盒，其包含(i)FVIII和(ii)如项[1]至[66]中任一项所定义的多肽，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血障碍，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于50。
[71]如项[1]至[66]中任一项所定义的多肽用于改善因子VIII的血浆半衰期和/或降低因子VIII施用频率的用途。
[72]一种治疗凝血障碍的方法，包括向具有内源性VWF的患者施用有效量的如[1]至[66]项中任一项所定义的多肽和FVIII，其中紧接施用多肽后，施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。
[73]一种治疗凝血障碍的方法，包括向具有内源性VWF的患者施用有效量的由[1]至[66]项中任一项定义的多肽和FVIII，其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于50。
附图说明
图1：通过测定大鼠中的白蛋白部分定量的D'D3-FP的平均停留时间、终末半衰期和清除率(平均值)(实施例1)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-SingleChain(rVIII-单链)
图2：通过测定大鼠中的FVIII抗原定量的rVIII-单链的平均停留时间、终末半衰期和清除率(平均值)(实施例1)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图3：通过测定大鼠中的白蛋白部分定量的D'D3-FP的平均停留时间、终末半衰期和清除率(平均值)(实施例2)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图4：通过测定大鼠中的FVIII抗原定量的rVIII-单链的平均停留时间、终末半衰期和清除率(平均值)(实施例2)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图5：通过测定兔中的白蛋白部分定量的D'D3-FP的平均停留时间、终末半衰期和清除率(个体动物数据和平均值)(实施例3)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图6：通过测定兔中的FVIII抗原定量的rVIII-单链的平均停留时间、终末半衰期和清除率(个体动物数据和平均值)(实施例3)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图7：通过测定兔中的FVIII抗原定量的不同重组FVIII产物的平均停留时间、终末半衰期和清除率(个体动物数据和平均值)(实施例4)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图8：根据大鼠和兔中的D'D3-FP相对rVIII-单链的摩尔比，FVIII的平均停留时间、终末半衰期和清除率的变化(单独给予rVIII-SC定义为1倍变化)。
缩写：rVIII-SC：rVIII-单链
图9：根据大鼠和兔中的D'D3-FP相对内源性VWF的摩尔比，FVIII的平均停留时间、终末半衰期和清除率的变化(单独给予rVIII-SC定义为1倍变化)。
详述
在第一方面，本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽，该多肽用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和因子VIII(FVIII)，其中该多肽能够与所述FVIII结合，并且其中待施用的多肽与待施用的FVIII的摩尔比大于50。在优选实施方案中，该多肽包含半衰期延长部分。
在第二方面，本发明涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽，该多肽用于治疗凝血障碍，所述治疗包括向具有内源性VWF的受试者施用该多肽和因子VIII(FVIII)，其中该多肽能够与所述FVIII结合，其中所施用的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。在优选实施方案中，该多肽包含半衰期延长部分。
包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽在本文中将被称为“本发明的多肽”。本发明的多肽优选包含半衰期延长部分。
比例
如下文更详细描述的，本发明的多肽可以是单体，二聚体或其混合物。根据本发明的任何摩尔比是指本发明的多肽的单体亚单位的摩尔浓度的比例，无论其实际作为单体或二聚体存在。比例相对于共同施用的FVIII的摩尔浓度或相对于内源性VWF单体亚单位的摩尔浓度形成。除非另有说明，否则本申请中本发明多肽相对于FVIII的任意比例是指待施用的本发明的多肽的量(以摩尔计)除以待施用的FVIII的量(以摩尔计)。内源性VWF是天然存在于动物或人血浆中的VWF，其待被给予本发明的多肽和共同施用的FVIII。通常由一系列约2至40个VWF单体亚单位的不同低聚物组成。除非另有说明，否则本申请中本发明的多肽相对于本发明的内源性VWF的任何比例是指紧接本发明多肽施用后，将本发明多肽的血浆摩尔浓度除以内源性VWF单体亚单位(内源性VWF)的血浆摩尔浓度。紧接本发明多肽施用后本发明多肽的血浆摩尔浓度是假定在40mL/kg的血浆体积中施用后直接施用的本发明多肽的稀释度计算。为本发明的目的假定静脉内施用时施用后本发明多肽的量与施用量相同。
根据本发明的一个方面，本发明的多肽与内源性VWF的摩尔比大于0.5。待治疗受试者的血浆中内源性VWF的浓度可以通过例如如实施例中所述的ELISA或活性测定来确定。通常，所测量的浓度将以U/mL给出。如下所述，该值可以转换为摩尔浓度。
正常人血浆(NHP)含有浓度为1U/mL或定义为100％的VWF。这对应于大约10μg/mL的蛋白质浓度(Haberichter S.L.and Montgomery R.R.,Structure and function ofvon Willebrand factor；于:Hemostasis and Thrombosis,eds.Marder,Aird,Bennett,Schulman and White,Lippincott Williams&Wilkins 2013,pp197-207)。基于NHP中的这种VWF浓度和包括18-19％的糖基化的成熟VWF单体的大约267,500Da的分子量，可以计算NHP的VWF单体单元的摩尔浓度约37×10-9Mol/L。
为了分别计算正常大鼠或兔血浆中大鼠或兔VWF亚单位的摩尔浓度，使用与人VWF相当的单体亚单位的分子量(267,500Da)和假定相当的比活性(100U/mg)和所测量的大鼠或兔血浆中的内源性VWF活性(也参见实施例)。
人群中VWF的浓度在NHP中的VWF浓度在约60％至约200％发生变化。在本发明的某些实施方案中，内源性VWF的浓度定义为NHP中的浓度。在其他实施方案中，在待治疗的受试者中确定内源性VWF的浓度，并且多肽的剂量基于该个体值。
所施用的本发明的多肽与内源性VWF的摩尔比优选为至少2，或至少3，或至少4，或至少5，或至少6，或至少7，或至少8，或至少9，或至少10，更优选至少15，或至少20，或至少25，或至少30，最优选至少40，或至少50，或至少75。
待施用的本发明的多肽与内源性VWF的摩尔比范围可以为0.5至1,000，或1至500，或2至400，或3至300，或4至250，或5至200，或6至150，或7至140，或8至130，或9至120，或10至110。优选地，所施用的本发明多肽与内源性VWF的摩尔比范围为3至100，4至90，或5至80，或6至75，或10至60。
待施用的本发明的多肽与待施用的FVIII的摩尔比优选为至少2，或至少5，或至少10，或至少20，或至少30，或至少40，或在至少50，更优选该比例大于50，或至少75，至少100，或大于100，或至少200，最优选至少300，或至少400，或至少500，或至少600，或至少700，或至少800，或至少900，或至少1,000，或至少1100，或至少1,200，或至少1,300，或至少1,400，或至少1,500，或至少1,600或至少1,700，或至少1,800，或至少1,900，或至少2,000，或至少2,500，或至少3,000，或至少5,000，或至少8,000，或至多10,000。
待施用的本发明的多肽与待施用的FVIII的摩尔比范围可以为2至10,000，或5至5,000，或10至4,000，或20至3,000，或30至2,000，或40到1000。优选地，待施用的本发明的多肽与待施用的FVIII的摩尔比可以为60至2500，或110至2,000，或150至1,500，或200至1,000。
表1总结了根据本发明的治疗的各种实施方案。在给定的实施方案中，必须分别满足列2和3二者的要求。
表1：
Figure BDA0001477397530000141
Figure BDA0001477397530000151
Figure BDA0001477397530000161
表1所示的实施方案1至72可以与本文所述的本发明的任何其它实施方案和方面组合。下面进一步描述根据本发明的治疗的进一步细节。
截短的VWF
本文所用的术语“血管性血友病因子”(VWF)不仅包括天然存在的(天然的)VWF，还包括至少保持天然存在的VWF的FVIII结合活性的变体，例如，其中一个或多个残基被插入、缺失或置换的序列变体。通过实施例6中所述的FVIII-VWF结合测定确定FVIII结合活性。
根据本发明的优选VWF是由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列所表示的人VWF。编码SEQ ID NO：4的cDNA示于SEQ ID NO：3。
编码人天然VWF的基因转录成9kb的mRNA，其翻译成2813个氨基酸的前多肽原(pre-propolypeptide)，估计分子量为310,000Da。前多肽原含有N-末端22个氨基酸的信号肽、接着741个氨基酸的多肽原(pro-polypeptide)(SEQ ID NO：4的氨基酸23-763)和成熟亚单位(SEQ ID NO：4的氨基酸764-2813)。从N-末端切割741个氨基酸的多肽原得到由2050个氨基酸组成的成熟VWF。人天然VWF前多肽原的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。除非另有说明，否则本申请中VWF残基的氨基酸编号参考SEQ ID NO：4，即使VWF分子没有包含SEQ IDNO：4的所有残基。
天然VWF的多肽原包含多个结构域。在文献中可以找到不同的结构域注释(参见例如Zhou et al.(2012)Blood 120(2):449-458)。本申请中应用了VWF的天然前多肽原的以下结构域注释：
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
参考SEQ ID NO：4，D'结构域由氨基酸764-865组成；D3结构域由氨基酸866-1242组成。
特征“截短”是指多肽不包含成熟VWF的全部氨基酸序列(SEQID NO：4的氨基酸764-2813)。通常，截短的VWF不包含SEQ ID NO：4的所有氨基酸764-2813，而仅包含其片段。截短的VWF也可以被称为VWF片段，或者为复数形式的VWF片段。
通常，截短的VWF能够结合因子VIII。优选地，截短的VWF能够结合成熟形式的人天然因子VIII。在另一实施方案中，截短的VWF能够结合由氨基酸序列SEQ ID NO：5组成的单链因子VIII。可以通过实施例6中所述的FVIII-VWF结合测定来确定截短的VWF与因子VIII的结合。
本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO：4的氨基酸776至805具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：4的氨基酸776至805具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸776至805或由其组成。除非另有说明，否则在参考序列(例如SEQID NO：4的氨基酸776至805)的整个长度上确定序列同一性。
本发明的截短的VWF优选包含与SEQ ID NO：4的氨基酸766至864具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：4的氨基酸766至864具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸766至864或由其组成。
在另一优选实施方案中，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，截短的VWF由(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1242具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF由(a)SEQ ID NO：4的氨基酸764至1242或(b)其片段组成，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。
如下面更详细描述的，可以通过使用包含编码包含截短的VWF的多肽的核酸的细胞的方法来制备多肽。通过本身已知的技术将核酸引入合适的宿主细胞中。
在优选实施方案中，宿主细胞中的核酸编码(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸1至1242具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的成熟VWF仍然能够结合FVIII。更优选地，所述核酸编码(a)与SEQ ID NO：4的氨基酸1至1242具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。最优选地，核酸编码(a)SEQ ID NO：4的氨基酸1至1242，或(b)其片段，条件是截短的VWF仍然能够结合FVIII。特别是如果根据本发明的多肽是二聚体，则核酸将包含编码VWF(例如SEQ ID NO：4)的氨基酸1至763的序列，即使多肽中的截短的VWF不包含VWF(例如SEQ ID NO：4)的氨基酸1至763。
在其他实施方案中，截短的VWF包含以下氨基酸序列之一或由其组成，每个氨基酸序列均参考SEQ ID NO：4：
776-805；766-805；764-805；776-810；766-810；764-810；776-815；766-815；764-815；
776-820；766-820；764-820；776-825；766-825；764-825；776-830；766-830；764-830；
776-835；766-835；764-835；776-840；766-840；764-840；776-845；766-845；764-845；
776-850；766-850；764-850；776-855；766-855；764-855；776-860；766-860；764-860；
776-864；766-864；764-864；776-865；766-865；764-865；776-870；766-870；764-870；
776-875；766-875；764-875；776-880；766-880；764-880；776-885；766-885；764-885；
776-890；766-890；764-890；776-895；766-895；764-895；776-900；766-900；764-900；
776-905；766-905；764-905；776-910；766-910；764-910；776-915；766-915；764-915；
776-920；766-920；764-920；776-925；766-925；764-925；776-930；766-930；764-930；
776-935；766-935；764-935；776-940；766-940；764-940；776-945；766-945；764-945；
776-950；766-950；764-950；776-955；766-955；764-955；776-960；766-960；764-960；
776-965；766-965；764-965；776-970；766-970；764-970；776-975；766-975；764-975；
776-980；766-980；764-980；776-985；766-985；764-985；776-990；766-990；764-990；
776-995；766-995；764-995；776-1000；766-1000；764-1000；776-1005；766-1005；764-1005；
776-1010；766-1010；764-1010；776-1015；766-1015；764-1015；776-1020；766-1020；764-1020；
776-1025；766-1025；764-1025；776-1030；766-1030；764-1030；776-1035；766-1035；764-1035；
776-1040；766-1040；764-1040；776-1045；766-1045；764-1045；776-1050；766-1050；764-1050；
776-1055；766-1055；764-1055；776-1060；766-1060；764-1060；776-1065；766-1065；764-1065；
776-1070；766-1070；764-1070；776-1075；766-1075；764-1075；776-1080；766-1080；764-1080；
776-1085；766-1085；764-1085；776-1090；766-1090；764-1090；776-1095；766-1095；764-1095；
776-1100；766-1100；764-1100；776-1105；766-1105；764-1105；776-1110；766-1110；764-1110；
776-1115；766-1115；764-1115；776-1120；766-1120；764-1120；776-1125；766-1125；764-1125；
776-1130；766-1130；764-1130；776-1135；766-1135；764-1135；776-1140；766-1140；764-1140；
776-1145；766-1145；764-1145；776-1150；766-1150；764-1150；776-1155；766-1155；764-1155；
776-1160；766-1160；764-1160；776-1165；766-1165；764-1165；776-1170；766-1170；764-1170；
776-1175；766-1175；764-1175；776-1180；766-1180；764-1180；776-1185；766-1185；764-1185；
776-1190；766-1190；764-1190；776-1195；766-1195；764-1195；776-1200；766-1200；764-1200；
776-1205；766-1205；764-1205；776-1210；766-1210；764-1210；776-1215；766-1215；764-1215；
776-1220；766-1220；764-1220；776-1225；766-1225；764-1225；776-1230；766-1230；764-1230；
776-1235；766-1235；764-1235；776-1240；766-1240；764-1240；776-1242；766-1242；764-1242；
764-1464；764-1250；764-1041；764-828；764-865；764-1045；764-1035；764-1128；764-1198；
764-1268；764-1261；764-1264；764-1459；764-1463；764-1464；764-1683；764-1873；764-1482；
764-1479；764-1672；和764-1874。
在某些实施方案中，截短的VWF相对于成熟野生型VWF具有内部缺失。例如，可以缺失A1，A2，A3，D4，C1，C2，C3，C4，C5，C6结构域或其组合，并保留D'结构域，D3结构域和CK结构域。在进一步的实施方案中，截短的VWF不包含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)，胶原和/或整联蛋白αIIbβIII(C1结构域内的RGDS序列)的结合位点。在其他实施方案中，截短的VWF不包含位于VWF的中心A2结构域的ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)。在另一个实施方案中，截短的VWF不包含GPIbα的结合位点和/或不包含胶原的结合位点和/或不包含整联蛋白αIIbβIII的结合位点和/或不包含其位于VWF中心A2结构域的ADAMTS13的切割位点(Tyr1605-Met1606)。
在其它实施方案中，截短的VWF包含与前一段所述的氨基酸序列之一具有至少90％，或至少91％，或至少92％，或至少93％，或至少94％，或至少95％，或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，条件是截短的VWF能够与FVIII结合。
如果本发明的多肽的两个单体共价连接，则本发明的多肽被称为本发明的“二聚体”。优选地，两个单体亚单位通过至少一个二硫桥共价连接，例如一个，二个，三个或四个二硫桥。形成至少一个二硫桥的半胱氨酸残基优选位于本发明多肽的截短的VWF部分内。在一个实施方案中，这些半胱氨酸残基为Cys-1099，Cys-1142，Cys-1222，Cys-1225或Cys-1227或其组合。
如果本发明的多肽是二聚体，则截短的VWF优选包含两个多肽或由其组成，每个多肽具有与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且能够结合FVIII。在优选实施方案中，截短的VWF包含与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，并且能够结合FVIII。最优选地，截短的VWF包含SEQ ID NO：4的氨基酸764至1099，氨基酸764至1142，氨基酸764至1222，氨基酸764至1225，或氨基酸764至1227或由其组成。
截短的VWF可以是WO 2013/106787 A1，WO 2014/198699 A2，WO 2011/060242 A2或WO 2013/093760 A2中公开的VWF片段中的任一种，其公开内容通过引用并入本文。
本文所用的术语“内源性VWF”是指VWF的单体亚单位，与二聚化或低聚化的程度无关。例如在根据本发明的比例的测定中，由本发明的多肽的一定数量的分子除以1,000个VWF十聚体多聚体分子形成的比例将与由本发明的多肽的相同数量的分子形成除以2,000个VWF五聚体多聚体分子形成的比例相同。
半衰期延长部分
除截短的VWF之外，本发明的多肽可在某些优选的实施方案中还包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可以是与截短的VWF融合的异源氨基酸序列。或者，半衰期延长部分可以通过不同于肽键的共价键与包含截短的VWF的多肽化学偶联。
在本发明的某些实施方案中，本发明多肽的半衰期通过化学修饰来延长：如半衰期延长部分例如聚乙二醇(PEG化)，糖基化PEG，羟乙基淀粉(HES化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物或透明质酸的附接。在另一个实施方案中，本发明的多肽通过化学接头与HLEP例如白蛋白缀合。Conjuchem LLC已经以示例性方式描述了这种缀合技术的原理(参见例如美国专利号7,256,253)。
在其它实施方案中，半衰期延长部分是半衰期增强蛋白(HLEP)。优选地，HLEP是白蛋白或其片段。白蛋白的N-末端可以与截短的VWF的C-末端融合。或者，白蛋白的C-末端可以与截短的VWF的N-末端融合。一个或多个HLEP可以融合到VWF的N-或C-末端部分，条件是它们不干扰或消除截短的VWF与FVIII的结合能力。
在一个实施方案中，多肽具有以下结构：
tVWF-L1-H,[式1]
其中tVWF是截短的VWF，L1是化学键或者接头序列，而H是HLEP。
L1可以是化学键或由一个或多个氨基酸组成的接头序列，例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸，并且可以彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型VWF中的相应位置。存在于L1中的合适的氨基酸的实例包括Gly和Ser。接头应该是非免疫原性的并且可以是不可切割的或可切割的接头。不可切割的接头可以包括WO2007/090584中举例说明的交替的甘氨酸和丝氨酸残基。在本发明的另一个实施方案中，截短的VWF部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，其用作人蛋白质中的天然结构域间接头。优选地，其天然环境中的此类肽序列位于蛋白质表面附近，并且可被免疫系统接近，使得可以假定对该序列具有天然耐受性。实例在WO2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如WO 2013/120939 A1中。
下文描述了优选的HLEP序列。本发明同样包括对相应HLEP的确切的“N-末端氨基酸”或确切的“C-末端氨基酸”的融合，或与相应HLEP的“N-末端部分”或“C-末端部分”的融合，其包括HLEP的一个或多个氨基酸的N-末端缺失。多肽可以包含多于一个HLEP序列，例如两个或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可以串联融合到VWF的C-末端部分，例如作为连续重复序列。
半衰期增强多肽(HLEP)
优选地，半衰期延长部分是半衰期延长多肽(HLEP)，更优选HLEP选自白蛋白或其片段，免疫球蛋白恒定区及其部分，例如Fc片段，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(例如XTEN(Schellenberger et al.2009；Nature Biotechnol.27:1186-1190)，同型氨基酸重复序列(HAP)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)，α白蛋白，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，转铁蛋白或其变体，人绒毛膜促性腺激素-β亚单位的羧基末端肽(CTP)，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂质。
本文使用的“半衰期增强多肽”优选选自白蛋白，白蛋白家族成员，免疫球蛋白G的恒定区及其片段，能够在生理条件下与白蛋白、白蛋白家族的成员以及免疫球蛋白恒定区的部分结合的区域和多肽。它可以是本文所述的全长半衰期增强蛋白(例如白蛋白，白蛋白家族成员或免疫球蛋白G的恒定区)或其一个或多个片段，其能够稳定或延长治疗活性或凝血因子的生物活性。这样的片段长度可以是来自HLEP片段的10个或更多个氨基酸，或者可以包括至少约15个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约50个，至少约100个或更多个连续氨基酸，或者可以包括HLEP序列的部分或全部，只要与没有HLEP的相应多肽相比，HLEP片段提供至少25％的功能性半衰期延长。
本发明的多肽的HLEP部分可以是野生型HLEP的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和置换，其中此类改变基本上不改变截短的VWF的FVIII-结合活性。
特别地，本发明的所提出的VWF HLEP融合构建体可以包括HLEP的天然存在的多态性变体和HLEP片段。HLEP可以衍生自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡和鲑鱼。
白蛋白作为HLEP
术语“人血清白蛋白”(HSA)和“人白蛋白”(HA)和“白蛋白”(ALB)在本申请中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”较宽，并且包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所用，“白蛋白”统称为白蛋白多肽或氨基酸序列，或白蛋白片段或变体，其具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，特别是本文SEQ ID NO：6所示的成熟形式的人白蛋白或其他脊椎动物或其片段的白蛋白，或这些分子或其片段的类似物或变体。
特别地，本发明的所提出的多肽可以包括天然存在的人白蛋白的多态性变体和人白蛋白的片段。一般而言，白蛋白片段或变体将为至少10个，优选至少40个，最优选多于70个氨基酸长。
本发明的优选实施方案包括用作具有增强的与FcRn受体结合的本发明多肽的HLEP的白蛋白变体。与具有野生型白蛋白融合的截短的VWF相比，这种白蛋白变体可能导致截短的VWF白蛋白变体融合蛋白的更长的血浆半衰期。
本发明的多肽的白蛋白部分可以包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰。
免疫球蛋白作为HLEP
免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)是本领域已知的以增加治疗性蛋白质的半衰期(Dumont J A et al.2006.BioDrugs 20:151-160)。IgG的重链恒定区由3个结构域(CH1-CH3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以衍生自任何哺乳动物，或分别衍生自亚类IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域的IgG和IgG片段也可以用作HLEP。治疗性多肽部分优选经由抗体的铰链区或甚至可以是可切割的肽接头连接到IgG或IgG片段。几项专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合，以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。US 2004/0087778和WO 2005/001025描述了Fc结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与生物活性肽的融合蛋白具有增加肽的半衰期，否则其将在体内快速清除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性，延长的循环半衰期和更大的溶解性(WO2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO蛋白(WO 2005/063808)以及Fc与G-CSF(WO 2003/076567)，胰高血糖素样肽-1(WO 2005/000892)，凝血因子(WO 2004/101740)和白介素-10(美国专利号6,403,077)的融合，均具有半衰期增强特性。
根据本发明可以使用的各种HLEP在WO 2013/120939A1中详细描述。
本发明的多肽的N-聚糖和唾液酸化
本发明的多肽优选包含N-聚糖，并且至少75％，优选至少85％，更优选至少90％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。在优选实施方案中，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。本发明人发现，包含高度唾液酸化VWF片段的多肽不仅本身具有延长的半衰期，而且还能延长共同施用的FVIII的半衰期。换句话说，施用本发明的多肽导致共同施用FVIII的延长的半衰期和/或降低的清除率。
本发明的多肽优选包含N-聚糖，并且糖蛋白的N-聚糖的至少50％的唾液酸(sialyl)基是α-2,6连接的唾液酸基。通常，末端唾液酸基可以通过α-2,3-或通过α-2,6-键附接到半乳糖基。通常，本发明多肽的N-聚糖包含比α-2,3-连接的唾液酸基更多的α-2,6连接的唾液酸基。优选地，N-聚糖的至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％的唾液酸基是α-2,6连接的唾液酸基。这些实施方案可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酸转移酶来获得。
在一个实施方案中，本发明的多肽至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的N-聚糖包括至少一个唾液酸基。在另一个实施方案中，本发明多肽的至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的N-聚糖包含至少一个唾液酸基。
在另一个实施方案中，本发明多肽的小于15％，小于12％，小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％或甚至小于1％的N-聚糖是脱唾液酸-N-聚糖，即它们是缺乏唾液酸基的N-聚糖。在另一个实施方案中，本发明多肽的小于15％，小于12％，小于10％，或小于8％，或小于6％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％或甚至小于1％的N-聚糖是脱唾液酸-N-聚糖，即它们不具有唾液酸基。
本发明的其它实施方案包括截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述糖蛋白包含N-聚糖，其中小于35％，优选小于34％，优选小于33％，优选小于32％，优选小于31％，优选小于30％，优选小于29％，优选小于28％，优选小于27％，优选小于26％，优选小于25％，优选小于24％，优选小于23％，优选小于22％，优选小于21％，优选小于20％，优选小于19％，优选小于18％，优选小于17％，优选小于16％，优选小于15％，优选小于14％，优选小于13％，优选小于12％，优选小于11％，优选小于10％，优选小于9％，优选小于8％，优选小于7％，优选小于6％，和优选小于5％的所述N-聚糖平均包含两个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。
本发明的其它实施方案包括截短的血管性血友病因子(VWF)，其中所述截短的VWF能够结合因子VIII(FVIII)，并且其中所述截短的VWF包含N-聚糖，其中小于6％，优选小于5％，优选小于4％，优选小于3％，优选小于2％，优选小于1％的所述N-聚糖平均包含三个或更多个末端和非唾液酸化半乳糖残基。
上述实施方案可以彼此组合。上述提到的N-聚糖的任何百分比，或任何唾液酸化程度的指代应被理解为平均百分比或程度，即它们指分子群而不是单个分子。很明显，糖蛋白群体内个体糖蛋白分子的糖基化或唾液酸化将显示出一些异质性。
二聚体
还已经发现，本发明的多肽具有高比例的二聚体。因此，本发明的多肽优选作为二聚体存在。在一个实施方案中，至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％或约100％的多肽作为二聚体存在。在另一个实施方案中，本发明多肽的二聚体：单体的比例为至少1.5，优选至少2，更优选至少2.5或至少3。最优选本发明的所有多肽以二聚体形式存在。二聚体的使用是有利的，因为二聚体与单体相比具有改善的对因子VIII的亲和力。本发明多肽的二聚体含量以及二聚体与单体的比例可以如实施例1所述测定。
在一个实施方案中，本发明的多肽因子VIII的亲和力大于人天然VWF对相同因子VIII分子的亲和力。因子VIII亲和力可以指人天然因子VIII，或指由SEQ ID NO：5表征的因子VIII分子。
已经发现，具有高比例二聚体的本发明多肽的制备物确实对因子VIII具有增加的亲和力。对因子VIII的这种增加的亲和力确实导致本发明的多肽增强因子VIII的稳定。作为替代或与增加的二聚体比例组合，本发明优选的实施方案是根据本发明的在因子VIII结合结构域内具有突变的本发明的多肽确实增加对因子VIII的亲和力。例如在WO2013/120939A1中公开了合适的突变。
多肽的制备
编码本发明多肽的核酸可以根据本领域已知的方法制备。基于VWF的cDNA序列(SEQ ID NO：3)，可以设计并产生编码本发明上述截短的VWF构建体或多肽的重组DNA。
即使由宿主细胞分泌的多肽不包含VWF的氨基酸1至763，优选编码多肽细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码与SEQ ID NO：4的氨基酸23至763或优选氨基酸1至763具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。最优选地，编码多肽细胞内前体的核酸(例如DNA)包含编码SEQ ID NO：4的氨基酸23至763或SEQ ID NO：4的氨基酸1至763的核苷酸序列。
可以使用其中DNA含有以正确取向插入表达质粒的整个开放阅读框的构建体用于蛋白质表达。典型表达载体含有指导对应于携带质粒细胞中插入核酸的大量mRNA的合成的启动子。它们还可以包括允许其在宿主生物体内自主复制的复制序列的起点，以及提高合成mRNA翻译效率的序列。稳定的长期载体可以通过使用例如病毒的调节元件(例如，来自EB病毒基因组的OriP序列)维持为自由复制的实体。还可以产生已将载体整合到基因组DNA中的细胞系，并且以这种方式，基因产物是连续生产的。
通常，通过将编码本发明的多肽的核酸引入哺乳动物宿主细胞来获得待提供的细胞。
根据本发明可以使用对细胞培养和糖蛋白的表达敏感的任何宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人视网膜成纤维细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆用于生长在悬浮培养物中的293细胞，Graham etal.，J.GenVirol.，36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243 251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather etal.,Annals NY.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人羊水细胞(CAP)；和人肝细胞系(Hep G2)。优选地，细胞系是啮齿动物细胞系，特别是CHO或BHK的仓鼠细胞系。
适于引入足以实现哺乳动物宿主细胞中目的糖蛋白表达的核酸的方法是本领域已知的。参见，例如，Gething et al.,Nature,293:620-625,1981；Manteiet al.,Nature,281:40-46,1979；Levinson et al.EP117,060；和EP 117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入哺乳动物细胞的常用方法包括Graham和van der Erb的磷酸钙沉淀法(Virology,52:456-457,1978)或Hawley-Nelson的lipofectamineTM(Gibco BRL)方法(Focus 15:73,1993)。Axel在美国专利号4,399,216中已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面。对于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown et al.,MethodsinEnzymology,1989,Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537,1990,和Mansour et al.,Nature,336:348-352,1988。
在允许表达多肽的条件下培养细胞。可以使用本领域技术人员已知的方法回收和纯化多肽。
终末半衰期、MRT和清除率
本发明的另一方面是上文定义的多肽来增加因子VIII的终末半衰期或平均停留时间(MRT)或降低因子VIII的清除率的用途。为了评估药代动力学数据，应用线性药代动力学模型(通过中央隔室的化合物消除)。因此，除非另有说明，否则本文使用的任何药代动力学参数均基于线性药代动力学模型(通过中央隔室的化合物消除)。
在一定时间t的“半衰期”T1/2(t)是将时间t存在的血浆浓度C(t)减半所需的时间，即C[t+T1/2(t)]＝C(t)/2。当t趋于无穷大时，“终末半衰期”是T1/2(t)的极限。
如果共同施用有效量的本发明多肽，相对于单独施用FVIII，所施用的FVIII的终末半衰期增加至少25％，优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，最优选至少150％。本发明的另一方面是使用上文定义的多肽来增加因子VIII的终末半衰期。
本文所用的术语“MRT”是指药物分子(例如本发明的多肽或FVIII)停留在体内的平均时间。在具有恒定清除率的线性药代动力学系统中，MRT可以计算为第一时刻曲线下面积(AUMC)除以血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。第一时刻曲线是时间乘以当时的血浆浓度。
如果共同施用有效量的本发明多肽，相对于单独施用FVIII，所施用的FVIII的MRT增加至少25％，优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少100％，最优选至少150％。本发明的另一方面是上文定义的多肽来增加因子VIII的终末半衰期或平均停留时间(MRT)或降低因子VIII的清除率的用途。
本文所用的术语“清除率”是指血浆清除药物的速率。具体地，它是药物的当前消除速率除以其当前的血浆浓度。在单次静脉内施用后的线性药代动力学系统中，清除率可以计算为剂量相对于血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)的比，只要清除率是恒定的。清除率越小，血浆清除药物所花费的时间越长。
如果共同施用有效量的本发明多肽，相对于单独施用FVIII，所施用的FVIII的清除率降低至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少60％，最优选至少70％。
本发明进一步涉及增加体内因子VIII MRT或半衰期的方法，或降低体内因子VIII清除率的方法，包括向受试者施用有效量的如上所定义的多肽。
如本文所用，术语“FVIII的体内回收”定义为相对于所施用的FVIII的总量将循环中的的百分比外推至t＝0的FVIII的百分比。作为用于计算循环中预期的FVIII浓度的基础，通常假定40mL/kg的血浆体积。
本发明还涉及上文定义的多肽的用途，例如，但不限于上述表1中详细描述的用于增加FVIII的体内恢复的实施方案[01]至[72]。相对于没有施用多肽的FVIII的回收率，FVIII的体内回收率增加至少5％，优选至少10％，更优选至少15％，18％，20％，25％，甚至更优选至少26％，27％，28％，29％或30％，最优选超过35％或甚至超过40％。
本发明的另一方面是一种治疗凝血障碍的方法，包括向有需要的患者施用有效量的如上文所定义的多肽。
另一方面是上文定义的多肽的用途，例如，通过但不限于上述表1中的实施方案[01]至[72]中的任何一个，用于降低治疗血友病A中FVIII的施用频率。静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少至每周两次。或者，静脉内或皮下施用FVIII的频率可以减少到每周一次，甚至更低，例如每10天一次或每14天一次。FVIII可以每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或任何两个前述值之间的任何范围，例如每四天到每月，每10天至每两周，或者每周两到三次，等。
另一方面是如上所定义的多肽来降低在治疗血友病A中施用的FVIII的剂量的用途。
治疗凝血障碍
本发明的多肽可用于治疗包括血友病A在内的凝血障碍。术语“血友病A”是指功能性凝血FVIII缺乏症，其通常是遗传性的。
疾病的治疗包括已经在任何临床阶段或症状时诊断为患有任何形式的疾病的患者的治疗；疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化的延缓；和/或预防和/或降低疾病的严重性。
向其施用本发明多肽的“受试者”或“患者”优选是人。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。
在本文中描述了包含本发明的多肽和任选的FVIII的组合物。组合物通常作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。
术语“因子VIII”和“FVIII”在本文中可互换使用并且包括血浆衍生的FVIII和重组FVIII。重组FVIII包括但不限于全长FVIII以及双链B结构域缺失或截短的变体以及单链B结构域缺失或截短的变体，例如WO 2004/067566中描述的和具有在B结构域外突变但具有FVIII的生物活性的其它FVIII变体。
本发明的多肽可以通过各种途径施用于患者，例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、腹腔内、肌内、外用或局部。任何给定情况下最合适的施用途径将取决于具体的多肽、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用本发明的多肽。
优选静脉内或皮下施用多肽和FVIII。
在第一个实施方案中，静脉内施用多肽和FVIII二者。在第二个实施方案中，皮下施用多肽和FVIII二者。
在另一个实施方案中，静脉内施用FVIII，并且通过不同的途径施用多肽。在进一步的实施方案中，皮下施用多肽，并且经由不同的途径施用FVIII。例如，可以皮下施用多肽，并且可以静脉内施用FVIII。
在另外的实施方案中，皮下施用FVIII，并且多肽通过不同的途径施用。在另外的实施方案中，静脉内施用多肽，并通过不同的途径施用FVIII。例如，可以静脉内施用多肽，并且可以皮下施用FVIII。
确定用本发明的多肽的总剂量和治疗长度在本领域技术人员的能力范围内。待施用的本发明的多肽的剂量取决于待施用的FVIII的浓度、待治疗的患者中的内源性VWF的浓度或两者。考虑到本发明的多肽的分子量，本领域技术人员可以确定基于本申请的发明人定义的比例的有效剂量。FVIII的典型剂量可以为约20U/kg体重至约100U/kg体重。
根据本发明，用本发明多肽治疗的患者也用凝血因子VIII治疗。本发明的多肽和因子VIII可以同时或以顺序的方式施用，两种施用方式包括在术语“联合治疗”和“共同施用”中。本发明的多肽和因子VIII可以作为混合物施用，即在相同的组合物内施用，或分开施用，即作为分开的组合物施用。
所用组合物中因子VIII的浓度的范围通常在10-10,000IU/mL。在不同的实施方案中，本发明组合物中FVIII的浓度的范围在10-8,000IU/mL，或10-5,000IU/mL，或20-3,000IU/mL或50-1,500IU/mL，或3,000IU/mL，或2,500IU/mL，或2,000IU/mL，或1,500IU/mL，或1,200IU/mL，或1,000IU/mL或800IU/mL，或750IU/mL，或600IU/mL，或500IU/mL，或400IU/mL，或300IU/mL，或250IU/mL，或200IU/mL，或150IU/mL，或125IU/mL，或100IU/mL，或62.5IU/mL，或50IU/mL，只要满足关于本文定义的本发明的VWF多肽的比例的要求即可。
“国际单位”或“IU”是通过使用针对以“IU”方式校准的国际标准制剂而校准的标准的FVIII活性测定测量的FVIII的凝血活性(效力)的量度单位，所述FVIII活性测定例如一步凝血测定或显色底物FVIII活性测定。一步凝血测定是本领域已知的，例如N Lee，Martin L et al.，An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIIIConcentrates，Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中所述的。一步测定的原理：该测试作为激活的部分凝血活酶时间(aPTT)测定的经修改的版本进行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血系统因子的激活。添加钙离子会引发凝血级联。测定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。该测定在存在因子VIII缺乏血浆的情况下进行。缺乏血浆的凝血能力由待测试样品中包含的凝血因子VIII恢复。凝血时间的缩短与样品中存在的因子VIII的量成正比。凝血因子VIII的活性通过与国际单位中具有因子VIII的已知活性的标准制剂直接比较来定量。
另一个标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例如coamaticFVIII测试试剂盒(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.le Monza 338-20128Milano，Italy)。显色测定原理：在钙和磷脂存在下，因子X被因子IXa激活成因子Xa。因子VIIIa作为辅因子刺激该反应。FVIIIa由待测样品中FVIII的反应混合物中的少量凝血酶形成。当使用最佳浓度的Ca2+，磷脂和因子IXa和过量的因子X时，因子X的活化与因子VIII的效力成正比。活化的因子X从显色底物S-2765中释放发色团pNA。因此，在405nm处测量的pNA的释放与所形成的FXa的量成正比，因此也与样品的因子VIII活性成正比。
药物组合物
可以通过将具有所需纯度的多肽与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子洗涤剂、抗氧化剂和其它各种添加剂混合制备适用于本文所述方法的本发明的多肽的治疗剂型，作为冻干制剂或水溶液储存。参见Remington's PharmaceuticalSciences,16th edition(Osol,ed.1980)。这样的添加剂所用的剂量和浓度必须对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH值保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mM至约50mM的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠柠檬酸盐混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡糖酸钠混合物，葡萄糖酸-氢氧化钠混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可以加入防腐剂以延缓微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量加入防腐剂。合适的防腐剂包括苯酚，苄醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)，氯化六甲双铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，L-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨醇，木糖醇，核糖醇，肌醇(myoinisitol)，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如纤维醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少残基的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质的0.1至10,000重量/重量份存在。
可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，普朗尼克多元醇，聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(
Figure BDA0001477397530000361
等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
另外的其它赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如EDTA)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素E)和共溶剂。
除了本发明的多肽之外，本文的制剂还可以含有第二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例提供如下。
施用方案可以根据许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程度和患者对本发明的多肽的敏感性)从每月一次到每天发生变化。在具体实施方案中，本发明的多肽以下面的方式施用：每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或在上述值中的任意两个值之间的任何范围，例如从每四个星期到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等。
待施用的本发明的多肽的剂量将根据具体的多肽、受试者以及疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和所选择的施用途径；可以由本领域技术人员容易地确定合适的剂量。
本领域技术人员将认识到，本发明的多肽的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用形式、途径和部位以及受治疗的特定受试者的年龄和状况确定，以及医生将最终确定要使用的合适的剂量。每当合适时，该剂量可以重复。如果发展出副作用，剂量的量和/或频率可以根据正常的临床实践改变或减少。
序列表中所示的核苷酸和氨基酸序列总结在表2中。表2：
Figure BDA0001477397530000381
以下实施例说明本发明，但不应将其解释为将本发明限制于下文所述的具体实施方案。
实施例
目的
我们旨在调查包含截短的VWF和半衰期延长部分的多肽(“本发明的多肽”)与FVIII和内源性VWF的比例分别对片段和FVIII的药代动力学(PK)的影响。
实验的概述如下表所示。
表3：
Figure BDA0001477397530000391
在药代动力学实施例中，计算出不同的摩尔比。因此，作出以下假设：
-药物在施用后在每kg体重40mL血浆中被稀释
-所使用的本发明多肽的分子量：D'D3-FP单体亚单位的分子量(包括糖基化)：127,000Da(HLEM＝人白蛋白)
-所使用的FVIII的分子量：rVIII-单链的分子量(含糖基化)：180,000Da，比活：11,000IU/mg
-作为D'D3-FP的一部分的白蛋白的分子量：66,000Da
使用相同摩尔FVIII活性的重组FVIII产物(rVIII-单链，
Figure BDA0001477397530000401
)，当以相同的活性剂量施用时计算相同的摩尔比
-内源性人、大鼠或兔VWF单体分子量(18-19％糖基化)：267,500Da
-假定内源性大鼠或兔VWF具有与人VWF相同的比活性，即一个U/mL(或标准的100％)假定为10μg/mL(公开的人浓度相关于一个U/mL或标准的100％)
-从12只CD大鼠使用
Figure BDA0001477397530000402
Ac试剂盒(SiemensHealthcareDiagnostics GmbH，Eschborn，Germany)，大鼠血浆内源性VWF活性测定为0.946±0.181U/mL并计算为35.36×10-9mol/L，针对标准人血浆(针对相应WHO标准进行校准，SiemensHealthcareDiagnostics GmbH)进行校准
-从来自实施例3的5只兔子使用
Figure BDA0001477397530000403
Ac试剂盒(SiemensHealthcare Diagnostics GmbH，Eschborn，Germany)，兔血浆中的内源性VWF活性测定为0.242±0.056U/mL并计算为9.05×10-9mol/L，针对标准人血浆(针对相应WHO标准进行校准，Siemens Healthcare Diagnostics GmbH)进行校准。
实施例1：通过在大鼠中共同施用rVIII-单链(恒定剂量)和递增的D'D3-FP剂量来延长FVIII的药代动力学
材料与方法
产生D'D3白蛋白融合蛋白(D'D3-FP)：
通过定制基因合成(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)制备由编码VWF氨基酸1至1242的cDNA、甘氨酸/丝氨酸接头和人白蛋白的cDNA组成的D'D3-FP的表达盒。通过侧接限制性位点(EcoRI、NotI)，从提供的克隆载体中切下表达盒并将其插入到用EcoRI和NotI线性化的pIRESneo3载体(BD Biosciences，FranklinLakes，NJ，USA)中。所得到的表达质粒含有CMV启动子控制下的通过短接头编码序列融合到白蛋白编码序列的编码VWF肽原D'和D3(SEQ ID NO：4的VWF氨基酸1至1242)的核苷酸序列。编码序列的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1，成熟D'D3-FP的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。
使用类似的方法产生用于加His标签的D'D3蛋白(通过甘氨酸/丝氨酸接头连接的D'D3和His8)和与人绒毛膜促性腺激素-β亚单位的C-末端肽融合的D'D3融合蛋白(也通过甘氨酸/丝氨酸接头连接并在融合蛋白的C-末端被加上8个组氨酸标签)的表达质粒。成熟D'D3-His8的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：7，成熟D'D3-CTP的氨基酸序列显示为SEQ IDNO：8。
如上所述的表达质粒在XL10Gold(Agilent Technologies)中生长并使用标准操作方案(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。
使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染CHO K1细胞，并在500-1000μg/ml遗传霉素存在下，在无血清培养基(CD-CHO，Invitrogen)中生长。共转染如WO2007/144173中所述的编码PACE/弗林蛋白酶(pFu-797)的表达质粒，以最大化肽原切割功效。根据其通过白蛋白特异性酶免疫测定(见下文)定量的D'D3-FP表达产量，生长并选择单细胞来源的克隆。最终选择用于D'D3-FP发酵的细胞系称为T2050-CL3。
在灌注模式下应用发酵方法的生物反应器中进行D'D3-FP的生产。用于生产含D'D3的多肽的发酵方法以细胞系T2050-CL3的解冻开始，随后在摇瓶中细胞扩增，最后使用Sartorius BioStat B-DCU 5L生物反应器和BioStat STR 50L一次性生物反应器以灌注模式进行的发酵过程。BioSeps 10L或200L(Applikon)分别用作细胞保留装置。细胞培养基是具有8mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO4的PowerCHO3(Lonza BESP1204)或具有10mM L-谷氨酰胺和1μM CuSO4的ProCHO5(Lonza BESP1072)。
摇瓶中的种子训练在37℃，7.5％CO2下以160rpm的摇床速度进行。
用2.5×105个细胞/mL的靶VCD接种5L生物反应器。在+37.0℃，pH为7.00，氧饱和度为30％下，在具有8mM L-谷氨酰胺和1μMCuSO4的PowerCHO3中培养细胞。在已经从+37℃的生物反应器进行初始收获之后，温度变换至+34.0℃(评价范围+31℃
Figure BDA0001477397530000421
+35℃)。使用鼓泡的CO2为酸和NaHCO3为碱来控制pH。覆盖空气流速设定为0.5L/min。使用环形鼓泡器作为鼓泡单元。在下拉(down pull)模式下，搅拌速率为150rpm，2倍倾斜度叶轮。
用3.0×105个细胞/mL的靶VCD接种50L生物反应器。在+37.0℃，pH为6.90，氧饱和度为30％下，在具有10mM L-谷氨酰胺和1μMCuSO4的ProCHO5培养基中培养细胞。在初始的一个或两个收获之后，温度变换至+34.0℃。PH控制如上，覆盖空气流速设定为2L/min。使用微量鼓泡器作为鼓泡单元。在下拉模式下，搅拌速率为90rpm，2倍倾斜度叶轮。
当生物反应器中的VCD≥1×106个细胞/mL时，开始灌注。灌注速率设定为1.0体积/体积/天。BioSep在7(30)W的输入功率下以反冲洗模式操作，其为5(10)分钟运行时间和10秒反冲洗(括号中的数字表示50L生物反应器)。将灌注液和排出液进行直列式(inline)过滤并在+2至+8℃下经48小时收集于袋中。使用葡萄糖消耗作为参数，使用2g/L葡萄糖的靶标，使用浊度探头通过活性排出控制VCD。收获液和排出液进行直列式过滤，由一次性过滤器和一次性袋组成的收获系统每隔一天更换一次。
为了制备如下所述的PK分析的材料，通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化D'D3白蛋白融合蛋白收获物。简而言之，使用具有30kD膜(例如Pall Centramate OS030T12)的TFF系统(例如PallCentramate 500S)将来自生物反应器的无细胞收获物浓缩30倍。将浓缩物加入NaCl和EDTA至终浓度为0.75M NaCl和5mM EDTA，并加载至用20mM Tris缓冲液pH 7.4预平衡的CaptureSelect HumanAlbumin柱(Life Technologies)上过夜。用平衡缓冲液洗涤柱后，用洗脱缓冲液(20mM Tris，2M MgCl2，pH7.4)洗脱D'D3-FP。然后将洗脱液10倍浓缩，并使用具有30kD截止值的超离心过滤器(例如Amicon.UFC903024)用50mM Tris，150mMNaCl，pH 7.4进行透析。为了将D'D3-FP二聚体与单体部分分开，将该材料加载至用50mMTris，150mM NaCl，pH 7.4预平衡的Superdex 200pg柱(GEHealthcare Code：17-1069-01)上，合并含有D'D3-FP二聚体的峰级分。使用二聚体和单体峰级分曲线下面积计算二聚体与单体的比例。D'D3-FP的二聚体制剂用于实施例1-4中的药代动力学实验。
加His标签的D'D3蛋白通过Ni-螯合亲和力和尺寸排阻层析纯化。简而言之，将TFF浓缩的无细胞生物反应器收获物(详见上文)加载至预平衡(20mM磷酸钠/500mM NaCl，pH7.4)的Ni-Sepharose柱(HisTrapTM，GE Healthcare)上过夜。用20mM磷酸钠/500mMNaCl/30mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱子后，用20mM磷酸钠+500mMNaCl+500mM咪唑(pH 7.4)洗脱该蛋白质。然后浓缩洗脱液并使用Amicon超离心过滤器(参见上文)透析(TBS，pH7.4)。然后将最终产物加载到SEC柱上(参见上文)，将含有二聚体的峰级分合并并浓缩至约7mg/mL OD280-320。
动物：
在Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)培育重量范围为240-300g的雌性Crl：CD(Sprague Dawley)大鼠。在室内，动物被保持在标准安置条件下，即在21-22℃，12小时/12小时的光-暗周期。动物随意饲喂标准大鼠饮食(
Figure BDA0001477397530000431
，Soest，Germany)。自来水随意提供。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。组大小为n＝6，分为2个组群。因此，使用每个时间点n＝3只动物。
实验室评估：
测试品以总体积为3mL/kg通过单次注射i.v.施用到侧尾静脉中。D'D3-FP制剂以基于人白蛋白值的50至10,000μg/kg的剂量水平应用，并在+37℃孵育约30分钟后与200IU/kg rVIII-单链(rVIII-单链，显色活性)共同施用。仅接受rVIII-单链的动物用作对照(表4)。这导致施用的D'D3-FP(以单体计算)相对于rVIII-单链的摩尔比的范围为7.5至1500，以及D'D3-FP相对于内源性大鼠VWF的摩尔比(均作为单体以针对FVIII结合位点调节)的范围为0.54至107.1。
使用交替取样方案静脉内推注注射后5分钟、3、8、24、32、48、56和72小时，在短期麻醉下，对血液样品进行眶后取血。PK曲线是从每组两只大鼠的两个组群获得的。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃保存用于测定FVIII抗原和/或白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来确定D'D3-FP暴露。因此，任何量或剂量的D'D3-FP表示为白蛋白的量或剂量。其他含D'D3的多肽用D'D3特异性Elisa检测。用来自Stago，S.A.S.，France的FVIII Asserachrom ELISA检测试剂盒检测FVIII:Ag血浆水平。
在具有商业化多克隆抗体制剂的Elisa中的血浆样品中测量D'D3-白蛋白融合物。对于捕获和检测，使用相同的抗体，除了检测抗体是POD标记的。简而言之，将96孔板(NuncImmuno-Plate Maxisorp，商品编号449824)的每个孔用100μL包被溶液(山羊抗人白蛋白IgG，目录号A80-129A，Bethyl Laboratories，稀释在50mM包被缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Capsules，Sigma产品号：C-3041)中至2μg/mL)包被，并在+21℃孵育2-20小时。包被程序之后，使用洗涤缓冲液(具有吐温20的磷酸盐缓冲盐水，Sigma产品号：P3563)进行3次洗涤步骤。随后用封闭溶液(Candor Biosience，目录号110500)在+21℃封闭1.5小时，然后再进行3次洗涤步骤。随后将100μl每个样品施加到板上并在+37℃孵育1小时。作为标准，将样品缓冲液(LowCross Buffer，Candor Biosience，目录号100500)以2步递减的形式稀释所测试物质的相应注射溶液至浓度为50ng/mL至0.78ng/mL。取自动物的柠檬酸盐化血浆样品也用样品缓冲液至少1:30稀释，样品缓冲液也施加作为空白。再经过4次洗涤步骤，将100μL检测溶液(POD标记的抗人白蛋白IgG，目录号A80-129P，Bethyl Laboratories，封闭液溶液1:40000稀释)施加至每个孔并在+37℃45min。再经过4次洗涤步骤，每孔100μL的显色底物(TMB，Siemens Healthcare产物OUVF，OUVG)施加20分钟，然后每孔加入另外100μl终止溶液(OSFA，Siemens Healthcare)。在酶标仪中在450/650nm测量板。
在具有专用的抗D'D3抗体的抗D'D3夹心ELISA的血浆样品中测量不含白蛋白的含D'D3的多肽。简而言之，将96孔板(Nunc Immuno-Plate Maxisorp，产品号449824)的每个孔用100μL包被溶液(D'D3捕获抗体在50mM包被缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Capsules，Sigma产品号：C-3041)中稀释至1μg/mL)包被，并在+21℃孵育16小时。包被程序之后，使用洗涤缓冲液(具有吐温20的Tris缓冲盐水，Sigma产品号：T9039)进行3次洗涤步骤。用封闭溶液(Candor Bioscience，目录号110500)在+21℃封闭1.5小时，然后再进行3次洗涤步骤。随后将每个样品各100μl施加到板上并在+21℃孵育1.5小时。作为标准，将样品缓冲液(具有吐温20的Tris缓冲盐水，Sigma产品号：T9039)以2步递减的形式稀释所测试的物质的相应注射溶液至浓度为70ng/mL至1.1ng/mL。柠檬酸盐化血浆样品也用样品缓冲液至少1:30稀释，样品缓冲液也施加作为空白。再经过3次洗涤步骤，将100μL检测溶液(POD标记的抗D'D3检测抗体(专有研究级制剂)，在样品缓冲液中稀释至0.2μg/mL)施加至每个孔，并在+21℃下孵育1小时。再经过3次洗涤步骤，每孔100μL的显色底物(TMB，Siemens Healthcare产品号：OUVF，OUVG)施加30分钟，然后每孔施加另外的100μl终止溶液(OSFA，SiemensHealthcare)。在酶标仪中在450/650nm测量板。
平均停留时间(MRT)、清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算是通过非隔室方法进行的。
表4：处理组
Figure BDA0001477397530000461
FVIII:C＝显色FVIII活性；rVIII-SC＝rVIII-单链
*D'D3-FP作为单体计算
**D'D3-FP相对于内源性VWF单体作为单体计算以比较相同数量的FVIII结合位点。对于内源性大鼠VWF的计算，假设为与人VWF相同的比活性，即假定一个U/mL(或标准的100％)为10μg/mL(测量的大鼠血浆浓度为0.946U/mL)
结果
通过测定白蛋白组分，然后计算D'D3-FP浓度来定量D'D3-FP，并且所有测量数据都远高于测定的检测限(至多72小时p.a.)。ELISA用于特异性检测人白蛋白。D'D3-FP的平均停留时间(MRT)和清除率不受在0.05至10mg/kg i.v范围内给定剂量的影响。(图1和表5)。
通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(200IU/kg显色FVIII活性)的暴露在D'D3-FP存在下延长(图2和表5)。因此，在rVIII-单链组中，FVIII:Ag在24-32小时p.a.时达到117mIU/mL的检测限，而在用5和10mg/kg共同处理的组中D'D3-FP共处理组具有剂量依赖性地增加血浆浓度并且在72小时p.a.时未达到检测限。
已经是最低剂量的0.05mg/kg i.v.的D'D3-FP增加了rVIII-单链的MRT和终末半衰期并且清除率略有降低。至多0.2mg/kg，仅在MRT、终末半衰期和清除率方面观察到微小的变化，而对于0.5至10mg/kg，观察到MRT和终末半衰期剂量依赖性增加或清除率降低。因此得出结论，在该实验设置中，需要相对于rVIII-单链约75倍过量的D'D3-FP(0.5mg/kg剂量)以相应地延长FVIII半衰期。
假定在较低剂量的D'D3-FP情况下，内源性大鼠VWF与D'D3-FP竞争与更高剂量相比更有效地与共施用FVIII结合，从而解释D'D3-FP剂量在FVIII PK上的剂量依赖性。
与单独施用的rVIII-单链相比，计算MRT和终末半衰期增加和清除率的降低见表5。rVIII-单链与0.05-0.2mg/kg D'D3-FP的共同施用降低了清除率并延长MRT和终末半衰期小于2倍。从0.5mg/kg(D'D3-FP相对于rVIII-单链的摩尔比＝75；相对于内源性大鼠VWF的摩尔比＝5.36)开始，可以观察到剂量依赖行降低清除率和增加MRT和终端半衰期。即使剂量为10mg/kg D'D3-FP(D'D3-FP相对于rVIII-单链的摩尔比＝1500；相对于内源性大鼠VWF的摩尔比＝107.1)，则观察到相对于较低剂量的进一步变化，表明还没有达到该作用的平台期。
表5：在大鼠中共同施用rVIII-单链和D'D3-FP后，D'D3-FP和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)
剂量D'D3-FP为0.05-10mg/kg，剂量rVIII-单链为200IU/kg
Figure BDA0001477397530000481
rVIII-SC＝rVIII-单链
a来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数降低
b来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数增加
c以μg/mL测定白蛋白
实施例2：通过在大鼠中以不同剂量(D'D3-FP：rVIII-单链的比例恒定)共同施用rVIII-单链和D'D3-FP延长FVIII的药代动力学
材料与方法
动物：在Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)培育重量范围为220-270g的雌性Crl：CD(Sprague Dawley)大鼠。在室内，动物被保持在标准安置条件下，即在21-22℃，12小时/12小时的光-暗周期。动物随意饲喂标准大鼠饮食(
Figure BDA0001477397530000491
，Soest，Germany)。随意提供自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
组大小为n＝6，分为2个组群。因此，使用每个时间点n＝3只动物。
实验室评估：测试品以总体积为4.5mL/kg通过单次注射i.v.施用到侧尾静脉中。D'D3-FP制剂基于人白蛋白值以1至10mg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与100至1000IU/kg rVIII-单链(rVIII-SingleChain，显色活性)以恒定的D'D3-FP对rVIII-单链的比例共同施用。仅接受rVIII-单链的动物用作对照(表6)。
使用交替取样方案静脉内推注注射后5分钟、3、8、24、32、48、56和72小时，在短期麻醉下，对血液样品进行眶后取血。PK曲线是从每组两只大鼠的两个组群获得的。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃保存用于测定FVIII抗原和/或白蛋白。
通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来确定D'D3-FP暴露。因此，任何量或剂量的D'D3-FP表示为白蛋白的量或剂量。用来自Stago，S.A.S.，France的FVIIIAsserachrom ELISA检测试剂盒检测FVIII:Ag血浆水平。
平均停留时间(MRT)、清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算是通过非隔室方法进行的。
表6：处理组
Figure BDA0001477397530000501
FVIII:C＝显色FVIII活性；rVIII-SC＝rVIII-单链
*D'D3-FP作为单体计算
**D'D3-FP相对于内源性VWF单体作为单体计算以比较相同数量的FVIII结合位点。对于内源性大鼠VWF的计算，假设为与人VWF相同的比活性，即假定一个U/mL(或标准的100％)为10μg/mL(测量的大鼠血浆浓度为0.946U/mL)
结果
通过其白蛋白组分定量D'D3-FP，并且所有测量数据(至多72小时p.a.)都远高于测定的检测限。D'D3-FP的平均停留时间(MRT)和清除率不受在1至10mg/kg i.v.范围内给定剂量的影响(图3和表7，与图1和表5进行比较)。
通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(100至1000IU/kg显色FVIII活性)的暴露在D'D3-FP存在下延长(图4和表7)。随着剂量依赖性的FVIII暴露，低剂量rVIII-单链组在24小时p.a.时达到了117mIU/mL的FVIII:Ag检测限，而较高剂量后来达到检出限，并且用D'D3-FP的共同处理观察到最长的曲线，特别是两个高剂量D'D3-FP共同处理组在至多72小时p.a.时均未达到检测限。
FVIII的药代动力学特征不受FVIII剂量的影响。如前所述，D'D3-FP药代动力学也不受D'D3-FP剂量的影响。
表7：在大鼠中共同施用rVIII-单链和D'D3-FP后，D'D3-FP和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)
剂量D'D3-FP为1至10mg/kg，剂量rVIII-单链为100至1000IU/kg，恒定的D'D3-FP与rVIII-单链的比例。
Figure BDA0001477397530000511
rVIII-SC＝rVIII-SingleChain(rVIII-单链)
a来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数降低
b来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数增加
c以μg/mL测定白蛋白
实施例3：通过在兔中共同给予rVIII-单链(恒定剂量)和递增D'D3-FP剂量来延长FVIII的药代动力学
材料与方法
动物：体重范围为2.2-2.8kg(Bauer，Neuental，Germany)的雌性CHB兔每笼一个在标准安置条件即21-23℃和50％相对湿度、12小时/12小时的光-暗周期下被保持在铁丝笼中。给动物随意提供自来水和饲喂兔颗粒(
Figure BDA0001477397530000521
，Deutsche Tiernahrung CremerGmbH&Co.KG，Düsseldorf，Germany)。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
实验室评估：测试品通过单次注射i.v.施用到侧耳静脉，组大小每组n＝3只动物。D'D3-FP制剂以基于人白蛋白值的0.5至3mg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与150IU/kg rVIII-单链(rVIII-SingleChain，显色活性)共同施用。仅接受rVIII-单链的动物用作对照(表8)。
在施用前、静脉内推注后5和30分钟、1、2、4、6、8、24、32、48、72和96小时(rVIII-单链)或施用前、静脉内推注后5分钟、1、4、8、24、32、48、72、96、120、144和168小时(与D'D3-FP共同处理的rVIII-单链)，从耳动脉取血液样品。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃下储存用于测定FVIII抗原和/或D'D3-FP。通过使用人白蛋白特异性ELISA测量构建体的白蛋白部分来确定D'D3-FP暴露。因此，任何量或剂量的D'D3-FP表示为白蛋白的量或剂量。通过ELISA(Asserachrom Stago，S.A.S.，France)检测FVIII:Ag血浆水平。
平均停留时间(MRT)、清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算是通过非隔室方法进行的。
表8：处理组
Figure BDA0001477397530000531
FVIII:C＝显色FVIII活性；rVIII-SC＝rVIII-单链
*D’D3-FP作为单体计算
**D’D3-FP相对于内源性VWF单体作为单体计算以比较相同数量的FVIII结合位点。对于内源性大鼠VWF的计算，假设为与人VWF相同的比活性，即假设一个U/mL(或标准的100％)为10μg/mL(测量的兔血浆浓度为0.242U/mL)
结果
一般来说，大鼠和兔的结果非常具有可比性。详细观察结果如下：
通过其白蛋白成分定量D'D3-FP；并且测量值远高于测定的检测限(至多测量的168小时p.a.)。剂量在0.5至3mg/kg范围内的增加不影响MRT和清除率(图5)或终末半衰期(表9)。
通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(150IU/kg显色FVIII活性)的暴露在D'D3-FP存在下相关地延长(图6)。在兔中，当单独给予rVIII-单链(检测限117mIU/mL)时，FVIII:Ag的血浆水平可以最大限度地在至多48小时p.a.时测量，并且与3mg/kgD'D3-FP共处理后最大限度地可在至多168小时p.a.的最后时间点时测量。像大鼠一样，这种PK的延长剂量依赖性。
表9：
rVIII-单链和D'D3-FP在兔中共同施用后，D'D3-FP和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)
剂量D'D3-FP为0.5-3mg/kg，剂量rVIII-单链为150IU/kg
Figure BDA0001477397530000541
rVIII-SC＝rVIII-SingleChain(rVIII-单链)
a来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数降低
b来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数增加
c以μg/mL测定白蛋白
FVIII:Ag的清除率、MRT和终末半衰期增加的计算见表9。0.5mg/kg(D'D3-FP相对于rVIII-单链的摩尔比＝100)的最低共施用剂量已经相关延长FVIII:Ag暴露。D'D3-FP剂量增加至3mg/kg(D'D3-FP相对于rVIII-单链的摩尔比＝600)导致FVIII:Ag MRT和终末半衰期延长至少2.5倍，FVIII:Ag的清除率降低2.5倍。
实施例4：通过在兔中共同施用不同重组FVIII产物与D'D3-FP的来延长FVIII的药代动力学
材料与方法
动物：体重范围为2.2-2.8kg(Bauer，Neuental，Germany)的雌性CHB兔每笼一个在标准安置条件即21-23℃和50％相对湿度、12小时/12小时的光-暗周期下被保持在铁丝笼中。给动物随意提供自来水和饲喂兔颗粒(
Figure BDA0001477397530000551
Deutsche Tiernahrung CremerGmbH&Co.KG，Düsseldorf，Germany)。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
实验室评估：测试品通过单次注射i.v.施用到侧耳静脉，组大小每组n＝3只动物。D'D3-FP制剂以基于人白蛋白值的1.5mg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与150IU/kg rVIII-单链(rVIII-SingleChain，根据测定的显色活性给予剂量)、150IU/kg
Figure BDA0001477397530000552
(重组全长FVIII，根据标记给予剂量)或150IU/kg
Figure BDA0001477397530000553
(重组B结构域缺失的FVIII，根据标记给予剂量)共同施用。仅接受150IU/kg rVIII-单链、
Figure BDA0001477397530000554
或
Figure BDA0001477397530000555
的动物作为对照(表10)。
在施用前、静脉内推注后5和30分钟、1、2、4、6、8、24、32、48、72和96小时(单独重组FVIII产物)或施用前、静脉内推注后5分钟、1、4、8、24、32、48、72、96、120、144和168小时(与D'D3-FP共同处理的重组FVIII产物)，从耳动脉取血液样品。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃下储存用于测定FVIII抗原和/或D'D3-FP。通过使用人白蛋白ELISA测量构建体的白蛋白部分来确定D'D3-FP暴露。因此，任何量或剂量的D'D3-FP表示为白蛋白的量或剂量。通过ELISA(AsserachromStago，S.A.S.，France)检测FVIII:Ag血浆水平。
平均停留时间(MRT)、清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算是通过非隔室方法进行的。
表10：处理组
Figure BDA0001477397530000561
rFVIII＝重组因子VIII；rVIII-SC＝rVIII-单链
*D’D3-FP作为单体计算
**D’D3-FP相对于内源性VWF单体作为单体计算以比较相同数量的FVIII结合位点。对于内源性大鼠VWF的计算，假设为与人VWF相同的比活性，即假设一个U/mL(或标准的100％)为10μg/mL(测量的兔血浆浓度为0.242U/mL)
假设：所有产物具有相同的比活性，从而计算相同的摩尔比
结果
通常，不同重组FVIII产物之间的结果非常具有可比性。由于D'D3-FP的共同施用引起血浆FVIII延长的详细观察结果如下：
通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(150IU/kg显色FVIII活性)的暴露在D'D3-FP存在下相关地延长(图7)。当单独给予重组FVIII产物(检测限117mIU/mL)时，FVIII:Ag的血浆水平可以最大限度地在至多32小时p.a.(
Figure BDA0001477397530000562
)或48小时p.a.(rVIII-单链和
Figure BDA0001477397530000563
)时测量，并且与D'D3-FP共处理后最大限度地可在至多96小时p.a.(
Figure BDA0001477397530000564
)或120小时p.a.(rVIII-单链和
Figure BDA0001477397530000565
)的最后时间点时测量。
表11：在不同的rFVIII产物和D'D3-FP在兔中共同施用后，D'D3-FP和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)
剂量D'D3-FP为1.5mg/kg，剂量rFVIII为150IU/kg
Figure BDA0001477397530000571
rVIII-SC＝rVIII-SingleChain(rVIII-单链)
a来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数降低
b来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数增加
c以μg/mL测定白蛋白
FVIII:Ag的清除率的降低、MRT和终末半衰期增加的计算见表11。所有三种产物的清除率都相当可观，即2.4倍至2.7倍的变化。基于单独三种重组FVIII产物的t1/2和MRT差异，当单独给予时，
Figure BDA0001477397530000572
的MRT和t1/2的相对增加显示较高的变异性，范围为3.0-3.2倍，其药代动力学最短，当单独给予时，rVIII-单链和
Figure BDA0001477397530000573
为1.7-2.0倍，其显示出大致相当的药代动力学。综合考虑并主要考察相对减少的清除率，三种重组FVIII产物的药代动力学延长非常具有可比性。
实施例5：通过在大鼠中共同施用rVIII-单链与D'D3-His8以及D'D3-CTP融合蛋白来延长FVIII的药代动力学
材料与方法
动物：在Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)培育重量范围为230-300g的雌性Crl：CD(Sprague Dawley)大鼠。在室内，动物被保持在标准安置条件下，即在21-22℃，12小时/12小时的光-暗周期。动物随意饲喂标准大鼠饮食(
Figure BDA0001477397530000581
，Soest，Germany)。随意提供自来水。动物饲养和研究程序符合德国动物福利法和欧盟法规。
组大小为n＝6，分为2个组群。因此，使用每个时间点n＝3只动物。
实验室评估：测试品以总体积为3.0mL/kg通过单次注射i.v.施用到侧尾静脉中。包含D'D3的蛋白质基于OD值以1mg/kg的剂量水平施用，并在+37℃孵育约30分钟后与200IU/kg rVIII-单链(rVIII-SingleChain，显色活性)共同施用。这导致包含D'D3的蛋白质相对于rVIII-单链的比例为78和相对于内源性VWF的比例为5.6(表12)；仅接受rVIII-单链的动物用作对照。
使用交替取样方案静脉内推注注射后5分钟、3、8、24、32、48、56和72小时，在短期麻醉下，对血液样品进行眶后取血。PK曲线是从每组两只大鼠的两个组群获得的。使用柠檬酸钠(2份柠檬酸钠3.13％+8份血液)将血液样品进行抗凝处理，加工成血浆，并在-20℃保存用于测定FVIII抗原和/或D'D3融合蛋白。
通过使用D'D3-FP作为标准的ELISA法来确定D'D3-His8和D'D3-CTP融合蛋白暴露(参见上文)。用来自Stago，S.A.S.，France的FVIII Asserachrom ELISA检测试剂盒检测FVIII:Ag血浆水平。
平均停留时间(MRT)、清除率(CL)和终末半衰期(t1/2)的估算是通过一个隔室方法进行的。
表12：处理组
Figure BDA0001477397530000591
FVIII:C＝显色FVIII活性；rVIII-SC＝rVIII-单链
*D'D3-His8和D'D3-CTP蛋白剂量基于OD
**D'D3-His8和D'D3-CTP蛋白剂量通过分子量校正
***D'D3-His8和D'D3-CTP相对于内源性VWF单体作为单体计算以比较相同数量的FVIII结合位点。对于内源性大鼠VWF的计算，假设为与人VWF相同的比活性，即假定一个U/mL(或标准的100％)为10μg/mL(测量的大鼠血浆浓度为0.946U/mL)
结果
所有测量数据(至多72小时p.a.)都远高于检测限。MRT、t1/2和清除率表明，与D'D3-8His相比，D'D3-CTP具有更长的半衰期和平均停留时间以及降低的清除率，但甚至是D'D3-8His也显示出稍长的MRT和半衰期以及降低的清除率(表13)。
在两种D'D3蛋白的存在下，通过ELISA定量为FVIII:Ag的共同施用的FVIII(200IU/kg显色FVIII活性)的药代动力学参数得到改善(表13)。包含D'D3的蛋白质的暴露差异转化为FVIII:Ag暴露的差异，即D'D3-CTP导致比D'D3-8His更长的FVIII:Ag暴露。
表13：在大鼠中共同施用rVIII-单链和D'D3蛋白之后，包含D'D3的蛋白质和FVIII:Ag的药代动力学参数(非隔室分析)。剂量包含D'D3的蛋白质为1mg/kg，剂量rVIII-单链为200IU/kg。
Figure BDA0001477397530000601
rVIII-SC＝rVIII-单链
a来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数降低
b来自单独给予rVIII-单链的数据的倍数增加
c基于OD测定
PK研究结果的结论
这些研究表明，D'D3-FP与FVIII产物的共同施用延长了FVIII:Ag血浆MRT和半衰期，降低了FVIII:Ag清除率，无论FVIII分子是否含有B结构域、还是B区缺失或是呈现为单链或双链产物。这种延长仅取决于D'D3-FP相对于共同施用FVIII以及内源性VWF的比例。
当就D'D3-FP相对于施用的rVIII-单链的摩尔比(图8)以及相对于内源性VWF的摩尔比(图9)而言终末半衰期和MRT增加或清除率减少时，大鼠的作用往往比兔更强。关于相对于rVIII-单链的摩尔比，在大鼠<30倍的比例导致小于两倍的变化，而在>50倍的比例可以获得更有利的效果，从约300倍的比例开始可以实现等于或大于2.7倍的改善。甚至高于750优选为1000或更优选为1250甚至更优选为1500的更高的比例导致终末半衰期和MRT的改善仍然更高，或清除率降低。
关于相对于内源性VWF的比例，物种特异性差异较大，这表明在大约比例≥5在大鼠(和假定在人中具有与大鼠相似的内源性VWF水平)和在大约>60在兔中可能实现2倍的改善。在比例大约>50在大鼠中，实现3倍的改善。
出乎意料的是，可以显示，当以相对于共同施用的FVIII的比例为78和相对于内源性VWF的比例为5.6施用时，没有半衰期延长部分的D'D3-His8也稍微延长FVIII药代动力学参数。在这些比例用D'D3-CTP融合蛋白获得FVIII半衰期和平均停留时间的更好的延长以及降低的清除率，所述D'D3-CTP融合蛋白包含人绒毛膜促性腺激素-β亚单位的C-末端肽作为半衰期延长部分而不是D'D3-FP中包含的白蛋白。
由于在大鼠和在兔(与人血友病A患者相反)中，人施用和内源性FVIII与D'D3-FP和VWF竞争结合位点，可以预期在人血友病A患者中对FVIII的作用甚至更强。
实施例6：测定FVIII对VWF片段二聚体和单体的亲和力
在生物反应器中表达VWF片段(1-1242)白蛋白融合物(D'D3-FP)；在如上所述的纯化和单体和二聚体的分离之后，经由Biacore仪器(T200，GE Healthcare)通过表面等离子体共振来评估FVIII对这些制剂的亲和力。
通过NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(乙醇胺盐酸盐)(两者均包含在来自GEHealthcare的胺偶联试剂盒(BR1000-50)中)将抗白蛋白抗体(MA1-20124，ThermoScientific)经由其N-末端共价偶联到活化的CM 3芯片上。对于固定化，将3μg/mL抗体在乙酸钠缓冲液(10mM，pH5.0)中稀释，并将抗体溶液以流速10μL/min流过芯片7分钟。在固定化程序之后，通过将乙醇胺溶液(1M，pH 8.3)以流速10μL/min流过芯片5分钟，使非偶联的葡聚糖细丝饱和。饱和流动池的目的是使分析物与芯片的非特异性结合最小化。通过使用与上述相同的程序用乙醇胺饱和空流动池来建立参考流动池。
分别通过D'D3-FP蛋白(5μg/mL)以10μL/min的流速流过芯片3分钟，将二聚体和单体D'D3-FP蛋白质固定在共价偶联的抗白蛋白抗体上。二聚体D'D3-FP的捕获质量为335RU，单体D'D3-FP为147RU，假定在单体上和二聚体D'D3-FP上对于FVIII都有一个结合位点。
为了产生FVIII的结合曲线，将每种D'D3-FP蛋白制剂在运行缓冲液(HBS-P+：0.1MHEPES、1.5M NaCl和0.5％v/v Surfactant P20，pH7.4；产品代码BR100671，GEHealthcare)中稀释至0.25nM、0.5nM、1nM、3nM和4nM的浓度。通过进行单循环动力学，将每个稀释物浓度升高的样品流过芯片2分钟(流速30μL/min)，然后解离时间为10分钟，运行缓冲液HBS-P+。所有测量均进行两次。将测量程序的温度调节至+25℃。
使用BiaEvaluation Software计算结合参数。曲线拟合方法基于Langmuir方程。用于计算的输入数据是分析物FVIII(rVIII-单链)的摩尔质量，其他参数如最大RU值和斜率自动从拟合的结合和解离曲线中提取出来。BiaEvaluation Software的输出是结合速率常数和解离速率常数，从中计算亲和力常数。结果示于表12。
表12：D'D3-FP二聚体和单体的FVIII亲和力数据
Figure BDA0001477397530000621
rVIII-单链与单体D'D3-FP的结合速率常数略有增加，而rVIII-单链与D'D3-FP二聚体的解离速率常数是单体的三分之一。解离速率常数和结合速率常数的商表示rVIII-单链对D'D3-FP的亲和力。因此与D'D3-FP单体相比，二聚体D'D3-FP显示出对FVIII的增加的亲和力。
序列表
<110> 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司
<120> 用于治疗血友病的截短的血管性血友病因子多肽
<130> A222
<150> EP 15168930.4
<151> 2015-05-22
<150> EP 16163239.3
<151> 2016-03-31
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5616
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding construct VWF fragment - G/S linker - albumin
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction enzyme cleavage site
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(3757)
<223> coding sequence for VWF amino acids 1 to 1242
<220>
<221> misc_feature
<222> (3758)..(3850)
<223> coding sequence for glycine/serine linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (3851)..(5608)
<223> coding sequence for human albumin
<220>
<221> misc_feature
<222> (5609)..(5616)
<223> NotI restriction enzyme cleavage site
<400> 1
gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60
gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120
atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180
gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240
ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300
attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360
catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420
cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480
gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540
agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600
atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660
caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720
cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780
tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840
gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900
gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960
gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020
ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080
cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140
catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200
cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260
ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320
ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380
cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440
cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500
gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560
gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620
ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680
gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740
cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800
cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860
cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920
cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980
gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040
ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100
cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160
ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220
ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280
cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340
catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400
aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460
ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520
ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580
ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640
cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700
gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760
gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820
gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880
gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940
ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000
gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060
caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120
gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180
catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240
ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300
ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360
gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420
cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480
acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540
ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600
cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660
gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720
caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780
tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840
gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900
aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960
agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020
gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080
tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140
gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200
accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260
atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320
tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380
cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440
actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500
tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560
tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620
ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680
atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740
gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800
aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860
gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920
agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980
taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040
gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100
agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160
ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220
gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280
cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340
cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400
tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460
caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520
gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580
tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616
<210> 2
<211> 1095
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide encoded by SEQ ID NO:1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D碊3 region (VWF amino acids 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(510)
<223> glycine/serine linker
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (511)..(1195)
<223> human albumin
<400> 2
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala
500 505 510
His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn
515 520 525
Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys
530 535 540
Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala
545 550 555 560
Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu
565 570 575
His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu
580 585 590
Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg
595 600 605
Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
610 615 620
Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn
625 630 635 640
Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His
645 650 655
Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys
660 665 670
Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu
675 680 685
Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala
690 695 700
Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala
705 710 715 720
Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala
725 730 735
Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His
740 745 750
Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala
755 760 765
Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys
770 775 780
Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile
785 790 795 800
Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala
805 810 815
Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala
820 825 830
Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His
835 840 845
Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu
850 855 860
Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr
865 870 875 880
Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn
885 890 895
Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys
900 905 910
Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val
915 920 925
Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly
930 935 940
Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu
945 950 955 960
Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys
965 970 975
Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val
980 985 990
Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val
995 1000 1005
Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
1010 1015 1020
Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
1025 1030 1035
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln
1040 1045 1050
Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys
1055 1060 1065
Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys
1070 1075 1080
Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
1085 1090 1095
<210> 3
<211> 8442
<212> DNA
<213> Homo Sapiens
<400> 3
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780
gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840
ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020
cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080
ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140
gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200
gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260
aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320
agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380
gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc ccccacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440
gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500
ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560
atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620
cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680
atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740
gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920
aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980
gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040
tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100
agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160
gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220
attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280
atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340
ttgacttcag aaatgcatgg ggcgcgcccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400
acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460
acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520
ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580
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gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700
accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760
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ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880
tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940
gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000
tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca cagtgacatg 6060
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ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240
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gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080
gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140
cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200
tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260
accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320
ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380
atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440
ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500
gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560
tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620
tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680
tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740
gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920
tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980
ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040
agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100
tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160
gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220
tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280
tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340
cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400
gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442
<210> 4
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 5
<211> 1444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Single Chain Factor VIII
<400> 5
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
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Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln
755 760 765
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
770 775 780
Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
805 810 815
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
820 825 830
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
835 840 845
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu
850 855 860
Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu
865 870 875 880
Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
885 890 895
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
900 905 910
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe
915 920 925
Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
930 935 940
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
945 950 955 960
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn
965 970 975
Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
980 985 990
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
995 1000 1005
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1010 1015 1020
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1025 1030 1035
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1040 1045 1050
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1055 1060 1065
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1070 1075 1080
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1085 1090 1095
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1100 1105 1110
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1130 1135 1140
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1145 1150 1155
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1160 1165 1170
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1175 1180 1185
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1190 1195 1200
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1220 1225 1230
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1235 1240 1245
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1250 1255 1260
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1265 1270 1275
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1280 1285 1290
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1295 1300 1305
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1310 1315 1320
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1325 1330 1335
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1340 1345 1350
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1355 1360 1365
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1370 1375 1380
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1385 1390 1395
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1400 1405 1410
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1415 1420 1425
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1430 1435 1440
Tyr
<210> 6
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 7
<211> 519
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> His-tagged D碊3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> Amino acid sequence of D碊3 - His8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D碊3 region (VWF amino acids 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(511)
<223> glycine / serine linker
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (512)..(519)
<223> polyhistidine tag
<400> 7
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser His
500 505 510
His His His His His His His
515
<210> 8
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> His-tagged CTP fusion protein
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D碊3 region (VWF amino acids 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(511)
<223> glycine / serine linker
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (512)..(576)
<223> C-terminal peptide of human chorionic gonadotropin beta subunit
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (577)..(584)
<223> Polyhistidin tag
<400> 8
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ala
500 505 510
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
515 520 525
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Ser Ser Ser
530 535 540
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
545 550 555 560
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser
565 570 575
His His His His His His His His
580

Claims (18)

1.包含截短的血管性血友病因子即VWF的多肽和因子VIII即FVIII在制备用于在具有内源性VWF的受试者中治疗凝血障碍的药物组合物中的用途，其中所述截短的VWF包含SEQID NO：4的氨基酸764至1242，其中所述多肽能够与所述FVIII结合，其中在所述药物组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于50，并且其中所述多肽包含半衰期延长部分。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者是人。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物静脉内施用。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述半衰期延长部分是与所述截短的VWF融合的异源氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或者由选自以下的多肽组成：免疫球蛋白恒定区及其部分，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的C-末端肽，称为XTEN的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列即HAP，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列即PAS，白蛋白，α白蛋白，甲胎蛋白，维生素D结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述免疫球蛋白恒定区为Fc片段。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述半衰期延长部分与所述多肽缀合。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉即HES，聚乙二醇即PEG，聚唾液酸即PSA，弹性蛋白样多肽，肝素前体聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，及其组合。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述白蛋白结合配体为脂肪酸链。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽是包含N-聚糖的糖蛋白，并且其中至少75％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
11.根据权利要求10所述的用途，其中至少85％的所述N-聚糖平均包含至少一个唾液酸部分。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽是二聚体。
13.根据权利要求1所述的用途，其中与参考治疗相比，通过共同施用所述多肽增加了FVIII的平均停留时间即MRT，其中所述参考治疗与所述治疗相同，除了在所述参考治疗中以等摩尔量施用所述多肽和所述FVIII。
14.根据权利要求1所述的用途，其中与单独使用FVIII的治疗相比，FVIII的施用频率降低。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽的血浆半衰期大于内源性VWF的血浆半衰期。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述多肽的血浆半衰期比内源性VWF的血浆半衰期大至少25％。
17.一种药物组合物，其包含(i)FVIII和(ii)如权利要求1至16中任一项所定义的多肽，其中在所述药物组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于50，并且其中所述多肽包含半衰期延长部分。
18.如权利要求1至16中任一项所定义的多肽和FVIII在制备用于改善FVIII的血浆半衰期和/或用于降低FVIII施用频率的药物组合物中的用途，其中在所述药物组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于50，并且其中所述多肽包含半衰期延长部分。
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