CN110381986B - 用于血管外施予以治疗或预防凝血疾病的截短型冯维勒布兰德因子多肽 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种用于治疗或预防凝血疾病之重组多肽，其包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗或预防包含向患有凝血疾病之个体施予该重组多肽且血管外施予第八凝血因子蛋白质(FVIII)，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

Description

用于血管外施予以治疗或预防凝血疾病的截短型冯维勒布兰 德因子多肽

【技术领域】

本发明关于改善凝血疾病治疗的产品及方法。

【先前技术】

有各种由缺乏凝血因子所引起的出血性病症。最常见的病症系分别由缺乏第八凝血因子(FVIII)及第九凝血因子所造成的A型及B型血友病。另一种已知的出血性病症为冯维勒布兰德病(VWD)。

在血浆中的FVIII主要以与冯维勒布兰德因子(von Willebrand Factor,VWF)之非共价复合物存在，且其凝血功能为加速因子IXa依赖性之因子X转换成为因子Xa。

典型的血友病或A型血友病为遗传型出血性病症。其系由X染色体连锁之凝血FVIII缺乏所引起，且影响几乎全为男性，发病率为每10,000人中介于一至两人。X染色体缺陷系由本身不是血友病患者的女性带原者遗传。A型血友病之临床表现为增加之出血倾向。

在接受预防性治疗之严重的A型血友病患者中，由于FVIII的血浆半衰期短，约12至14小时，所以FVIII必须每周经静脉内(i.v.)施予约3次。每次i.v.施予都很麻烦，伴随着疼痛且承担感染的风险，尤其当这大多数由经确诊为A型血友病的患者本身或孩童的父母在家里完成时。

因此，非常希望能增加FVIII的半衰期，使得必须施予含有此FVIII之医药组成物的频率较低。

已进行许多藉由下列者来延长未激活之FVIII的半衰期之尝试：降低其与细胞受体之交互作用WO 2003/093313 A2，WO 2002/060951 A2)、将聚合物与FVIII共价连接WO1994/15625 A1，WO 1997/11957 A1及US 4970300)、将FVIII包封(WO 1999/55306 A1)、引入新颖的金属结合位点(WO 1997/03193 A1)、将A2结构域藉由肽链接(WO 1997/40145 A1及WO 2003/087355 A1)或双硫连结(WO 2002/103024 A2)共价连接至A3结构域、或将A1结构域与A2结构域共价连接(WO 2006/108590 A1)。

另一提高FVIII或VWF的功能性半衰期之方法为藉由FVIII之聚乙二醇化(PEGylation)(WO 2007/126808 A1，WO 2006/053299 A2，WO 2004/075923 A2)或藉由VWF之聚乙二醇化(WO 2006/071801 A2)达成。增加经聚乙二醇化之VWF的半衰期亦可能间接提高存在于血浆中FVIII的半衰期。亦曾说明FVIII之融合蛋白(WO 2004/101740 A2、WO2008/077616 A1及WO 2009/156137 A1)。

在不同形式的冯维勒布兰德病(VWD)中缺失、功能上有缺陷或仅少量可用的VWF为存在于哺乳动物血浆中的多聚体黏性糖蛋白，其具有多重生理功能。在初级止血期间，VWF系作为血小板表面上的特定受体与细胞外基质组分(诸如胶原蛋白)之间的媒介子起作用。而且，VWF适合作为前凝血FVIII之载体及稳定蛋白质。VWF系在内皮细胞及巨核细胞中合成为2813个氨基酸前驱体分子。野生型VWF之氨基酸序列及cDNA序列揭示于Collins etal.1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4393-4397。前驱体多肽(原前-VWF)系由N端22个残基信号肽、接着741个残基前肽及在成熟血浆VWF中发现的2050个残基多肽所组成(Fischeret al.,FEBS Lett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽裂解之后，在VWF的两个单体之间形成C端双硫键。在通过分泌途径进一步运送期间，添加12个N-连结及10个O-连结之碳水化合物侧链。更重要的是VWF二聚体系经由N端双硫键多聚合化且741个氨基酸长度的前肽系以晚期高尔基体(Golgi apparatus)中的PACE酵素/弗林蛋白酶(furin)裂解。

一旦分泌入血浆中，蛋白酶ADAMTS13可裂解在VWF之A1结构域内的高分子量VWF多聚体。血浆VWF因此由从500kDa之单二聚体至由多至20种以上分子量超过10,000kDa之二聚体所组成之多聚体为范围的全范围多聚体所组成。VWF-HMWM由此具有最强的止血活性，其可以瑞斯托菌素(ristocetin)辅因子活性(VWF：RCo)测量。VWF：RCo/VWF抗原之比越高，则高分子量多聚体之相对量越高。

在血浆中，FVIII与VWF以高亲和性结合，其防止FVIII过早消除及因此除了其在初级止血中的角色以外亦在稳定FVIII、调节FVIII之血浆水平扮演关键角色，且因此亦为控制次级止血的中心因子。与VWF结合的未激活之FVIII在血浆中的半衰期为约12至14小时。在其中没有或几乎没有VWF存在的第3型冯维勒布兰德病中，FVIII的半衰期仅约2至6小时，由于降低之FVIII浓度而导致此等患者轻度至中度A型血友病症状。亦曾使用VWF对FVIII之稳定效应来协助FVIII在CHO细胞中的重组表现(Kaufman et al.1989,Mol Cell Biol 9:1233-1242)。第2N型von Willebrand氏病的特征在于VWF突变引起的低FVIII水平，该病影响FVIII与VWF之结合。第2N型VWD病患的FVIII水平范围介于约3IU/dL与30IU/dL之间，一般低于20IU/dL，取决于VWF之特定突变(Sadler J.E.and Blinder M.,Von WillebrandDisease:Diagnosis,Classification,and Treatment；in:Hemostasis and Thrombosis,eds.Colman,Marder,Clowes,George,Aird,and Goldhaber,Lippincott Williams&Wilkins 2006,pp 905-921)。

已说明经VWF衍生之多肽(特别为VWF片段)于试管内及活体内稳定FVIII。WO2013/106787 A1指出包含FVIII蛋白及特定的VWF片段之嵌合蛋白。FVIII及VWF片段的该等嵌合杂二聚体具有1：1之VWF对FVIII的固定摩尔比。

WO 2014/198699 A2和WO 2013/083858 A2说明VWF片段及其治疗血友病之用途。顷发现FVIII之生体可用率可在与类似的莫耳量之VWF片段经血管外共同施予时显著地改良。超过FVIII之高莫耳过量的VWF据称不为所欲，且在VWF片段与FVIII经s.c.共同施予的实验中发现VWF剂量对FVIII的生体可用率不具有关键性。因此，VWF片段对FVIII之摩尔比以及VWF剂量被认为对FVIII生体可用率不重要。

WO 2011/060242 A2揭示包含特定的VWF片段及抗体Fc区之融合多肽，提出VWF片段对FVIII的多至10：1之特定摩尔比。此外，并无呈现关于该等Fc-融合建构体的体内资料。

Yee et al.(2014)Blood 124(3):445-452发现经融合至免疫球蛋白G1之Fc部分的含有D’D3结构域之VWF片段在VWF-缺乏之小鼠中足以稳定内源性第八因子。然而，虽然VWF D’D3-Fc融合蛋白在输注FVIII-缺陷小鼠中时展现显著延长的存活期，但是VWF D’D3-Fc融合蛋白不延长共同输注FVIII的存活期。

直到今天为止，A型血友病的标准治疗涉及频繁的静脉内输注FVIII，不论是衍生自人类捐赠者血浆之浓缩物形式或是基于重组FVIII的医药制剂形式。虽然这些取代疗法通常有效，例如在接受预防性治疗之严重的A型血友病患者中，但如上述，由于第八凝血因子约12小时之短的FVIII血浆半衰期，所以第八凝血因子必须于每周经静脉内(i.v.)施予约3次。已知如果达到高于健康非血友病者之FVIII活性的1％，例如藉由升高FVIII水平超过0.01U/mL，严重A型血友病转变成中度A型血友病。在预防性疗法中，投药方案系经设计以使FVIII活性的谷底水平不低于健康非血友病者之FVIII活性的2-3％的水平。每次i.v.施予都很麻烦，伴随着疼痛且承担感染的风险，尤其当这大多数由经确诊为A型血友病的患者本身或孩童的父母在家里进行治疗时。此外，频繁的i.v.注射不可避免地导致疤痕形成，干扰未来的输注。由于严重血友病的预防性治疗始于生命早期，在儿童通常小于2岁时，每周要注射FVIII 3次到这么小的病患的静脉甚至更为困难。在有限的期间内，植入注射座系统可提供替代方案。尽管可能发生重复感染且注射座可能造成身体运动时的不便，它们一般仍被视为优于静脉内注射。

因此这方面仍有高度医疗需求，以消除静脉内输注FVIII的需要。

由于FVIII是一种非常大型且不安定的分子，若经由皮下、肌肉内或皮内(即血管外)给予，其因为吸收不良及严重降解而具有非常低的生体可用率。

EP 0710114 A1揭示浓度超过1000IU/mL之B结构域删除FVIII的FVIII配方适合用于皮下施予，导致在s.c.施予猴子后测量活性(FVIII：C)-时间曲线下面积得到5-10％的生体可用率。

EP 0772452揭示浓度至少500IU/mL的B结构域删除FVIII与有机添加剂的FVIII配方经皮下施予时，可导致FVIII血浆水平达到正常FVIII水平的至少1.5％超过6h。使用水解明胶或大豆油乳液作为有机添加剂及浓度1100IU/mL的B结构域删除FVIII且剂量为10000IU/kg，在石蟹猕猴中见到以活性(FVIII：C)-时间曲线下面积测量之超过50％的生体可用率。然而这并不是治疗患有凝血疾病之病患的适当临床情况。

WO 1997/11957 A1揭示当皮下施予B结构域删除FVIII(比活性15000IU/mg；剂量2500IU/kg)时，生体可用率为5.3％，然而FVIII的单甲氧基聚乙二醇化接合物在石蟹猕猴达成22％或19％的生体可用率。

根据WO 2015/185758 A2，呈现一种包含第八凝血因子及一或多个冯维勒布兰德因子肽之非共价复合物的组成物，其中冯维勒布兰德因子肽包含至少氨基酸764至1035及1691至1905。FVIII：VWF之分子比例介于1：1至1：20之间。在WO 2015/185758 A2中，A型血友病犬接受s.c.及后续i.v.注射单独的重组B结构域删除FVIII，或与五倍莫耳过剩之经金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶消化pdVWF产生之VWF片段组合注射。分析样本的全血凝血时间(WBCT)及在显色FVIII活性测定中之活性。相较于s.c.单独施予FVIII，皮下施予VWF片段与FVIII之复合物导致超越正常犬之凝血时间所需的时间增加1.4倍。相较于单独施予FVIII，施予VWF片段与FVIII亦导致s.c.及i.v.施予时犬血浆中FVIII活性随时间增加及几乎双倍的曲线下面积(AUC)值。

在WO 2008/151817 A1中，显示VWF经血管外施予后可吸收至血流，无须任何可能带来免疫反应风险增加的稳定性共价修饰，且当与FVIII非静脉内共同施予时，VWF可用来增强FVIII的摄取。使用未经任何半衰期延长修饰之VWF。VWF抗原对FVIII活性比例大于2：1。仅考虑包含全长VWF之多聚体及单体产物。然而藉由使用全长VWF，高比例的VWF对FVIII可能导致血栓形成风险增加。此外，当使用全长VWF时，要增加比例所需的蛋白质量将无法用于施予。进一步，多聚体及单体。

有向病患静脉内施予FVIII的替代方案之医疗需求。此外，有当血管外施予时提供第八凝血因子吸收的方法以及适合该等方法之化合物或组成物的持续需求。

【发明内容】

本发明的第一目标是提供一种改善的基于第八凝血因子(FVIII)蛋白质之凝血疾病的治疗或预防。

根据第二目标，该治疗应允许向有此需要之个体以替代性途径施予FVIII。具体而言，应可经由皮下施予FVIII。

根据第三目标，该治疗应至少提供足以治疗凝血疾病个体的该施予之FVIII的药物动力学参数。

根据第四目标，该治疗应提供具体而言足够高的FVIII半衰期，以允许可耐受或改善的施予频率。

发明人意外发现，第八凝血因子(FVIII)蛋白质可经由血管外途径成功施予以用于治疗或预防凝血疾病，惟该FVIII系与包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽共同施予。该重组多肽能够与该共同施予之FVIII结合。欲施予之重组多肽对欲施予之FVIII的摩尔比较佳系高于50。包含截短型VWF之重组多肽较佳地包含半衰期延长部分(HLEM)。不希望受限于任何理论，一般相信很重要是要达成高度过量的包含截短型VWF之经施予重组多肽，以最小化共同施予之FVIII与内源性VWF之结合，该内源性VWF具有较大的分子结构，相较于截短型VWF可能导致增加的分解代谢。藉由使用本文所述之共同施予之FVIII与该重组多肽，这是第一次指出以血管外途径施予FVIII不仅是有可能的，甚至可在循环中达成临床上重要的FVIII量。

本发明进一步显示血管外施予重组多肽提供或增加共同施予之FVIII的生体可用率。此外，重组多肽与FVIII一起皮下施予，允许与FVIII实质吸收至血流有关之血管外施予FVIII导致FVIII活性水平不仅显著超过侦测极限，但更进一步适合治疗应用。与FVIII共同施予之重组多肽不仅具有足够长的半衰期、一旦到达血浆后增加FVIII于此区室中之维持，但亦提供适合治疗应用之FVIII的生体可用率。

此外，本发明进一步显示血管外施予重组多肽可允许包含FVIII经由与重组多肽所使用之施予途径不同之途径施予的治疗选项。具体而言，显示因为静脉内施予FVIII与皮下施予重组多肽之组合而来的好处。

本发明因此特别关于下列实施方式[1]至[73]：

[1]一种用于治疗或预防凝血疾病之重组多肽，其包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗或预防包含向患有凝血疾病之个体施予该重组多肽且血管外施予第八凝血因子蛋白质(FVIII)，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

[2]一种用于治疗或预防凝血疾病之重组多肽，其包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗或预防包含向患有凝血疾病之个体血管外施予该重组多肽且施予第八凝血因子蛋白质(FVIII)，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

[3]如实施方式[1]或[2]供使用之重组多肽，其中该多肽包含半衰期延长部分(HLEM)。

[4]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该个体系人类个体。

[5]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该截短型VWF系人类截短型VWF。

[6]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽系经皮下、皮内或肌肉内施予。

[7]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该FVIII系经皮下、皮内或肌肉内施予。较佳地，FVIII与该多肽皆经皮下施予。

[8]根据实施方式[2]至[6]供使用之重组多肽，其中FVIII系经由与重组多肽不同的施予途径施予，较佳地FVIII系经静脉内施予；更佳地重组多肽系经皮下施予且FVIII系经静脉内施予。

[9]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该截短型VWF包含与SEQ IDNO：4之氨基酸776至805具有至少90％序列同一性之氨基酸序列、较佳地包含与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性之氨基酸序列。

[10]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该截短型VWF缺乏SEQ IDNO：4之氨基酸1243至2813。

[11]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该截短型VWF系由(a)SEQID NO：4之氨基酸764至1242、(b)与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性之氨基酸序列、或(c)(a)或(b)之片段组成。

[12]如实施方式[3]至[11]中任一项供使用之重组多肽，其中该HLEM系与该截短型VWF融合之异源性氨基酸序列。

[13]如实施方式[12]供使用之重组多肽，其中该异源性氨基酸序列包含选自由下列所组成之群组的多肽或由选自由下列所组成之群组的多肽所组成：转铁蛋白及其片段、人绒毛膜促性腺激素之C端肽、XTEN序列、同源氨基酸重复(HAP)、脯胺酸-丙胺酸-丝胺酸重复(PAS)、白蛋白、艾芙米(afamin)、α-胎蛋白、维生素D结合蛋白质、在生理条件下能够与白蛋白或免疫球蛋白恒定区结合之多肽、能够与新生儿Fc受体(FcRn)结合之多肽、特别是免疫球蛋白恒定区及其部分、较佳地免疫球蛋白之Fc部分、及彼等之组合。免疫球蛋白恒定区或其部分较佳地系免疫球蛋白G1之Fc片段、免疫球蛋白G2之Fc片段或免疫球蛋白A之Fc片段。

[14]如实施方式[3]至[11]中任一项供使用之重组多肽，其中该HLEM系与该重组多肽接合。

[15]如实施方式[14]供使用之重组多肽，其中该HLEM系选自由下列所组成之群组：羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)、类弹性蛋白多肽、肝素前体(heparosan)聚合物、玻尿酸及白蛋白结合配体，例如脂肪酸链、及彼等之组合。

[16]如实施方式[3]至[13]中任一项供使用之重组多肽，其中该重组多肽不包含任何与该重组多肽接合之HLEM。

[17]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽系包含N-聚醣之糖蛋白，且其中较佳地至少75％、较佳地至少85％之该N-聚糖包含平均至少一个唾液酸部分。

[18]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该重组多肽系以二聚体存在或至少具有高比例的二聚体。

[19]如实施方式[18]供使用之重组多肽，其中该重组多肽系较佳地包含二个在本文中揭示实施例之一所定义之多肽之同型二聚体，且形成二聚体之二个单体彼此经由截短型VWF内的半胱胺酸残基所形成的至少一或多个双硫键共价连接。

[20]如实施方式[19]供使用之重组多肽，其中形成一或多个双硫键之半胱胺酸残基系选自由Cys-1099、Cys-1142、Cys-1222、Cys-1225、Cys-1227及彼等之组合所组成之群组，较佳地Cys-1099及Cys-1142，其中氨基酸编号系指SEQ ID NO：4。

[21]如实施方式[18]至[20]中任一项供使用之重组多肽，其中该二聚体对FVIII之亲和性系大于单体多肽对FVIII之亲和性，该单体多肽具有与二聚体多肽之单体次单位相同的氨基酸序列。

[22]如实施方式[18]至[21]中任一项供使用之重组多肽，其中本发明之多肽的二聚体：单体比系至少1.5、较佳地至少2、更佳的是至少2.5或至少3。较佳地，本发明之重组多肽不包含多肽的单体及/或多聚体形式或至少实质上不含多肽的单体及/或多聚体形式。最佳的是本发明之所有多肽皆以二聚体存在。

[23]如实施方式[18]至[22]中任一项供使用之重组多肽，其中该二聚体多肽具有FVIII结合亲和性，该FVIII结合亲和性之解离常数K_D小于1nM、较佳地小于500pM、小于200pM、小于100pM、小于90pM或小于80pM。

[24]如实施方式[23]供使用之重组多肽，其中K_D范围自0.1pM至500pM、自0.5pM至200pM、自0.75pM至100pM或最佳地自1pM至80pM。

[25]如实施方式[18]至[24]中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽具有以解离常数K_D为特征之FVIII结合亲和性，且该二聚体多肽的解离常数K_D相较于单体多肽的解离常数K_D减少，较佳地减少至少10倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

[26]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽相较于野生型VWF之氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代，其中该经修饰多肽对FVIII之结合亲和性较佳地进一步藉由导入该至少一个取代而相较于参考多肽之结合亲和性增加，该参考多肽除了该修饰之外具有相同氨基酸序列。

[27]根据实施方式[26]供使用之重组多肽，其中该等在截短型VWF中之取代具有进一步增加共同施予之FVIII在施予后的半衰期的能力。藉此，治疗亦可提供特别是进一步增加之FVIII体内半衰期，以允许可耐受或改善的施予频率。

[28]如实施方式[26]或[27]供使用之重组多肽，其中该取代系选自由下列所组成之组合群组：S764G/S766Y、S764P/S766I、S764P/S766M、S764V/S766Y、S764E/S766Y、S764Y/S766Y、S764L/S766Y、S764P/S766W、S766W/S806A、S766Y/P769K、S766Y/P769N、S766Y/P769R、S764P/S766L及S764E/S766Y/V1083A，氨基酸编号系参照SEQ ID NO：4序列。

[29]如实施方式[28]供使用之重组多肽，其中该取代系S764E/S766Y或S764E/S766Y/V1083A组合。

[30]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该施予之FVIII的平均滞留时间(MRT)系藉由共同施予该重组多肽而增加，较佳地相较于参考治疗增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比、及/或除了并未施予重组多肽。

[31]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中施予FVIII之MRT系至少10h、较佳地至少15h、至少20h或至少25h。

[32]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该施予之重组多肽的MRT系增加，较佳地相较于参考治疗增加至少1.5倍、至少2倍或至少3倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比特别是低于50。

[33]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该施予之FVIII的终末半衰期系藉由共同施予该重组多肽而增加，较佳地相较于参考治疗增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比、及/或除了并未施予重组多肽。藉此，治疗可提供特别是够高的FVIII体内半衰期，以允许可耐受或改善的施予频率。

[34]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中与具有HLEM之该多肽共同施予之该FVIII达到1％谷底水平之时间期间相较于参考治疗系延长，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了该FVIII系与不具有该HLEM之重组多肽一起施予、及/或除了并未施予重组多肽。

[35]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中

(i)与该多肽共同施予之该FVIII达到1％谷底水平之时间期间系至少约30h、至少约35h、至少约38h、至少约40h、或至少约50h；或(ii)与该多肽共同施予之该FVIII达到5％谷底水平之时间期间系至少约20h、至少约22h、至少约29h、至少约34h、或至少约43h；或

(iii)与该多肽共同施予之该FVIII达到10％谷底水平之时间期间系至少约5h、至少约6h、至少约10h、至少约18h、或至少约20h。

[36]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽之血浆半衰期相较于内源性VWF之血浆半衰期及/或相较于正常人血浆(NHP)中VWF之血浆半衰期增加，其中该多肽之血浆半衰期系较佳地至少100％、至少200％或较佳地至少400％高于内源性VWF之血浆半衰期及/或相较于正常人血浆(NHP)中VWF之血浆半衰期。

[37]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该凝血疾病系A型血友病或类血友病(von-Willebrand氏病)。

[38]如实施方式[37]供使用之重组多肽，其中凝血疾病系A型血友病且系轻度A型血友病，其内源性FVIII活性水平一般系5％至40％的正常人血浆(NHP)中内源性FVIII活性水平；或中度A型血友病，其内源性FVIII活性水平一般系1％至5％的NHP中内源性FVIII活性水平；或严重A型血友病，其内源性FVIII活性水平一般系低于1％的NHP中内源性FVIII活性。

[39]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该多肽系(i)在有要求时用于治疗及控制出血事件、(ii)用于例行性预防，特别是减少出血事件的频率或(iii)用于手术前后的出血管理。

[40]如实施方式[39]供使用之重组多肽，其中多肽系用于例行性预防，以减少A型血友病病患的出血事件频率。

[41]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中重组多肽与FVIII蛋白质之共同施予系藉由下列达成：

-(i)在包含重组多肽与FVIII蛋白质的单一组成物中一起施予，或

-(ii)施予各自提供于分开组成物中之重组多肽(第一化合物)与FVIII蛋白质(第二化合物)，该等分开组成物可选地作为组合疗法的一部分，其中第一化合物系于第二化合物之前、之后或同时施予。当第一化合物系于第二化合物之前或之后施予时，可应用任何合适时间间隔以施予第一化合物及第二化合物。具体而言，对于例行性预防之目的而言，第一化合物之施予与第二化合物之施予可根据独立或配合的投药计划提供。

[42]如实施方式[41]供使用之重组多肽，其中以(i)为例，重组多肽与FVIII蛋白质之共同施予系藉由下列达成：

提供包含掺合于单一组成物之重组多肽与FVIII之组合式产品，或

提供至少二种分开产品之组合或套组，该二种分开产品预定在施予前混合，藉此第一产品包含重组多肽且第二产品包含FVIII。

[43]如实施方式[41]供使用之重组多肽，其中以(ii)为例，重组多肽与FVIII蛋白质(特别是当同时施予时及/或特别是当两者皆以血管外施予时)系以近距离施予，较佳地注射部位相距不多于50mm、不多于40mm、不多于30mm、特别是不多于20mm。

[44]如实施方式[41]或[43]供使用之重组多肽，其中以(ii)为例，重组多肽与FVIII蛋白质可在1个月内、在三周内、在二周内、在一周内、在一天内、在约一小时内、在30分钟(min)内、在15min内或在5min内共同施予。

[45]如实施方式[41]、[43]或[44]供使用之重组多肽，其中以(ii)为例，重组多肽与FVIII蛋白质可在不超过1个月、不超过三周、不超过二周、不超过一周、不超过一天、不超过约一小时、较佳地在30min内、更佳地在15min内且最佳地在5min内的时间间隔内共同施予。

[46]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中重组多肽不包含FVIII蛋白质及/或不包含具有FVIII活性之多肽。

[47]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该FVIII系血浆衍生FVIII蛋白质或重组FVIII蛋白质，较佳地人类FVIII蛋白质。

[48]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该FVIII系重组FVIII蛋白质。

[49]如任何实施方式[48]供使用之重组多肽，其中重组FVIII具有完整的天然B结构域或具有删除、截短型或经修饰的B结构域。可选地，重组FVIII蛋白质可包含至少一个半衰期延长部分(HLEM)。合适HLEM系在本文中揭示。

[50]如实施方式[48]供使用之重组多肽，其中FVIII蛋白质系重组单链第八凝血因子，较佳地包含或由氨基酸序列SEQ ID NO：5或其片段组成，前提是该等片段具有FVIII活性。

[51]如实施方式[48]供使用之重组多肽，其中重组FVIII具有删除或截短型B结构域，前提是该删除或截短型B结构域包含异源性插入至少一个连接符肽及/或半衰期增长多肽。

[52]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中当FVIII系经血管外施予时，该施予之FVIII在与重组多肽共同施予后的生体可用率藉由重组多肽增加，此系与参考治疗比较，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了该FVIII之施予系在无施予该重组多肽的情况下进行。藉此，血管外施予重组多肽提供或增加施予之FVIII的生体可用率。较佳地，重组多肽与FVIII一起之皮下共同施予，允许与FVIII实质吸收至血流有关之血管外施予FVIII导致FVIII活性水平不仅显著超过侦测极限，但更进一步适合治疗应用。较佳地，与FVIII共同施予之重组多肽不仅具有足够长的半衰期、一旦到达血浆后增加FVIII于此区室中之维持，但亦提供适合治疗应用之FVIII的生体可用率。

[53]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中血管外施予之FVIII之生体可用率在与该重组多肽共同施予之后系至少2％、至少3％、至少5％、较佳地至少7％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％。

[54]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该重组多肽之生体可用率系至少30％、较佳地至少35％、更较佳地至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少80％。

[55]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中共同施予之FVIII蛋白质之剂量不超过2500IU/kg、较佳地不超过2000IU/kg、不超过1500IU/kg、不超过1000IU/kg、不超过600IU/kg、不超过500IU/kg或不超过400IU/kg。

[56]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII之最大浓度(C_max)系10mIU/mL、至少25mIU/mL、至少50mIU/mL、至少100mIU/mL、至少200mIU/mL、至少300mIU/mL或至少400mIU/mL FVIII活性、较佳地显色FVIII活性。

[57]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在共同施予该重组多肽与FVIII后，该重组多肽之最大浓度(C_max)系至少20nmol/kg、至少40nmol/kg、至少60nmol/kg、至少80nmol/kg或至少160nmol/kg。较佳地，在共同施予该重组多肽与FVIII后，该重组多肽之最大浓度(C_max)系至少5μg HLEM/mL、至少10μg HLEM/mL、至少15μg HLEM/mL、或至少20μgHLEM/mL，其中该等值系基于HLEM之计算，较佳地，该等值系基于使用HLEM特定测定之定量诸如免疫测定法，较佳地人类白蛋白之特定测定。进一步的一较佳实施例关于如前述实施例中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该重组多肽之最大浓度(C_max)高于参考治疗至少3倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于本发明之摩尔比。

[58]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该共同施予FVIII之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)系至少1,000mIU*h/mL、至少2,000mIU*h/mL、至少3,000mIU*h/mL、至少5,000mIU*h/mL、至少10,000mIU*h/mL或至少20,000mIU*h/mL FVIII活性、较佳地显色FVIII活性。

[59]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在共同施予该重组多肽与FVIII后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)系至少2nmol*h/mL、至少3nmol*h/mL、至少4nmol*h/mL、至少20nmol*h/mL、至少40nmol*h/mL或至少80nmol*h/mL。较佳地，在共同施予该重组多肽与FVIII后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)系至少500μg HLEM*h/mL、至少750μg HLEM*h/mL、至少1,000μg HLEM*h/mL、至少5,000μg HLEM*h/mL、或至少10,000μg HLEM*h/mL，其中该等值系基于HLEM之计算，较佳地，该等值系基于使用HLEM特定测定之定量诸如免疫测定法，较佳地人类白蛋白之特定测定。进一步的一较佳实施方式关于如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)高于参考治疗至少5倍、至少10倍、或至少15倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于本发明之摩尔比。

[60]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在共同施予该重组多肽与FVIII后，该重组多肽之清除(CL)值系介于1.0至2.5mL/kg/h、或介于1.1至2.2mL/kg/h或介于1.2至2.1mL/kg/h之范围。

[61]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该重组多肽的清除率(CL)相较于参考治疗减少至少2倍、至少5倍或至少10倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于本发明之摩尔比。

[62]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该施予之FVIII的清除率(CL)相较于参考治疗系减少较佳地至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7.5倍或至少10倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于本发明之摩尔比。

[63]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中在共同施予该重组多肽与FVIII后，该施予FVIII之清除(CL)值系低于135mL/kg/h、低于80mL/kg/h、低于45mL/kg/h、低于40mL/kg/h、低于35mL/kg/h、低于30mL/kg/h或低于25mL/kg/h。该施予FVIII的清除(CL)值系较佳地低于参考治疗之该值，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比。

[64]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中欲施予之该重组多肽对该FVIII之摩尔比系至少75、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500或至少1000。

[65]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该重组多肽系以至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.5mg/kg、至少1mg/kg或至少3mg/kg重组多肽之量施予。

[66]如前述实施方式中任一项供使用之重组多肽，其中该重组多肽系以不超过20mg/kg、不超过15mg/kg、不超过10mg/kg或不超过5mg/kg重组多肽之量施予。

[67]一种用于治疗或预防如实施方式[1]至[66]中任一项定义之凝血疾病之医药组成物，该组成物包含

(i)重组多肽，其包含如实施方式[1]至[7]中任一项或实施方式[9]至[66]中任一项之截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，惟该重组多肽与该FVIII欲经由相同施予途径施予，及

(ii)第八凝血因子蛋白质(FVIII)，

其中在该组成物中重组多肽对FVIII的摩尔比系高于50。

[68]一种如实施方式[67]供使用之医药组成物，其中该治疗包含血管外施予该组成物至患有凝血疾病之个体，且

该医药组成物系调制为适合用于血管外共同施予。较佳地，至少部分的该重组多肽系键合至FVIII。根据该医药组成物之进一步较佳实施方式，该重组多肽系非共价键合至FVIII。较佳地，该医药组成物包含高比例的该多肽之二聚体。进一步较佳的是，该医药组成物不包含多肽的单体及/或多聚体形式或至少实质上不含多肽的单体及/或多聚体形式。

[69]一种医药套组，其包含(i)包含第八凝血因子蛋白质(FVIII)之第一组成物及(ii)包含重组多肽之第二组成物，该重组多肽包含如实施方式[1]至[66]中任一项所使用以用于治疗或预防凝血疾病之截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗包含较佳地血管外施予该重组多肽及该FVIII蛋白质至患有凝血疾病之个体，其中该FVIII及该重组多肽系提供于该套组中。较佳地，该FVIII与该重组多肽系提供于该套组中，以允许在施予之前至少一部分的该重组多肽与该FVIII结合，且前提是欲施予之重组多肽对欲施予之FVIII的摩尔比系高于50。较佳地，该第二组成物包含高比例的该多肽之二聚体。进一步较佳的是，该第二组成物不包含多肽的单体及/或多聚体形式或至少实质上不含多肽的单体及/或多聚体形式。

[70]一种治疗或预防凝血疾病之方法，该方法包含向患有凝血疾病之个体共同施予有效量的包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽与第八凝血因子蛋白质(FVIII)，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。此方法中的重组多肽可较佳地如实施方式[1]至[66]中任一项所提供。该多肽可经皮下、皮内或肌肉内施予。该FVIII亦可经皮下、皮内或肌肉内施予。较佳地，FVIII与该多肽皆经皮下施予。根据该方法之另一变体，FVIII系经由与重组多肽不同的施予途径施予，较佳地FVIII则经静脉内施予，更具体地重组多肽系经皮下施予且FVIII系经静脉内施予。

[71]一种治疗或预防凝血疾病之方法，该方法包含经由不同施予途径向患有凝血疾病之个体施予有效量的包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽及第八凝血因子蛋白质(FVIII)，其中该重组多肽能够与FVIII结合。此方法中的重组多肽可如实施方式[2]至[66]中任一项所提供。在此实施例中，重组多肽对FVIII之摩尔比不一定要在施予该重组多肽之前决定。较佳地，FVIII系经静脉内施予，更佳地重组多肽系经皮下施予且FVIII系经静脉内施予。

[72]如实施方式[1]至[66]中任一项定义之重组多肽用于治疗或预防凝血疾病，该重组多肽包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗或预防包含较佳地血管外施予该多肽及第八凝血因子(FVIII)蛋白质至个体，其中该重组多肽能够与该FVIII结合。欲施予之重组多肽对欲施予之FVIII的摩尔比较佳系高于50。

[73]一种包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽用于制造用于治疗或预防凝血疾病之药物之用途，该治疗或预防包含向个体较佳地血管外施予该重组多肽及第八凝血因子(FVIII)蛋白质，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50，前提是该重组多肽系如实施方式[1]至[66]中任一项所定义。

【图式简单说明】

图1显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随或不伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后，包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽(以下亦称：重组多肽)的水平。rD’D3-FP系经由其白蛋白组分定量，且rD’D3-His数据系计算为等莫耳浓度。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝1-4只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗。缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图2显示以皮下施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随或不伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后，重组多肽血浆水平的最大浓度及AUC。rD’D3-FP系经由其白蛋白组分定量，且rD’D3-His数据系计算为等莫耳浓度。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝1-4只小鼠。C_max及AUC_0-inf的估计系藉由二室重吸收模型进行；

图3显示以皮下施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随或不伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后，rD’D3-FP或rD’D3-His的生体可用率。rD’D3-FP系经由其白蛋白组分定量，且rD’D3-His数据系计算为等莫耳浓度。数据系自每个时间点n＝1-4只小鼠计算的平均AUC_0-inf值计算。AUC_0-inf的估计系藉由二室重吸收模型进行。生体可用率系计算为在s.c.施予后相较于i.v.施予后之AUC_0-inf的百分比，假设rD’D3-FP用于三个不同i.v.组使用不同剂量的rD’D3-FP伴随或不伴随rFVIII；

图4显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随或不伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后的FVIII活性血浆水平。FVIII系定量为显色FVIII活性。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝2-3只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗；缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图5显示在皮下施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随或不伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后的FVIII活性血浆水平最大浓度及AUC。FVIII系定量为显色FVIII活性。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝2-3只小鼠。C_max及AUC_0-inf的估计系藉由二室重吸收模型进行；

图6显示在皮下施予rD’D3-FP或rD’D3-His伴随重组FVIII至FVIII ko小鼠后的显色FVIII活性之生体可用率。数据系自每个时间点n＝2-3只小鼠计算的平均AUC_0-inf值计算。AUC_0-inf的估计系藉由二室重吸收模型进行。生体可用率系计算为在s.c.施予后相较于i.v.施予后之AUC_0-inf的百分比，假设rD’D3-FP用于二个不同i.v.组使用不同剂量的rD’D3-FP伴随或不伴随rFVIII。FVIII剂量及选定rD’D3-FP剂量系如图中数字给予；

图7显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP伴随或不伴随重组FVIII至猪后的重组多肽血浆水平。rD’D3-FP系经由其白蛋白组分定量。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝1-3只猪。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗。缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图8显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP伴随或不伴随重组FVIII至猪后的FVIII活性血浆水平。FVIII系定量为显色FVIII活性。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝1-3只猪。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗；缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图9显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP伴随或不伴随不同重组FVIII或血浆衍生性FVIII至FVIII ko小鼠后的重组多肽血浆水平。rD’D3-FP系经由其白蛋白组分定量。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝2-3只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗。缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图10显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP伴随或不伴随不同重组FVIII或血浆衍生性FVIII至FVIII ko小鼠后的FVIII活性血浆水平(图8A图8B/>及图8CReFacto/>)。FVIII系定量为显色FVIII活性。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝2-3只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗；缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；

图11显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP EYA或rD’D3-CTP伴随重组FVIII至FVIIIko小鼠后的重组多肽血浆水平。rD’D3-FP EYA系经由其白蛋白组分定量，且rD’D3-CTP系经由其D’D3组分定量。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝3只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗。缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内；及

图12显示以皮下或静脉内施予rD’D3-FP EYA或rD’D3-CTP伴随重组FVIII至FVIIIko小鼠后的FVIII活性血浆水平。FVIII系定量为显色FVIII活性。资料系以平均值±SD表示，每个数据点的n＝3只小鼠。实线代表s.c.且虚线代表i.v.治疗；缩写：s.c.：皮下；i.v.：静脉内。

【实施方式】

发明详细说明

在第一方面中，本发明关于一种用于治疗或预防凝血疾病之重组多肽，其包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗包含向患有凝血疾病之个体施予该重组多肽且血管外施予第八凝血因子(FVIII)蛋白质，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

在第二方面中，本发明关于一种用于治疗或预防凝血疾病之医药组成物，该组成物包含

(i)本发明之包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽及

(ii)第八凝血因子蛋白质(FVIII)，

其中在医药组成物中重组多肽对FVIII蛋白质之摩尔比系大于50且其中该重组多肽能够与该FVIII结合，该治疗包含向患有凝血疾病之个体血管外施予医药组成物，且该医药组成物系经调制以用于血管外共同施予。

在第三方面中，本发明关于一种医药套组，其包含(i)包含第八凝血因子(FVIII)蛋白质之第一组成物及(ii)包含本发明之重组多肽之第二组成物，本发明之重组多肽包含如本文所述之用于治疗或预防凝血疾病之截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗包含向个体施予重组多肽且血管外施予FVIII蛋白质，其中该FVIII及该重组多肽系提供于套组中以允许在施予前至少一部分之该重组多肽与该FVIII结合，且前提是欲施予之重组多肽对欲施予之FVIII之摩尔比高于50。

根据第四方面，本发明关于一种治疗或预防凝血疾病之方法，该方法包含向个体共同施予有效量的包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之本发明之重组多肽且血管外施予第八凝血因子(FVIII)蛋白质，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

在第五方面中，本发明关于本发明之重组多肽用于治疗或预防凝血疾病之用途，该重组多肽包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，该治疗包含向个体施予该多肽且血管外施予第八凝血因子(FVIII)蛋白质，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

根据进一步方面，本发明关于包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之重组多肽用于制造用于治疗或预防凝血疾病之药物之用途，该治疗包含向个体施予该多肽且血管外施予第八凝血因子(FVIII)蛋白质，其中该重组多肽能够与该FVIII结合，且其中欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比高于50。

包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之多肽将在本文中称为「本发明之多肽」或「重组多肽」。本发明之多肽较佳地包含半衰期延长部分(HELM)。

比例

如以下详细说明，本发明之多肽可为单体、二聚体或其混合物。根据本发明的任何摩尔比系指本发明之多肽(不论实际以单体或二聚体存在)之单体次单元的莫耳浓度之比。比例系相对共同施予FVIII之莫耳浓度形成。在本申请案中，本发明之多肽相对FVIII的任何比系指欲施予之本发明之多肽(其较佳地以二聚体存在)中所包含之单体的量(以莫耳计)除以欲施予之FVIII的量(以莫耳计)，除非另有其他的指示。举非限制性实例来说，共同施予100μM之本发明之单体多肽与1μM之FVIII意指100的比例。如果50μM之本发明之二聚体多肽与1μM之FVIII共同施予，则可获得相同的100的比例。

欲施予之本发明之多肽对欲施予之FVIII的摩尔比系超过50、更佳的是该比例大于60、或至少75、至少100、或大于100、或至少200、最佳的是至少300、或至少400、或至少500、或至少600、或至少700、或至少800、或至少900、或至少1,000、或至少1,100、或至少1,200、或至少1,300、或至少1,400、或至少1,500、或至少1,600、或至少1,700、或至少1,800、或至少1,900、或至少2,000、或至少2,500、或至少3,000或至少5,000、或至少8,000或最高10,000。欲施予之本发明之多肽对欲施予之FVIII的摩尔比根据某些实施例可能不超过10,000之比例、5,000之比例、2,500之比例或2,000之比例。

欲施予之本发明多肽对欲施予之FVIII的摩尔比范围可自50以上至10,000、或自50以上至5,000、或自50以上至4,000、或自50以上至3,000、或自50以上至2,000、或自50以上至1,000。较佳地，欲施予之本发明多肽对欲施予之FVIII的摩尔比范围系自60至2,500、或自110至2,000、或自150至1,500、或自200至1,000。

正常人类血浆(NHP)含有定义成1U/mL或100％浓度之VWF。这对应于约10μg/mL之蛋白质浓度(Haberichter S.L.and Montgomery R.R.,Structure and function of vonWillebrand factor；in:Hemostasis and Thrombosis,eds.Marder,Aird,Bennett,Schulman and White,Lippincott Williams&Wilkins 2013,pp 197-207)。基于此VWF在NHP中的浓度及成熟VWF单体(包括18-19％糖化)约267,500Da之分子量，可计算出NHP中VWF单体单元约37x10^-9 Mol/L之莫耳血浆浓度。内源性VWF在人类血浆中的半衰期系约16h(Lenting PJ,Christophe OD,Denis CV.von Willebrand factor biosynthesis,secretion,and clearance:connecting the far ends.Blood.2015.125(13):2019-28)。

本发明之治疗的进一步细节系进一步描述于下。

截短型VWF

在本文中使用之用语「冯维勒布兰德因子(von Willebrand Factor)」(VWF)包括天然发生(天然)之VWF，但是亦包括至少保留天然发生之VWF的FVIII结合活性的其变体，例如其中插入、删除或取代一或多个残基之序列变体。FVIII结合活性系以FVIII-VWF结合测定法判定，如实例2中所述。

根据本发明的较佳VWF系由SEQ ID NO：4所示之氨基酸序列代表的人类VWF。编码SEQ ID NO：4之cDNA显示于SEQ ID NO：3。

编码人类天然VWF之基因系转录成9kb mRNA，其转译成具有310，000Da之预估分子量的2813个氨基酸之原前多肽。原前多肽含有N端22个氨基酸信号肽，随后为741个氨基酸前多肽(SEQ ID NO：4之氨基酸23-763)及成熟次单位(SEQ ID NO：4之氨基酸764-2813)。自N端裂解741个氨基酸前多肽产生由2050个氨基酸所组成之成熟VWF。人类天然VWF原前多肽之氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4。除非以其他方式指示，本申请案中VWF残基的氨基酸编号系指SEQ ID NO：4，即使VWF分子特别是截短型VWF不包含SEQ ID NO：4的所有残基。

天然VWF之前多肽包含多个结构域。不同结构域的批注可在文献中找到(见例如Zhou et al.(2012)Blood 120(2)：449-458)。下列VWF之天然原前多肽的结构域批注应用于本申请案中：

D1-D2-D′-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK

参照SEQ ID NO：4，D’结构域系由氨基酸764-865组成；且D3结构域系由氨基酸866-1242组成。

本发明之「截短型」特征意指多肽不包含成熟VWF之完整氨基酸序列(SEQ ID NO：4之氨基酸764-2813)。一般而言，截短型VWF不包含SEQ ID NO：4之所有氨基酸764-2813，但仅包含其片段。截短型VWF亦可称为VWF片段或复数的VWF片段。

一般而言，截短型VWF能够结合第八凝血因子。较佳地，截短型VWF能够结合成熟形式的人类天然第八凝血因子。在另一实施例中，截短型VWF能够结合重组FVIII，较佳地结合如本文中描述之FVIII，另外更佳地结合由氨基酸序列SEQ ID NO：5所组成之单链第八凝血因子。截短型VWF与第八凝血因子之结合可由FVIII-VWF结合测定法判定，如实例2中所述。

本发明之截短型VWF较佳地包含与SEQ ID NO：4之氨基酸776至805具有至少90％序列同一性之氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，且能够结合FVIII。在较佳实施例中，截短型VWF包含与SEQ ID NO：4之氨基酸776至805具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性之氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，且能够结合FVIII。最佳的是，截短型VWF包含SEQ ID NO：4之氨基酸776至805或由SEQ ID NO：4之氨基酸776至805组成。除非在本文中以其他方式指示，序列同一性系依照参考序列的完整长度判定(例如SEQ ID NO：4之氨基酸776至805)。

本发明之截短型VWF较佳地包含与SEQ ID NO：4之氨基酸766至864具有至少90％序列同一性之氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，且能够结合FVIII。在较佳实施例中，截短型VWF包含与SEQ ID NO：4之氨基酸766至864具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性之氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，且能够结合FVIII。最佳的是，截短型VWF包含SEQ ID NO：4之氨基酸776至805或由SEQ ID NO：4之氨基酸766至864组成。

在另一较佳实施例中，截短型VWF系由(a)与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性之氨基酸序列或(b)其片段组成，惟该截短型VWF仍能够结合FVIII。更佳的是，截短型VWF系由(a)与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性之氨基酸序列或(b)其片段组成，惟该截短型VWF仍能够结合FVIII。最佳的是，截短型VWF系由(a)SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242或(b)其片段组成，惟该截短型VWF仍能够结合FVIII。

如以下更详细描述的，本发明之多肽可藉由使用细胞之方法制备，该细胞包含编码包含截短型VWF之多肽的核酸。该核酸系藉由本身已知之技术导入至合适宿主细胞之中。

在较佳实施例中，在宿主细胞中之核酸编码(a)与SEQ ID NO：4之氨基酸1至1242具有至少90％序列同一性之氨基酸序列或(b)其片段，惟该截短型成熟VWF仍能够结合FVIII。更佳的是，该核酸编码(a)与SEQ ID NO：4之氨基酸1至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性之氨基酸序列或(b)其片段，惟该截短型VWF仍能够结合FVIII。最佳的是，该核酸编码(a)SEQ ID NO：4之氨基酸1至1242或(b)其片段，惟该截短型VWF仍能够结合FVIII。特别是如果根据本发明之多肽系二聚体，则该核酸将包含编码VWF之氨基酸1至763的序列(例如SEQ ID NO：4)，即使在该多肽中截短型VWF不包含VWF的氨基酸1至763(例如SEQ ID NO：4)。

根据较佳实施例，本发明之重组多肽之截短型VWF可不包含SEQ ID NO：4之VWF的氨基酸序列1至763。

根据进一步较佳实施例，截短型VWF包含下列氨基酸序列中之一者或由下列氨基酸序列中之一者组成，各者指的是SEQ ID NO：4：776-805；766-805；764-805；776-810；766-810；764-810；776-815；766-815；764-815；776-820；766-820；764-820；776-825；766-825；764-825；776-830；766-830；764-830；776-835；766-835；764-835；776-840；766-840；764-840；776-845；766-845；764-845；776-850；766-850；764-850；776-855；766-855；764-855；776-860；766-860；764-860；776-864；766-864；764-864；776-865；766-865；764-865；776-870；766-870；764-870；776-875；766-875；764-875；776-880；766-880；764-880；776-885；766-885；764-885；776-890；766-890；764-890；776-895；766-895；764-895；776-900；766-900；764-900；776-905；766-905；764-905；776-910；766-910；764-910；776-915；766-915；764-915；776-920；766-920；764-920；776-925；766-925；764-925；776-930；766-930；764-930；776-935；766-935；764-935；776-940；766-940；764-940；776-945；766-945；764-945；776-950；766-950；764-950；776-955；766-955；764-955；776-960；766-960；764-960；776-965；766-965；764-965；776-970；766-970；764-970；776-975；766-975；764-975；776-980；766-980；764-980；776-985；766-985；764-985；776-990；766-990；764-990；776-995；766-995；764-995；776-1000；766-1000；764-1000；776-1005；766-1005；764-1005；776-1010；766-1010；764-1010；776-1015；766-1015；764-1015；776-1020；766-1020；764-1020；776-1025；766-1025；764-1025；776-1030；766-1030；764-1030；776-1035；766-1035；764-1035；776-1040；766-1040；764-1040；776-1045；766-1045；764-1045；776-1050；766-1050；764-1050；776-1055；766-1055；764-1055；776-1060；766-1060；764-1060；776-1065；766-1065；764-1065；776-1070；766-1070；764-1070；776-1075；766-1075；764-1075；776-1080；766-1080；764-1080；776-1085；766-1085；764-1085；776-1090；766-1090；764-1090；776-1095；766-1095；764-1095；776-1100；766-1100；764-1100；776-1105；766-1105；764-1105；776-1110；766-1110；764-1110；776-1115；766-1115；764-1115；776-1120；766-1120；764-1120；776-1125；766-1125；764-1125；776-1130；766-1130；764-1130；776-1135；766-1135；764-1135；776-1140；766-1140；764-1140；776-1145；766-1145；764-1145；776-1150；766-1150；764-1150；776-1155；766-1155；764-1155；776-1160；766-1160；764-1160；776-1165；766-1165；764-1165；776-1170；766-1170；764-1170；776-1175；766-1175；764-1175；776-1180；766-1180；764-1180；776-1185；766-1185；764-1185；776-1190；766-1190；764-1190；776-1195；766-1195；764-1195；776-1200；766-1200；764-1200；776-1205；766-1205；764-1205；776-1210；766-1210；764-1210；776-1215；766-1215；764-1215；776-1220；766-1220；764-1220；776-1225；766-1225；764-1225；776-1230；766-1230；764-1230；776-1235；766-1235；764-1235；776-1240；766-1240；764-1240；776-1242；766-1242；764-1242；764-1464；764-1250；764-1041；764-828；764-865；764-1045；764-1035；764-1128；764-1198；764-1268；764-1261；764-1264；764-1459；764-1463；764-1464；764-1683；764-1873；764-1482；764-1479；764-1672；及764-1874。

在某些实施例中，截短型VWF相对于成熟野生型VWF具有内部删除。例如，A1、A2、A3、D4、C1、C2、C3、C4、C5、C6、CK结构域或彼等之组合可被删除，且D’结构域及/或D3结构域保留。根据进一步实施例，截短型VWF缺乏结构域A1、A2、A3、D4、C1、C2、C3、C4、C5、C6或CK中之一或多者。根据进一步实施例，截短型VWF缺乏SEQ ID NO：4之氨基酸1243至2813，即结构域A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK。

在进一步实施例中，截短型VWF不包含血小板糖蛋白Ibα(GPIbα)、胶原蛋白及/或整合素αIIbβIII(C1结构域中之RGDS序列)结合位点。在其他实施例中，截短型VWF不包含ADAMTS13切割位点(Tyr1605-Met1606)，其系位于VWF的中央A2结构域。在又一实施例中，截短型VWF不包含GPIbα结合位点及/或不包含胶原蛋白结合位点及/或不包含整合素αIIbβIII结合位点及/或其不包含ADAMTS13切割位点(Tyr1605-Met1606)，其系位于VWF的中央A2结构域。

在其他实施例中，截短型VWF包含与前段列举之氨基酸序列中之一者具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，惟该截短型VWF能够结合FVIII。

若本发明之多肽的二个单体系共价连接，则本发明之多肽在本发明中被称为「二聚体」。较佳地，共价键系位于本发明之多肽的截短型VWF部分之中。较佳地，二个单体次单位系经由至少一个双硫键例如一、二、三或四个双硫键共价连接。形成至少一个双硫键的半胱胺酸残基较佳地位于本发明之多肽的截短型VWF部分之中。在一实施例中，这些半胱胺酸残基系Cys-1099、Cys-1142、Cys-1222、Cys-1225或Cys-1227或彼等之组合。较佳地，本发明之二聚体多肽除了位于多肽的截短型VWF部分之中的该共价键之外，不包含任何连接单体的进一步共价键，特别是不包含位于多肽之HLEM或HLEP部分之中的任何进一步共价键。然而根据替代实施例，本发明之二聚体多肽可包含位于多肽之HLEM或HLEP部分之中的连结单体的共价键。

二聚体较佳地系同型二聚体，藉此各单体较佳地包含在本文中揭示之HLEM。如果本发明之多肽系二聚体，则截短型VWF较佳地包含二个多肽或由二个多肽组成，该二个多肽之各者的氨基酸序列与SEQ ID NO：4的氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225或氨基酸764至1227具有至少90％序列同一性，且能够结合FVIII。在较佳实施例中，截短型VWF包含与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225或氨基酸764至1227具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性之氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，且能够结合FVIII。最佳的是，截短型VWF包含下列或由下列组成：SEQ ID NO：4之氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225、氨基酸764至1227或氨基酸764至1242。

截短型VWF可为WO 2013/106787 A1、WO 2014/198699 A2、WO 2011/060242 A2或WO 2013/093760 A2中揭示之VWF片段之任一者，彼等之揭露以引用方式并入本文中。

根据进一步较佳实施例，如上揭示之截短型VWF可包含在WO 2016/000039 A1中揭示之氨基酸取代的至少一者。该些经修饰版本的截短型VWF相较于根据SEQ ID NO：4之野生型VWF的D’结构域之氨基酸序列，包含至少一个在其D’结构域中之氨基酸取代。经修饰版本的截短型VWF之氨基酸序列相对于各别野生型序列可具有一或多个氨基酸取代。经修饰的截短型VWF之D’结构域的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：4之D’结构域较佳地具有一或2个氨基酸取代。较佳的是，在SEQ ID NO：4之位置764(对应SEQ ID NO：2之位置1)的S系经选自由G、P、V、E、Y、A及L所组成之群组的氨基酸取代。也较佳的是，在SEQ ID NO：4之位置766(对应SEQ ID NO：2之位置3)的S系经选自由Y、I、M、V、F、H、R及W所组成之群组的氨基酸取代。较佳的取代组合包括S764G/S766Y、S764P/S766I、S764P/S766M、S764V/S766Y、S764E/S766Y、S764Y/S766Y、S764L/S766Y、S764P/S766W、S766W/S806A、S766Y/P769K、S766Y/P769N、S766Y/P769R及S764P/S766L(所指的是SEQ ID NO：4之序列)。本发明之多肽对FVIII之结合亲和性可进一步藉由导入该等取代而相较于除了该等修饰之外具有相同氨基酸序列的参考多肽之结合亲和性增加。该等在截短型VWF中之取代可使共同施予之FVIII的半衰期增加。

在本文中使用之用语「内源性VWF」系指VWF之单体次单位，与其多聚化程度无关。

半衰期延长部分(HLEM)

除了截短型VWF之外，本发明之多肽在某些较佳实施例中可能进一步包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可为融合至截短型VWF之异源性氨基酸序列。替代地，半衰期延长部分可藉由与肽键不同之共价键化学接合至包含截短型VWF之多肽。

在本发明之某些实施例中，本发明之多肽的半衰期藉由化学修饰延长，例如连接半衰期延长部分诸如聚乙二醇(聚乙二醇化)、醣化PEG、羟乙基淀粉(羟乙基淀粉化(HESylation))、聚唾液酸、类弹性蛋白多肽、肝素前体(heparosan)聚合物或玻尿酸。在另一实施例中，本发明之多肽经由化学连接符诸如白蛋白与HLEM接合。此接合技术的原理已由Conjuchem LLC以例示性方式描述(见例如美国专利第7,256,253号)。

在其他实施例中，半衰期延长部分系半衰期增长蛋白质(HLEP)。较佳地，HLEP系白蛋白或其片段。白蛋白的N端可与截短型VWF的C端融合。可替代地，白蛋白的C端可与截短型VWF的N端融合。一或多个HLEP可与VWF的N端或C端部分融合，惟彼等不干扰或阻碍截短型VWF结合FVIII的能力。

重组多肽进一步较佳地包含位于截短型VWF与HLEM之间的化学键或连接符序列。

该连接符序列可为由一或多个氨基酸所组成之肽连接符，特别是1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3个(例如1、2或3个)氨基酸，且可彼此相同或不同。较佳地，连接符序列不存在于野生型VWF的对应位置上。存在于该连接符序列上的较佳氨基酸包括Gly及Ser。连接符序列应不具免疫原性。较佳连接符可包含交替的甘胺酸及丝胺酸残基。合适连接符系描述于例如WO2007/090584。

在本发明的另一实施例中，在截短型VWF部分与HLEM之间的肽连接符系由作为人类蛋白质中的天然结构域间连接符的肽序列所组成。较佳地，该等肽序列在其天然环境中系位于靠近蛋白质表面且可让免疫系统接近，所以可假设对抗此序列的天然耐受性。实例系于WO 2007/090584中给出。可裂解的连接符序列描述于例如WO 2013/120939 A1中。

在重组多肽的较佳实施例中，介于截短型VWF与HLEM之间的连接符系甘胺酸/丝胺酸肽连接符，其具有SEQ ID NO：2之氨基酸序列480-510或由SEQ ID NO：2之氨基酸序列480-510所组成。

在一实施例中，多肽具有下列结构：

tVWF-L1-H，[式1]

其中tVWF系截短型VWF，L1系化学键或连接符序列且H系HLEM，特别是HLEP。

L1可为化学键或由一或多个氨基酸所组成之连接符序列，例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3个(例如1、2或3个)氨基酸，且可彼此相同或不同。通常，连接符序列不存在于野生型VWF的对应位置上。存在于L1上的合适氨基酸之实例包括Gly及Ser。连接符应不具免疫原性且可为不可裂解或可裂解连接符。不可裂解连接符可包含如WO2007/090584 A1所例示之交替的甘胺酸及丝胺酸残基。在本发明的另一实施例中，在截短型VWF部分与白蛋白部分之间的肽连接符系由作为人类蛋白质中的天然结构域间连接符的肽序列所组成。较佳地，该等肽序列在其天然环境中系位于靠近蛋白质表面且可让免疫系统接近，所以可假设对抗此序列的天然耐受性。实例系于WO 2007/090584中给出。可裂解的连接符序列描述于例如WO 2013/120939 A1中。

较佳的HLEP序列于下文说明。本发明同样地涵盖与各别HLEP之确切「N端氨基酸」或确切「C端氨基酸」的融合，或与各别HLEP之「N端部分」或「C端部分」的融合，其包括HLEP的一或多个氨基酸之N端删除。多肽可包含超过一个HLEP序列，例如二或三个HLEP序列。这些多个HLEP序列可与VWF的C端部分串联融合，例如成为连续性重复。

半衰期增长多肽(HLEP)

较佳地，半衰期延长部分系半衰期延长多肽(HLEP)。更佳的是，HLEP系选自由下列所组成之群组：白蛋白、白蛋白家族成员或其片段、具有大流体动力学体积之溶剂合物无规链(例如XTEN(Schellenberger et al.2009；Nature Biotechnol.27:1186-1190)、同源氨基酸重复(HAP)或脯胺酸-丙胺酸-丝胺酸重复(PAS)、艾芙米(afamin)、α-胎蛋白、维生素D结合蛋白质、转铁蛋白或其变体或片段、人绒毛膜促性腺激素-β次单位之羧基端肽(CTP)、能够与新生儿Fc受体(FcRn)结合之多肽、特别是免疫球蛋白恒定区及其部分例如Fc片段、在生理条件下能够与白蛋白、白蛋白家族成员或其片段或免疫球蛋白恒定区或其部分结合之多肽或脂质。免疫球蛋白恒定区或其部分较佳地系免疫球蛋白G1之Fc片段、免疫球蛋白G2之Fc片段或免疫球蛋白A之Fc片段。

在本文中使用之半衰期增长多肽可为在本文中描述之全长半衰期增长蛋白质或其能够稳定或延长凝血因子之治疗活性或生物活性特别是增加本发明之多肽体内半衰期之一或多个片段。该等片段可具有10或更多个氨基酸长度或可包括至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100或更多个来自HLEP序列之连续氨基酸或可包括各别HLEP之部分或全部的特定结构域，只要这些HLEP片段相较于无HLEP的各别多肽提供功能性半衰期延长至少25％。

本发明之多肽的HLEP部分可为野生型HLEP之变体。用语「变体」包括保守性或非保守性的插入、删除及取代，其中该等变化实质上不改变截短型VWF的FVIII结合活性。

特别是，本发明所提出的截短型VWF HLEP融合建构体可包括HLEP天然发生的多形性变体及HLEP之片段。HLEP可衍生自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人类、猴、牛、绵羊或猪。非哺乳动物HLEP包括但不限于母鸡及鲑鱼。

根据本揭露之特定实施例，本发明之重组多肽的HLEM(特别是HLEP)部分可用替代用语「FP」表示。较佳地，用语「FP」代表人类白蛋白。

根据特定较佳实施例，重组多肽系融合蛋白质。本发明中的融合蛋白质系由符合读框地联结至少二个编码截短型VWF以及HLEP之DNA序列所产生的蛋白质。技艺人士了解融合蛋白质DNA序列之转译将导致单一蛋白质序列。根据进一步较佳的实施例符合读框地插入编码肽连接符之DNA序列，可获得包含截短型VWF、合适连接符及HELP之融合蛋白质。

根据一些实施例，共同施予之FVIII不包含任何在本文中描述之HLEM或HLEP结构。根据某些其他实施例，共同施予之FVIII可包含在本文中描述之HLEM或HLEP结构中之至少一者。

作为HLEP之白蛋白

用语「人类血清白蛋白」(HSA)及「人类白蛋白」(HA)及「白蛋白」(ALB)在本申请案中可交换使用。用语「白蛋白」及「血清白蛋白」更为广泛，涵盖人类血清白蛋白(及其片段及变体)以及来自其他物种之白蛋白(及其片段及变体)。

如本文中所使用，「白蛋白」统称具有白蛋白之一或多个功能活性(例如生物活性)的白蛋白多肽或氨基酸序列或白蛋白片段或变体。具体而言，「白蛋白」系指人类白蛋白或其片段，特别是如在本文中SEQ ID No：6所示之成熟形式的人类白蛋白、或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段、或这些分子或其片段的类似物或变体。

根据本揭露之特定实施例，替代用语「FP」系用来表示HLEP，特别是将白蛋白定义为HLEP。

特别是，本发明所提出的多肽可包括人类白蛋白之天然发生的多形性变体及人类白蛋白之片段。通常来说，白蛋白片段或变体的长度将为至少10、较佳地至少40、最佳地超过70个氨基酸。

本发明之较佳实施例包括作为本发明之多肽的HLEP之白蛋白变体，其对于FcRn受体的结合提高。与野生型白蛋白之截短型VWF融合相比，该等白蛋白变体可导致截短型VWF白蛋白变体融合蛋白更长的血浆半衰期。

本发明之多肽的白蛋白部分可包含HA的至少一个子结构域或结构域或其保守性修饰。

作为HLEP之免疫球蛋白

所属技术领域中已知免疫球蛋白G(IgG)恒定区(Fc)增加治疗性蛋白质的半衰期(Dumont J A et al.2006.BioDrugs 20:151-160)。IgG重链恒定区系由3个结构域(CH1-CH3)及绞链区所组成。免疫球蛋白序列可分别源自任何哺乳动物或源自子类别IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。没有抗原结合结构域之IgG和IgG片段亦可用作为HLEP。治疗性多肽部分较佳地经由抗体绞链区或甚至可裂解的肽连接符连接至IgG或IgG片段。许多专利及专利申请案说明治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区融合以提高治疗性蛋白质的活体内半衰期。US2004/0087778及WO 2005/001025说明增加肽的半衰期之Fc结构域或至少部分之免疫球蛋白恒定区与具有生物活性肽的融合蛋白，否则肽会于活体内迅速消除。说明达成提高之生物活性、延长之循环半衰期及更大溶解度的Fc-IFN-β融合蛋白(WO 2006/000448 A2)。揭示具有延长之血清半衰期及增加之活体内效力的Fc-EPO蛋白(WO 2005/063808 A1)，以及揭示与G-CSF之Fc融合(WO 2003/076567 A2)、类升糖素肽-1(WO 2005/000892 A2)、凝血因子(WO 2004/101740 A2)及介白素-10(美国专利第6,403,077号)，全部皆具有半衰期增长性质。

可依照本发明使用的各种HLEP详细说明于WO 2013/120939 A1中。

本发明之多肽之N-聚醣及唾液酸化

本发明之多肽较佳地包含N-聚醣，且至少75％，较佳为至少85％，更佳为至少90％之该N-聚醣包含平均至少一个唾液酸部分。在较佳的实施例中，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％之N-聚醣包含平均至少一个唾液酸部分。发明人发现包含高唾液酸化之VWF片段的多肽不仅本身可具有进一步延长之半衰期，且亦可能能够进一步延长共同施予之FVIII的半衰期。换言之，本发明多肽的施予导致造成共同施予之FVIII的半衰期延长及/或清除率降低。

本发明之多肽较佳地包含N-聚醣，且糖蛋白之N-聚醣的至少50％之唾液基(sialyl)为经α-2,6-连结之唾液基。末端唾液基通常可经由α-2,3-或经由α-2,6-键联连接至半乳糖基团。本发明之多肽的N-聚醣通常包含比经α-2,3-连结之唾液基更多的经α-2,6-连结之唾液基。较佳地，至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％之N-聚醣的唾液基为经α-2,6-连结之唾液基。该等实施例可藉由例如在哺乳动物细胞中共同表现人类α-2,6-唾液酸转移酶而获得。

产生该等糖蛋白之合适方法描述于待审PCT/EP2016/061440。因此，在本文中描述一种产生包含唾液酸化增加之N-聚醣的糖蛋白之方法，该方法包含(i)提供包含编码包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之多肽的核酸之细胞及(ii)在小于36.0℃之温度下培养该细胞。此外，描述一种产生包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之糖蛋白的二聚体之方法，或用于增加该糖蛋白之二聚化的方法，该方法包含(i)提供包含编码糖蛋白之氨基酸序列的核酸之细胞及(ii)在小于36.0℃之温度下培养该等细胞。进一步地，在本文中描述一种产生包含唾液酸化增加之N-聚醣的糖蛋白之方法，该方法包含(i)提供细胞，该等细胞包含编码包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)之多肽的核酸及编码α-2,6-唾液酸转移酶之重组核酸及(ii)在允许糖蛋白及α-2,6-唾液酸转移酶表现之条件下培养该等细胞。

在一实施例中，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％之本发明之多肽的N-聚醣包含至少一个唾液酸基团。在另一实施例中，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％之本发明之多肽的N-聚醣包含至少一个唾液酸基团。

在另一实施例中，少于15％、少于12％、少于10％、或少于8％、或少于6％、或少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％或甚至少于1％之本发明之多肽的N-聚醣为无唾液酸(asialo)-N-聚醣，亦即彼等为缺乏唾液酸基团之N-聚醣。在另一实施例中，少于15％、少于12％、少于10％、或少于8％、或少于6％、或少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％或甚至少于1％之本发明之多肽的N-聚醣为无唾液酸(asialo)-N-聚醣，亦即彼等不具有唾液酸基团。

本发明之其他实施例包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，其中该截短型VWF能够与第八凝血因子(FVIII)结合，且其中该糖蛋白包含N-聚醣，其中小于35％、较佳地小于34％、较佳地小于33％、较佳地小于32％、较佳地小于31％、较佳地小于30％、较佳地小于29％、较佳地小于28％、较佳地小于27％、较佳地小于26％、较佳地小于25％、较佳地小于24％、较佳地小于23％、较佳地小于22％、较佳地小于21％、较佳地小于20％、较佳地小于19％、较佳地小于18％、较佳地小于17％、较佳地小于16％、较佳地小于15％、较佳地小于14％、较佳地小于13％、较佳地小于12％、较佳地小于11％、较佳地小于10％、较佳地小于9％、较佳地小于8％、较佳地小于7％、较佳地小于6％及较佳地小于5％的该N-聚醣包含平均二或更多个末端及非唾液酸化半乳糖残基。

本发明之仍其他实施例包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，其中该截短型VWF能够与第八凝血因子(FVIII)结合，且其中该截短型VWF包含N-聚醣，其中小于6％、较佳地小于5％、较佳地小于4％、较佳地小于3％、较佳地小于2％及较佳地小于1％的该N-聚醣包含平均三或更多个末端及非唾液酸化半乳糖残基。

上述实施例可彼此组合。应了解上述N-聚醣之任何百分比或唾液酸化程度的任何指示为平均百分比或程度，亦即彼等系指分子群，不是单一分子。无疑的是糖蛋白群内的个别糖蛋白分子之糖化或唾液酸化将显示一些异质性。

二聚体

本发明之多肽具有高比例的二聚体。本发明之多肽因此较佳地以二聚体存在。在一实施例中，至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％或约100％之多肽系以二聚体存在。在另一实施例中，本发明之多肽的二聚体：单体比系至少1.5、较佳地至少2、更佳的是至少2.5或至少3。最佳的是本发明之所有多肽皆以二聚体存在。进一步较佳的是本发明之多肽不包含多聚体形式。使用二聚体是有利的，因为与单体相比，二聚体对第八凝血因子具有改良的亲和性。本发明之多肽的二聚体含量及二聚体对单体之比可如实例2中所述方式判定。

在一实施例中，本发明之多肽对第八凝血因子之亲和性大于人类天然VWF对相同的第八凝血因子分子之亲和性。多肽对第八凝血因子之亲和性可指人类天然(不论是血浆衍生或重组)第八凝血因子，特别是具有截短型或删除B结构域之重组第八凝血因子分子，较佳地第八凝血因子分子可由SEQ ID NO：5表征。

已发现具有高比例二聚体之本发明多肽的制剂对第八凝血因子确实具有增加之亲和性。此增加之对第八凝血因子的亲和性确实导致本发明之多肽稳定第八凝血因子之作用提高。作为二聚体比例增加之替代方案或与增加之二聚体比例组合之下，本发明之多肽在第八凝血因子结合结构域内具有突变(其确实增加对第八凝血因子之亲和性)为本发明较佳的实施例。适合的突变揭示于例如WO 2013/120939 A1中。

多肽之制备

编码本发明之多肽之核酸可根据该领域已知之方法制备。基于人类天然VWF原前形式之cDNA序列(SEQ ID NO：3)，可设计及产生编码上述截短型VWF建构体或本发明之多肽的重组DNA。

即使由宿主细胞分泌之多肽不包含人类天然VWF原前形式之氨基酸1至763，但较佳的是编码多肽之细胞内前驱体的核酸(例如DNA)包含编码与SEQ ID NO：4之氨基酸23至763或较佳地氨基酸1至763具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列之核苷酸序列。最佳的是，编码多肽之细胞内前驱体的核酸(例如DNA)包含编码SEQ ID NO：4之氨基酸23至763或SEQ ID NO：4之氨基酸1至763的核苷酸序列。

建构体中的DNA若含有以正确方向插入表现质体中的完整开放阅读框，则可用于蛋白质表现。典型表现载体含有引导大量对应质体携带细胞中所插入之核酸的mRNA合成之启动子。彼等亦可包括容许彼等在宿主生物体内自主复制的复制起点序列及增加合成之mRNA转译的效率之序列。稳定的长期载体可藉由使用例如病毒的调节组件(例如来自EB病毒基因组之OriP序列)而维持成自由复制的实体。亦可产生整合载体至基因组DNA中的细胞系，且以此方式连续地产生基因产品。

欲提供之细胞通常系藉由引入编码本发明多肽之核酸至哺乳动物宿主细胞中而获得。

任何易于细胞培养及表现糖蛋白之宿主细胞可依照本发明加以利用。在某些实施方式中，宿主细胞系哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞之非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人类视网膜胚细胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands))；经SV40转形之猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或经次选殖以于悬浮培养中生长之293细胞，Graham etal.,J.Gen Virol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；鼠赛托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243 251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587)；人子宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2,HB8065)；鼠乳房肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals NY.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；PS4细胞；人类羊水细胞(CAP)；及人肝肿瘤细胞系(Hep G2)。较佳地，细胞系为囓齿类细胞系，尤其为仓鼠细胞系，诸如CHO或BHK。

适合引入足以达成关注之糖蛋白表现之核酸至哺乳动物宿主细胞之方法为本技术中已知。见例如Gething et al.,Nature,293:620-625,1981；Mantei et al.,Nature,281:40-46,1979；Levinson et al.EP 117,060；及EP 117,058。用于哺乳动物细胞之引入基因物质至哺乳动物细胞之常见方法包括Graham和van der Erb之磷酸钙沉淀方法(Virology,52:456-457,1978)或Hawley-Nelson之lipofectamine^TM(Gibco BRL)方法(Focus 15:73,1993)。哺乳动物细胞宿主系统转形的通用方面已由Axel于美国专利第4,399,216号中说明。关于引入基因物质至哺乳动物细胞的各种技术，见Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537,1990、及Mansour et al.,Nature,336:348-352,1988。

细胞系在允许多肽表现的条件下培养。多肽可使用熟习本技术领域者已知的方法回收及纯化。

最大浓度、时间-浓度曲线下面积、终末半衰期、MRT、清除率及生体可用率

本发明之另一方面系包含本文上述定义之截短型VWF之多肽血管外施予后提供或增加FVIII之生体可用率之用途。此外，本发明之方面系其相较于与该治疗完全相同之参考治疗用于增加第八凝血因子之C_max、AUC、终末半衰期及/或平均滞留时间(MRT)及/或减少清除率之用途，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比，特别是低于50、低于60、低于75、低于100、低于200、低于300、低于400或低于1000之摩尔比。

为了评药物动力学数据，采用二室模型(双相药物动力学特性)。

最大浓度(C_max)系该模型给出之最高血浆浓度值。在共同施予该重组多肽与FVIII之后，FVIII之最大浓度(C_max)可为至少10mIU/mL、至少25mIU/mL、至少50mIU/mL、至少100mIU/mL、至少200mIU/mL、至少300mIU/mL或至少400mIU/mL FVIII活性，较佳为显色FVIII活性。

在共同施予重组多肽与FVIII后，该重组多肽之最大浓度(C_max)根据某些实施例系至少20nmol/kg、至少40nmol/kg、至少60nmol/kg、至少80nmol/kg或至少160nmol/kg。较佳地，在共同施予该重组多肽与FVIII后，该重组多肽之最大浓度(C_max)系至少5μg HLEM/mL、10μg HLEM/mL、至少15μg HLEM/mL、或至少20μg HLEM/mL，其中该等值系基于HLEM之计算，较佳地，该等值系基于使用HLEM特定测定之定量诸如免疫测定法，较佳地人类白蛋白之特定测定。重组多肽的最大浓度(C_max)相较于参考治疗可高出至少3倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。

AUC_0-inf系自零至无限血浆浓度-时间曲线下面积。在重组多肽与FVIII共同施予之后，该共同施予FVIII之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)可为至少1000mIU*h/mL、至少2000mIU*h/mL、至少3000mIU*h/mL、至少5000mIU*h/mL、至少10000mIU*h/mL或至少20000mIU*h/mL FVIII活性、较佳地显色FVIII活性。

在共同施予重组多肽与FVIII后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)系至少2nmol*h/mL、至少3nmol*h/mL、至少4nmol*h/mL、至少20nmol*h/mL、至少40nmol*h/mL或至少80nmol*h/mL。较佳地，在共同施予重组多肽与FVIII后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)可为至少500μg HLEM*h/mL、至少750μg HLEM*h/mL、至少1000μg HLEM*h/mL、至少5000μg HLEM*h/mL、或至少10000μg HLEM*h/mL，其中该等值系基于HLEM之计算，较佳地，该等值系基于使用HLEM特定测定之定量诸如免疫测定法，较佳地人类白蛋白之特定测定。

在重组多肽与FVIII共同施予之后，该共同施予重组多肽之t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)可高于参考治疗至少5倍、至少10倍、或至少15倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于本发明之摩尔比。

在特定时间t的「半衰期」T1/2(t)为使在时间t呈现的血浆浓度C(t)变一半所需的时间。「终末半衰期」(之后简写为t_1/2)系当t趋向无限时，T1/2(t)的极限。计算方式为将2的天然对数除以终末消除常数。

施予之FVIII的终末半衰期可藉由共同施予该重组多肽而增加，较佳地相较于参考治疗增加至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。较佳地，共同施予之FVIII的终末半衰期相较于参考治疗增加，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。

在共同施予重组多肽后，该施予之FVIII的终末半衰期可为至少5h、至少6h、至少7h、至少9h、至少10h或至少15h。

本发明之多肽的血浆半衰期相较于内源性VWF可增加，其中多肽之血浆半衰期较佳地高出内源性VWF至少100％、至少200％或较佳至少400％。

在与FVIII共同施予后重组多肽的终末半衰期可为至少10h、至少15h、至少20h、至少25h、至少30h或至少35h。重组多肽之终末半衰期相较于参考治疗可增加，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。

如本文中所使用之用语「MRT」意指药物分子(例如本发明之多肽或FVIII)滞留于体内的平均时间。在具有固定清除率之药物动力学系统中，MRT可以第一时刻曲线下的面积(AUMC_0-inf)除以AUC_0-inf来计算。第一时刻曲线系时间乘以该时间的血浆浓度。AUMC_0-inf的计算类似AUC_0-inf。

施予之FVIII的平均滞留时间(MRT)藉由共同施予该重组多肽而增加，较佳地相较于参考治疗增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。

该施予之FVIII的MRT可为至少10h、较佳地至少15h、至少20h或至少25h。

施予之重组多肽的MRT可较佳地相较于参考治疗增加至少1.5倍、至少2倍或至少3倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于根据本发明之摩尔比。

如本文中所使用之用语「清除率」系指血浆药物清除的速率。特定言之，其为药物现行的消除速率除以其现行的血浆浓度。在单一静脉内施予之后的药物动力学系统中，清除率可以剂量对AUC_0-inf之比来计算，先决条件为清除率是固定的。清除率越低，血浆药物清除所花的时间就越长。

在重组多肽与FVIII共同施予之后，该施予之FVIII的清除率(CL)相较于参考治疗系减少较佳地至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少7.5倍或至少10倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的比低于本发明之摩尔比。

较佳地，在共同施予重组多肽与FVIII后，该施予FVIII之清除(CL)值系低于135mL/kg/h、低于80mL/kg/h、低于45mL/kg/h、低于40mL/kg/h、低于35mL/kg/h、低于30mL/kg/h或低于25mL/kg/h。该施予FVIII的清除(CL)值系较佳地低于参考治疗之该值，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比。

在共同施予重组多肽与FVIII后，该重组多肽之清除(CL)值可介于1.0至2.5mL/kg/h、或介于1.1至2.2mL/kg/h或介于1.2至2.1mL/kg/h之范围。

在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该重组多肽的清除率(CL)相较于参考治疗减少至少2倍、至少5倍或至少10倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于本发明之摩尔比。

如本文中所使用之用语生体可用率系定义为相对于本发明之多肽(例如rD’D3-FP)在i.v.施予后的AUC_0-inf，本发明之多肽(例如rD’D3-FP)在s.c.施予后的AUC_0-inf之百分比。

本发明进一步关于使用本文上述例如但不限于上述实施例[1]至[66]定义之多肽使FVIII能够皮下施予。本发明具体而言进一步关于使用本文上述定义之多肽以提供或增加FVIII之生体可用率。

在与重组多肽共同施予后，施予之FVIII的生体可用率相较于参考治疗可增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了欲施予之该重组多肽不包含HLEM、及/或除了欲施予之该重组多肽对欲施予之该FVIII的摩尔比低于根据本发明之摩尔比。

在与重组多肽共同施予后，施予之FVIII的生体可用率较佳地系至少2％、至少3％、至少5％、较佳地至少7％、至少10％、至少15％、至少30％、至少35％或至少40％。在与重组多肽共同施予后，施予之FVIII的生体可用率的进一步较佳范围系5-80％、5-70％、5-60％、5-50％、5-40％、5-30％、5-25％、10-25％、10-15％或5-15％。

在与FVIII共同施予后，重组多肽的生体可用率系至少30％、较佳地至少35％、更佳地至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％或至少80％。

本发明之进一步方面系一种治疗凝血疾病之方法，该方法包含向有需要之病患施予有效量的如上定义之多肽。

进一步方面为使用如上文所定义之多肽(例如但不限于以上实施例[1]至[66]中之任一项)以减少A型血友病治疗中施予FVIII之频率。皮下施予FVIII之频率可减至每周二次。替代地，皮下施予FVIII之频率可减少至每周一次，或甚至降低至例如每10天一次或每14天一次。FVIII可以每周两次、每5天一次、每周一次、每10天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次，或在前述各值中任两个值之间的任何范围施予，例如从每四天一次至每月一次、从每10天一次至每两周一次等。

在本文中用语「谷底水平」用于定义在预防性治疗中将应用下一次FVIII剂量时之血浆FVIII浓度。目前，严重A型血友病患者的建议谷底水平(即体内存在之凝血因子的最低水平)设定为1％。至1、5及10％谷底水平的时间系藉由设定等于0.01、0.05或0.1IU/mL之模型方程式并解出时间计算。

较佳地，与具有HLEM之多肽一起共同施予之FVIII达到1％、5％或10％谷底水平的时间期间相较于参考治疗延长，其中该参考治疗与本发明之治疗完全相同，除了该FVIII系与不具有该HLEM之重组多肽一起施予。

与多肽一起共同施予之FVIII达到1％谷底水平的时间期间系至少约30h、至少约35h、至少约38h、至少约40h或至少约50h；或与该多肽一起共同施予之FVIII达到5％谷底水平的时间期间系至少约20h、至少约22h、至少约29h、至少约34h或至少约43h；或与该多肽一起共同施予之FVIII达到10％谷底水平的时间期间系至少约5h、至少约6h、至少约10h、至少约18h或至少约20h。

治疗凝血病症

本发明之多肽可用于治疗凝血疾病包括A型血友病及类血友病(von-Willebrand氏病)。用语「A型血友病」系指缺乏功能性凝血FVIII，期通常为遗传而来。根据一些较佳实施例，类血友病(von-Willebrand氏病)系选自由第2N型类血友病(von-Willebrand氏病)、第3型类血友病(von-Willebrand氏病)及第1型类血友病(von-Willebrand氏病)所组成之群组。

在一实施例中，凝血疾病系中度A型血友病。中度A型血友病较佳地系以内源性FVIII活性水平为特征，其系NHP中内源性FVIII活性水平的约1％至约5％。一般而言，具有中度A型血友病的个体之内源性FVIII活性水平系血浆0.01至0.05IU/mL。

在另一实施例中，凝血疾病系轻度A型血友病。轻度A型血友病较佳地系以内源性FVIII活性水平为特征，其系NHP中内源性FVIII活性水平的约5％至约40％。一般而言，具有轻度A型血友病的个体之内源性FVIII活性水平系血浆0.05至0.4IU/mL。

在另一实施例中，凝血疾病系严重A型血友病，较佳地与低于NHP中内源性FVIII活性水平的1％之内源性FVIII活性水平有关。

在另一实施例中，凝血疾病系第2N型类血友病(von-Willebrand氏病)。第2N型类血友病(von-Willebrand氏病)较佳地系以内源性FVIII活性水平为特征，其系自约3IU/dL至约30IU/dL FVIII活性水平，对应NHP中内源性FVIII活性水平的3％至约30％。大部分病患具有低于20IU/dL的内源性FVIII活性水平，即低于NHP中内源性FVIII活性水平的20％之水平。因此，第2N型类血友病(von-Willebrand氏病)个体具有自0.03IU/mL至0.3IU/mL的血浆内源性FVIII活性水平，一般低于0.2IU/mL。

在另一实施例中，凝血疾病系第3型类血友病(von-Willebrand氏病)，其较佳地系以治疗前的内源性FVIII活性水平为特征，其范围通常系约1IU/dL与约20IU/dL FVIII活性水平之间，对应NHP中内源性FVIII活性水平的约1％至约20％之间。大部分病患具有低于10IU/dL的内源性FVIII活性水平，即低于NHP中内源性FVIII活性水平的10％之水平。

根据另一实施例中，该凝血疾病系第1型类血友病(von-Willebrand氏病)，其特征为治疗前的内源性FVIII活性水平相较于NHP中内源性FVIII活性水平为低。

疾病之治疗涵盖治疗已诊断为具有任何临床阶段或表现的任何疾病形式的病患；延迟疾病症状或征候的发作或进展或加重或恶化；及/或预防及/或减少疾病的严重性。

以本发明之多肽施予之「个体」或「病患」较佳为人类。在某些方面中，人类系小儿病患。在其他方面中，人类系成年病患。

在本文中描述包含本发明之多肽及可选地FVIII之组成物。组成物通常以包括医药上可接受之载剂的无菌医药组成物之一部分来供应。此组成物可呈任何适合的形式(取决于所欲施予给病患的方法)。

用语「第八凝血因子」及「FVIII」或「第八凝血因子蛋白质」在本文中可互换使用且涵盖源自血浆的FVIII及重组FVIII二者。重组FVIII涵盖但不限于全长FVIII、以及双链B-结构域删除或截短型变体、以及单链B-结构域删除或截短型变体，例如那些在WO 2004/067566 A1中所述者，及在B-结构域外部突变但仍具有FVIII之生物活性的其他FVIII变体。

本发明之多肽可以各种血管外路径施予病患，诸如皮下、皮内或肌肉内。在任何提出的例子中，最适合的施予路径将取决于特定多肽、个体、疾病的本质和严重性、及个体的身体状况而定。较佳地，本发明之多肽将经皮下施予。

多肽及FVIII较佳地系经皮下共同施予。

以本发明之多肽及FVIII治疗之剂量总次数及治疗长度的决定完全在那些熟习本技术领域者的能力范围内。欲施予之本发明之多肽以及FVIII的剂量可取决于欲施予之FVIII的浓度、欲治疗之病患体内的内源性内源性VWF之浓度或二者而定。基于本申请案之发明人所定义之比例的有效剂量可由技艺人士考虑本发明之多肽之分子量以及欲施予之FVIII之分子量来决定。也会考虑凝血疾病的严重程度，以判定本发明之多肽以及欲施予之FVIII的适当剂量。FVIII的典型剂量范围可自约20IU/kg体重至约1000IU/kg体重、较佳自约20IU/kg体重至约500IU/kg体重、进一步较佳自约20IU/kg体重至约400IU/kg体重、更佳自约20IU/kg体重至约300IU/kg体重。

根据本发明，经本发明之多肽治疗的病患亦经第八凝血因子治疗。本发明之多肽及第八凝血因子可较佳地同时(即一起)施予，虽然原则上亦可以顺序方式施予，这二种施予模式皆涵盖于用语「组合疗法」及「共同施予」之中。本发明之多肽及第八凝血因子可以混合物(即在相同组成物中)施予或分开(即作为不同的组成物)施予。重组多肽与FVIII蛋白质之共同施予较佳地系藉由以包含重组多肽与FVIII蛋白质之单一组成物一起施予达成。根据进一步较佳实施例，重组多肽与FVIII蛋白质之共同施予系藉由下列达成：提供包含掺合于单一组成物之重组多肽与FVIII之组合式产品，或提供至少二种分开产品之组合或套组，该二种分开产品预定在施予前混合，藉此第一产品包含重组多肽且第二产品包含FVIII。

具体而言，当重组多肽与FVIII蛋白质系提供于在共同施予前需混合之分开的组成物或产物中时，混合物在施予前可经处理，该处理之方式允许至少一部分的该重组多肽与该FVIII在施予前结合。例如，混合物可经孵养一段时间。该孵养可在室温下、或适当的升高温度然而较佳系在低于40℃的温度下进行小于1min、或小于5min。该快速孵养步骤在重构包含掺合于单一组成物之重组多肽与FVIII之组合式产品期间亦可能适当。

在所使用之组成物中的第八凝血因子浓度通常在10至10,000IU/mL之范围内。在不同的实施例中，在本发明之组成物中的FVIII浓度可在10-8,000IU/mL、或10-5,000IU/mL、或20-3,000IU/mL、或50-1,500IU/mL、或3,000IU/mL、或2,500IU/mL、或2,000IU/mL、或1,500IU/mL、或1,200IU/mL、或1,000IU/mL、或800IU/mL、或750IU/mL、或600IU/mL、或500IU/mL、或400IU/mL、或300IU/mL、或250IU/mL、或200IU/mL、或150IU/mL、或125IU/mL、或100IU/mL、或62.5IU/mL、或50IU/mL之范围内，先决条件为满足关于如本文所定义之本发明的VWF多肽之比有关的要求。

「国际单位」或「IU」是FVIII的凝血活性(效力)之测量单位，测量方式为FVIII活性分析法(诸如单阶段凝血分析法)或显色受质FVIII活性分析法，该等方法使用以「IU」计经国际标准制剂校准的标准品。一阶段凝血测定系所属技术领域已知，诸如在N Lee,MartinL,et al.,An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates,Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中所述。一阶段测定的原理为：测试系以活化部分凝血活酶时间(aPTT)-测定的改良版本进行：以磷脂质及表面激活剂孵养血浆导致内因性凝血系统之因子的活化。添加钙离子触发凝血级联。判定至形成可测量纤维蛋白血块的时间。该测定系在第八凝血因子缺乏血浆存在下进行。缺乏血浆的凝血能力系藉由欲测试样本中所包括的第八凝血因子而恢复。凝血时间的缩短系与样本中存在的第八凝血因子之量成正比。第八凝血因子的活性系藉由与具有以国际单位计之第八凝血因子已知活性的标准制剂直接比较而定量。

另一标准分析法为显色受质分析法。显色受质分析可自市场上购得，诸如FVIII测试套组(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V.leMonza 338-20128Milano,Italy)。显色分析法的原理为：第X因子系在钙及磷脂的存在下以第IXa因子激活成第Xa因子。此反应系以第VIIIa因子作为辅因子刺激。FVIIIa系藉由反应混合物中少量凝血酶作用，自欲测量之样品中的FVIII所形成。当使用最适化浓度的Ca2+、磷脂和第IXa因子及过量的第X因子时，第X因子之激活系与第八因子之效力成比例。激活之第X因子系自显色受质S-2765释出发色基pNA。在405nm测量的释出之pNA因此与所形成的FXa量成比例且因此亦与样品的第八因子活性成比例。

医药组成物

适合于本文所述之方法的本发明多肽之治疗性配方可藉由如下述而制备成用于贮存的冻干配方或水溶液：将具有所欲纯度的多肽与通常于本技术中使用之随意的医药上可接受之载剂、赋形剂或稳定剂混合(所有该等在本文皆称为「载剂」)，亦即缓冲剂、稳定剂、保存剂、等张剂、非离子型清洁剂、抗氧化剂和其他的杂项添加剂。见Remington’sPharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980)。此等添加剂在所使用的剂量及浓度下必须对接受者无毒。

缓冲剂帮助维持pH值在接近生理条件的范围内。其可以从约2mM至约50mM为范围之浓度存在。适合的缓冲剂包括有机酸及无机酸二者及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、反丁烯二酸盐缓冲剂(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸单钠混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二钠混合物、反丁烯二酸单钠-反丁烯二酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)及乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可使用磷酸盐缓冲剂、组胺酸缓冲剂和三甲基胺盐，诸如Tris。

可添加保存剂以阻止微生物生长且可以0.2％-1％(w/v)为范围之量添加。适合的保存剂包括苯酚、苯甲醇、间-甲苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苯甲基铵、卤化苯甲烃铵(例如氯化苯甲烃铵、溴化苯甲烃铵及碘化苯甲烃铵)、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)及对羟基苯甲酸烷酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇及3-戊醇。可添加有时称为「稳定剂」的等张剂以确保液体组成物的等张性且包括多元糖醇，较佳为三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。稳定剂系指广泛类别的赋形剂，其功能可从增积剂至使治疗剂溶解或帮助防止变性或黏附至容器壁之添加剂。典型的稳定剂可为多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，诸如精胺酸、离胺酸、甘胺酸、麸酰胺酸、天冬酰胺、组胺酸、丙胺酸、鸟胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、麸胺酸、苏胺酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油及类似者，包括环醇，诸如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、麸胱甘肽、硫辛酸、氢硫乙酸钠、硫甘油、α-单硫甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少残基的肽)；蛋白质，诸如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；单醣，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双醣，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；及三醣，诸如棉籽糖；及多醣，诸如聚葡萄糖。稳定剂可以每重量份活性蛋白质计0.1至10,000重量份之范围存在。

可添加非离子型界面活性剂或清洁剂(亦称为「润湿剂」)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗蛋白质免于搅拌诱发之聚集，其亦允许配方暴露于承受剪切表面应力而不引起蛋白质变性。适合非离子型界面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、氧化异丙烯多元醇(Pluronic polyol)、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单醚(-20、/>-80等)。非离子型界面活性剂可以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml之范围或0.07mg/ml至约0.2mg/ml之范围存在。

额外的杂项赋形剂包括增积剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫胺酸、维生素E)及共溶剂。

除了本发明之多肽以外，本文中之配方亦可含有第二治疗剂。适合的第二治疗剂的实例于下文提供。

给药时程可从每月一次至每天一次之间变化，其系取决于许多临床因素而定，包括疾病类型、疾病严重性和患者对本发明多肽的敏感性。在特定实施例中，本发明之多肽系以每周两次、每5天一次、每周一次、每10天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次，或在前述各值中任两个值之间的任何范围施予，例如从每四周一次至每月一次、从每10天一次至每两周一次等。

欲施予之本发明多肽的剂量将根据特别的多肽、个体、疾病的本质和严重性、个体的身体状况、治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)及所选择之施予路径而改变；适当的剂量可由熟习本技术领欲者轻易地决定。

熟习本技术领域者应了解本发明多肽的个别剂量之最适量及间隔将由欲治疗之病况的本质和程度；施予形式、路径和部位；及欲治疗之特定个体的年龄和病况来决定，且最后由医师决定欲使用之适当剂量。此剂量可视需要经常重复。若发展出副作用，则可依照常规临床实践来改变或降低剂量的量及/或频率。

医药组成物较佳地调制成经血管外施予、较佳地调制成经皮下施予。

该领域之技艺人士将了解此处所描述之本发明易于进行除了特别说明者外之变化及修饰。应了解本发明包括落于本发明之精神与范围内的所有该等变化及修饰。本发明亦包括在本说明书中独立或总体提及或指示之所有特征、组成物、步骤及化合物，及该等特征、组成物、步骤及化合物之任二者或更多者的任何及所有组合。

序列表中显示之核苷酸及氨基酸序列摘列于表1。

表1:

本发明之某些实施例现将参照下列实例描述，该等实例之目的仅作为说明之用，并无意限制前述一般性之范畴。

实例

材料及方法

产制D’D3白蛋白融合蛋白质(D’D3-FP)：

由编码VWF氨基酸1至1242之cDNA、甘胺酸/丝胺酸连接符及人类白蛋白之cDNA所组成的D’D3-FP之表现卡匣系由客制化基因合成制备(Eurofins Genomics,Ebersberg,Germany)。透过侧接限制位点(EcoRI,NotI)，表现卡匣自供应的选殖载体切除并插入经EcoRI及NotI线性化之pIRESneo3载体(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)中。所得表现质体含有在CMV启动子控制下编码VWF前肽、D’及D3(SEQ ID NO：4之VWF氨基酸1至1242)之核苷酸序列经由短连接符编码序列融合至白蛋白编码序列。编码序列之核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1，成熟D’D3-FP之氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。在表现期间D1D2VWF前肽(741个氨基酸)的存在对于合成多肽的二聚化至关重要。

使用类似方式产制经His-标签化的D’D3蛋白质(以甘胺酸/丝胺酸连接符连接之D’D3及His8)及亦经由甘胺酸/丝胺酸连接符连接至人绒毛膜促性腺激素-β次单位之C端肽且在融合蛋白质的C端以8个组胺酸标签化之D’D3融合蛋白质的表现质体。成熟D’D3-His之氨基酸序列显示为SEQ ID NO：7，成熟D’D3-CTP之氨基酸序列显示为SEQ ID NO：8。

如上述之表现质体在XL10 Gold(Agilent Technologies)中生长且使用标准程序(Qiagen,Hilden,Germany)纯化。

CHO K1细胞系使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染并于无血清介质(CD-CHO,Invitrogen)中在500至1000μg/ml遗传霉素(Geneticin)存在下生长。如WO 2007/144173 A1中所述之编码PACE/弗林蛋白酶(furin)(pFu-797)之表现质体系经共转染以最大化前肽裂解效率。使源自单细胞之选殖株生长并根据彼等藉由白蛋白特异性酶免疫测定(见下文)所定量之D’D3-FP表现产率选择。最终选用于D’D3-FP发酵之细胞系称为T2050-CL3。

D’D3-FP之生产系在采用灌流模式之发酵程序的生物反应器中进行。用于生产含D’D3多肽之发酵程序始于将细胞系T2050-CL3解冻，随后使细胞在振荡烧瓶中扩增且最终使用Sartorius BioStat B-DCU 5L生物反应器及BioStat STR 50L单次使用生物反应器的灌流模式发酵程序。分别使用BioSeps 10L或200L(Applikon)作为细胞滞留装置。细胞培养基为含8mM L-麸酰胺酸及1μM CuSO₄之PowerCHO3(Lonza BESP1204)或含10mM L-麸酰胺酸及1μM CuSO₄之ProCHO5(Lonza BESP1072)。

在振荡烧瓶中之种子列车(seed train)系在37℃、7.5％CO₂下以振荡速度160rpm执行。

将5L生物反应器以2.5x10⁵个细胞/mL之目标VCD接种。使细胞于含8mM L-麸酰胺酸及1μM CuSO₄之PowerCHO3中在+37.0℃之温度、pH 7.00及30％氧饱和度下培养。在自生物反应器在+37℃下运行进行初始收集之后，将温度切换至+34.0℃(评估范围+31℃至+35℃)。pH的控制使用CO₂喷气作为酸及NaHCO₃作为碱。覆盖空气流速设定为0.5L/min。使用环喷气器作为喷气单元。搅动速率为150rpm，使用2倍螺距叶片叶轮的下拉模式。

将50L生物反应器以3.0×10⁵个细胞/mL之目标VCD接种。使细胞于含10mM L-麸酰胺酸及1μM CuSO₄之ProCHO5介质中在+37.0℃之温度、pH 6.90及30％氧饱和度下培养。在初始一或二次收集之后，将温度切换至+34.0℃。PH控制如上所述，覆盖空气流速设定为2L/min。使用微喷气器作为喷气单元。搅动速率为90rpm，使用2倍螺距叶片叶轮的下拉模式。

当生物反应器中之VCD≥1.0×10⁶个细胞/mL时，灌流启动。灌流速率设定为1.0体积/体积/天。BioSep系以5(10)分钟运行时间及10秒回冲之回冲模式操作，功率输入为7(30)W(括号中的数字系指50L生物反应器)。将灌流液及流出液线内过滤并在+2至+8℃下收集至袋中48小时。使用浊度探针藉由主动排出控制VCD，使用葡萄糖消耗量作为参数，目标为2g/L葡萄糖。将收集物及流出液在线内过滤，由抛弃式过滤器及抛弃式袋组成之收集系统每二天更换一次。

为了制备用于下文所述之PK分析之材料，将D’D3白蛋白融合蛋白质收集物藉由亲和性及粒径排阻层析法纯化。简言之，将来自生物反应器之无细胞收集物使用具有30kD膜(例如Pall Centramate OS030T12)之TFF系统(例如Pall Centramate 500S)浓缩30倍。在该浓缩物中加入NaCl及EDTA至最终浓度0.75M NaCl及5mM EDTA，并经整夜装载至CaptureSelect人类白蛋白管柱(Life Technologies)上，管柱系经20mM Tris缓冲剂pH7.4预平衡。在用平衡缓冲剂洗涤管柱后，将D’D3-FP用洗提缓冲剂(20mM Tris,2M MgCl₂,pH 7.4)洗提。接着将洗出液10倍浓缩，并使用具有30kD截留之超离心过滤器(例如Amicon.UFC903024)以50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4透析。为了分离D’D3-FP二聚体与单体部分，将该材料装载至经50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4预平衡之Superdex 200pg管柱(GE Healthcare代码：17-1069-01)并将含有D’D3-FP二聚体之尖峰流份汇集。使用二聚体及单体尖峰流份之曲线下面积计算二聚体对单体比例。该D’D3白蛋白融合蛋白质之二聚体制剂系用于药物动力学实验中。若无另行指示，该等二聚体制剂在下文中称为D’D3-FP。

rD’D3-FP EYA变体藉由等效方法步骤产制。

经His-标签化之D’D3蛋白质系以Ni-螯合物亲和性及粒径排阻层析法纯化。简言之，将经TFF浓缩之无细胞生物反应器收获物(参见上文的详述)经隔夜装载于预平衡(20mM磷酸钠/500mM NaCl，pH 7.4)之Ni-Sepharose管柱上(HisTrap^TM,GE Healthcare)。在以20mM磷酸钠/500mM NaCl/30mM咪唑，pH 7.4洗涤管柱之后，将蛋白质以20mM磷酸钠+500mMNaCl+500mM咪唑，pH 7.4洗提。接着将洗出液浓缩，且使用Amicon超离心过滤器透析(TBS,pH7.4)(参见上文)。接着将最终产物装载于SEC管柱上(参见上文)，汇集含有二聚体之尖峰流份且浓缩至约7mg/mL OD_280-320。经His-标签化之D’D3蛋白质之二聚体制剂系用于药物动力学实验中。若无另行指示，该等二聚体制剂在下文中称为rD’D3-His。

实例1：重组FVIII在rD’D3-FP或其变体存在下之皮下生体可用率

要评估血管外注射是否为改善FVIII疗法的选项，选择典型的代表性血管外疗法即皮下(s.c.)注射。我们的目标是要表征包含截短型VWF之重组多肽在不同方式中对于FVIII之皮下生体可用率的影响：

.实例1.1：在A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，皮下给予rD’D3-FP及rVIII-单链两者之探讨。

.实例1.2：在生理内源性FVIII之模型中，即在猪中，皮下给予rD’D3-FP及rVIII-单链两者之探讨。

.实例1.3：在A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，rD’D3-FP对不同FVIII产品(各以皮下给予之)之影响探讨。

.实例1.4：在小鼠A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，rD’D3-FP亲和性变体(具有非白蛋白HELP之rD’D3分子)与rVIII-单链两者皆皮下给予之作用探讨。

因此，我们探讨包含VWF之D’及D3结构域经由连接符肽融合至白蛋白之重组多肽经由皮下与重组FVIII共同施予时的影响。

在实例中，使用包含截短型VWF之多肽，该多肽具有如SEQ ID NO：2所定义之氨基酸序列。此特定融合蛋白质系由下列组成：N端氨基酸序列1至479代表VWF D’D3区域(人类天然VWF之氨基酸764至1242)、随后31个氨基酸甘胺酸/丝胺酸连接符肽及C端人类白蛋白氨基酸序列511至1095。此具有如SEQ ID NO：2所定义之序列的融合蛋白质，在以下被称为rD’D3-FP或rD’D3-FP WT。

就实例之目的而言，使用具有如SEQ ID NO：5定义之氨基酸序列的重组B结构域删除单链FVIII，即rVIII-单链。在实例1.3中，不同的重组FVIII产品系经测试。

进一步地，我们探讨不同的rD’D3-FP对rVIII-单链之比例的影响。

白蛋白融合作为皮下可用率的潜在调节剂之影响系藉由比较rD’D3-FP与His-标签化之rD’D3(rD’D3-His)的生体可用率来探讨。成熟D’D3-His之氨基酸序列显示于SEQ IDNO：7，藉此D’D3与His8藉由甘胺酸/丝胺酸连接符连接在一起。

除了使用白蛋白作为半衰期延长多肽(HLEP)，在一些实例中，使用具有经由甘胺酸/丝胺酸连接符融合至rD’D3之CTP(人绒毛膜促性腺激素-β次单位之C端肽)而非白蛋白之rD’D3-FP变体，此变体在以下称为rD’D3-CTP。融合蛋白质rD’D3-CTP具有如SEQ ID NO：8所定义之序列。

在某些实例中，使用rD’D3-FP之高亲和性变体。此特定变体融合蛋白质系由下列组成：N端氨基酸序列1至479代表VWF D’D3区域(人类天然VWF之氨基酸764至1242)、随后31个氨基酸甘胺酸/丝胺酸连接符肽及C端人类白蛋白氨基酸序列511至1095，惟在该多肽之D’D3结构域中存在三个氨基酸取代，即S764E、S766Y及V1083A。此融合蛋白质系由如SEQ IDNO：2所定义且在D’D3区域中具有该三个取代S764E、S766Y及V1083A之序列组成。该变体在以下称为rD’D3-FP EYA。

材料及方法

背景信息

为了计算不同rD’D3-FP：rVIII-单链组合的比例，做出下列假设：

.药物在施予之后经每kg体重40mL血浆稀释

.本发明使用之多肽的分子量：rD’D3-FP单体次单位分子量(包括醣化)：127,000Da(HLEM＝人类白蛋白)；使用单体重量计算比例

.rD’D3-His的分子量：rD’D3-His单体次单位分子量(包括醣化)：64,000Da；使用单体重量计算比例

.rD’D3-FP EYA变体的分子量：rD’D3-FP单体次单位分子量(包括醣化)：127,000Da；使用单体重量计算比例

.rD’D3-CTP的分子量：rD’D3-CTP单体次单位分子量(包括醣化)：69,800Da；使用单体重量计算比例

.所使用之FVIII的分子量：rVIII-单链分子量(具有醣化)：180,000Da及比活性：11,000IU/mg

.所使用之其他FVIII产品的分子量：

○分子量：285,000Da及比活性：5,000IU/mg

○分子量：280,000Da及比活性：7,000IU/mg

○分子量：170,000Da及比活性：10,700IU/mg

系CSL Behring公司的血浆衍生性人类FVIII产品。

系购自Baxter AG,Vienna,Austria且系重组全长第八凝血因子制剂。

ReFacto系购自Pfizer Limited,Kent,United Kingdom且系具有删除B结构域的重组第八凝血因子制剂。

分析

rD’D3-FP(野生型以及EYA变体)的施用剂量水平系由人类白蛋白ELISA定量，藉此测量蛋白质的白蛋白部分。此rD’D3-FP ELISA也用于血浆样本。

人类白蛋白ELISA使用来自Bethyl Laboratories,Inc.(Montgomery,USA)之多株山羊抗人类白蛋白捕捉抗体。侦测溶液系由多株过氧化酶标记抗人类白蛋白侦测抗体制剂(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,USA)组成。显色读出物(即来自SiemensHealthcare(Eschborn,Germany)之TMB)系用于微量板读取仪中以450/650nm(ELx808,BioTek,USA)在停止后直接定量。使用含有rD’D3-FP之药物配方作为标准物。rD’D3-FP的量系表示为白蛋白的mg数，即不针对分子的D’D3部分进行调整。

rD’D3-His及rD’D3-CTP建构体的剂量水平系于OD₂₈₀测量，且rD’D3-His蛋白质的量系调整至与rD’D3-FP的量等莫耳的浓度。藉此，rD’D3-His的单位与rD’D3-FP相同，即在图上以理论性白蛋白mg表示。rD’D3-CTP系以和rD’D3-FP(EYA变体)类似之摩尔比投药且单位不转换成白蛋白，而是如同rD’D3-CTP给予。含有rD’D3-His及rD’D3-CTP之PK血浆样本系以抗D’D3 ELISA测量。此D’D3 ELISA使用单株抗人类D’D3捕捉抗体(公司内部研究制备)。侦测溶液系由另一经单株过氧化酶标记之抗人类D’D3侦测抗体组成(公司内部研究制备)。显色读出物(即来自Siemens Healthcare(Eschborn,Germany)之TMB)系用于微量板读取仪中以450/650nm(ELx808,BioTek,Vermont,USA)在停止后直接定量。以标准品而言，使用含有rD’D3-His及rD’D3-CTP之药物配方，且如同先前将rD’D3-His计算为相较于rD’D3-FP之等莫耳浓度，即其量再次以理论性白蛋白mg表示。rD’D3-CTP的量以rD’D3-CTP的浓度表示。

FVIII显色活性血浆水平系藉由FVIII测定(FVIII：C显色测定，Chromogenix,Instrumentation Laboratory SpA,Milan,Italy)根据厂商的测试说明手册侦测。FVIII显色活性缩写为FVIII：C。

人类FVIII：Ag血浆水平系使用来自Stago,S.A.S.,France之FVIII AsserachromELISA测试套组根据测试说明手册判定。Asserachrom测试套组含有除了停止溶液以外的所有试剂，停止溶液系获自Siemens Healthcare(Eschborn,Germany)。使用含有rVIII-单链之药物配方作为标准物。

动物

FVIII ko小鼠

选择FVIII基因剔除(ko)小鼠(代表A型血友病表型)，因为牠们缺乏FVIII基因的外显子16及17，因此不具有血浆第八凝血因子活性(Bi L.et al,Nature genetics,1995,Vol 10(1),119-121；Bi L.et al,Blood,1996,Vol 88(9),3446-3450)。此允许在FVIII治疗后藉由定量这些小鼠血浆中的FVIII活性，进行FVIII活性水平分析。

体重介于17至35g之雄性及雌性FVIII ko小鼠系由Charles River Laboratories(Sulzfeld,Germany)繁殖。在公司内部，动物饲养于标准饲养条件下，即在20至24℃之12h/12h光-暗循环下。动物得以任意采食标准大鼠饲料(Ssniff-Soest,Germany)。供应自来水供任意采食。动物饲养管理及研究程序遵从德国动物福利法及欧盟规定。

组别大小为n＝12，分成3或4个研究世代。因此，使用每个时间点n＝3-4只动物。

猪

选择猪是因为猪在预测人类皮下给药之生体可用率方面是良好模型。

体重介于23至27kg的公猪系由Schlosser(Schwalmtal,Germany)繁殖。在公司内部，动物饲养于18至21℃下之铺稻草猪舍。以碎谷物喂饲动物。供应自来水供任意采食。动物饲养管理及研究程序遵从德国动物福利法及欧盟规定。

组别大小为2(静脉内(i.v.))或3(皮下(s.c.))。

实例1.1：在A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，皮下给予rD’D3-FP及rVIII-单链两者之探讨。

实验细节

测试制品系以总体积5mL/kg单次注射经s.c.施予至颈部或经i.v.施予至侧尾静脉。施予剂量水平及途径在表2中给予。

表2：治疗组

rD’D3-FP系以基于人类白蛋白值之0.3至10mg/kg的剂量范围应用，rVIII-单链剂量范围自50至400IU/kg显色FVIII活性。rVIII-单链以注射用水重构，且rD’D3-FP以及rD’D3-His在水浴中解冻。为了共同施予，将化合物在+37℃下一起孵养大约30分钟。每例中施予5mL/kg的剂量体积，如有需要使用FVIII的稀释缓冲剂以解离化合物。

血液样本在短期麻醉下使用替代取样方案自眼后采集。s.c.组的时间点为3、8、16、24、48、72及96h p.a.(400IU/kg rVIII-单链及10mg/kg rD’D3-FP+400IU/kg rVIII-单链组为例外)，且i.v.组为5min、3、8、24、48、72及96h p.a.。PK特性系得自每组3或4个小鼠研究世代，且每个时间点n＝3-4只动物。血液样本使用柠檬酸钠抗凝血(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)、经处理成血浆并储存在-70℃下以用于判定FVIII活性、FVIII抗原、白蛋白及/或rD’D3-His。

rD’D3-FP暴露系藉由使用人类白蛋白ELISA测量建构体之白蛋白部分判定。另外，测量FVIII显色活性及选定组别中的人类FVIII抗原。

生物统计学

最大浓度(C_max)、t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)、平均滞留时间(MRT)、廓清(CL)及终末半衰期(t_1/2)的估计系藉由i.v.计算中的二室模型及藉由s.c.计算的二室-重吸收模型进行。参数估计方面，采用加权最小平方成本函数。生体可用率系计算为s.c.施予后相较于i.v.施予之AUC_0-inf的百分比。至1、5及10％谷底水平的时间系藉由设定等于0.01、0.05或0.1IU/mL之模型方程式并解出时间计算。

结果

评估D’D3数据

两种D’D3(rD’D3-FP及rD’D3-His，分别含有及不含白蛋白融合)的建构体在s.c.施予后吸收。rD’D3-FP可在整个96h的观察期之中定量，即使0.3mg/kg的最低剂量；即其维持在23.4ng/mL的侦测极限之上(图1)。然而，rD’D3-FP相较于rD’D3-His可侦测到显著较高水平，特别是在较晚的时间点。

需要提起的是，一些曲线在最后二个测量点显示高类似性，导致终末期的血浆浓度曲线「平坦化」。藉此清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计值包括最后点时，预计将会非常长。第二种计算不包括最后时间点，以避免高估生体可用率；表3提供数据的比较且显示不包括最后时间点的数据与其他数据有良好一致性。因此，在表格与图式中(图1除外)，使用不包括96h数据点的第二数据组，其可能低估rD’D3-FP的生体可用率。

C_max及AUC_0-inf显示0.3-10mg/kg rD’D3-FP及0-400IU/kg rVIII-单链测试范围的剂量依赖性，与添加的rFVIII无关(表3，图2)。与降低暴露有关，rD’D3-His的C_max以及AUC_0-inf两者皆相关地低于可相比的rD’D3-FP剂量。详细地说，s.c.施予的C_max降低>3倍且AUC_0-inf降低>16倍。

rD’D3-FP的清除率、MRT及t_1/2不显示剂量依赖性。s.c.估计值中的高度变异性易发生难以替平坦的暴露-时间曲线适配正确曲线。在s.c.后清除值的范围为1.2-2.1mL/kg/h，i.v.施予后的值稍微较低(0.8-0.9mL/kg/h)。与此一致的是，s.c.的MRT(t_1/2)范围为41-117h(15-90h)，且i.v.施予为55-83h(39-69h)。相对地，rD’D3-His的消除快速许多，即s.c.后的清除率为34.8mL/kg/h且i.v.施予后为11.8mL/kg/h(>13倍差异)，s.c.后的MRT为11h且i.v.施予后为5h(>3倍差异)，s.c.后的t_1/2为7h且i.v.施予后为6h(>2倍差异)。

重要的是，rD’D3-FP在皮下施予后的生体可用率范围为40-79％，实验中的不同组别之间再次具有相当高的差异性(表4，图3)。然而，此生体可用率与本实验中所使用之rVIII-单链或rD’D3-FP的剂量无关。rD’D3-His显示较低的生体可用率34％。

表3:在s.c.或i.v.施予r D’D3-FP或r D’D3-His及rVIII-单链至FVIII ko小鼠后的r D’D3-FP或r D’D3-His的药物动力学参数

*最后二个测量点的高度类似性导致终末期血浆浓度曲线的人工「平坦化」；藉此清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计值包括最后时间点时，预计会非常长。因此，进行不包括最后时间点的额外计算，以避免高估生物可用率。

表4:r D’D3-FP或r D’D3-His在s.c.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的生物可用率

n.a.＝不适用；*＝s.c.数据的AUC估计值具有较低信赖水平(见上)

§相同治疗的参考组以粗体表示评估FVIII数据

不伴随本发明之任何多肽施予之rVIII-单链(即不伴随任何D’D3-FP建构体)当经s.c.施予时并无实质吸收，至少无法测量到侦测极限以上的FVIII活性。然而令人意外的是，当与二种D’D3建构体(rD’D3-FP及rD’D3-His，分别具有及不具有白蛋白融合)中之任一者共同s.c.施予时，FVIII即可吸收；且FVIII活性持续整个吸收过程(图3)。

需要提起的是对于FVIII活性来说，一个曲线在最后二个测量点也显示高类似性，导致终末期的血浆浓度曲线「平坦化」。藉此清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计值包括最后点时，预计将会非常长。第二种计算不包括最后时间点，以避免高估生体可用率；表5提供数据的比较。因此，在表格与图式中(图4除外)，使用不包括最后数据点的第二数据组，其可能低估rD’D3-His的生体可用率。

取决于FVIII剂量，FVIII活性系于至少32h(1mg/kg rD’D3-FP及50IU/kg rVIII-单链)及最高96h的最后时间点(例如任何400IU/kg rVIII-单链及1-10mg/kg rD’D3-FP的剂量)定量；即其维持在3或10mIU/mL的侦测极限之上(图4)。举例来说，图4代表在s.c.或i.v.施予1或3mg/kg rD’D3-FP伴随100IU/kg rVIII-单链后的FVIII血浆暴露，相较于施予3mg/kg rD’D3-His伴随200IU/kg rVIII-单链(施予较高剂量以使暴露得以监测)。当未施予D’D3建构体时，rVIII-单链维持在侦测极限以下，即使使用400IU/kg的s.c.剂量(数据未显示)。

C_max及AUC_0-inf显示0.3-10mg/kg rD’D3-FP及0-400IU/kg rVIII-单链测试范围的剂量依赖性，与共同施予之rD’D3-FP无关，然而当给予rD’D3-His时暴露量远远较低(表5，图5)。

当rD’D3-FP与rVIII-单链以>50之摩尔比给予时，rVIII-单链之CL范围为7.5-23.7mL/kg/h，且系低于0.3mg/kg rD’D3-FP及200IU/kg rVIII-单链s.c.(比例45)或rD’D3-His共同施予。与此一致的是，rD’D3-FP及rVIII-单链以>50之比例给予时，rVIII-单链之MRT及t_1/2相较于rD’D3-His为高，50IU/kg之非常低剂量的rVIII-单链除外(MRT范围：24-37h，t_1/2范围：8-20h)。就比较而言，rVIII-单链i.v.施予(不包括rD’D3-FP)在FVIII ko小鼠显示约2-3mL/kg/h的CL、18h的MRT及15h的t_1/2，在人类显示约2-3mL/kg/h的CL、约20h的MRT及约14h的t_1/2(数据未显示于本文中)。因此，s.c.施予后的药物动力学参数各不相同，但粗略来说与i.v.施予后相当。

综上所述，rVIII-单链之生体可用率范围当给予剂量≥3mg/kg rD’D3-FP时为11-25％，当给予剂量1mg/kg rD’D3-FP时介于6-14％，且当给予剂量0.3mg/kg rD’D3-FP时≤4％(表6，图6)。此生体可用率对于rVIII-单链剂量的依赖在于观察到最高测试剂量400IU/kg时的潜在饱和，其可能与可得吸收面积有关。另外，rD’D3-FP剂量限制rVIII-单链的可用性，即rD’D3-FP剂量越高，rVIII-单链可用性越佳。此可转换为重要的rD’D3-FP对rVIII-单链测试比例为至少447(≥3mg/kg rD’D3-FP；排除饱和的400IU/kg rVIII-单链剂量)、测试范围中可接受的比例为74-596(1mg/kg rD’D3-FP)及不利的测试比例为45(0.3mg/kg rD’D3-FP)。因此结论是<50的比例已显示为不利的FVIII生体可用率，而超过50的比例为有利者。

当与rD’D3-His共同施予时，rVIII-单链之生体可用率不成比例地较低，即3mg/kgrD’D3-His及200IU/kg rVIII-单链剂量时为1％，建议rD’D3白蛋白融合在rVIIII-单链生体可用率的优点。

此外计算s.c.及i.v.施予的至谷底时间(表7)。至于生体可用率，较高剂量的rD’D3-FP及/或FVIII显示有利的谷底水平，且在固定FVIII或rD’D3-FP剂量以内，rD’D3-FP：rVIII-单链比例增加导致更有利的至谷底水平时间。

表5:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP及rVIII-单链至FVIII ko小鼠后的FVIII显色活性的药物动力学参数

*最后二个测量点的高度类似性导致终末期血浆浓度曲线的人工「平坦化」；

藉此清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计值包括最后时间点时，预计会非常长。因此，

进行不包括最后时间点的额外计算，以避免高估生物可用率。

表6：在s.c.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的rVIII-单链(FVIII显色活性)生物可用率

n.a.＝不适用；*＝s.c.数据之AUC估计值的较低信赖水平(见上)

^§相同治疗的参考组以粗体表示

表7:在s.c.施予rVIII-单链(FVIII显色活性)至FVIII ko小鼠后的至谷底水平时间

实例1.2：重组FVIII(rVIII-单链)在rD’D3-FP存在下于猪的皮下生体可用率实验细节

测试制品系以总体积0.211至0.751mL/kg单次注射经s.c.施予至侧腹或经i.v.施予至耳静脉。施予剂量水平及途径在表8中给予。

表8：治疗组

rD’D3-FP系以基于人类白蛋白值之3至10mg/kg的剂量范围应用，rVIII-单链剂量范围自100至400IU/kg显色FVIII活性。rVIII-单链以注射用水重构，且rD’D3-FP在水浴中解冻。

血液样本系自耳静脉或隐静脉采集。10mg/kg rD’D3-FP s.c.组的时间点为给药前、施予后3、12、24、32、48、72、96、120、144及168h，且i.v.组为给药前5min、施予后3、12、24、32、48、72、96、120、144及168h。3mg/kg rD’D3-FP s.c.组的时间点为给药前、施予后1、3、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240及264h。

PK特性系得自个别动物。血液样本使用柠檬酸钠抗凝血(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)、经处理成血浆并储存在-70℃下以用于判定FVIII抗原及白蛋白。

rD’D3-FP暴露系藉由使用人类白蛋白ELISA测量蛋白质之白蛋白部分判定。人类FVIII：Ag血浆水平利用FVIII Asserachrom ELISA判定。

生物统计学

最大浓度(C_max)、t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)、平均滞留时间(MRT)、廓清(CL)及终末半衰期(t_1/2)的估计系藉由i.v.计算中的二室模型及藉由s.c.计算的二室-重吸收模型进行。参数估计方面，采用加权最小平方成本函数。生体可用率系计算为s.c.施予后相较于i.v.施予之AUC_0-inf的百分比。至1、5及10％谷底水平的时间系藉由设定等于0.01、0.05或0.1IU/mL之模型方程式并解出时间计算。

结果

评估D’D3数据

rD’D3-FP 3及10mg/kg在s.c.施予后吸收且在整个长达168h观察期间定量；即其维持在23.4ng/mL的侦测极限之上(图7)。

C_max及AUC_0-inf显示在3-10mg/kg rD’D3-FP测试范围的剂量依赖性(表9)。C_max与0-400IU/kg rVIII-单链范围内的添加rFVIII无关，然而rD’D3-FP之AUC_0-inf随着添加rVIII-单链的剂量增加。相较于100IU/kg或单独给予rVIII-单链，rD’D3-FP在经200或400IU/kgrVIII-单链治疗的动物中在清除率、MRT及t_1/2方面显示较长PK特性(表9)，即rD’D3-FP与FVIII一起给予相较于无适当量的FVIII可在系统中维持较长。

与此一致的是，rD’D3-FP在皮下施予后的生体可用率范围为59-187％(表10)，较高值系由最高的共同施予FVIII剂量所达到。结论是，rVIII-单链支持rD’D3-FP的皮下吸收。

表9:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP及rVIII-单链至猪后的rD’D3-FP之药物动力学参数

表10:rD’D3-FP在s.c.施予猪后相对于i.v.参照治疗计算的生物可用率

^§相同治疗的参考组以粗体表示评估FVIII数据

当与rD’D3-FP经s.c.共同施予时，FVIII意外地被吸收，且FVIII活性持续整个吸收过程(图8)。取决于FVIII剂量，FVIII活性系于至少48h(3mg/kg rD’D3-FP及100IU/kgrVIII-单链)及最高168h(例如任何400IU/kg rVIII-单链及3或10mg/kg rD’D3-FP的剂量)定量；即其维持在117mIU/mL的侦测极限之上。

C_max及AUC_0-inf显示在100-400IU/kg rVIII-单链测试范围的剂量依赖性。在i.v.施予药物后的值预期较高(表10)。经s.c.施予后的FVIII活性清除率(2.9-4.1mL/kg/h)高于i.v.施予后(1.2mL/kg/h)。然而，以s.c.施予较高rVIII-单链剂量200或400IU/kg后的MRT及t_1/2与i.v.施予相当(分别为82及85h相较于77h及52及59h相较于54h)。在较低剂量100IU/kg rVIII-单链下，MRT及t_1/2甚至更长(分别为130及83h)。因此，s.c.施予较高剂量rVIII-单链后的药物动力学参数大致与i.v.施予后相当，100IU/kg rVIII-单链剂量则更优异。

rVIII-单链之生体可用率范围为29-40％，随着rVIII-单链及/或rD’D3-FP之剂量增加(表12)。

此外计算s.c.及i.v.施予的至谷底时间(表13)。所有s.c.剂量的至1％谷底水平时间相当，然而200及400IU/kg rVIII-单链+3或10mg/kg rD’D3-FP的至5％或10％谷底时间相当，且100IU/kg rVIII-单链+3mg/kg rD’D3-FP较优。

表11:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP及rVIII-单链至猪后的FVIII活性之药物动力学参数

表12:在s.c.施予猪后相对于i.v.参照治疗计算的rVIII-单链(FVIII活性)生物可用率

^§相同治疗的参考组以粗体表示

表13:在s.c.施予rVIII-单链(FVIII抗原)至猪后的至谷底水平时间

实例1.3：在小鼠A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，rD’D3-FP对不同FVIII产品(各以皮下给予之)之影响探讨。

实验细节

测试制品系以总体积5mL/kg单次注射经s.c.施予至颈部或经i.v.施予至侧尾静脉。施予剂量水平及途径在表14中给予。

表14：治疗组

rD’D3-FP系以基于人类白蛋白值之3mg/kg的剂量应用，且FVIII产品以200IU/kg显色FVIII活性的剂量应用(标称：及ReFacto/>分析证明书：/>)。及/>AF系根据包装仿单重构。/>系使用吸量管以注射用水重构。rD’D3-FP于水浴中解冻，并与各别FVIII产品混合。在各例中，施予5mL/kg剂量体积，所有产品皆使用FVIII稀释缓冲剂。

应提及的是，四种不同产品的rD’D3-FP：rFVIII比例为322至442的相对高范围，基于彼等之不同分子量及比活性。

血液样本在短期麻醉下使用替代取样方案自眼后采集。S.c.组别中之时间点为施予后3、8、16、24、32、48、72及96h，且i.v.组为施予后5min、3、8、16、24、48、72及96h。PK特性系得自每组四个小鼠研究世代，且每个时间点n＝3。血液样本使用柠檬酸钠抗凝血(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)、经处理成血浆并储存在-70℃下以用于判定显色FVIII活性及白蛋白。

rD’D3-FP暴露系藉由使用人类白蛋白ELISA测量建构体之白蛋白部分判定。另外，测量FVIII显色活性。

生物统计学

最大浓度(C_max)、t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)、平均滞留时间(MRT)、廓清(CL)及终末半衰期(t_1/2)的估计系藉由i.v.计算中的二室模型及藉由s.c.计算的二室-重吸收模型进行。参数估计方面，采用加权最小平方成本函数。生体可用率系计算为s.c.施予后相较于i.v.施予之AUC_0-inf的百分比。至1、5及10％谷底水平的时间系藉由设定等于0.01、0.05或0.1IU/mL之模型方程式并解出时间计算。

结果

评估D’D3数据

与共同施予之FVIII产品无关，rD’D3-FP在s.c.施予后吸收。rD’D3-FP可在整个96h观察期间定量，且维持在23.4ng/mL的侦测极限之上(图9)。

rD’D3-FP在分别i.v.或s.c.施予后的PK特性并无可见差异，与共同施予之FVIII无关。与此一致的是，清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计分别显示所有s.c.或i.v.治疗资料有良好一致性(表15)。详细地说，i.v.清除率范围为0.9至1.1mL/kg/h，s.c.施予后清除率稍微较高(1.0至1.5mL/kg/h)。与此一致的是，i.v.及s.c.治疗的MRT及t_1/2范围分别介于40-56h及31-40h及介于61-117h及35-89h；即i.v.的清除率较低，但通常i.v.治疗的MRT及t_1/2较短。

重要的是，rD’D3-FP在皮下施予后的生体可用率范围为56-87％(表16)，且不同的共同施予FVIII产品之间并无重要差异。其与rVIII-单链非常类似(表4，范围40-79％)。

表15:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP及不同FVIIII产品至FVIII ko小鼠后的rD’D3-FP之药物动力学参数

表16:rD’D3-FP在s.c.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的生物可用率

评估FVIII数据

当与rD’D3-FP经s.c.共同施予时，所有FVIII产品被吸收，且FVIII活性持续整个吸收过程(图10)。相对地，没有一种产品单独给予时显示重要的s.c.生体可用率。

C_max、AUC_0-inf、清除率、MRT及t_1/2的估计资料于表17给出。虽然不同FVIII产品单独给予时显示不同的PK特性，清除率在s.c.施予后相较于i.v.施予总是增加，即自3.1增加至51.5mL/kg/h，/>自4.4增加至78.5mL/kg/h且ReFacto/>自1.7增加至16.2mL/kg/h。S.c.与i.v.施予之间的MRT大约相同(/>及/>范围17-19h；ReFacto/>范围21-28h)，与共同施予rVIII-单链的结果一致(见表11)。就这些其他FVIII产品而言，i.v.施予后的t_1/2相较于s.c.施予后为长(Beriate：8h s.c.相较于13hi.v.；/>12h s.c.相较于14h i.v.；ReFacto/>11h s.c.相较于15h i.v.)。

与rD’D3-FP共同施予之不同FVIII产品的皮下生体可用率范围为6-11％，建议FVIII产品之间无重大差异(表18)。此稍微低于当共同施予rD’D3-FP与rVIII-单链时所观察到的20％(见表12)；然而所有FVIII产品的生体可用率皆在可接受的范围内。这表示rD’D3-FP扮演皮下施予后FVIII重吸收的关键角色。然而，rD’D3-FP与rVIII-单链之组合可进一步改善FVIII的生体可用率。

此外计算s.c.及i.v.施予的至谷底时间(表19)。以1％谷底水平来说，i.v.及s.c.施予后的资料大约相当(60及79h，/>66及68h，/>AF 98及104h)。S.c.施予后的至5％或10％谷底水平时间优于i.v.施予后：Beriate显示s.c.相较于i.v.之优越性分别为：4％(5％谷底)及17％(10％谷底)，/>29％(5％谷底)及50％(10％谷底)及/>AF 50％(5％谷底)及28％(10％谷底)。

表17:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP及不同FVIIII产品至FVIII ko小鼠后的FVIII抗原之药物动力学参数

n.a.:模型化不适用(数据低于检测极限)

表18:不同FVIII产品(FVIII抗原)在S.C.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的生物可用率

n.a.：不适用表19:在s.c.或i.v.施予不同FVIIII产品(FVIII抗原)至FVIII ko小鼠后的至谷底水平时间

n.a.:模型化不适用(数据低于检测极限)

实例1.4：在小鼠A型血友病模型中，即在FVIII ko小鼠中，rD’D3-FP亲和性变体(具有非白蛋白HELP之rD’D3分子)与rVIII-单链两者皆皮下给予之作用探讨。

实验细节

测试制品系以总体积5 mL/kg单次注射经s.c.施予至颈部或经i.v.施予至侧尾静脉。施予剂量水平及途径在表20中给予。

表20：治疗组

rD’D3-FP EYA系以基于人类白蛋白值之3 mg/kg的剂量应用，rD’D3-CTP以基于蛋白质内容物之4.29mg/kg的剂量应用(两者皆导致高的rD’D3变体：rVIII-单链剂量，表20)，且FVIII产品以200IU/kg显色FVIII活性的剂量应用。rVIII-单链以注射用水重构，且rD’D3-FP EYA以及rD’D3-CTP在水浴中解冻。在各例中，施予5mL/kg剂量体积，使用FVIII稀释缓冲剂稀释。

血液样本在短期麻醉下使用替代取样方案自眼后采集。S.c.组别中之时间点为施予后3、8、16、24、32、48、72及96h，且i.v.组为施予后5min、3、8、16、24、48、72及96h。PK特性系得自每组四个小鼠研究世代，且每个时间点n＝3。血液样本使用柠檬酸钠抗凝血(1份柠檬酸钠3.13％+9份血液)、经处理成血浆并储存在-70℃下以用于判定FVIII活性、白蛋白及/或rD’D3-CTP。

rD’D3-FP EYA暴露系藉由使用人类白蛋白ELISA测量建构体之白蛋白部分判定。rD’D3-CTP系藉由ELISA技术使用针对抗人D’D3之抗体测量。另外，测量FVIII显色活性。

生物统计学

最大浓度(C_max)、t＝0至t＝∞浓度对时间曲线下面积(AUC_0-inf)、平均滞留时间(MRT)、廓清(CL)及终末半衰期(t_1/2)的估计系藉由i.v.计算中的二室模型及藉由s.c.计算的二室-重吸收模型进行。参数估计方面，采用加权最小平方成本函数。生体可用率系计算为s.c.施予后相较于i.v.施予之AUC_0-inf的百分比。至1、5及10％谷底水平的时间系藉由设定等于0.01、0.05或0.1IU/mL之模型方程式并解出时间计算。

结果

评估D’D3数据

rD’D3-FP EYA与rD’D3-CTP两者皆在s.c.施予后吸收，且两者皆可在整个96h观察期间定量，即维持在23.4ng/mL的侦测极限之上(图11)。

清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计在表21中给出，显示rD’D3-FPEYA相较于rD’D3-CTP在i.v.施予后及s.c.施予后具有较长的t_1/2及MRT(EYA的t_1/2：30h i.v.及32h s.c.相较于CTP的22h为常；EYA的MRT：42h i.v.及57h s.c.相较于CTP的27h i.v.及40h s.c.为长)。这些数据也显示两种rD’D3-FP变体的s.c施予相等或优于i.v.施予。rD’D3-CTP的C_max高于rD’D3-EYA，特别是在i.v.施予后。rD’D3-EYA的AUC_0-inf在s.c.施予后稍微高于rD’D3-CTP(1094及825μg*h/mL)，但在i.v.施予后无重大差异(1669及1783μg*h/mL)。这些数据显示AUC_0-inf在i.v.施予后较高，大部分是因为高的初始值。

rD’D3-FP EYA在皮下施予后的生体可用率系66％，rD’D3-CTP则为47％(表22)，且因此在rD’D3-FP于FVIII ko小鼠中的范围内(范围40-79％，表4)。

表21:在s.c.或i.v.共同施予r D’D3-FP EYA及rD’D3-CTP与rVIII-单链至FVIIIko小鼠后的rD’D3-FP EYA及rD’D3-CTP的药物动力学参数

表22：rD’D3变体在s.c.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的生物可用率

评估FVIII数据

当与rD’D3-FP EYA或rD’D3-CTP经s.c.共同施予时，FVIII被吸收，且FVIII活性持续整个吸收过程(图12)。FVIII活性系于96h的整个观察期定量。

清除率、MRT、t_1/2及AUC_0-inf的估计在表23中给出，显示rD’D3-FP EYA相较于rD’D3-CTP在s.c.施予后具有可相比的MRT及t_1/2(MRT：27及29h，t_1/2 13及12h)，且rD’D3-FP EYA在i.v.施予后具有稍微较高的MRT及t_1/2(MRT：30及25h，t_1/2 21及18h)。两种变体在相同施予途径下则无观察到AUC_0-inf的差异(s.c.为16及18IU*h/mL，i.v.为111及110IU*h/mL)。在i.v.及s.c.施予后，rD’D3-FP EYA的C_max相较于rD’D3-CTP皆为低(s.c.后为0.46相较于0.51IU/mL，及i.v后为4.63相较于5.49)。

rD’D3-FP EYA组中rVIII-单链之生体可用率系14％，rD’D3-CTP组为16％(表24)。

此外，计算s.c.施予之至谷底时间，其显示rD’D3-FP EYA与rD’D3-CTP在1％(105及104h)及5％(76及78h)谷底有可相比的结果，及rD’D3-FP EYA相较于rD’D3-CTP在10％(64相较于52h)谷底水平有非常轻微的优势(表25)。综上所述，这些数据显示rD’D3变体是FVIII的药物动力学改善的原因，主要不是附接至rD’D3变体之半衰期延长原则的类型。然而，不含任何HELP之rD’D3多肽无法改善FVIII的药物动力学或至少仅具有受损的效果(见表5及7)。

表23:在s.c.或i.v.施予rD’D3-FP EYA或rD’D3-CTP及rVIII-单链至FVIII ko小鼠后的FVIII抗原的药物动力学参数

表24:在s.c.施予FVIII ko小鼠后相对于i.v.参照治疗计算的rVIII-单链(FVIII抗原)生物可用率

表25:在s.c.施予rVIII-单链(FVIII抗原)至FVIII ko小鼠后的至谷底水平时间

体内实验结论

本发明显示rD’D3-FP在不同物种的皮下生体可用率(表26)及重组FVIII产品即rVIII-单链、ReFacto />或/>当与rD’D3-FP皮下共同施予时的相对生体可用率(表27)。

表26:rD’D3-FP在不同物种中的生物可用率

表27：FVIII在不同物种中的生物可用率

n.d.，未测定

事实上，本结果显示皮下一起施予rD’D3-FP与FVIII允许血管外施予重组FVIII产品，即rVIII-单链或其他FVIII产品，例如 或ReFacto />与前所未见的FVIII吸收至血流有关(rVIII-单链生体可用率范围为3-40％)，导致FVIII活性水平显著超过侦测极限。rD’D3-CTP及rD’D3-FP EYA大致显示与rD’D3-FP可相比的资料。该所得的FVIII活性水平适合用于治疗性应用。

rD’D3-FP或其变体优于rD’D3-His，rD’D3-FP不仅具有较长半衰期、一旦达到血浆中增加维持此区室中的FVIII，同时相较于rD’D3-His不成比例的增高rVIII-单链当与rD’D3-FP或其变体共同施予时的生体可用率。此支持使用白蛋白或其他HLEP达到半衰期延长系有利方式。实例2：判定FVIII对VWF片段二聚体及单体的亲和性

VWF片段(1至1242)白蛋白融合(D’D3-FP)系于生物反应器中表现；在如上述纯化并单离为单体及二聚体后，经由Biacore仪器(T200,GE Healthcare)透过表面电浆共振检测FVIII对这些制剂的亲和性。

藉由NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)及EDC(乙醇胺盐酸盐)(二者皆包含在来自GEHealthcare的胺偶合套组(BR1000-50)中)，将抗白蛋白抗体(MA1-20124,ThermoScientific)经由其N端共价偶合至活化的CM 3芯片。为了固定，将3μg/mL的抗体用乙酸钠缓冲剂(10mM,pH 5.0)稀释并且使抗体溶液以10μL/min的流速流过芯片7min。在固定化程序之后，藉由乙醇胺溶液(1M,pH 8.3)流过芯片5min(以10μL/min流速)使非偶合葡聚糖丝饱和。使流动池饱和之目的是要最小化分析物与芯片的非特异性结合。藉由使用如上述相同的程序，用乙醇胺使空的流动池饱和，设定成参考流动池。

藉由使D’D3-FP蛋白质(5μg/mL)流过芯片3min(流速10μL/min)，分别将二聚体及单体D’D3-FP蛋白质固定至共价偶合的抗白蛋白抗体。

为了建立FVIII的结合曲线，将各D’D3-FP蛋白质制剂稀释于流动缓冲剂(HBS-P+：0.1M HEPES、1.5M NaCl及0.5％v/v界面活性剂P20，pH 7.4；产品代码BR100671，GEHealthcare)成为浓度0.25nM、0.5nM、1nM、3nM及4nM。藉由执行单循环动力学，将各稀释液的渐升浓度样本流过芯片2min(流速30μL/min)，随后10min的解离时间使用流动缓冲剂HBS-P+。所有测量执行二次。测量程序的温度调整至+25℃。

结合参数使用BiaEvaluation软件计算。曲线配适方法系基于Langmuir方程式。计算输入数据系分析物FVIII(rVIII-单链)之莫耳质量，其他参数如最大RU及斜率系自配适缔合及解离曲线自动算出。BiaEvaluation软件之输出系缔合速率常数及解离速率常数，自此计算出亲和性常数。结果显示于表28。

表28:D’D3-FP二聚体及单体的rFVIII-单链亲和性资料

相较于D’D3-FP单体(K_D＝30nM)，二聚体D’D3-FP显示显著(K_D＝34pM)增加之对FVIII的亲和性，此来自于rVIII-单链的较快缔合及较慢解离二者。

SEQUENCE LISTING

<110> CSL Behring Recombinant Facility AG

<120> 用于血管外施予以治疗或预防凝血疾病的截短型冯维勒布兰德因子多肽

<130> 2016_L004_A267

<150> EP 16198497.6

<151> 2016-11-11

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5616

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码构建体VWF片段- G/S 连接子 - 白蛋白的DNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> EcoRI限制性酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(3757)

<223> VWF氨基酸1到1242的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3758)..(3850)

<223> 甘氨酸/丝氨酸连接子的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3851)..(5608)

<223> 人白蛋白的编码序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5609)..(5616)

<223> NotI限制性酶切位点

<400> 1

gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60

gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120

atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180

gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240

ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300

attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360

catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420

cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480

gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540

agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600

atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660

caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720

cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780

tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840

gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900

gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960

gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020

ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080

cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140

catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200

cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260

ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320

ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380

cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440

cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500

gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560

gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620

ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680

gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740

cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800

cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860

cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920

cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980

gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040

ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100

cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160

ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220

ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280

cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340

catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400

aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460

ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520

ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580

ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640

cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700

gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760

gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820

gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880

gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940

ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000

gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060

caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120

gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180

catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240

ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300

ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360

gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420

cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480

acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540

ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600

cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660

gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720

caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780

tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840

gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900

aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960

agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020

gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080

tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140

gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200

accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260

atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320

tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380

cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440

actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500

tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560

tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620

ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680

atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740

gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800

aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860

gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920

agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980

taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040

gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100

agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160

ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220

gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280

cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340

cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400

tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460

caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520

gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580

tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616

<210> 2

<211> 1095

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:1编码的多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> VWF D'D3 区域 (VWF 氨基酸 764 - 1242)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (480)..(510)

<223> 甘氨酸/丝氨酸连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (511)..(1095)

<223> 人白蛋白

<400> 2

Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp

1 5 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro

35 40 45

Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys

50 55 60

Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr

85 90 95

Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr

115 120 125

Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly

165 170 175

Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val

180 185 190

Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser

195 200 205

Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln

225 230 235 240

Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val

245 250 255

Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg

260 265 270

Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met

275 280 285

Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val

290 295 300

Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys

325 330 335

Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly

340 345 350

Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu

355 360 365

Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn

370 375 380

Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu

385 390 395 400

Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

405 410 415

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys

435 440 445

Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys

450 455 460

Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp Ala

500 505 510

His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn

515 520 525

Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys

530 535 540

Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala

545 550 555 560

Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu

565 570 575

His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu

580 585 590

Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg

595 600 605

Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg

610 615 620

Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn

625 630 635 640

Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His

645 650 655

Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys

660 665 670

Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu

675 680 685

Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala

690 695 700

Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

705 710 715 720

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala

725 730 735

Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His

740 745 750

Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala

755 760 765

Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys

770 775 780

Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile

785 790 795 800

Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala

805 810 815

Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala

820 825 830

Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His

835 840 845

Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu

850 855 860

Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr

865 870 875 880

Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn

885 890 895

Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys

900 905 910

Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val

915 920 925

Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly

930 935 940

Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

945 950 955 960

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys

965 970 975

Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val

980 985 990

Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val

995 1000 1005

Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile

1010 1015 1020

Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

1025 1030 1035

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

1040 1045 1050

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys

1055 1060 1065

Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

1070 1075 1080

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

1085 1090 1095

<210> 3

<211> 8442

<212> DNA

<213> 人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(8442)

<400> 3

atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105 2110 2115

cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525 2530 2535

gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

2585 2590 2595

gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

2600 2605 2610

gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

2645 2650 2655

atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755 2760

atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

agg aag tgc agc aag tga 8442

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 4

<211> 2813

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met

1460 1465 1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

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Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

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Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

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2060 2065 2070

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

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Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

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2120 2125 2130

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

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2210 2215 2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

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Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

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Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

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Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

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2525 2530 2535

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2540 2545 2550

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

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2600 2605 2610

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Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

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2660 2665 2670

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2690 2695 2700

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2720 2725 2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755 2760

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

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2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

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Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 5

<211> 1444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链因子viii分子的氨基酸序列

<400> 5

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

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35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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115 120 125

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His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

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Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

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225 230 235 240

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565 570 575

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Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

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675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

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Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

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Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

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740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln

755 760 765

Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met

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Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu

805 810 815

Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn

820 825 830

Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln

835 840 845

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850 855 860

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865 870 875 880

Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser

885 890 895

Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala

900 905 910

Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe

915 920 925

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930 935 940

Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

945 950 955 960

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn

965 970 975

Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe

980 985 990

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995 1000 1005

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1010 1015 1020

Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met

1025 1030 1035

Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg

1040 1045 1050

Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile

1055 1060 1065

His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr

1070 1075 1080

Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val

1085 1090 1095

Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu

1100 1105 1110

Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val

1115 1120 1125

Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His

1130 1135 1140

Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

1145 1150 1155

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala

1160 1165 1170

Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu

1175 1180 1185

Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln

1190 1195 1200

Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser

1205 1210 1215

Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly

1220 1225 1230

Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys

1235 1240 1245

His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu

1250 1255 1260

His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu

1265 1270 1275

Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu

1280 1285 1290

Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe

1295 1300 1305

Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His

1310 1315 1320

Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro

1325 1330 1335

Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr

1340 1345 1350

Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr

1355 1360 1365

Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp

1370 1375 1380

Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

1385 1390 1395

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu

1400 1405 1410

Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln

1415 1420 1425

Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu

1430 1435 1440

Tyr

<210> 6

<211> 585

<212> PRT

<213> 人

<400> 6

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

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Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

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85 90 95

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Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

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515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

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545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 7

<211> 519

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> His-标签化的D'D3

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> D'D3 - His8的氨基酸序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> VWF D'D3区域 (VWF 氨基酸 764 - 1242)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (480)..(511)

<223> 甘氨酸/丝氨酸连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (512)..(519)

<223> 多组氨酸标签

<400> 7

Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp

1 5 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro

35 40 45

Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys

50 55 60

Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr

85 90 95

Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr

115 120 125

Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly

165 170 175

Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val

180 185 190

Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser

195 200 205

Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln

225 230 235 240

Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val

245 250 255

Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg

260 265 270

Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met

275 280 285

Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val

290 295 300

Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys

325 330 335

Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly

340 345 350

Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu

355 360 365

Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn

370 375 380

Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu

385 390 395 400

Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

405 410 415

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys

435 440 445

Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys

450 455 460

Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser

465 470 475 480

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

485 490 495

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser His

500 505 510

His His His His His His His

515

<210> 8

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> His-标签化的CTP融合蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(479)

<223> VWF D'D3区域 (VWF 氨基酸 764 - 1242)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (480)..(511)

<223> 甘氨酸/丝氨酸连接子

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (512)..(576)

<223> 人绒毛膜促性腺激素beta亚基的C-末端肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (577)..(584)

<223> 多组氨酸标签

<400> 8

Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp

1 5 10 15

Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro

35 40 45

Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys

50 55 60

Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr

85 90 95

Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr

100 105 110

Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr

115 120 125

Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile

130 135 140

Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly

165 170 175

Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val

180 185 190

Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser

195 200 205

Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln

225 230 235 240

Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val

245 250 255

Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg

260 265 270

Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met

275 280 285

Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val

290 295 300

Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys

325 330 335

Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly

340 345 350

Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu

355 360 365

Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn

370 375 380

Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu

385 390 395 400

Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro

405 410 415

Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp

420 425 430

Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys

435 440 445

Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys

450 455 460

Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Ser

465 470 475 480

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ala

500 505 510

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

515 520 525

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Ser Ser Ser

530 535 540

Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly

545 550 555 560

Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser

565 570 575

His His His His His His His His

580

Claims (94)

1.包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)的重组多肽在制备用于治疗或预防凝血疾病的药物中的用途，其中所述重组多肽被皮下、皮内或肌肉内施予患有凝血疾病的个体且施予第八凝血因子蛋白质(FVIII)，该重组多肽能够与该FVIII结合，其中所述截短型VWF包含与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述重组多肽包含半寿期延长部分(HLEM)，该重组多肽以二聚体存在，并且其中欲施予的所述重组多肽对欲施予的FVIII的摩尔比高于50，该二聚体多肽具有FVIII结合亲和性，该FVIII结合亲和性之解离常数K_D小于1nM。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述重组多肽和第八凝血因子蛋白质(FVIII)经皮下、皮内或肌肉内共同施予给患有凝血疾病的个体。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中该个体是人类个体。

4.如权利要求1所述的用途，其中该二聚体多肽具有的FVIII结合亲和性的解离常数K_D小于500pM。

5.如权利要求1所述的用途，其中该二聚体多肽具有的FVIII结合亲和性的解离常数K_D小于200pM。

6.如权利要求1所述的用途，其中该二聚体多肽具有的FVIII结合亲和性的解离常数K_D小于100pM。

7.如权利要求1所述的用途，其中该二聚体多肽具有的FVIII结合亲和性的解离常数K_D小于90pM。

8.如权利要求1所述的用途，其中该二聚体多肽具有的FVIII结合亲和性的解离常数K_D小于80pM。

9.如权利要求1或2所述的用途，其中该截短型VWF系由(a)SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242、或(b)与SEQ ID NO：4之氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性之氨基酸序列组成。

10.如权利要求1或2所述的用途，其中该HLEM是与该截短型VWF融合的异源性氨基酸序列。

11.如权利要求10所述的用途，其中该异源性氨基酸序列包含选自下述中的多肽或由选自下述中的多肽所组成：白蛋白或其片段、转铁蛋白或其片段、人绒毛膜促性腺激素之C端肽、XTEN序列、同源氨基酸重复(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复(PAS)、艾芙米(afamin)、α-胎蛋白、维生素D结合蛋白质、在生理条件下能够与白蛋白或与免疫球蛋白恒定区结合之多肽、能够与新生儿Fc受体(FcRn)结合之多肽、及其组合。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述多肽包括免疫球蛋白恒定区或其部分或者由免疫球蛋白恒定区或其部分组成。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述部分是免疫球蛋白的Fc部分。

14.如权利要求1或2所述的用途，其中该HLEM与该重组多肽缀合。

15.如权利要求14所述的用途，其中该HLEM选自下述中：羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)、类弹性蛋白多肽、肝素前体(heparosan)聚合物、玻尿酸及白蛋白结合配体，及其组合。

16.如权利要求15所述的用途，其中该HLEM包括脂肪酸链。

17.如权利要求1或2所述的用途，其中相较于参考治疗而言，该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了待施予的该重组多肽不包含HLEM和/或除了待施予的该重组多肽与待施予的该FVIII的摩尔比低于50。

18.如权利要求17所述的用途，其中该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加至少1.5倍。

19.如权利要求17所述的用途，其中该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加至少2倍。

20.如权利要求17所述的用途，其中该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加至少3倍。

21.如权利要求17所述的用途，其中该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加至少4倍。

22.如权利要求17所述的用途，其中该施予的FVIII的平均滞留时间(MRT)通过共同施予该重组多肽而增加至少5倍。

23.如权利要求1或2所述的用途，其中相较于参考治疗而言，该施予的重组多肽的平均滞留时间(MRT)增加，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了待施予的该重组多肽不包含HLEM及/或除了待施予的该重组多肽对待施予的该FVIII的摩尔比低于50。

24.如权利要求23所述的用途，其中该施予的重组多肽的平均滞留时间(MRT)增加至少1.5倍。

25.如权利要求23所述的用途，其中该施予的重组多肽的平均滞留时间(MRT)增加至少2倍。

26.如权利要求23所述的用途，其中该施予的重组多肽的平均滞留时间(MRT)增加至少3倍。

27.如权利要求1或2所述的用途，其中相较于参考治疗而言，该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了待施予的该重组多肽不包含HLEM及/或除了待施予的该重组多肽对待施予的该FVIII的摩尔比低于50。

28.如权利要求27所述的用途，其中该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加至少1.2倍。

29.如权利要求27所述的用途，其中该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加至少1.5倍。

30.如权利要求27所述的用途，其中该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加至少2倍。

31.如权利要求27所述的用途，其中该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加至少2.5倍。

32.如权利要求27所述的用途，其中该施予的FVIII的终末半衰期由共同施予该重组多肽而增加至少3倍。

33.如权利要求1或2所述的用途，其中相较于参考治疗而言，与具有HLEM的该多肽共同施予的该FVIII达到1％谷底水平的时间期间被延长，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了该FVIII与不具有该HLEM的重组多肽一起施予。

34.如权利要求1或2所述的用途，其中相较于内源性VWF的血浆半衰期及/或相较于正常人血浆(NHP)中VWF的血浆半衰期而言，该多肽的血浆半衰期增加。

35.如权利要求34所述的用途，其中该多肽的血浆半衰期比内源性VWF的血浆半衰期及/或正常人血浆(NHP)中VWF的血浆半衰期高至少100％。

36.如权利要求34所述的用途，其中该多肽的血浆半衰期比内源性VWF的血浆半衰期及/或正常人血浆(NHP)中VWF的血浆半衰期高至少200％。

37.如权利要求34所述的用途，其中该多肽的血浆半衰期比内源性VWF的血浆半衰期及/或正常人血浆(NHP)中VWF的血浆半衰期高至少400％。

38.如权利要求1或2所述的用途，其中该凝血疾病是A型血友病或类血友病(von-Willebrand氏病)。

39.如权利要求1或2所述的用途，其中该重组多肽及该FVIII蛋白质的共同施予是通过下列任一项实现的：(i)在包含该重组多肽及该FVIII蛋白质的单一组合物中一起施予、或(ii)施予各自以分开的组合物提供的该重组多肽即第一化合物及该FVIII蛋白质即第二化合物，其中该第一化合物系在该第二化合物之前、之后或同时施予。

40.如权利要求1或2所述的用途，其中该FVIII是血浆衍生蛋白质或重组FVIII蛋白质。

41.如权利要求1或2所述的用途，其中FVIII通过皮下、皮内或肌肉内施予，并且在与该重组多肽共同施予之后，该施予的FVIII的生物利用度为至少2％。

42.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少3％。

43.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少5％。

44.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少7％。

45.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少10％。

46.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少15％。

47.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少20％。

48.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少25％。

49.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少30％。

50.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少35％。

51.如权利要求41所述的用途，其中该施予的FVIII的生物利用度为至少40％。

52.如权利要求1或2所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少30％、。

53.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少35％。

54.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少40％。

55.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少45％。

56.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少50％。

57.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少55％。

58.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少60％。

59.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少65％。

60.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少70％。

61.如权利要求52所述的用途，其中该重组多肽的生物利用度为至少80％。

62.如权利要求1或2所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过2500IU/kg。

63.如权利要求62所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过1500IU/kg。

64.如权利要求62所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过1000IU/kg。

65.如权利要求62所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过600IU/kg。

66.如权利要求62所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过500IU/kg。

67.如权利要求62所述的用途，其中共同施予的FVIII蛋白质的剂量不超过400IU/kg。

68.如权利要求1所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少10mIU/mL FVIII活性。

69.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少25mIU/mL FVIII活性。

70.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少50mIU/mL FVIII活性。

71.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少100mIU/mL FVIII活性。

72.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少200mIU/mL、或FVIII活性。

73.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少300mIU/mL FVIII活性。

74.如权利要求68所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，FVIII的最大浓度(C_max)为至少400mIU/mL FVIII活性。

75.如权利要求68-74中任一项所述的用途，其中所述FVIII活性为显色FVIII活性。

76.如权利要求1或2所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该重组多肽的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少2倍，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予的该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予的该重组多肽对欲施予的该FVIII的摩尔比低于50。

77.如权利要求76所述的用途，其中该重组多肽的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少5倍。

78.如权利要求76所述的用途，其中该重组多肽的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少10倍。

79.如权利要求1或2所述的用途，其中在该重组多肽与FVIII共同施予之后，该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少，其中该参考治疗与该治疗完全相同，除了欲施予的该重组多肽不包含HLEM及/或除了欲施予的该重组多肽对欲施予的该FVIII的摩尔比低于50。

80.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少1.5倍。

81.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少2倍。

82.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少3倍。

83.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少5倍。

84.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少7.5倍。

85.如权利要求79所述的用途，其中该施予的FVIII的清除率(CL)值相较于参考治疗而言减少至少10倍。

86.如权利要求1或2所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少75。

87.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少100。

88.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少200。

89.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少300。

90.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少400。

91.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少500。

92.如权利要求86所述的用途，其中欲施予的该重组多肽对该FVIII的摩尔比为至少1000。

93.一种用于治疗或预防如权利要求1至92中任一项定义的凝血疾病的药物组合物，该组合物包含

(i)如权利要求1至92中任一项所述的包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)的重组多肽，及

(ii)第八凝血因子蛋白质(FVIII)；

其中在该药物组合物中该重组多肽对该FVIII蛋白质的摩尔比大于50，且其中该重组多肽能够与该FVIII结合，

该治疗包含向患有凝血疾病的个体血管外施予该药物组合物，且

该药物组合物经调制以用于皮下、皮内或肌肉内共同施予。

94.一种医药套组，其包含(i)第一组合物，其中含有第八凝血因子(FVIII)蛋白质；及(ii)第二组合物，其中含有根据如权利要求1至92中任一项使用的重组多肽，该重组多肽包含截短型冯维勒布兰德因子(VWF)，用于治疗或预防凝血疾病。