ES2908008T3 - Polipéptidos truncados del Factor de von Willebrand para su administración extravascular en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea - Google Patents

Abstract

Un polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A o la enfermedad de von Willebrand, dicho tratamiento o profilaxis comprende la administración del polipéptido recombinante extravascular y una proteína de Factor VIII (FVIII) a un sujeto que tiene el trastorno de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido recombinante es capaz de unirse a dicho FVIII, en el que el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de extensión de la semivida (HLEM), en el que el polipéptido está presente como un dímero en el que la relación dímero : monómero del polipéptido de la invención es de al menos 1,5, en el que el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizado por una constante de disociación KD inferior a 1 nM, y en el que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos truncados del Factor de von Willebrand para su administración extravascular en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado para su uso en el tratamiento o profilaxis del trastorno de la coagulación sanguínea hemofilia A o enfermedad de von-Willebrand.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existen diversos trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, que resultan de las deficiencias del Factor VIII (FVIII) y IX de la coagulación sanguínea, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand (VWD).

En el plasma, el FVIII existe principalmente como un complejo no covalente con el Factor von Willebrand (VWF), y su función coagulante es acelerar la conversión del Factor X en Xa dependiente del Factor IXa.

La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico heredado. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X de la coagulación sanguínea FVIII, y afecta casi exclusivamente a los varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. La anomalía del cromosoma X es transmitida por mujeres portadoras que no son a su vez hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es una mayor tendencia al sangrado.

En los pacientes con hemofilia A grave sometidos a tratamiento profiláctico, el FVIII debe administrarse por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida plasmática del FVIII, de aproximadamente 12 a 14 horas. Cada administración i.v. es engorrosa, está asociada al dolor y conlleva el riesgo de una infección, especialmente porque la mayoría de las veces es realizada en casa por los propios pacientes o por los padres de los niños que han sido diagnosticados de hemofilia A.

Por lo tanto, sería muy deseable aumentar la semivida del FVIII para que las composiciones farmacéuticas que contienen dicho FVIII tengan que administrarse con menos frecuencia.

Se han hecho varios intentos para prolongar la semivida del FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con los receptores celulares (WO 2003/093313 A2, WO 2002/060951 A2), uniendo covalentemente polímeros al FVIII (WO 1994/15625 A1, WO 1997/11957 A1 y US 4970300), por encapsulación del FVIII (WO 1999/55306 A1), mediante la introducción de novedosos sitios de unión de metales (WO 1997/03193 A1), mediante la unión covalente del dominio A2 al dominio A3, ya sea por vía peptídica (WO 1997/40145 A1 y WO 2003/087355 A1) o por enlace disulfuro (WO 2002/103024 A2) o mediante la unión covalente del dominio A1 al dominio A2 (WO 2006/108590 A1).

Otro enfoque para mejorar la semivida funcional del FVIII o del VWF es la PEGilación del FVIII (WO 2007/126808 A1, WO 2006/053299 A2, WO 2004/075923 A2) o por PEGilación del VWF (WO 2006/071801 A2). El aumento de la semivida del FVW PEGilado también aumentaría indirectamente la semivida del FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión del FVIII (WO 2004/101740 A2, WO2008/077616 A1 y WO 2009/156137 A1).

El VWF, que falta, está funcionalmente defectuoso o sólo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD), es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie de las plaquetas y los componentes de la matriz extracelular, como el colágeno. Además, el VWF sirve como proteína portadora y estabilizadora del FVIII procoagulante. El VWF se sintetiza en las células endoteliales y los megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo salvaje se divulgan en Collins et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal de 22 residuos en su extremo N, seguido de un propéptido de 741 residuos y del polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el VWF plasmático maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la escisión del péptido señal en el retículo endoplasmático, se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros del VWF. Durante el transporte posterior a través de la vía secretora se añaden 12 cadenas laterales de carbohidratos ligadas a la N y 10 ligadas a la O. Más importante aún, los dímeros del VWF se multimerizan a través de puentes disulfuro N-terminales y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud es escindido por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío.

Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS13 puede escindir los multímeros de alto peso molecular del VWF dentro del dominio A1 del VWF. Por lo tanto, el VWF plasmático está formado por toda una gama de multímeros que van desde dímeros simples de 500 kDa hasta multímeros formados por hasta más de 20 dímeros de un peso molecular superior a 10.000 kDa. El VWF-HMWM es el que tiene la mayor actividad hemostática, que puede medirse en la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relación VWF:RCo/VWF antígeno, mayor será la cantidad relativa de multímeros de alto peso molecular.

En el plasma, el FVIII se une con alta afinidad al VWF, lo que lo protege de la eliminación prematura y, por lo tanto, desempeña, además de su función en la hemostasia primaria, un papel crucial para estabilizar el FVIII, regular los niveles plasmáticos del FVIII y, como consecuencia, también es un factor central para controlar la hemostasia secundaria. La semivida del FVIII no activado unido al VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en el plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no existe o casi no existe el FVIII, la semivida del FVIII es sólo de aproximadamente 2 a 6 horas, lo que da lugar a síntomas de hemofilia A de leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador del VWF sobre el FVIII también se ha utilizado para ayudar a la expresión recombinante del FVIII en células CHO (Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol 9:1233-1242). La enfermedad de von Willebrand tipo 2N se caracteriza por niveles bajos de FVIII debido a mutaciones en el VWF que afectan a la unión del FVIII al VWF. Los niveles de FVIII en pacientes con VWD tipo 2N están en un intervalo entre aproximadamente 3 IU/dL y 30 IU/dL, normalmente por debajo de 20 IU/dL, dependiendo de la mutación específica en el VWF (Sadler J.E. y Blinder M., Von Willebrand Disease: Diagnosis, Classification, and Treatment; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Colman, Marder, Clowes, George, Aird y Goldhaber, Lippincott Williams & Wilkins 2006, pp 905-921).

Se ha descrito que los polipéptidos derivados del VWF, en particular los fragmentos del VWF, estabilizan el FVIII in vitro e in vivo. WO 2013/106787 A1 se dirige a las proteínas quiméricas que comprenden una proteína FVIII y ciertos fragmentos del VWF. Estos heterodímeros quiméricos de FVIII y fragmento de VWF tienen una relación molar fija de VWF a FVIII de 1:1.

El documento WO 2014/198699 A2 y WO 2013/083858 A2 describen fragmentos de VWF y su uso en el tratamiento de la hemofilia. Se descubrió que la biodisponibilidad de los FVIII puede mejorar significativamente tras la coadministración extravascular con cantidades molares similares de fragmentos de VWF. Se dijo que un alto exceso molar de VWF sobre FVIII no era deseable, y en experimentos con fragmentos de VWF coadministrados s.c. con FVIII se encontró que la dosis de VWF no era crítica para la biodisponibilidad del FVIII. Por lo tanto, se consideró que las proporciones molares de los fragmentos de VWF sobre el FVIII, así como la dosis de VWF, no eran críticas para la biodisponibilidad del FVIII.

El documento WO 2011/060242 A2 divulga polipéptidos de fusión que comprenden ciertos fragmentos de FVW y una región Fc de anticuerpos que proponen relaciones molares específicas del fragmento de FVW sobre el FVIII de hasta 10:1. Además, no se presentan datos in vivo con respecto a dichas construcciones de fusión Fc.

Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452 encontraron que un fragmento de VWF que contiene los dominios D'D3 fusionados a la porción Fc de la inmunoglobulina G1 es suficiente para estabilizar el Factor VIII endógeno en ratones deficientes de VWF. Sin embargo, aunque una proteína de fusión VWF D'D3-Fc mostró una supervivencia notablemente prolongada cuando se transfirió a ratones con deficiencia de FVIII, la proteína de fusión VWF D'D3-Fc no prolongó la supervivencia del FVIII cotransfundido.

Hasta hoy, el tratamiento estándar de la hemofilia A implica infusiones intravenosas frecuentes de FVIII, ya sea como concentrados derivados de los plasmas de donantes humanos o como preparados farmacéuticos basados en FVIII recombinante. Si bien estas terapias de sustitución son generalmente eficaces, por ejemplo, en pacientes con hemofilia A grave sometidos a tratamiento profiláctico, como se ha mencionado anteriormente el Factor VIII tiene que administrarse por vía intravenosa (i.v.) aproximadamente 3 veces por semana debido a la corta semivida plasmática del Factor VIII, de aproximadamente 12 horas. Si se alcanzan niveles superiores al 1 % de la actividad del FVIII en personas sanas no hemofílicas, por ejemplo, mediante un aumento de los niveles de FVIII por encima de 0,01 U/ml, la hemofilia A grave se convierte en hemofilia A moderada. Cada administración i.v. es engorrosa, está asociada al dolor y conlleva el riesgo de una infección, sobre todo porque la mayoría de las veces se realiza en el tratamiento domiciliario por los propios pacientes o por los padres de los niños a los que se les diagnostica hemofilia A. Además, las frecuentes inyecciones i.v. provocan inevitablemente la formación de cicatrices, lo que interfiere en futuras infusiones. Dado que el tratamiento profiláctico en la hemofilia grave se inicia en las primeras etapas de la vida, ya que los niños suelen tener menos de 2 años, resulta aún más difícil inyectar FVIII 3 veces por semana en las venas de pacientes tan pequeños. Durante un periodo limitado, la implantación de sistemas de puertos puede ofrecer una alternativa. A pesar de que pueden producirse infecciones repetidas y de que los puertos pueden causar molestias durante el ejercicio físico, suelen considerarse favorables en comparación con las inyecciones intravenosas.

Por lo tanto, sigue habiendo una gran necesidad médica de obviar la necesidad de infundir el FVIII por vía intravenosa.

Como el FVIII es una molécula muy grande y lábil, presenta una biodisponibilidad muy baja debido a una absorción insuficiente y a una degradación grave, si se administra por vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, es decir, extravascular.

El documento EP 0710114 A1 divulga que las formulaciones de FVIII de un FVIII suprimido del dominio B en una concentración superior a 1000 IU/ml son adecuadas para la administración subcutánea, dando lugar a una biodisponibilidad del 5-10 % tras la administración s.c. en monos midiendo el área bajo la curva de actividad (FVIII:C)-tiempo.

El documento EP 0772452 divulga que las formulaciones de FVIII de un FVIII suprimido del dominio B en una concentración de al menos 500 IU/ml junto con un aditivo orgánico, cuando se administran por vía subcutánea, pueden conducir durante más de 6 h a un nivel plasmático de FVIII de al menos el 1,5 % de los niveles normales de FVIII. Utilizando gelatina hidrolizada o emulsión de aceite de soja como aditivo orgánico y un FVIII suprimido del dominio B en una concentración de 1100 IU/ml y una dosis de 10000 IU/kg, se observó más del 50 % de biodisponibilidad, medida como el área bajo la curva de actividad (FVIII:C)-tiempo en monos cynomolgus.

El documento WO 1997/11957 A1 divulga una biodisponibilidad del 5,3 % cuando se administró por vía subcutánea un FVIII suprimido del dominio B (actividad específica 15000 IU/mg; dosis 2500 IU/kg), mientras que un conjugado mPEGilado del FVIII alcanzó biodisponibilidades del 22 % o del 19 % en monos cynomolgus.

De acuerdo con el documento WO 2015/185758 A2 se presenta una composición que comprende un complejo no covalente de Factor VIII y uno o más péptidos de Factor von Willebrand, en el que los péptidos de Factor von Willebrand comprenden al menos los aminoácidos 764 a 1035 y 1691 a 1905. La relación molecular FVIII:VWF está entre 1:1 y 1:20. En WO 2015/185758 A2 perros con hemofilia A fueron sometidos a la inyección s.c. y posterior i.v. de FVIII recombinante con supresión del dominio B, solo o en combinación con un exceso molar de cinco veces de un fragmento de VWF obtenido por digestión del pdVWF con la proteasa V-8 de S. aureus . Se analizaron las muestras para determinar el tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT) y la actividad en el ensayo cromogénico de la actividad del FVIII. La administración subcutánea de un fragmento de VWF en complejo con FVIII dio lugar a un aumento de 1,4 veces en el tiempo necesario para superar el tiempo de coagulación de un perro normal en comparación con la administración s.c. de FVIII solo. La administración del Fragmento VWF con el FVIII también dio lugar a un aumento de la actividad del FVIII en el plasma de los perros a lo largo del tiempo y a unos valores del área bajo la curva (AUC) casi duplicados, tanto para la aplicación s.c. como i.v., en comparación con la administración del FVIII solo.

En el documento WO 2008/151817 A1 se demostró que el VWF puede ser captado en el torrente sanguíneo cuando se administra por vía extravascular sin ninguna modificación covalente estabilizadora, lo que puede suponer un mayor riesgo de respuestas inmunitarias, y que el VWF puede utilizarse para mejorar la captación del FVIII cuando se coadministra con el FVIII por vía no intravenosa. El VWF se aplicó sin ninguna modificación de extensión de la semivida. La relación entre el antígeno VWF y la actividad del FVIII era superior a 2:1. Sólo se han considerado los productos multiméricos y monoméricos que comprenden un VWF de longitud completa. Sin embargo, al aplicar el VWF de longitud completa, las altas proporciones de VWF sobre FVIII pueden dar lugar a un elevado riesgo trombogénico. Además, cuando se utiliza el VWF de longitud completa, las cantidades de proteína necesarias para aumentar la relación no serían aceptables para su administración. Además, multimérica y monomérica.

Las divulgaciones de Swystun y Lillicrap (2014) Blood. Vol. 124 (3), p. 313-315 ("FVIII stabilization: VWF D'D3 will do") y de Yee et al. (2014) Blood. Vol. 124 (3) p. 445-451 ("Avon Willebrand factor fragment containing the D'D3 domains is sufficient to stabilize coagulation factor VIII in mice") se refieren al hallazgo de que un fragmento truncado del factor de von Willebrand (VWF) que contiene la región D'D3 de unión al factor VIII (FVIII) del VWF es suficiente para estabilizar los niveles endógenos de FVIII en ratones deficientes en VWF. Los fragmentos de VWF fueron expresados o infundidos en ratones con deficiencia de VWF. Sin embargo, la coinfusión de un VWF D'D3-Fc con FVIII dio lugar a un rápido aclaramiento del FVIII administrado exógenamente en ratones deficientes en FVIII. Los constructos D'D3 descritos en Yee et al. (2014) son monómeros, dímeros o multímeros. Los constructos D'D3 mostrados en Yee et al. (2014) no fueron capaces de estabilizar un FVIII coadministrado en ratones con hemofilia A. El constructo VWF D'D3-Fc mostrado tenía una Kd de 1,5 nM para la unión del FVIII.

Existe una necesidad médica de alternativas a la administración intravenosa de FVIII a los pacientes. Además, existe una necesidad continua de procedimientos que proporcionen la absorción del Factor VIII cuando se administra extravascularmente, así como de compuestos o composiciones adecuadas para dichos procedimientos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención es como se define en las reivindicaciones, es decir es un polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (FV) truncado para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A o la enfermedad de von Willebrand, dicho tratamiento o profilaxis comprende la administración del polipéptido recombinante extravascular y una proteína de Factor VIII (FVIII) a un sujeto que tiene un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido recombinante es capaz de unirse a dicho FVIII, en el que el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de extensión de la semivida (HLEM), en el que el polipéptido está presente como un dímero en el que la relación dímero: monómero del polipéptido de la invención es de al menos 1,5, en el que el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd inferior a 1 nM, y en el que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que una proteína de Factor VIII (FVIII) puede administrarse con éxito por vía extravascular para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la coagulación de la sangre, siempre que el FVIII se coadministre con un polipéptido recombinante que comprenda un Factor de von Willebrand (VWF) truncado. Dicho polipéptido recombinante es capaz de unirse a dicho FVIII coadministrado. La relación molar entre el polipéptido recombinante que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar es preferentemente superior a 50. El polipéptido recombinante que comprende un v W f truncado comprende preferentemente una fracción de extensión de la semivida (HLEM). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que es importante lograr un alto exceso del polipéptido recombinante administrado que comprende un FVW truncado para minimizar la unión del FVIII coadministrado al FVW endógeno, que tiene una estructura molecular más grande que probablemente conduce a un mayor catabolismo en comparación con el FVW truncado. Mediante el uso de la coadministración de FVIII y dicho polipéptido recombinante aquí presentado, se demuestra por primera vez que la vía extravascular para la aplicación de FVIII no sólo es posible, sino que incluso se logran cantidades clínicamente relevantes de FVIII en la circulación.

La invención demuestra además que la administración extravascular del polipéptido recombinante proporciona o aumenta la biodisponibilidad de un FVIII coadministrado. Además, la administración subcutánea del polipéptido recombinante junto con el FVIII permite la administración extravascular de un FVIII asociado a una absorción relevante del FVIII en el torrente sanguíneo que da lugar a niveles de actividad del FVIII no sólo significativamente superiores al límite de detección, sino también adecuados para su aplicación terapéutica. El polipéptido recombinante cuando se coadministra con el FVIII no sólo tiene una semivida suficientemente larga, aumenta el mantenimiento del FVIII en el plasma una vez que llega a este compartimento, sino que también proporciona una biodisponibilidad del FVIII adecuada para su aplicación terapéutica.

Además, la invención demuestra que la administración extravascular del polipéptido recombinante puede permitir una opción de tratamiento que comprenda una administración de FVIII a través de una vía de administración diferente a la utilizada para el polipéptido recombinante. En particular, se demuestran los beneficios derivados de la combinación de un FVIII administrado por vía intravenosa y un polipéptido recombinante administrado por vía subcutánea.

La presente invención, por tanto, proporciona:

El polipéptido recombinante de la invención comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A o la enfermedad de von Willebrand, dicho tratamiento o profilaxis comprende la administración del polipéptido recombinante extravascular y una proteína de Factor VIII (FVIII) a un sujeto que tiene un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido recombinante es capaz de unirse a dicho FVIII, en el que el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de extensión de la semivida (HLEM), en el que el polipéptido está presente como un dímero en el que la relación dímero : monómero del polipéptido de la invención es de al menos 1,5, en el que el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd inferior a 1 nM, y en el que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, dicho tratamiento o profilaxis comprende administrar el polipéptido recombinante y una proteína de Factor VIII (FVIII) extravascular a un sujeto que tiene el trastorno de coagulación sanguínea.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el sujeto es un sujeto humano.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el VWF truncado es un VWF truncado humano.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el FVIII se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. Preferentemente, tanto el FVIII como dicho polipéptido se administran por vía subcutánea.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el FVIII se administra a través de una vía de administración diferente a la del polipéptido recombinante, preferentemente el FVIII se administra por vía intravenosa; más preferentemente el polipéptido recombinante se administra por vía subcutánea y el FVIII se administra por vía intravenosa.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el VWF truncado carece de los aminoácidos 1243 a 2813 de la SEQ ID NO:4.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el VWF truncado consiste en (a) los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, o en (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la HLEM es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada al VWF truncado.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en transferrina y fragmentos de la misma, el péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica humana, una secuencia XTEN, repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), albúmina afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, polipéptidos capaces de unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), en particular a las regiones constantes de las inmunoglobulinas y a porciones de las mismas, preferentemente a la porción Fc de la inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos. La región constante de la inmunoglobulina o porciones de la misma es preferentemente un fragmento Fc de la inmunoglobulina G1, un fragmento Fc de la inmunoglobulina G2 o un fragmento Fc de la inmunoglobulina A.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la HLEM se conjuga con el polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho HLEM conjugado se selecciona del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosán, ácido hialurónico y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos, y combinaciones de los mismos.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido recombinante no comprende ningún HLEM conjugado al polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido es una glicoproteína que comprende N-glicanos, y en la que preferentemente al menos el 75 %, preferentemente al menos el 85 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido recombinante es un homodímero que comprende preferentemente dos polipéptidos tal como se define en una de las realizaciones aquí divulgadas, y los dos monómeros que forman el dímero están unidos covalentemente entre sí a través de al menos uno o más puentes disulfuro formados por residuos de cisteína dentro del VWF truncado.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, los residuos de cisteína que forman uno o más puentes de disulfuro se seleccionan del grupo que consiste en Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, Cys-1227 y combinaciones de los mismos, preferentemente Cys-1099 y Cys-1142, donde la numeración de aminoácidos se refiere a SEQ ID NO:4.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la afinidad de dicho dímero por el FVIII es mayor que la afinidad de un polipéptido monomérico por el FVIII, teniendo dicho polipéptido monomérico la misma secuencia de aminoácidos que una subunidad monomérica del polipéptido dimérico.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, en la que la relación dímero: monómero del polipéptido de la invención es al menos 2, preferentemente al menos 2,5 o al menos 3. Preferentemente, el polipéptido recombinante de la invención no comprende formas monoméricas y/o multímeras del polipéptido o al menos está esencialmente libre de formas monoméricas y/o multímeras del polipéptido. Lo más preferible es que todos los polipéptidos de la invención estén presentes como dímeros.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd de menos de 500 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 90 pM o menos de 80 pM.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la Kd oscila entre 0,1 pM y 500 pM, entre 0,5 pM y 200 pM, entre 0,75 pM y 100 pM o, más preferentemente, entre 1 pM y 80 pM.

El polipéptido de la invención tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd y, preferentemente, dicha constante de disociación Kd del polipéptido dimérico se reduce en comparación con la constante de disociación Kd de un polipéptido monomérico, preferentemente por un factor de al menos 10, por un factor de al menos 100, por un factor de al menos 500 o por un factor de al menos 1000.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido comprende al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del VWF de tipo salvaje, en la que la afinidad de unión de dicho polipéptido modificado al FVIII se incrementa preferentemente mediante la introducción de dicha al menos una sustitución en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas modificaciones. Dichas sustituciones dentro del VWF truncado pueden tener la capacidad de aumentar aún más la semivida del FVIII coadministrado tras su administración. De este modo, el tratamiento también puede proporcionar, en particular, una semivida in vivo del FVIII que se incrementa aún más para permitir una frecuencia de administración tolerable o mejorada.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, las sustituciones se seleccionan del grupo de combinaciones que consiste en S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R, S764P/S766L, y S764E/S766Y/V1083A, refiriéndose a la secuencia de la SEQ ID NO:4 con respecto a la numeración de aminoácidos.

Dicha sustitución es preferentemente la combinación S764E/S766Y o S764E/S766Y/V1083A.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el tiempo de residencia medio (MRT) del FVIII administrado se incrementa por la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente por un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención y/o salvo que no se ha administrado ningún polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el MRT del FVIII administrado es de al menos 10 h, preferentemente de al menos 15 h, de al menos 20 h o de al menos 25 h.

El MRT del polipéptido recombinante administrado se incrementa, preferentemente en un factor de al menos 1,5, al menos 2 o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante a administrar con respecto al FVIII a administrar es inferior a una relación molar según la invención, en particular inferior a 50.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la semivida terminal del FVIII administrado se incrementa mediante la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente en un factor de al menos 1,2, al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5, o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención y/o salvo que no se ha administrado ningún polipéptido recombinante. De este modo, el tratamiento puede proporcionar, en particular, una semivida in vivo del FVIII lo suficientemente alta como para permitir una frecuencia de administración tolerable o mejorada.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el período de tiempo para alcanzar un nivel mínimo del 1 % del FVIII coadministrado con dicho polipéptido que tiene una HLEM se prolonga en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el FVIII se administra con un polipéptido recombinante sin tener dicho HLEM y/o excepto que no se ha administrado ningún polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el período de tiempo bien sea

(i) para alcanzar el nivel mínimo del 1 % del FVIII coadministrado con dicho polipéptido es de al menos aproximadamente 30h, al menos aproximadamente 35h, al menos aproximadamente 38h, al menos aproximadamente 40h, o al menos aproximadamente 50h; o

(ii) para alcanzar el nivel mínimo del 5 % del FVIII coadministrado con dicho polipéptido es de al menos aproximadamente 20h, al menos aproximadamente 22h, al menos aproximadamente 29h, al menos aproximadamente 34h, o al menos aproximadamente 43h; o

(iii) para alcanzar el nivel mínimo del 10 % del FVIII coadministrado con dicho polipéptido es de al menos aproximadamente 5h, al menos aproximadamente 6h, al menos aproximadamente 10h, al menos aproximadamente 18h, o al menos aproximadamente 20h.

La semivida plasmática del polipéptido se incrementa en comparación con la del VWF endógeno y/o en comparación con la del v W f del plasma humano normal (NHP), donde la semivida plasmática del polipéptido es preferentemente al menos un 100 %, al menos un 200 % o preferentemente al menos un 400 % mayor que la del v W f endógeno y/o en comparación con la del VWF del plasma humano normal (NHP).

El trastorno de la coagulación sanguínea hemofilia A y es bien sea una hemofilia A leve, típicamente asociada con un nivel de actividad del FVIII endógeno que es del 5 % al 40 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal (NHP), o una hemofilia A moderada, asociada normalmente a un nivel de actividad del FVIII endógeno del 1 % al 5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal, o hemofilia A grave, asociada normalmente a un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior al 1 % de la actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido se utiliza para (i) el tratamiento y el control a demanda de episodios de hemorragia, (ii) la profilaxis rutinaria, en particular para reducir la frecuencia de los episodios de hemorragia, o (iii) la gestión perioperatoria de la hemorragia.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido se utiliza para la profilaxis de rutina para reducir la frecuencia de los episodios de sangrado de un paciente con hemofilia A.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la coadministración del polipéptido recombinante y de la proteína FVIII se consigue bien sea

(i) por administración conjunta en una única composición que comprenda el polipéptido recombinante y la proteína FVIII, o

(ii) mediante la administración del polipéptido recombinante (primer compuesto) y la proteína FVIII (segundo compuesto), cada uno de ellos en composiciones separadas, opcionalmente como parte de una terapia combinada, en la que el primer compuesto se administra antes, después o simultáneamente con el segundo compuesto. Se puede aplicar cualquier intervalo de tiempo adecuado para la administración del primer compuesto y del segundo cuando el primer compuesto se administra antes o después del segundo. En particular, a los efectos de la profilaxis de rutina, la administración del primer compuesto y la administración del segundo compuesto pueden proporcionarse según esquemas de dosificación independientes o coordinados.

En el caso de (i), la coadministración del polipéptido recombinante y de la proteína FVIII se realiza bien sea

proporcionando un producto combinado que comprenda el polipéptido recombinante y el FVIII mezclados en una única composición o

proporcionando un conjunto o kit de al menos dos productos separados dispuestos para ser mezclados antes de la administración, en el que un primer producto comprende el polipéptido recombinante y un segundo producto comprende el FVIII.

En el caso de (ii), el polipéptido recombinante y la proteína FVIII, en particular cuando se administran simultáneamente y/o en particular cuando se administran ambos extravascularmente, se administran en estrecha proximidad, preferentemente, los sitios de inyección están separados no más de 50 mm, no más de 40 mm, no más de 30 mm, en particular no más de 20 mm.

En el caso de (ii), el polipéptido recombinante y la proteína FVIII pueden coadministrarse en el plazo de un mes, en el plazo de tres semanas, en el plazo de dos semanas, en el plazo de una semana, en el plazo de un día, en el plazo de una hora aproximadamente, en el plazo de 30 minutos, en el plazo de 15 minutos o en el plazo de 5 minutos.

En el caso de (ii), el polipéptido recombinante y la proteína FVIII pueden coadministrarse en un intervalo de tiempo de no más de 1 mes, no más de tres semanas, no más de dos semanas, no más de una semana, no más de un día, no más de aproximadamente una hora, preferentemente en 30 minutos, más preferentemente en 15 minutos y más preferentemente en 5 minutos.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido recombinante no comprende una proteína FVIII y/o no comprende un polipéptido que tenga una actividad FVIII.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el FVIII es una proteína FVIII derivada del plasma o una proteína FVIII recombinante, preferentemente una proteína FVIII humana.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el FVIII es una proteína FVIII recombinante.

El FVIII recombinante puede tener el dominio B natural intacto o tener el dominio B eliminado, truncado o modificado. Opcionalmente, la proteína FVIII recombinante puede comprender al menos una fracción de extensión de la semivida (HLEM). En el presente documento se describen los HLEM adecuados.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la proteína FVIII es un Factor VIII recombinante de cadena única, que preferentemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5 o fragmentos de la misma, siempre que dichos fragmentos tengan actividad FVIII.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el FVIII recombinante tiene el dominio B eliminado o truncado siempre que dicho dominio B eliminado o truncado comprenda una inserción heteróloga de al menos un péptido enlazadory/o un polipéptido potenciador de la semivida.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, cuando el FVIII se administra por vía extravascular, la biodisponibilidad del FVIII administrado tras la coadministración con el polipéptido recombinante se incrementa en el polipéptido recombinante en comparación con un tratamiento de referencia en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el FVIII se administra sin dicho polipéptido recombinante. De este modo, la administración extravascular del polipéptido recombinante proporciona o aumenta la biodisponibilidad del FVIII administrado. Preferentemente, la coadministración subcutánea del polipéptido recombinantejunto con el FVIII permite la administración extravascular de un FVIII asociado a una absorción relevante del FVIII en el torrente sanguíneo que da lugar a niveles de actividad del FVIII no sólo significativamente superiores al límite de detección, sino además adecuados para su aplicación terapéutica. Preferentemente, el polipéptido recombinante cuando se coadministra con el FVIII no sólo tiene una semivida suficientemente larga, aumenta el mantenimiento del FVIII en el plasma una vez que llega a este compartimento, sino que también proporciona una biodisponibilidad del FVIII adecuada para su aplicación terapéutica.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la biodisponibilidad del FVIII administrado extravascularmente tras la coadministración con el polipéptido recombinante es de al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, preferentemente al menos el 7 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 % o al menos el 40 %.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la biodisponibilidad del polipéptido recombinante es de al menos el 30 %, preferentemente de al menos el 35 %, más preferentemente de al menos el 40 %, de al menos el 45 %, de al menos el 50 %, de al menos el 55 %, de al menos el 60 %, de al menos el 65 %, de al menos el 70 %, o de al menos el 80 %.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la dosificación de proteína FVIII coadministrada no supera las 2500 IU/kg, preferentemente no supera las 2000 IU/kg, no supera las 1500 IU/kg, no supera las 1000 IU/kg, no supera las 600 IU/kg, no supera las 500 IU/kg o no supera las 400 IU/kg.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, la concentración máxima (Cmáx) para el FVIII es de 10 mIU/ml, al menos 25 mIU/ml, al menos 50 mIU/ml, al menos 100 mIU/ml, al menos 200 mIU/ml, al menos 300 mIU/ml o al menos 400 mIU/ml de actividad del FVIII, preferentemente actividad cromogénica del FVIII.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, la concentración máxima (Cmáx) del polipéptido recombinante es de al menos 20 nmol/kg, al menos 40 nmol/kg, al menos 60 nmol/kg, al menos 80 nmol/kg o al menos 160 nmol/kg. Preferentemente, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con el FVIII, la concentración máxima (Cmáx) para el polipéptido recombinante es de al menos 5 |jg de HLEM/ml, de al menos 10 jg de HLEM/ml, de al menos 15 jg de HLEM/ml, o de al menos 20 jg de HLEM /ml, por lo que los valores se basan en un cálculo para la HLEM, preferentemente, los valores se basan en una cuantificación utilizando un ensayo específico para la HLEM, como un inmunoensayo, preferentemente específico para la albúmina humana. De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII la concentración máxima (Cmáx) para el polipéptido recombinante es al menos 3 veces mayor en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf) para el FVIII coadministrado es de al menos 1,000 mIU*h/ml, al menos 2.000 mIU*h/ml, al menos 3.000 mIU*h/ml, al menos 5.000 mIU*h/ml, al menos 10.000 mIU*h/ml o al menos 20.000 mIU*h/ml de actividad del FVIII, preferentemente actividad cromogénica del FVIII.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf) para el polipéptido recombinante coadministrado es de al menos 2 nmol * h/ml, al menos 3 nmol * h/ml, al menos 4 nmol * h/ml, al menos 20 nmol * h/ml, al menos 40 nmol * h/ml, o al menos 80 nmol * h/ml. Preferentemente, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUC0-¡nf) para el polipéptido recombinante coadministrado es de al menos 500 jg HLEM *h/ml, de al menos 750 jg HLEM *h/ml, de al menos 1,000 jg de HLEM *h/ml, al menos 5.000 jg de HLEM*h/ml, o al menos 10.000 jg de HLEM *h/ml, por lo que los valores se basan en un cálculo para la HLEM, preferentemente, los valores se basan en una cuantificación utilizando un ensayo específico de HLEM como un inmunoensayo, preferentemente específico para la albúmina humana. De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUC^mf) para el polipéptido recombinante coadministrado es al menos 5, es al menos 10 o es al menos 15 veces mayor en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del polipéptido recombinante asciende a un intervalo entre 1,0 y 2,5 ml/kg/h, o entre 1,1 y 2,2 ml/kg/h o entre 1,2 y 2,1 ml/kg/h.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del polipéptido recombinante se reduce en un factor de al menos 2, al menos 5, o al menos 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del FVIII administrado se reduce en comparación con un tratamiento de referencia, preferentemente en un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7,5 o al menos 10, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del FVIII administrado es inferior a 135 ml/kg/h, inferior a 80 ml/kg/h, inferior a 45 ml/kg/h, inferior a 40 ml/kg/h, inferior a 35 ml/kg/h, inferior a 30 ml/kg/h o inferior a 25 ml/kg/h. El valor del aclaramiento (CL) del FVIII administrado es preferentemente inferior al de un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, la relación molar entre el polipéptido recombinante y el FVIII a administrar es de al menos 75, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500 o al menos 1000.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido recombinante se administra en una cantidad de al menos 0,01 mg/kg, al menos 0,1 mg/kg, al menos 0,2 mg/kg, al menos 0,5 mg/kg, al menos 1 mg/kg o al menos 3 mg/kg de polipéptido recombinante.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, el polipéptido recombinante se administra con una cantidad no superior a 20 mg/kg, no superior a 15 mg/kg, no superior a 10 mg/kg, o no superior a 5 mg/kg del polipéptido recombinante.

El polipéptido de la invención puede administrarse por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. El FVIII también puede administrarse por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular. Preferentemente, tanto el FVIII como dicho polipéptido se administran por vía subcutánea. El FVIII puede administrarse por una vía diferente a la del polipéptido recombinante, preferentemente el FVIII se administra por vía intravenosa, más concretamente el polipéptido recombinante se administra por vía subcutánea y el FVIII por vía intravenosa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra los niveles del polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (FV) truncado (en adelante también: polipéptido recombinante) tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP o rD'D3-His con o sin FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. rD'D3-FP se cuantificó a través de su componente de albúmina, y los datos de rD'D3-His se calculan a concentraciones equimolares. Los datos se presentan como media ± SD para n=1-4 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v. Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 2 muestra la concentración máxima y el AUC de los niveles plasmáticos del polipéptido recombinante tras la administración subcutánea de rD'D3-FP o rD'D3-His con o sin FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. rD'D3-FP se cuantificó a través de su componente de albúmina, y los datos de rD'D3-His se calculan a concentraciones equimolares. Los datos se presentan como media ± SD para n=1-4 ratones por punto de tiempo. La estimación de la Cmáx y el AUCü-inf se realizó mediante un modelo de reabsorción bicompartimental;

La figura 3 muestra la biodisponibilidad de rD'D3-FP o rD'D3-His tras la administración subcutánea de rD'D3-FP o rD'D3-His con o sin FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. rD'D3-FP se cuantificó a través de su componente de albúmina, y los datos de rD'D3-His se calculan a concentraciones equimolares. Los datos se calcularon a partir de la media de AUCü-inf calculada en n=1-4 ratones por punto de tiempo. La estimación del AUCo-inf se realizó mediante un modelo de reabsorción bicompartimental. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje de la AUCo-inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v., en el caso de la rD'D3-FP para los tres grupos i.v. diferentes utilizando rD'D3-FP a diferentes dosis con o sin rFVIII;

La figura 4 muestra los niveles plasmáticos de actividad del FVIII tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP o rD'D3-His con o sin FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. El FVIII se cuantificó como actividad cromogénica del FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=2-3 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v.; Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 5 muestra la concentración máxima y el AUC de los niveles plasmáticos de la actividad del FVIII tras la administración subcutánea de rD'D3-FP o rD'D3-His con o sin FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. El FVIII se cuantificó como actividad cromogénica del FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=2-3 ratones por punto de tiempo. La estimación de la Cmáx y el AUC0-inf se realizó mediante un modelo de reabsorción bicompartimental;

La figura 6 muestra la biodisponibilidad de la actividad cromogénica del FVIII tras la administración subcutánea de rD'D3-FP o rD'D3-His con FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. Los datos se calcularon a partir de la media de AUC0-inf calculada a partir de n=2-3 ratones por punto de tiempo. La estimación del AUC0-inf se realizó mediante un modelo de reabsorción bicompartimental. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje de la AUC0-inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v., en el caso de la rD'D3-FP para los dos grupos i.v. diferentes utilizando rD'D3-FP a diferentes dosis con o sin rFVIII. Las dosis de FVIII y las dosis seleccionadas de rD'D3-FP se indican como números en el gráfico;

La figura 7 muestra los niveles plasmáticos del polipéptido recombinante tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP con o sin FVIII recombinante en cerdos. Los datos se presentan como media ± SD para n=1-3 cerdos por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v. Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 8 muestra los niveles plasmáticos de actividad del FVIII tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP con o sin FVIII recombinante en cerdos. El FVIII se cuantificó como actividad cromogénica del FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=1-3 cerdos por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v.; Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 9 muestra los niveles plasmáticos del polipéptido recombinante tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP con o sin diferentes FVIII recombinantes o un FVIII derivado del plasma en ratones con desactivación de FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=2-3 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v.

Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 10 muestra los niveles plasmáticos de actividad del FVIII tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP con o sin diferentes FVIII recombinantes o un FVIII derivado del plasma en ratones con desactivación de FVIII (Fig. 8A Beriate®, Fig. 8B Advate® y Fig. 8C ReFacto AF®). El FVIII se cuantificó como actividad cromogénica del FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=2-3 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v.; Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso;

La figura 11 muestra los niveles plasmáticos del polipéptido recombinante tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP EYA o rD'D3-CTP con FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. El rD'D3-FP EYA se cuantificó a través de su componente de albúmina y el rD'D3-CTP a través de su componente D'D3. Los datos se presentan como media ± SD para n=3 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v. Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso; y

La figura 12 muestra los niveles plasmáticos de actividad del FVIII tras la administración subcutánea o intravenosa de rD'D3-FP EYA o rD'D3-CTP con FVIII recombinante en ratones con desactivación de FVIII. El FVIII se cuantificó como actividad cromogénica del FVIII. Los datos se presentan como media ± SD para n=3 ratones por punto de tiempo. Las líneas continuas representan el tratamiento s.c. y las líneas punteadas el tratamiento i.v.; Abreviatura: s.c.: subcutáneo; i.v.: intravenoso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a un polipéptido recombinante según la reivindicación 1.

El polipéptido recombinante de la invención puede estar comprendido en una composición farmacéutica, comprendiendo la composición

(i) el polipéptido recombinante de la invención, y

(ii) una proteína del Factor VIII (FVIII),

en la que dicha composición farmacéutica está formulada para su coadministración extravascular.

El polipéptido recombinante de la invención puede estar comprendido en un kit farmacéutico que comprende (i) una primera composición que comprende una proteína de Factor VIII (FVIII) y (ii) una segunda composición que comprende el polipéptido recombinante de la invención, en la que dicho FVIII y dicho polipéptido recombinante se proporcionan dentro del kit para permitir, antes de la administración, que al menos una proporción de dicho polipéptido recombinante se una a dicho FVIII.

El polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado se denominará en el presente documento "polipéptido de la invención" o "polipéptido recombinante". El polipéptido de la invención comprende una fracción de extensión de la semivida (HLEM).

Ratios

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención es un dímero o una mezcla de un dímero y un monómero. Cualquier relación molar según la invención se refiere a una relación de la concentración molar de la subunidad monomérica del polipéptido de la invención, ya sea que esté presente como monómero o dímero. Los ratios se forman sobre la concentración molar del FVIII coadministrado. Cualquier relación del polipéptido de la invención sobre el FVIII en esta solicitud se refiere a la cantidad de monómeros comprendidos en el polipéptido de la invención, que está preferentemente presente como dímero, que se va a administrar (en moles) dividida por la cantidad de FVIII que se va a administrar (en moles), a menos que se indique lo contrario. A modo de ejemplo no limitativo, la coadministración de 100 pM de un polipéptido monomérico de la invención con 1 pM de FVIII supone una relación de 100. La misma relación de 100 se obtiene si se coadministran 50 pM de un polipéptido dimérico de la invención con 1 pM de FVIII.

La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50, más preferentemente la relación es superior a 60, o al menos 75, o al menos 100, o al menos 200, más preferentemente al menos 300, o al menos 400, o al menos 500, o al menos 600, o al menos 700 o al menos 800, o al menos 900, o al menos 1.000, o al menos 1.100, o al menos 1.200, o al menos 1.300, o al menos 1.400, o al menos 1.500, o al menos 1.600, o al menos 1.700, o al menos 1.800, o al menos 1.900, o al menos 2.000, o al menos 2.500, o al menos 3.000 o al menos 5.000, o al menos 8.000 o hasta 10.000. La relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar puede, según ciertas realizaciones, no superar una relación de 10.000, una relación de 5.000, una relación de 2.500 o una relación de 2.000.

La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar puede oscilar entre 50 y 10.000, o entre 50 y 5.000, o entre 50 y 4.000, o entre 50 y 3.000, o entre 50 y 2.000, o entre 50 y 1.000. Preferentemente, la relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar oscila entre 60 y 2.500, o entre 110 y 2.000, o entre 150 y 1.500, o entre 200 y 1.000.

El plasma humano normal (NHP) contiene VWF en una concentración de 1 U/ml o 100 % por definición. Esto corresponde a una concentración de proteína de aproximadamente 10 pg/ml (Haberichter S.L. y Montgomery R.R., Structure and function of von Willebrand factor; en Hemostasis and Thrombosis, eds. Marder, Aird, Bennett, Schulman y White, Lippincott Williams & Wilkins 2013, pp 197-207). Basándose en esta concentración de VWF en el NHP y en un peso molecular del monómero maduro del VWF de aproximadamente 267.500 Da, incluyendo un 18-19 % de glicosilación, se puede calcular una concentración plasmática molar de la unidad monomérica del VWF de aproximadamente 37 * 10'9 Mol/L para el NHP. La semivida del VWF endógeno en el plasma humano es de aproximadamente 16 horas (Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: connecting the far ends. Blood. 2015.125(13):2019-28).

Más adelante se describen otros detalles del tratamiento de acuerdo con la invención.

El VWF truncado

El término "factor de von Willebrand" (VWF), tal y como se utiliza aquí, incluye el VWF natural (nativo), pero también variantes del mismo que conservan al menos la actividad de unión al FVIII del VWF natural, por ejemplo, variantes de secuencia en las que se han insertado, eliminado o sustituido uno o más residuos. La actividad de unión del FVIII se determina mediante un ensayo de unión del FVIII al FWF como se describe en el ejemplo 2.

Un VWF preferido de acuerdo con esta invención es el VWF humano representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:4. El ADNc que codifica la SEQ ID NO:4 se muestra en la SeQ ID NO:3.

El gen que codifica el VWF nativo humano se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepropolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepropolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos N-terminal, seguido de un pro-polipéptido de 741 aminoácidos (aminoácidos 23-763 de la SEQ ID NO:4) y la subunidad madura (aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NO:4). La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos del N-terminal da lugar a un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido del VWF humano nativo se muestra en la SEQ ID NO:4. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos del VWF en esta solicitud se refiere a la SEQ ID NO:4, incluso si la molécula de VWF, en particular un VWF truncado, no comprende todos los residuos de la SEQ ID NO:4.

El propolipéptido del VWF nativo comprende múltiples dominios. En la literatura se pueden encontrar diferentes anotaciones de dominio (véase, por ejemplo Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458). En esta solicitud se aplica la siguiente anotación de dominio del prepropolíptido nativo del VWF:

D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK

Con referencia a la SEQ ID NO:4, el dominio D' consiste en los aminoácidos 764-865; y el dominio D3 consiste en los aminoácidos 866-1242.

La característica "truncado" en términos de la presente invención significa que el polipéptido no comprende la secuencia completa de aminoácidos del VWF maduro (aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NO:4). Típicamente, el VWF truncado no comprende todos los aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NO:4, sino sólo un fragmento del mismo. Un VWF truncado también puede denominarse fragmento de VWF o, en plural, fragmentos de VWF.

El VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII. Preferentemente, el VWF truncado es capaz de unirse a la forma madura del Factor VIII nativo humano. En otra realización, el VWF truncado es capaz de unirse a un FVIII recombinante, preferentemente a un FVIII como el descrito en el presente documento, preferentemente a un Factor VIII de cadena única que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5. La unión del VWF truncado al Factor VIII puede determinarse mediante un ensayo de unión FVIII-VWF como se describe en el Ejemplo 2.

El VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

En otra realización preferida, el VWF truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención puede prepararse mediante un procedimiento que utiliza células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas mediante técnicas conocidas per se.

El ácido nucleico de la célula huésped codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NO:4. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NO:4. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica los aminoácidos 1 a 1242 de la SEQ ID NO:4. Dado que el polipéptido de acuerdo con esta invención es un dímero, el ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, SEQ ID NO:4), incluso si el VWF truncado en el polipéptido no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, SEQ ID NO:4).

El VWF truncado del polipéptido recombinante de la invención no comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 763 del VWF de la SEQ ID NO:4.

En ciertas realizaciones, el VWF truncado tiene una deleción interna en relación con el VWF maduro de tipo salvaje. Por ejemplo, los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK o combinaciones de los mismos pueden ser eliminados, y se mantiene el dominio D' y/o el dominio D3. De acuerdo con realizaciones adicionales, el VWF truncado carece de uno o más de los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6 o CK. De acuerdo con otras realizaciones, el VWF truncado carece de los aminoácidos 1243 a 2813 de la SEQ ID NO:4, es decir, los dominios A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK.

En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para la glicoproteína plaquetaria Iba (GPIba), el colágeno y/o la integrina aIIbpIII (secuencia RGDS dentro del dominio C1). En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF. En otra realización, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para GPIba, y/o no comprende el sitio de unión para el colágeno, y/o no comprende el sitio de unión para la integrina aIIbpIII, y/o no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF.

En otras realizaciones, el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 %, o al menos el 91 %, o al menos el 92 %, o al menos el 93 %, o al menos el 94 %, o al menos el 95 %, o al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con una de las secuencias de aminoácidos mencionadas en el párrafo anterior, siempre que el VWF truncado sea capaz de unirse al FVIII.

El polipéptido de la invención se denomina "dímero" en la presente invención si dos monómeros del polipéptido de la invención están unidos covalentemente. Preferentemente, el enlace covalente se localiza dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. Preferentemente, las dos subunidades monoméricas están unidas covalentemente a través de al menos un puente disulfuro, por ejemplo, mediante uno, dos, tres o cuatro puentes disulfuro. Los residuos de cisteína que forman el al menos un puente disulfuro se encuentran preferentemente dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. En una realización, estos residuos de cisteína son Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, o Cys-1227 o combinaciones de ellos. Preferentemente, el polipéptido dimérico de la invención no comprende ningún otro enlace covalente que vincule los monómeros además de dicho enlace covalente situado dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido, en particular no comprende ningún otro enlace covalente situado dentro de la porción HLEM o HLEP del polipéptido. Sin embargo, según otras realizaciones, el polipéptido dimérico de la invención puede comprender un enlace covalente situado en la porción HLEM o HLEP del polipéptido que une los monómeros.

El dímero es preferentemente un homodímero, por lo que cada monómero comprende preferentemente una HLEM como se divulga en el presente documento. El VWF truncado preferentemente comprende o consiste en dos polipéptidos cada uno con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

El VWF truncado puede ser cualquiera de los fragmentos de VWF divulgados en WO 2013/106787 A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 o WO 2013/093760 A2, siempre que el VWF truncado comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

De acuerdo con otras realizaciones preferidas, el VWF truncado como se ha divulgado anteriormente puede comprender al menos una de las sustituciones de aminoácidos como se divulga en WO 2016/000039 A1. Estas versiones modificadas del VWF truncado comprenden al menos una sustitución de aminoácidos dentro de su dominio D', en comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF de tipo salvaje según la SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de las versiones modificadas del VWF truncado puede tener una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la respectiva secuencia de tipo salvaje. La secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF truncado modificado tiene preferentemente una o dos sustituciones de aminoácidos en relación con el dominio D' de la SEQ ID NO:4. Se prefiere que S en la posición 764 de la SEQ ID NO:4, correspondiente a la posición 1 de la SEQ ID NO:2, esté sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, P, V, E, Y, A y L. También se prefiere que S en la posición 766 de la SEQ ID NO:4, correspondiente a la posición 3 de la SEQ ID NO:2 esté sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Y, I, M, V, F, H, R y W. Las combinaciones preferidas de sustituciones incluyen S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R y S764P/S766L, con referencia a la secuencia de la SEQ ID NO:4. La afinidad de unión del polipéptido de la presente invención al FVIII puede incrementarse aún más mediante la introducción de dichas sustituciones en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tenga la misma secuencia de aminoácidos excepto por dichas modificaciones. Dichas sustituciones dentro del VWF truncado pueden contribuir a aumentar la semivida del FVIII coadministrado.

El término "VWF endógeno", tal como se utiliza aquí, se refiere a las subunidades monoméricas del VWF, independientemente de su grado de multimerización.

Fracción de extensión de la semivida (HLEM)

Además del VWF truncado, el polipéptido de la invención comprende una fracción de extensión de la semivida. La fracción de extensión de la semivida puede ser una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada con el VWF truncado. Alternativamente, la fracción de extensión de semivida puede conjugarse químicamente con el polipéptido que comprende el VWF truncado mediante un enlace covalente diferente a un enlace peptídico.

En ciertas realizaciones de la invención, la semivida del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de una fracción que prolonga la semivida, como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietilalmidón (HESilación), los ácidos polisiálicos, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención se conjuga con una HLEM como la albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo La patente estadounidense n° 7.256.253).

En otras realizaciones, la fracción que prolonga la semivida es una proteína que aumenta la semivida (HLEP). Preferentemente, la HLEP es una albúmina o un fragmento de la misma. El N-terminal de la albúmina puede fusionarse con el C-terminal del VWF truncado. Alternativamente, el C-terminal de la albúmina puede fusionarse con el N-terminal del VWF truncado. Se pueden fusionar uno o más HLEP a la parte N- o C-terminal del VWF siempre que no interfieran 0 supriman la capacidad de unión del VWF truncado al FVIII.

El polipéptido recombinante comprende además, preferentemente, un enlace químico o una secuencia enlazadora situada entre el VWF truncado y la HLEM.

Dicha secuencia enlazadora puede ser un enlazador peptídico compuesto por uno o más aminoácidos, en particular de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo, 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Preferentemente, la secuencia enlazadora no está presente en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Los aminoácidos preferidos presentes en dicha secuencia de enlace incluyen Gly y Ser. La secuencia de enlace debe ser no inmunogénica. Los enlazadores preferidos pueden estar compuestos por residuos alternos de glicina y serina. Los enlazadores adecuados se describen, por ejemplo, en WO2007/090584.

En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la fracción truncada del VWF y la HLEM consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores interdominio naturales en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO 2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

En una realización preferida del polipéptido recombinante, el enlazador entre el VWF truncado y la HLEM es un enlazador peptídico de glicina/serina que tiene o consiste en la secuencia de aminoácidos 480 - 510 de la SEQ ID NO:2.

En una realización el polipéptido tiene la siguiente estructura:

tVWF - L1 -H , [fórmula 1]

En la que tVWF es el VWF truncado, L1 es un enlace químico o una secuencia de enlace, y H es una HLEM, en particular una HLEP.

L1 puede ser un enlace químico o una secuencia de enlace que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en WO 2007/090584 A1. En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la parte truncada del VWF y la parte de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Las secuencias HLEP preferidas se describen infra. También se incluyen en la invención las fusiones al "aminoácido N-terminal" exacto o al "aminoácido C-terminal" exacto de la HLEP respectiva, o las fusiones a la "parte N-terminal" o a la "parte C-terminal" de la HLEP respectiva, que incluyen deleciones N-terminales de uno o más aminoácidos de la HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse con la parte C-terminal del VWF en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.

Polipéptidos potenciadores de la semivida (HLEP)

Preferentemente, la fracción que extiende la semivida es un polipéptido que extiende la semivida (HLEP). Más preferentemente, la HLEP se selecciona del grupo que consiste en albúmina, un miembro de la familia de las albúminas o fragmentos de las mismas, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo, XTEN (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, transferrina o variantes o fragmentos de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, un polipéptido capaz de unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), en particular una región constante de inmunoglobulina y porciones de la misma, por ejemplo el fragmento Fcg. el fragmento Fc, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a un miembro de la familia de la albúmina o a fragmentos de la misma o a una región constante de la inmunoglobulina o a porciones de la misma. La región constante de la inmunoglobulina o porciones de la misma es preferentemente un fragmento Fc de la inmunoglobulina G1, un fragmento Fc de la inmunoglobulina G2 o un fragmento Fc de la inmunoglobulina A.

Un polipéptido potenciador de la semivida, tal como se utiliza en el presente documento, puede ser una proteína potenciadora de la semivida de longitud completa descrita en el presente documento o uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación, en particular de aumentar la semivida in vivo del polipéptido de la invención. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos unos 15, al menos unos 20, al menos unos 25, al menos unos 30, al menos unos 50, al menos unos 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos del HLEP respectivo, siempre que el fragmento HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25 % en comparación con el polipéptido respectivo sin la HLEP.

La porción HLEP del polipéptido de la invención puede ser una variante de una HLEP de tipo salvaje. El término "variantes" incluye inserciones, supresiones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, cuando dichos cambios no alteren sustancialmente la actividad de unión al FVIII del VWF truncado.

En particular, los constructos de fusión VWF-HLEP truncados propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de HLEPs y fragmentos de HLEPs. El HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP no mamíferas incluyen, entre otras, la gallina y el salmón.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, la porción HLEM, en particular una HLEP, del polipéptido recombinante de la invención puede especificarse con el término alternativo "FP". Preferentemente, el término "FP" representa una albúmina humana.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas, el polipéptido recombinante es una proteína de fusión. Una proteína de fusión en términos de la presente invención es una proteína creada por la unión dentro del marco de al menos dos secuencias de ADN que codifican el VWF truncado así como la HLEP. El experto entiende que la traducción de la secuencia de ADN de la proteína de fusión dará lugar a una única secuencia de proteína. Como resultado de una inserción dentro del marco de una secuencia de ADN que codifica un enlazador peptídico según otra realización preferida, puede obtenerse una proteína de fusión que comprende el VWF truncado, un enlazador adecuado y el HELP.

De acuerdo con algunas realizaciones, el FVIII coadministrado no comprende ninguna de las estructuras HLEM o HLEP aquí descritas. De acuerdo con algunas otras realizaciones, el FVIII coadministrado puede comprender al menos una de las estructuras HLEM o HLEP aquí descritas.

Albúmina como HLEP

Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).

Tal y como se utiliza aquí, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido de albúmina o a la secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente la forma madura de la albúmina humana tal como se muestra en la SEQ ID NO:6 o la albúmina de otros vertebrados o sus fragmentos, o análogos o variantes de estas moléculas o sus fragmentos.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, el término alternativo "FP" se utiliza para identificar la HLEP, en particular para definir la albúmina como HLEP.

En particular, los polipéptidos propuestos de la invención pueden incluirvariantes polimórficas naturales de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En general, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente de al menos 40, y más preferentemente de más de 70 aminoácidos.

Las realizaciones preferidas de la invención incluyen variantes de albúmina utilizadas como HLEP del polipéptido de la invención con una unión mejorada al receptor FcRn. Dichas variantes de albúmina pueden dar lugar a una semivida plasmática más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina del VWF truncada en comparación con una fusión del VWF truncado con una albúmina de tipo salvaje.

La porción de albúmina de los polipéptidos de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservativas del mismo.

Inmunoglobulinas como HLEP

Las regiones constantes (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en el arte para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de la cadena pesada de la IgG consiste en 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede proceder de cualquier mamífero o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Las IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden utilizarse como HLEP. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para aumentar la semivida in vivo de las proteínas terapéuticas. US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que de otro modo se eliminaría rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que conseguían una mayor actividad biológica, una semivida circulante prolongada y una mayor solubilidad (Wo 2006/000448 A2). Se divulgaron proteínas Fc-EPO con una semivida sérica prolongada y una mayor potencia in vivo (WO 2005/063808 A1), así como fusiones de Fc con G-CSF (WO 2003/076567 A2), péptido similar al glucagón-1 (WO 2005/000892 A2), factores de coagulación (WO 2004/101740 A2) y la interleucina-10 (Pat. de EE.UU. N° 6.403.077), todos ellos con propiedades de mejora de la semivida.

Varios HLEP que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen en detalle en WO 2013/120939 A1.

N-Glicanos y Sialilación del polipéptido de la invención

El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 75 %, preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. En realizaciones preferidas, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. Los inventores descubrieron que los polipéptidos que comprenden fragmentos de FVW altamente sialilados no sólo pueden tener una semivida más prolongada por sí mismos, sino que también pueden ser capaces de prolongar aún más la semivida del FVIII coadministrado. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una semivida prolongada y/o a una eliminación reducida del FVIII coadministrado.

El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 50 % de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glicoproteínas son grupos sialilo ligados a a-2,6. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2,3- o a través de un enlace a-2,6. Típicamente, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,6 que a a-2,3. Preferentemente, al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 % de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

Los procedimientos adecuados para producir dichas glicoproteínas se describen en el documento pendiente PCT/EP2016/061440. En consecuencia, se describe un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, cuyo procedimiento comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento para producir un dímero de una glicoproteína que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, o para aumentar la dimerización de dicha glicoproteína, cuyo procedimiento comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicoproteína, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un factor de von Willebrand (VWF) truncado y un ácido nucleico recombinante que codifica una a-2,6-sialiltransferasa, y (ii) cultivar las células en condiciones que permiten la expresión de la glicoproteína y de la a-2,6-sialiltransferasa.

En una realización, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico.

En otra realización, menos del 15 %, menos del 12 %, menos del 10 %, o menos del 8 %, o menos del 6 %, o menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 %, o menos del 2 % o incluso menos del 1 % de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos del 15 %, menos del 12 %, menos del 10 %, o menos del 8 %, o menos del 6 %, o menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 %, o menos del 2 % o incluso menos del 1 % de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo ácido siálico.

Otras realizaciones de la invención comprenden un Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que dicho VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII (FVIII), y en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos, en el que menos del 35 %, preferentemente menos del 34 %, preferentemente menos del 33 %, preferentemente menos del 32 %, preferentemente menos del 31 %, preferentemente menos del 30 %, preferentemente menos del 29 %, preferentemente menos del 28 %, preferentemente menos del 27 %, preferentemente menos del 26 % preferentemente menos del 25 %, preferentemente menos del 24 %, preferentemente menos del 23 % preferentemente menos del 22 %, preferentemente menos del 21 %, preferentemente menos del 20 % preferentemente menos del 19 %, preferentemente menos del 18 %, preferentemente menos del 17 % preferentemente menos del 16 %, preferentemente menos del 15 %, preferentemente menos del 14 % preferentemente menos del 13 %, preferentemente menos del 12 %, preferentemente menos del 11 % preferentemente menos del 10 %, preferentemente menos del 9 %, preferentemente menos del 8 %, preferentemente menos del 7 %, preferentemente menos del 6 % y preferentemente menos del 5 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, dos o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

El Factor de von Willebrand (VWF) truncado, en el que dicho VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII (FVIII), comprende preferentemente N-glicanos, en los que menos del 6 %, preferentemente menos del 5 %, preferentemente menos del 4 %, preferentemente menos del 3 %, preferentemente menos del 2 %, y preferentemente menos del 1 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, tres o más residuos de galactosa terminales y no sialilados.

Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Todos los porcentajes de N-glicanos mencionados anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, deben entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una única molécula. Está claro que la glicosilación o sialilación de las moléculas individuales de glicoproteínas dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.

Dímeros

El polipéptido de esta invención tiene una alta relación de dímeros. El polipéptido de la invención se presenta por tanto como dímero. En una realización, al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % de los polipéptidos están presentes como dímeros. En otra realización, la relación dímero: monómero del polipéptido de la invención es al menos 1,5, preferentemente al menos 2, más preferentemente al menos 2,5 o al menos 3. Lo más preferible es que todos los polipéptidos de la invención estén presentes como dímeros. Se prefiere además que el polipéptido de la invención no comprenda formas multiméricas. El uso de dímeros es favorable, ya que el dímero tiene una mejor afinidad con el Factor VIII en comparación con el monómero. El contenido de dímeros y la relación entre dímeros y monómeros del polipéptido de la invención pueden determinarse como se describe en el ejemplo 2.

En una realización, la afinidad del polipéptido de la invención al Factor VIII es mayor que la del VWF nativo humano a la misma molécula de Factor VIII. La afinidad al Factor VIII del polipéptido puede referirse al Factor VIII humano nativo, derivado del plasma o recombinante, en particular a una molécula de Factor VIII recombinante que tenga un dominio B truncado o eliminado, preferentemente una molécula de Factor VIII como la caracterizada por la SEQ ID NO:5.

Se ha encontrado que las preparaciones del polipéptido de esta invención con una alta proporción de dímeros tienen una mayor afinidad al Factor VIII. Esta mayor afinidad al Factor VIII conduce a una mayor estabilización del Factor VIII por los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente o en combinación con una proporción aumentada de dímeros también los polipéptidos de acuerdo con la invención con mutaciones dentro del dominio de unión al Factor VIII que aumentan la afinidad al Factor VIII son realizaciones preferidas de la invención. Se divulgan mutaciones adecuadas, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Preparación del polipéptido

El ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede prepararse según procedimientos conocidos en la técnica. Basándose en la secuencia de ADNc de la forma prepro de VWF nativo humano (SEQ ID NO:3), puede diseñarse y generarse ADN recombinante que codifique los constructos o polipéptidos de VWF truncado antes mencionados de la invención.

Incluso si el polipéptido que es secretado por las células huésped no comprende los aminoácidos 1 a 763 de la preforma del VWF nativo humano, se prefiere que el ácido nucleico (por ejemplo el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 23 a 763 o, preferentemente, con los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NO:4. Más preferentemente, el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 23 a 763 de la SEQ ID NO:4, o los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NO:4.

Los constructos en los que el ADN contiene el marco de lectura abierto completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión pueden utilizarse para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células portadoras del plásmido. También pueden incluir una secuencia de origen de replicación que permite su replicación autónoma dentro del organismo anfitrión, y secuencias que aumentan la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades de libre replicación utilizando elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que hayan integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce de forma continua.

Típicamente, las células a proporcionar se obtienen introduciendo el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en células huésped de mamífero.

Cualquier célula huésped susceptible de cultivo celular, y de expresión de glicoproteínas, puede ser utilizada de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, una célula huésped es de mamífero. Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c(NSO/1, Ec ACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34) células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, At CC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (HepG2, Hb 8065); tumor mamario de ratón (Mm T 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células de amniocitos humanos (CAP); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la línea celular es una línea celular de roedores, especialmente una línea celular de hámster como CHO o BHK.

Los procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en células huésped de mamíferos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981 Manteietal., Nature, 281:40-46, 1979 Levinson et al. EP 117.060 y EP 117,058. En el caso de las células de mamíferos, los procedimientos habituales para introducir material genético en ellas incluyen el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) o el procedimiento de lipofectamina™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células de mamíferos han sido descritos por Axel en US. Pat. N° 4.399.216. Para diversas técnicas de introducción de material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990 y Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988.

Las células se cultivan en condiciones que permiten la expresión del polipéptido. El polipéptido puede recuperarse y purificarse utilizando procedimientos conocidos por el artesano experto.

Concentración máxima, área bajo la curva de concentración temporal, semivida terminal, MRT, aclaramiento y biodisponibilidad

El polipéptido de la invención puede utilizarse para proporcionar o aumentar la biodisponibilidad del FVIII tras la administración extravascular. Además, puede utilizarse para aumentar la Cmáx, el AUC, la semivida terminal y/o el tiempo medio de permanencia (MRT) y/o reducir el aclaramiento del Factor VIII en comparación con un tratamiento de referencia que sea idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprenda una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar sea inferior a una relación molar según la invención, en particular inferior a una relación molar de 50, inferior a 60, inferior a 75, inferior a 100, inferior a 200, inferior a 300, inferior a 400 o inferior a 1000.

Para la evaluación de los datos farmacocinéticos se aplicó un modelo de dos compartimentos (perfil farmacocinético bifásico).

La concentración máxima (Cmáx) es la mayor concentración plasmática dada por el modelo. Tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con el FVIII, la concentración máxima (Cmáx) para el FVIII puede ser de al menos 10 IU/ml, de al menos 25 mIU/ml, de al menos 50 mIU/ml, de al menos 100 mIU/ml, de al menos 200 mIU/ml, de al menos 300 mIU/ml o de al menos 400 mIU/ml de actividad del FVIII, preferentemente de actividad cromogénica del FVIII.

Tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, la concentración máxima (Cmáx) del polipéptido recombinante es, según ciertas realizaciones, de al menos 20 nmol/kg, al menos 40 nmol/kg, al menos 60 nmol/kg, al menos 80 nmol/kg o al menos 160 nmol/kg. Preferentemente, tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con el FVIII, la concentración máxima (Cmáx) para el polipéptido recombinante es de al menos 5 |jg de HLEM/ml, 10 jg de HLEM/ml, al menos 15 jg de HLEM/ml, o al menos 20 jg de HLEM /ml, por lo que los valores se basan en un cálculo para la HLEM, preferentemente, los valores se basan en una cuantificación utilizando un ensayo específico para la HLEM, como un inmunoensayo, preferentemente específico para la albúmina humana. La concentración máxima (Cmáx) del polipéptido recombinante puede ser al menos 3 veces mayor en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

El AUCü-inf es el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo de cero a infinito. Tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCoinf) para el FVIII coadministrado puede ser de al menos 1000 mIU*h/ml al menos 2000 mIU*h/ml, al menos 3000 mlU*h/ml, al menos 5000 mIU*h/ml, al menos 10000 mIU*h/ml o al menos 20000 mIU*h/ml de actividad del FVIII, preferentemente actividad cromogénica del FVIII.

Tras la coadministración del polipéptido recombinante con FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUC0-inf) para el polipéptido recombinante coadministrado es de al menos 2 nmol * h/ml, al menos 3 nmol * h/ml, al menos 4 nmol * h/ml, al menos 20 nmol * h/ml, al menos 40 nmol * h/ml o al menos 80 nmol * h/ml. Preferentemente, tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUC0- f para el polipéptido recombinante coadministrado puede ser de al menos 500 |jg Hl Em *h/ml, de al menos 750 |jg h LEm *h/ml al menos 1000 |jg HLEM *h/ml al menos 5000 |jg HLEM*h/ml, o al menos 10000 jig HLEM *h/m, por lo que los valores se basan en un cálculo para la HLEM, preferentemente, los valores se basan en una cuantificación utilizando un ensayo específico para la HLEM, como un inmunoensayo, preferentemente específico para la albúmina humana.

Tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUC0- f para el polipéptido recombinante coadministrado puede ser al menos 5, es al menos 10 o es al menos 15 veces mayor en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a un tratamiento según la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

La "semivida" T1/2(t) en un determinado tiempo t es el tiempo que tarda en reducirse a la mitad la concentración plasmática C(t) presente en el tiempo t. La "semivida terminal" (en este último texto abreviada como t-io) es el límite de T1/2(t) cuando t tiende a infinito. Se calcula dividiendo el logaritmo natural de 2 por la constante de eliminación terminal.

La semivida terminal del FVIII administrado puede aumentarse mediante la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente por un factor de al menos 1,2, al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5, o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación entre el polipéptido recombinante que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención. Preferentemente, la semivida terminal del FVIII coadministrado se incrementa en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

La semivida terminal del FVIII administrado seguido de la coadministración del polipéptido recombinante, puede ser de al menos 5h, al menos 6h, al menos 7h, al menos 9h, al menos 10h o al menos 15h.

La semivida plasmática del polipéptido de la invención se incrementa en comparación con la del VWF endógeno, donde la semivida plasmática del polipéptido es preferentemente al menos un 100 %, al menos un 200 % o preferentemente al menos un 400 % mayor que la del VWF endógeno.

La semivida terminal del polipéptido recombinante seguido de la coadministración con FVIII, puede ser de al menos 10 h, al menos, 15 h, al menos 20 h, al menos 25 h, al menos 30 h o al menos 35 h. La semivida terminal del polipéptido recombinante puede aumentarse en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación entre el polipéptido recombinante que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

El término "MRT", tal como se utiliza aquí, significa el tiempo medio que una molécula de fármaco (por ejemplo, el polipéptido de la invención o un FVIII) reside en el cuerpo. En un sistema farmacocinético con aclaramiento constante, el MRT puede calcularse como el área bajo la curva del primer momento (AUMC0-inf) dividida por el AUC0-inf. La curva del primer momento es el tiempo multiplicado por la concentración de plasma en ese momento. El AUMC0-inf se calcula de forma análoga al AUC0-M.

El tiempo medio de permanencia (MRT) del FVIII administrado se incrementa por la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente por un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

El MRT del FVIII administrado puede ser de al menos 10 h, preferentemente de al menos 15 h, de al menos 20 h o de al menos 25 h.

El MRT del polipéptido recombinante administrado puede aumentar, preferentemente en un factor de al menos 1,5, al menos 2 o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a un tratamiento de la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

El término "aclaramiento", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la tasa de eliminación del fármaco en el plasma. En concreto, es la tasa de eliminación actual de un fármaco dividida por su concentración plasmática actual. En un sistema farmacocinético tras una única administración intravenosa, el aclaramiento puede calcularse como la relación entre la dosis y el AUCü-inf, siempre que el aclaramiento sea constante. Cuanto menor sea el aclaramiento, más tiempo tardará el plasma en ser eliminado del fármaco.

Tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, el valor del aclaramiento (CL) del FVIII administrado se reduce en comparación con un tratamiento de referencia, preferentemente en un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7,5 o al menos 10, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a un tratamiento de la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

Preferentemente, tras la coadministración del polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del FVIII administrado es inferior a 135 ml/kg/h, inferior a 80 ml/kg/h, inferior a 45 ml/kg/h, inferior a 40 ml/kg/h, inferior a 35 ml/kg/h, inferior a 30 ml/kg/h o inferior a 25 ml/kg/h. El valor del aclaramiento (CL) del FVIII administrado es preferentemente inferior al de un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

Tras la coadministración del polipéptido recombinante con el FVIII, el valor del aclaramiento (CL) del polipéptido recombinante puede ascender a un intervalo entre 1,0 y 2,5 ml/kg/h, o entre 1,1 y 2,2 ml/kg/h o entre 1,2 y 2,1 ml/kg/h.

Tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII, el valor de aclaramiento (CL) del polipéptido recombinante se reduce en un factor de al menos 2, al menos 5 o al menos 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o salvo que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

El término biodisponibilidad, tal como se utiliza aquí, se define como el porcentaje de la AUCü-inf del polipéptido de la invención, por ejemplo rD'D3-FP, tras la administración s.c., en relación con la AUC0-inf del polipéptido de la invención, por ejemplo rD'D3-FP, tras la administración i.v.

El polipéptido definido anteriormente permite la administración subcutánea del FVIII. La invención, en particular, se refiere al uso de un polipéptido como el definido anteriormente para proporcionar o aumentar la biodisponibilidad del FVIII.

La biodisponibilidad del FVIII administrado puede aumentar tras la coadministración con el polipéptido recombinante en un factor de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a una relación molar según la invención.

La biodisponibilidad del FVIII administrado tras la coadministración con el polipéptido recombinante es preferentemente de al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, preferentemente al menos el 7 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 30 %, al menos el 35 % o al menos el 40 %. Otros intervalos preferidos para la biodisponibilidad del FVIII administrado tras la coadministración con el polipéptido recombinante son 5-80 %, 5-70 %, 5-60 %, 5-50 %, 5-40 %, 5-30 %, 5-25 %, 10-25 %, 10-15 % o 5-15 %.

La biodisponibilidad del polipéptido recombinante tras la coadministración con el FVIII es de al menos el 30 %, preferentemente de al menos el 35 %, más preferentemente de al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %.

El polipéptido tal como se define anteriormente puede utilizarse en un procedimiento de tratamiento del trastorno de la coagulación de la sangre, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz del polipéptido.

El polipéptido definido anteriormente puede utilizarse para reducir la frecuencia de administración del FVIII en el tratamiento de la hemofilia A. La frecuencia de administración subcutánea del FVIII puede reducirse a dos veces por semana. Alternativamente, la frecuencia de la administración subcutánea del FVIII puede reducirse a una vez por semana, o incluso a una frecuencia menor, por ejemplo, una vez cada 10 días o una vez cada 14 días. El FVIII puede administrarse dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, desde cada cuatro días hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, etc.

El término "nivel mínimo" se utiliza aquí para definir la concentración plasmática de FVIII a la que, en un entorno profiláctico, se aplicaría la siguiente dosis de FVIII. Actualmente, para los pacientes con hemofilia A grave, los niveles mínimos recomendados (es decir, el nivel más bajo de factor de coagulación presente en el organismo) se fijan en el 1 %. El tiempo hasta los niveles mínimos del 1, 5 y 10 % se calcula estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0. 05 o 0,1 IU/ml y resolviendo el tiempo.

Preferentemente, el período de tiempo para alcanzar un nivel mínimo del 1 %, 5 % o 10 % del FVIII coadministrado junto con el polipéptido que tiene una HLEM se prolonga en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico al tratamiento según la invención, excepto que el FVIII se administra con un polipéptido recombinante sin tener dicho HLEM.

El período de tiempo para alcanzar el nivel mínimo del 1 % del FVIII coadministrado junto con el polipéptido es de al menos aproximadamente 30 horas, al menos aproximadamente 35 horas, al menos aproximadamente 38 horas, al menos aproximadamente 40 horas o al menos aproximadamente 50 horas; o para alcanzar el nivel mínimo del 5 % del FVIII coadministrado junto con dicho polipéptido es de al menos aproximadamente 20h, al menos aproximadamente 22h, al menos aproximadamente 29h, al menos aproximadamente 34h, o al menos aproximadamente 43h; o para alcanzar el nivel mínimo del 10 % del FVIII coadministrado junto con dicho polipéptido es de al menos aproximadamente 5h, al menos aproximadamente 6h, al menos aproximadamente 10h, al menos aproximadamente 18h, o al menos aproximadamente 20h.

Tratamiento de los trastornos de la coagulación

Los polipéptidos de la invención son útiles para tratar los trastornos de coagulación hemofilia A y enfermedad de von-Willebrand. El término "hemofilia A" se refiere a una deficiencia en la coagulación funcional del FVIII, que suele ser hereditaria. La enfermedad de von-Willebrand según algunas realizaciones preferidas se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de von-Willebrand tipo 2N, la enfermedad de von-Willebrand tipo 3 y la enfermedad de von-Willebrand tipo 1.

En una realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A moderada. La hemofilia A moderada se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno que es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. Normalmente, los sujetos con hemofilia A moderada tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,01 a 0,05 IU/ml en el plasma.

En otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A leve. La hemofilia A leve se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno que es de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. Típicamente, los sujetos que tienen hemofilia A leve tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,05 a 0,4 IU/ml en el plasma.

En otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A severa, preferentemente asociada con un nivel de actividad del FVIII endógeno que está por debajo del 1 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP.

En otra realización, el trastorno de la coagulación de la sangre es la enfermedad de von-Willebrand tipo 2N. La enfermedad de von-Willebrand tipo 2N se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno que va de aproximadamente 3 IU/dL a aproximadamente 30 IU/dL de nivel de actividad del FVIII que corresponde a un 3 % a un 30 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 20 IU/dL, es decir, un nivel inferior al 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. Así, los sujetos que padecen la enfermedad de von-Willebrand tipo 2N tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,03 IU/ml a 0,3 IU/ml en el plasma, normalmente por debajo de 0,2 IU/ml.

En otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la enfermedad de von-Willebrand de tipo 3, caracterizada preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes del tratamiento que suele estar en un intervalo entre aproximadamente 1 IU/dL y aproximadamente 20 IU/dL de nivel de actividad del FVIII, lo que corresponde a aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 10 IU/dL, es decir, un nivel inferior al 10 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP.

De acuerdo con otra realización, el trastorno de la coagulación sanguínea es la enfermedad de von-Willebrand de tipo 1, caracterizada por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes del tratamiento que se reduce en comparación con el nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.

El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier fase o manifestación clínica; el retraso del inicio o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un polipéptido de la invención es preferentemente un ser humano. En ciertos aspectos, el humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el humano es un paciente adulto.

En el presente documento se describen composiciones que comprenden el polipéptido de la invención y, opcionalmente, el FVIII. Las composiciones suelen suministrarse como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado para administrarla a un paciente).

Los términos "Factor VIII" y "FVIII" o "proteína del Factor VIII" se utilizan indistintamente en el presente documento y abarcan tanto el FVIII derivado del plasma como el FVIII recombinante. El FVIII recombinante abarca, sin limitación, el FVIII de longitud completa, así como las variantes de dos cadenas del dominio B suprimidas o truncadas, así como las variantes de una sola cadena del dominio B suprimidas o truncadas, por ejemplo las descritas en WO 2004/067566 A1 y otras variantes del FVIII con mutaciones fuera del dominio B pero que tienen la actividad biológica del FVIII.

El polipéptido de la invención puede ser administrado a un paciente por una variedad de rutas extravasculares tales como subcutánea, intradérmica o intramuscular. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá del polipéptido concreto, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del sujeto. Preferentemente, un polipéptido de la invención se administrará por vía subcutánea.

El polipéptido y el FVIII se administran preferentemente por vía subcutánea.

La determinación del número total de dosis y la duración del tratamiento con un polipéptido de la invención y FVIII está bien dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. La dosificación del polipéptido de la invención así como del FVIII a administrar depende de las concentraciones del FVIII a administrar, de la concentración del VWF endógeno en el paciente a tratar, o de ambas. Una dosificación eficaz basada en las proporciones definidas por los inventores de esta solicitud puede ser determinada por el experto, teniendo en cuenta el peso molecular del polipéptido de la invención así como el peso molecular del FVIII que se va a administrar. El grado de gravedad del trastorno de la coagulación sanguínea también puede considerarse para determinar la dosificación adecuada del polipéptido de la invención, así como del FVIII que debe administrarse. Las dosificaciones típicas de FVIII pueden oscilar entre aproximadamente 20 IU/kg de peso corporal y aproximadamente 1.000 IU/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 20 IU/kg de peso corporal y aproximadamente 500 IU/kg de peso corporal, y más preferentemente entre aproximadamente 20 IU/kg de peso corporal y aproximadamente 400 IU/kg de peso corporal.

De acuerdo con esta invención, el paciente que está siendo tratado con el polipéptido de la invención también es tratado con el Factor VIII de coagulación sanguínea. El polipéptido de la invención y el Factor VIII pueden administrarse preferentemente de forma simultánea, es decir, juntos, aunque en principio también podría realizarse una administración de forma secuencial, quedando ambos modos de administración englobados en el término "terapia combinada" y "coadministración". El polipéptido de la invención y el Factor VIII pueden administrarse como una mezcla, es decir, dentro de la misma composición, o por separado, es decir, como composiciones independientes. La coadministración del polipéptido recombinante y de la proteína FVIII se consigue preferentemente mediante la administración conjunta en una única composición que comprende el polipéptido recombinante y la proteína FVIII. De acuerdo con otras realizaciones preferidas, la coadministración del polipéptido recombinante y la proteína FVIII se consigue proporcionando un producto combinado que comprende el polipéptido recombinante y el FVIII mezclados en una única composición o proporcionando un conjunto o kit de al menos dos productos separados dispuestos para ser mezclados antes de la administración, en el que un primer producto comprende el polipéptido recombinante y un segundo producto comprende el FVIII.

En particular, en el caso de que el polipéptido recombinante y la proteína FVIII se proporcionen en composiciones o productos separados para ser mezclados antes de la coadministración, la mezcla puede ser tratada antes de la administración de tal manera que permita antes de la administración que al menos una proporción de dicho polipéptido recombinante se una a dicho FVIII. Por ejemplo, la mezcla podría incubarse durante un tiempo determinado. Dicha incubación puede llevarse a cabo en menos de 1 minuto, o en menos de 5 minutos, ya sea a temperatura ambiente o, si procede, a temperatura elevada, aunque preferentemente a una temperatura inferior a 40 °C. Esta etapa de incubación rápida también puede ser apropiada durante la reconstitución de un producto combinado que comprenda el polipéptido recombinante y el FVIII mezclado en una única composición.

La concentración de Factor VIII en la composición utilizada está típicamente en el intervalo de 10-10,000 IU/ml. En diferentes realizaciones, la concentración de FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10­ 8.000 IU/ml, o 10-5.000 IU/ml, o 20-3.000 IU/ml, o 50-1.500 IU/ml, o 3.000 IU/ml, o 2.500 IU/ml, o 2,000 IU/ml, o 1.500 IU/ml, o 1.200 IU/ml, o 1.000 IU/ml, o 800 IU/ml, o 750 IU/ml, o 600 IU/ml, o 500 IU/ml, o 400 IU/ml, o 300 IU/ml, o 250 IU/ml, o 200 IU/ml, o 150 IU/ml, o 125 IU/ml, o 100 IU/ml, o 625 IU/ml, o 50 IU/ml, siempre que se cumplan los requisitos relativos a la relación con respecto al polipéptido VWF de la invención tal como se define en el presente documento.

La "unidad internacional", o "IU", es una unidad de medida de la actividad de coagulación de la sangre (potencia) del FVIII, medida por un ensayo de actividad del FVIII, como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad del FVIII con sustrato cromogénico, utilizando un estándar calibrado en "IU" con respecto a una preparación estándar internacional. Los ensayos de coagulación de una etapa son conocidos en la técnica, como el descrito en N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación del plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de los factores del sistema intrínseco de coagulación. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo hasta la formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se realiza en presencia de plasma deficiente de Factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el Factor de Coagulación VIII incluido en la muestra a analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de Factor VIII presente en la muestra. La actividad del Factor VIII de la coagulación se cuantifica por comparación directa con una preparación estándar con una actividad conocida del Factor VIII en Unidades Internacionales.

Otro ensayo estándar es un ensayo de sustrato cromogénico. Los ensayos de sustrato cromogénico pueden adquirirse comercialmente, como el kit de ensayo Coamatic® FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el Factor X es activado por el Factor IXa a Factor Xa. Esta reacción es estimulada por el Factor VIIIa como cofactor. El FVIIIa se forma por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción a partir del FVIII en la muestra a medir. Cuando se utilizan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y Factor IXa y una cantidad excesiva de Factor X, la activación del Factor X es proporcional a la potencia del Factor VIII. El Factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromogénico S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es por lo tanto proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del Factor VIII de la muestra.

Composiciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas del polipéptido de la invención adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables que se emplean típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan aquí "portadores"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Estos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que van desde unos 2 mM hasta unos 50 mM. Entre los agentes tamponadores adecuados se encuentran los ácidos orgánicos e inorgánicos y sus sales, como los tamponadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), los tamponadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínicosuccinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódicofumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo mezcla de oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido lácticohidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Además, se pueden utilizartampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que oscilan entre el 0,2 % y el 1 % (p/v). Entre los conservantes adecuados se encuentran el fenol, el alcohol bencílico, el metacresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas pueden añadirse isotonificadores, a veces conocidos como "estabilizadores", que incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferentemente trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc, azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como la lactosa, la trehalosa, la estaquiosa, el manitol, el sorbitol, el xilitol, el ribitol, el mioinisitol, el galactitol, el glicerol y similares, incluidos los ciclitoles como el inositol; el polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióctico, el tioglicolato de sodio, el tioglicerol, el a-monotioglicerol y el tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como la albúmina de suero humano, la albúmina de suero bovino, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, la manosa, la fructosa y la glucosa; disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos como la rafinosa; y polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína activa.

Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a la tensión superficial de cizallamiento sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se encuentran los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles plurónicos, los monoéteres de sorbitán polioxilados (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otros excipientes diversos incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes.

La formulación del presente documento también puede contener un segundo agente terapéutico además de un polipéptido de la invención. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

El programa de dosificación puede variar desde una vez al mes hasta diariamente, dependiendo de una serie de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la misma y la sensibilidad del paciente al polipéptido de la invención. En realizaciones específicas, un polipéptido de la invención se administra, dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo desde cada cuatro semanas hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, etc.

La dosificación de un polipéptido de la invención que se va a administrar variará según el polipéptido particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosificación adecuada puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un polipéptido de la invención se determinarán por la naturaleza y el alcance de la condición que se está tratando, la forma, la ruta y el sitio de administración, y la edad y la condición del sujeto particular que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que se utilizarán. Esta dosificaciones puede repetirse tantas veces como sea necesario. Si se producen efectos secundarios, se puede modificar o reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

La composición farmacéutica se formula preferentemente para ser administrada extravascularmente, preferentemente para ser administrada subcutáneamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos mostradas en el listado de secuencias se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1:

continuación

Ciertas realizaciones de la invención se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que están destinados únicamente a la ilustración y no pretenden limitar el alcance de la generalidad descrita anteriormente.

EJEMPLOS

Material y procedimientos

Generación de la proteína de fusión de albúmina D'D3 (D'D3-FP):

El casete de expresión para D'D3-FP que consiste en ADNc que codifica los aminoácidos 1 a 1242 del VWF, un enlazador de glicina/serina y el ADNc de la albúmina humana se preparó mediante síntesis genética a medida (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania). A través de los sitios de restricción flanqueantes (EcoRI, Notl), el casete de expresión se extrajo del vector de clonación suministrado y se insertó en un vector pIRESneo3 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) linealizado con EcoRI y Notl. El plásmido de expresión resultante contenía secuencias de nucleótidos que codificaban el propéptido del VWF, D' y D3 (aminoácidos del VWF 1 a 1242 de la SEQ ID NO:4) fusionados a la secuencia codificante de la albúmina a través de una secuencia codificante de enlace corto bajo el control del promotor CMV. La secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante se muestra como SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácidos de la D'D3-FP madura se muestra como SEQ ID NO:2. La presencia del propéptido del VWF D1D2 (741 aminoácidos) durante la expresión es crucial para la dimerización del polipéptido sintetizado.

Se utilizó un enfoque similar para generar un plásmido de expresión para una proteína D'D3 marcada con His (D'D3 e His8 unidos por un enlazador de glicina/serina) y una proteína de fusión de D'D3 con el péptido C-terminal de la subunidad de gonadotropina coriónica humana-p, también unida mediante un enlazador de glicina/serina y marcada con 8 histidinas en el C-terminal de la proteína de fusión. La secuencia de aminoácidos del D'D3-His maduro se muestra como SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del D'D3-CTP maduro se muestra como SEQ ID NO: 8.

Los plásmidos de expresión descritos anteriormente se cultivaron en XL10 Gold (Agilent Technologies) y se purificaron utilizando protocolos estándar (Qiagen, Hilden, Alemania).

Las células CHO K1 se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio libre de suero (CD-CHO, Invitrogen) en presencia de 500-1000 pg/ml de Geneticina. Un plásmido de expresión que codifica PACE/furina (pFu-797) como se describe en WO 2007/144173 A1 para maximizar la eficacia de la escisión del propéptido. Los clones derivados de células individuales se cultivaron y seleccionaron según su rendimiento de expresión de D'D3-FP, cuantificado mediante un inmunoensayo enzimático específico para la albúmina (véase más adelante). La línea celular finalmente seleccionada para la fermentación de D'D3-FP se denominó T2050-CL3.

La producción de D'D3-FP se llevó a cabo en biorreactores aplicando un proceso de fermentación en modo de perfusión. El proceso de fermentación para la producción de polipéptidos que contienen D'D3 comenzó con la descongelación de la línea celular T2050-CL3, seguida de la expansión celular en matraces agitados y, finalmente, un proceso de fermentación en modo de perfusión utilizando el biorreactor BioStat B-DCU de 5 L de Sartorius y los biorreactores de un solo uso BioStat s Tr de 50 L. Como dispositivos de retención celular se utilizaron los BioSeps 10L o 200L (Applikon), respectivamente. Los medios de cultivo celular fueron PowerCHO3 (Lonza BESP1204) con 8 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 o ProCHO5 (Lonza BESP1072) con 10 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4.

Los trenes de siembra en frascos de agitación se realizaron a 37 °C, 7,5 % de CO2 a una velocidad de agitación de 160 rpm.

El biorreactorde 5Lfue inoculado con un VCD objetivo de 2,5 *105 células/ml. Las células se cultivaron en PowerCHO3 con 8 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 a una temperatura de 37,0 °C, un pH de 7,00 y una saturación de oxígeno del 30 %. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0 °C (intervalo evaluado de 31 °C a 35 °C) después de haber tomado las recolecciones iniciales del funcionamiento del biorreactor a 37 °C. El pH se controló utilizando CO2 sometido a burbujeo como ácido y NaHCO3 como base. El caudal de aire de superposición se fijó en 0,5 L/min. Se utilizó un burbujeador de anillo como unidad de burbujeo. La velocidad de agitación fue de 150 rpm con un impulsor de palas de doble paso en modo de tracción hacia abajo.

El biorreactor de 50L fue inoculado con un VCD objetivo de 3,0 *105 células/ml. Las células se cultivaron en medio ProCHO5 con 10 mM de L-glutamina y 1 pM de CuSO4 a una temperatura de 37,0 °C, un pH de 6,90 y una saturación de oxígeno del 30 %. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0 °C después de una o dos recolecciones iniciales. Control del PH como en el caso anterior, el caudal de aire de superposición se fijó en 2 L/min. Se utilizó un microburbujeador como unidad de burbujeo. La velocidad de agitación fue de 90 rpm con un impulsor de palas de doble paso en modo de tracción hacia abajo.

La perfusión se inició cuando el VCD en el biorreactor era >1,0 * 106 células/ml. La tasa de perfusión se fijó en 1,0 volumen/volumen/día. El BioSep fue operado en modo de retrolavado con 5 (10) minutos de funcionamiento y 10 segundos de retrolavado a una potencia de entrada de 7 (30) W (los números entre paréntesis se refieren al biorreactor de 50L). El perfusato y la hemorragia se filtraron en línea y se recogieron en bolsas durante 48 horas a una temperatura de 2 a 8 °C. El v Cd se controló por sangrado activo mediante una sonda de turbidez utilizando el consumo de glucosa como parámetro con un objetivo de 2 g/L de glucosa. La recolección y el sangrado se filtraron en línea, el sistema de recolección que consiste en un filtro desechable y una bolsa desechable se cambió cada dos días.

Para preparar el material para los análisis de PK descritos a continuación, se purificaron las recolecciones de proteínas de fusión de albúmina D'D3 mediante cromatografía de afinidad y de exclusión de tamaño. En resumen, la recolección libre de células del biorreactor se concentró 30 veces utilizando un sistema TFF (por ejemplo, Pall Centramate 500 S) con una membrana de 30 kD (por ejemplo, Pall Centramate OS030T12). Ese concentrado se enriqueció con NaCl y EDTA hasta una concentración final de 0,75 M de NaCl y 5 mM de EDTAy se cargó durante la noche en una columna CaptureSelect Human Albumin (Life Technologies) que se preequilibró con un tampón Tris 20 mM de pH 7,4. Tras lavar la columna con tampón de equilibrio, el D'D3-FP se eluyó con tampón de elución (20 mM Tris, 2 MgCh, pH 7,4). A continuación, el eluído se concentró 10 veces y se dializó contra 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,4 utilizando filtros ultracentrífugos con un corte de 30 kD (por ejemplo, Amicon. UFC903024). Para separar el dímero D'D3-FP de la porción de monómero ese material se cargó en una columna Superdex 200 pg (Código GE Healthcare: 17-1069­ 01) preequilibrada con 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,4 y se agruparon las fracciones de pico que contenían el dímero D'D3-FP. El área bajo la curva para las fracciones de pico de dímero y monómero se utilizó para calcular la relación de dímero a monómero. Para los experimentos farmacocinéticos se utilizaron preparaciones de dímeros de dicha proteína de fusión de albúmina D'D3. Estas preparaciones de dímeros se denominan en lo sucesivo D'D3-FP, si no se indica lo contrario.

La variante rD'D3-FP EYA se ha generado mediante pasos equivalentes del procedimiento.

Las proteínas D'D3 marcadas con His se purificaron mediante cromatografía de afinidad y exclusión por tamaño con Ni. En resumen, la recolección concentrada de biorreactores libres de células TFF (ver arriba para más detalles) se cargó en una columna de Ni-Sepharose (HisTrap™, GE Healthcare) preequilibrada (20mM de fosfato de sodio / 500 mM de NaCl, pH 7,4) durante la noche. Tras lavar la columna con 20mM de fosfato sódico / 500 mM de NaCl / 30 mM de Imidazol, pH 7,4, la proteína se eluyó con 20mM de fosfato sódico 500 mM de NaCl 500 mM de Imidazol, pH 7,4. A continuación, el eluído se concentró y se dializó (TBS, pH7,4) utilizando un filtro centrífugo Amicon Ultra (véase más arriba). El producto final se cargó en una columna SEC (véase más arriba), las fracciones de pico que contenían el dímero se agruparon y se concentraron a unos 7 mg/ml de OD280-320. Para los experimentos farmacocinéticos se utilizaron preparaciones de dímeros de proteínas D'D3 marcadas con His. Estas preparaciones de dímeros se denominan en lo sucesivo rD'D3-His, si no se indica lo contrario.

Ejemplo 1: Biodisponibilidad subcutánea de un FVIII recombinante en presencia de rD'D3-FP o de sus variantes

Para evaluar si las inyecciones extravasculares podrían ser una opción para una terapia mejorada con FVIII, se eligió un representante típico para una terapia extravascular, es decir, la inyección subcutánea (s.c.). El objetivo fue caracterizar el impacto de un polipéptido recombinante que comprende un FVIII truncado en la biodisponibilidad subcutánea del FVIII en diferentes enfoques:

Ejemplo 1.1: Investigación de rD'D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla administrados ambos por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Ejemplo 1.2: Investigación de rD'D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla administrados ambos por vía subcutánea en un modelo con FVIII endógeno fisiológico, es decir, en cerdos.

Ejemplo 1.3: Investigación del efecto del rD'D3-FP sobre diferentes productos de FVIII, cada uno de ellos administrado por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Ejemplo 1.4: Investigación del efecto de una variante de afinidad rD'D3-FP, una molécula rD'D3 con HELP sin albúmina y rVIII-Cadena Sencilla administrados ambos por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A de ratón, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Por lo tanto, se investigó el impacto de un polipéptido recombinante que comprende los dominios D' y D3 del VWF fusionado a la albúmina a través de un péptido enlazador cuando se coadministra subcutáneamente con un FVIII recombinante.

Para los Ejemplos, se utilizó un polipéptido que comprende un VWF truncado que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en la SEQ ID NO:2. Esta proteína de fusión particular consiste en una secuencia de aminoácidos N-terminal de 1 - 479 que representa la región D'D3 del VWF (aminoácidos 764 -1242 del VWF nativo humano), seguida de un péptido enlazador de 31 aminoácidos de glicina/serina y una secuencia de aminoácidos C-terminal de albúmina humana de 511 - 1095. Esta proteína de fusión que tiene una secuencia como la definida en la SEQ ID NO:2 se denomina rD'D3-FP o rD'D3-FP WT en lo sucesivo.

Para los fines de los ejemplos, se utilizó un FVIII recombinante de cadena simple suprimido del dominio B, es decir, rVIII-Cadena Sencilla, que tiene una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO:5. En el ejemplo 1.3 se han probado diferentes productos de FVIII recombinante.

Además, se investigó el impacto de diferentes proporciones de rD'D3-FP a la rVIII-Cadena Sencilla.

El impacto de la fusión de la albúmina como un mediador potencial para la disponibilidad subcutánea se investigó comparando la biodisponibilidad de la rD'D3-FP con la de una rD'D3 marcada con His (rD'D3-His). La secuencia de aminoácidos del D'D3-His maduro se muestra como SEQ ID NO: 7 en el que D'D3 e His8 se unen mediante un enlazador de glicina/serina.

Como alternativa a la albúmina como polipéptido de extensión de la semivida (HLEP), en algunos Ejemplos se utiliza una variante de rD'D3-FP que tiene en lugar de albúmina un CTP (péptido C-terminal de la subunidad de gonadotropina coriónica humana-p) fusionado a rD'D3 a través de un enlazador de glicina/serina que se denomina rD'D3-CTP en lo sucesivo. La proteína de fusión rD'D3-CTP tiene una secuencia como la definida en la SEQ ID NO:8.

En ciertos Ejemplos se utilizó una variante de alta afinidad de rD'D3-FP. Esta variante particular de la proteína de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos N-terminal de 1 - 479 que representa la región D'D3 del VWF (aminoácidos 76 -1242 del VWF nativo humano), seguida de un péptido enlazador de 31 aminoácidos de glicina/serina y una secuencia de aminoácidos C-terminal de albúmina humana de 511 - 1095, siempre que dentro del dominio D'D3 de dicho polipéptido estén presentes tres sustituciones de aminoácidos, es decir, S764E, S766Y y V1083A. Esta proteína de fusión consiste en una secuencia como la definida en SEQ ID NO:2 que tiene dichas tres sustituciones S764E, S766Y y V1083A dentro de la región D'D3. Dicha variante se denomina en lo sucesivo rD'D3-FP EYA.

Material y procedimientos

Información de fondo

Para calcular las proporciones de las diferentes combinaciones de rD'D3-FP:rVIII-Cadena Sencilla, se hicieron las siguientes suposiciones:

Los fármacos se diluyen en 40 ml de plasma por kg de peso corporal tras su administración

Peso molecular del polipéptido de la invención utilizado: peso molecular de la subunidad monomérica rD'D3-FP (incluida la glicosilación): 127.000 Da (HLEM = albúmina humana); el peso monomérico se utilizó en las relaciones calculadas

Peso molecular de rD'D3-His: peso molecular de la subunidad monomérica de rD'D3-His (incluida la glicosilación): 64.000 Da; el peso monomérico se utilizó en las relaciones calculadas

Peso molecular de la variante rD'D3-FP EYA: peso molecular de la subunidad monomérica rD'D3-FP (incluida la glicosilación): 127.000 Da; el peso monomérico se utilizó en las relaciones calculadas

Peso molecular del rD'D3-CTP: peso molecular del rD'D3-CTP de la subunidad monomérica (incluida la glicosilación): 69.800 Da; el peso monomérico se utilizó en las relaciones calculadas

Peso molecular del FVIII utilizado: peso molecular del rVIII-Cadena Sencilla (con glicosilación): 180.000 Da y actividad específica: 11.000 IU/mg

Peso molecular de otros productos de FVIII utilizados:

° Beriate®: peso molecular: 285.000 Da y actividad específica: 5.000 IU/mg

° Advate®: peso molecular: 280.000 Da y actividad específica: 7.000 IU/mg

° ReFactoAF®: peso molecular: 170.000 Da y actividad específica: 10.700 lU/mg

Beriate® es un producto de FVIII humano derivado del plasma de CSL Behring.

Advate® se compró a Baxter AG, Viena, Austria, y es una preparación de factor VIII recombinante de longitud completa.

ReFacto AF® fue adquirido a Pfizer Limited, Kent, Reino Unido, y es una preparación de factor VIII recombinante con un dominio B eliminado.

Análisis

La rD'D3-FP (tipo salvaje así como la variante EYA) se aplicó a niveles de dosis cuantificados por un ELISA de albúmina humana, midiendo así la parte de albúmina de la proteína. Este ELISA de rD'D3-FP se utilizó también para muestras de plasma.

El ELISA de albúmina humana utilizó un anticuerpo policlonal de captura de albúmina anti-humana de cabra de Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, EEUU). La solución de detección consiste en una preparación policlonal de anticuerpos de detección de albúmina anti-humana marcados con peroxidasa (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, USA). Se utilizó una lectura cromogénica, es decir, TMB de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania) para la cuantificación en un lector de microplacas a 450/650 nm (ELx808, BioTek, EE.UU.) directamente después de la parada. Como estándar, se utilizó la formulación del fármaco que contiene rD'D3-FP. Las cantidades de rD'D3-FP se dan en mg de albúmina, es decir, no se hizo ningún ajuste para la parte D'D3 de la molécula.

Los niveles de dosis del constructo rD'D3-His y rD'D3-CTP se midieron en OD280, y la cantidad de proteína se ajustó a una concentración equimolar a la cantidad de rD'D3-FP para rD'D3-His. De este modo, la unidad para rD'D3-His es la misma que para rD'D3-FP, es decir, se representa en los gráficos como mg teóricos de albúmina. rD'D3-CTP se dosificó en una relación molar similar a la de rD'D3-FP (variante EYA) y la unidad no se transfiere a la albúmina, sino que se da como rD'D3-CTP. Las muestras de plasma de la PK que contenían rD'D3-His y rD'D3-CTP se midieron en un ELISA anti-D'D3. Este ELISA de D'D3 utilizó un anticuerpo de captura monoclonal anti-D'D3 humano (preparación de investigación propia). La solución de detección consiste en otro anticuerpo de detección anti-D'D3 humano marcado con peroxidasa monoclonal (preparación propia de investigación). Se utilizó una lectura cromogénica, es decir, TMB de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania) para la cuantificación en un lector de microplacas a 450/650 nm (ELx808, BioTek, Vermont, EE.UU.) directamente después de la parada. Como estándar, se utilizó la formulación del fármaco que contiene rD'D3-His y rD'D3-CTP, y al igual que antes para el rD'D3-His se calculó a una concentración equimolar en comparación con el rD'D3-FP, es decir, de nuevo las cantidades se dan como mg teóricos de albúmina. Las cantidades de rD'D3-CTP se dan como concentraciones de rD'D3-CTP.

Los niveles plasmáticos de actividad cromogénica del FVIII se detectaron mediante el ensayo COAMATIC® FVIII (ensayo cromogénico FVIII:C, Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milán, Italia) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. La actividad cromogénica del FVIII se abrevia como FVIII:C.

Los niveles plasmáticos de FVIII:Ag humano se determinaron con el kit de prueba FVIII Asserachrom ELISA de Stago, S.A.S., Francia, según el manual de instrucciones de la prueba. El kit de prueba Asserachrom contenía todos los reactivos a excepción de la solución de parada, que se obtuvo de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania). Como estándar, se utilizó la formulación del fármaco que contiene rVIII-Cadena Sencilla.

Animales

Ratones con desactivación de FVIII

Se eligieron ratones con desactivación de FVIII (ko) (que representan un fenotipo de hemofilia A), ya que carecen de los exones 16 y 17 del gen FVIII, y por lo tanto no tienen actividad del factor VIII en plasma (Bi L. et al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121 Bi L. etal, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450). Esto permite analizar los niveles de actividad del FVIII tras el tratamiento con FVIII mediante la cuantificación de la actividad del FVIII en el plasma de estos ratones.

Los ratones con desactivación de FVIII machos y hembras con un intervalo de peso de 17-35 g fueron criados en Charles River Laboratories (Sulzfeld, Alemania). Internamente, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta estándar para ratas (Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). Se suministró agua del grifo ad libitum. La cría de animales y los procedimientos del estudio cumplían la ley alemana de bienestar animal y la normativa de la Unión Europea.

El tamaño del grupo fue de n=12, dividido en 3 o 4 cohortes. Así, se utilizaron n=3-4 animales por punto de tiempo.

Cerdos

Se eligió a los cerdos, ya que representan un buen modelo para la biodisponibilidad subcutánea con respecto a su predictividad para los hombres.

Los cerdos machos en un intervalo de peso de 23-27 kg fueron criados en Schlosser (Schwalmtal, Alemania). Internamente, los animales se mantuvieron en un establo sobre paja a 18-21 °C. Los animales fueron alimentados con grano triturado. Se suministró agua del grifo ad libitum. La cría de animales y los procedimientos del estudio cumplían la ley alemana de bienestar animal y la normativa de la Unión Europea.

El tamaño del grupo fue de 2 (intravenoso) o 3 (subcutáneo).

Ejemplo 1.1: Investigación de rD'D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla administrados ambos por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Detalles del experimento

Los artículos de prueba se administraron por vía s.c. en el cuello o por vía i.v. en la vena lateral de la cola mediante una única inyección, a un volumen total de 5 ml/kg. Los niveles de dosis y las vías de administración se indican en la Tabla 2

Tabla 2: Grupos de tratamiento

rD'D3-FP o rDD3-His rVlli-C a d e n a S e n c illa Ruta y duración Relación

[mg albiimina/kg] |IU FVIII:C/kg] de la observación rD'D3-FP:rFVIII - 400 se (72h) -10 400 se (72h) 745 3 400 se (96h) 223 3 200 se (96h) 447 3 100 se (96 h) 894 3 100 ¡v (96h) 894

3 50 se (96 h) 1787

3 se (96h) -3 - iv (96h) -1 400 se (96h) 74 1 100 se (96 h) 298

1 100 iv (96 h) 298

1 50 se (96h) 596

0,3 200 se (96h) 45 3 (rDD3-His) 200 se (96h) 447 3 (rD'D3-His) 200 iv (96h) 447

La rD'D3-FP se aplicó en un intervalo de dosis de 0,3 a 10 mg/kg basado en valores de albúmina humana, las dosis de rVIIl-Cadena Sencilla variaron de 50 a 400 IU/kg de actividad cromogénica de FVIII. La rVIII-Cadena Sencilla se reconstituyó con agua para inyección, y la rD'D3-FP así como la rD'D3-His se descongelaron en un baño de agua. Para la coadministración, los compuestos se incubaron juntos durante aproximadamente 30 minutos a 37 °C. En todos los casos, se administró un volumen de dosis de 5 ml/kg, utilizándose un tampón de dilución para el FVIII para la disolución de los compuestos si era necesario.

Las muestras de sangre se tomaron por vía retrobulbar bajo anestesia de corta duración utilizando un esquema de muestreo alterno. Los puntos de tiempo en los grupos s.c. fueron 3, 8, 16, 24, 48, 72 y 96 h p.a. (excepto para el grupo de 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla y el grupo de 10 mg/kg de rD'D3-FP 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla ), y en los grupos i.v. 5 min, 3, 8, 24, 48, 72 y 96 h p.a. El perfil PK se tomó de 3 o 4 cohortes de ratones por grupo, y n=3-4 animales por punto de tiempo. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII, el antígeno del FVIII, la albúmina y/o el rD'D3-His.

La exposición al rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina del constructo utilizando un ELISA de albúmina humana. Además, se midió la actividad cromogénica del FVIII y, en grupos seleccionados, el antígeno del FVIII.

Bioestadística

La estimación de la concentración máxima (Cmáx), el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf), el tiempo medio de permanencia (MRT), el aclaramiento (CL) y la semivida terminal (t-io) se realizó mediante modelización bicompartimental en los cálculos i.v., y mediante modelización bicompartimental-resorción en los cálculos s.c. Para la estimación de los parámetros, se aplicó una función de costes por mínimos cuadrados ponderados. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje del AUCü.inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v. El tiempo hasta el 1, 5 y 10 % de los niveles mínimos se calculó estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0,05 o 0,1 IU/ml y resolviendo el tiempo.

Resultados

Evaluación de los datos de D'D3

Ambos constructos de D'D3 (rD'D3-FP y rD'D3-His, con y sin fusión de albúmina, respectivamente) fueron absorbidos tras la administración s.c. La rD'D3-FP pudo ser cuantificada durante todo el periodo de observación de 96 h, incluso a la dosis más baja de 0,3 mg/kg; es decir, se mantuvo por encima del límite de detección de 23,4 ng/ml (Fig. 1). Sin embargo, la rD'D3-FP pudo detectarse en niveles significativamente más altos en comparación con la rD'D3-His, en particular en los puntos temporales más tardíos.

Es necesario mencionar que algunas de las curvas mostraron una gran similitud en los dos últimos puntos de medición, lo que llevó a un "aplanamiento" de la curva de concentración plasmática en la fase terminal. De este modo, la estimación del aclaramiento, el MRT, el t-i/2 y el AUCü.inf se estimó extremadamente larga al incluir el último punto. Se realizó un segundo cálculo sin el último punto de tiempo para evitar una sobreestimación de la biodisponibilidad; en la tabla 3 se comparan los datos y se observa una buena concordancia de los datos sin el último punto de tiempo con los demás datos. Por lo tanto, en las tablas y gráficos (excepto en la Fig. 1), se utilizó el segundo conjunto de datos sin el punto de datos de 96 h, lo que puede subestimar la biodisponibilidad de la rD'D3-FP.

La Cmáx y el AUC0-inf mostraron dependencia de la dosis en el intervalo probado de 0,3-10 mg/kg de rD'D3-FP y 0-400 lU/kg de rVIII-Cadena Sencilla, independientemente del rFVIII añadido (Tabla 3, Fig. 2). En relación con la menor exposición, tanto la Cmáx como el AUC0-¡nf de rD'D3-His fueron significativamente menores que los de dosis comparables de rD'D3-FP. En detalle, para la administración s.c., la Cmáx fue >3 veces y el AUC înf fue >16 veces menor.

El aclaramiento, el MRT y el t-i/2 no mostraron una dependencia de la dosis para el rD'D3-FP. La alta variabilidad en las estimaciones del c.s. es propensa a las dificultades para ajustar las curvas correctas para las curvas planas de exposición en el tiempo. Los valores de aclaramiento se situaron en el intervalo de 1,2-2,1 ml/kg/h tras la administración s.c., y ligeramente más bajos (0,8-0,9 ml/kg/h) tras la administración i.v. En consonancia con esto, el intervalo de MRT (t-io) fue de 41-117 h (15-90 h) para la administración s.c. y de 55-83 h (39-69 h) para la administración i.v. Por el contrario, la eliminación de rD'D3-His fue mucho más rápida, es decir, el aclaramiento fue de 34,8 ml/kg/h tras la administración s.c. y de 11,8 ml/kg/h tras la administración i.v. (diferencia >13 veces), el MRT fue de 11 h tras la administración s.c. y de 5 h tras la i.v. (diferencia >3 veces) y el t-i/2 fue de 7 h tras la administración s.c. y de 6 h tras la i.v. (diferencia >2 veces).

Es importante destacar que la biodisponibilidad de la rD'D3-FP tras la administración subcutánea oscila entre el 40 y el 79 %, de nuevo con una variabilidad bastante alta de los diferentes grupos dentro del experimento (Tabla 4, Fig. 3). Sin embargo, esta biodisponibilidad es independiente de la dosis de rVIII-Cadena Sencilla o de rD'D3-FP utilizada en este experimento. rD'D3-His mostró una biodisponibilidad inferior del 34 %

Tabla 3: Parámetros farmacocinéticos de rD’D3-FP o rD’D3-His después de administración s.c. o i.v. de rD'D3-FP o rD'D3-His y Rviii-Cadena Sencilla en ratones con eliminación de FVIII

100 ILI/kg rVlll-Cadena Sencilla

0.3 mg/kg rD ’D3-FP & 2.6 1.4 77 52 215 200 lü /kg rVlll-Cadena Sencilla

s.c.

3 m g/kg rD ’D3-Hís &

7.2

34.8 86

• • • 200 HJ/kg rV1H-Cadena Sencilla p

: v "• . ^{. /} - ^..

3 mg/kg rD ’D3-FP i.v. 90.0 0.9 48 34 3286 3 mg/kg rD ’D3-FP & 71.0 0.8 83 69 3702 100 lU/kg rVlll-Cadena Sencilla i.v.

1 mg/kg rD ’D3-FP & 27.1 0.9 55 39 1064 100 lU/kg rVlll-Cadena Sencilla i.v.

3 mg/kg rD’D3-His & 816 11.7

257 200 lU/kg rVIII-Cadena sencilla i.v.

* La alta similitud en los dos últimos puntos de medición conduce a un "aplanamiento" artificial de la curva de concentración plasmática en la fase terminal, por lo que la estimación del aclaramiento, MRT, t-i^/2 y AUCo-¡nf se estimó extremadamente larga cuando se incluye el último punto. Por lo tanto, se realizó un cálculo adicional sin el último punto de tiempo para evitar una sobreestimación de la biodisponlbllldad.

Tabla 4: Biodisponibilidad de rD’D3-FP o rD'D3-H¡s después de administración s.c. en

ratones con desactivación de FVIII calculada contra tratamientos de referencia i.v.

Tratamiento s.c. Biodisponibilidad [%] con tratamientos de referencia i.v.*

3 mg/kg rD'D3- 1 mg/kg rD’D3- 3 mg/kg rD’D3- 3 mg/kg rD'D3-FP & FP& FP i.v His &

100 lU/kg rVIII- 100 lU/kg rVIII- 200 lU/kg rVIII-Cadena sencilla Cadena sencilla Cadena sencilla

i.v i.v. i.v.

3 mg/kg rD’D3-FP s.c. 43 50 48 n.a.

10 mg/kg rD’D3-FP &

400 lu/kg rVIII-Cadena sencilla 67 77 75 n.a.

s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

400 lu/kg rvm-Cadena sencilla 40 47 45 n.a.

s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

200 lu/kg rvm-Cadena sencilla 38* 44* 43* n.a.

s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

100 lu/kg rVIII-Cadena sencilla 47 54 53 n.a.

s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

50 lu/kg rvm-Cadena sencilla 54 * 62* 61 * n.a.

S.C,

1 mg/kg rD’D3-FP &

400 lu/kg rvm-Cadena sencilla 68 79 77 n.a.

s.c.

1 mg/kg rD’D3-FP &

100 lu/kg rVIII-Cadena sencilla 58 68 66 n.a.

s.c.

1 mg/kg rD’D3-FP &

50 lu/kg rvm-Cadena sencilla 50* 58 * 56* n.a.

s.c.

0.3 mg/kg rD'D3-FP &

200 lu/kg rvm-Cadena sencilla 58 67 65 n.a.

s.c.

3 mg/kg rD’D3-His &

200 lu/kg rvm-Cadena sencilla n.a. n.a. na 34

s.c.

n.a. = no aplicable; * =menor confianza en la estimación del AUC de datos de s.c. (ver arriba)

5 el grupo de referencia con el mismo tratamiento se da en negrita

Evaluación de los datos del FVIII

El rVIII-Cadena Sencilla administrado sin ningún polipéptido de la invención, es decir, sin ningún constructo D'D3-FP, no se absorbió de forma relevante cuando se administró s.c., al menos no se pudo medir ninguna actividad del FVIII por encima del límite de detección. Sin embargo, sorprendentemente, el FVIII se absorbió cuando se coadministró s.c. con cualquiera de los dos constructos D'D3 (rD'D3-FP y rD'D3-His, con y sin fusión de albúmina, respectivamente); y la actividad del FVIII soportó el proceso de absorción (Fig. 3).

Es necesario mencionar que también para la actividad del FVIII una curva mostró una alta similitud en los dos últimos puntos de medición, lo que llevó a un "aplanamiento" de la curva de concentración plasmática en la fase terminal. De este modo, la estimación del aclaramiento, el MRT, el t-i/2 y el AUCü-inf se estimó extremadamente larga al incluir el último punto. Se realizó un segundo cálculo sin el último punto de tiempo para evitar una sobreestimación de la biodisponibilidad; en la Tabla 5 se ofrece una comparación de los datos. Por lo tanto, en las tablas y gráficos (excepto en la Fig. 4), se utilizó el segundo conjunto de datos sin el último punto de datos, lo que puede subestimar la biodisponibilidad de rD'D3-His.

Dependiendo de la dosis de FVIII, la actividad del FVIII se cuantificó durante al menos 32 h (1 mg/kg de rD'D3-FP y 50 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla) y hasta el último punto de tiempo de 96 h (por ejemplo, cualquier dosis con 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla y 1-10 mg/kg de rD'D3-FP); es decir, se mantuvo por encima del límite de detección de 3 o 10 mIU/ml (Fig. 4). Como ejemplo, la Fig. 4 representa la exposición plasmática del FVIII tras la administración s.c. o i.v. de 1 o 3 mg/kg de rD'D3-FP con 100 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla en comparación con 3 mg/kg de rD'D3-His con 200 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla (la dosis más alta se administró para poder monitorizar la exposición). Cuando no se administró el constructo D'D3, el rVIII-Cadena Sencilla se mantuvo por debajo del límite de detección, incluso a una dosis s.c. de 400 IU/kg (datos no mostrados).

La Cmáx y el AUCü-inf mostraron dependencia de la dosis en el intervalo probado de 0,3-10 mg/kg de rD'D3-FP y 0-400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla, independientemente de la rD'D3-FP coadministrada, mientras que la exposición fue mucho menor cuando se administró rD'D3-His (Tabla 5, Fig. 5).

Cuando el rD'D3-FP y el rVIII-Cadena Sencilla fueron administrados en una relación molar >50, la CL para el rVIII-Cadena Sencilla varió de 7,5-23,7 ml/kg/h, y fue por lo tanto más baja que la de 0,3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla s.c. (ratio 45) o la coadministración de rD'D3-His. En línea con esto, el MRT y el t-i/2 para el rVIII-Cadena Sencilla fueron más altos para el rD'D3-FP y el rVIII-Cadena Sencilla administrados en una relación >50 en comparación con el rD'D3-His, excepto para la dosis muy baja de rVIII-Cadena Sencilla de 50 IU/kg (intervalo MRT: 24-37 h, intervalo t-i^: 8-20 h). A modo de comparación, el rVIII-Cadena Sencilla administrado i.v. sin rD'D3-FP demostró tener una CL de ~2-3 ml/kg/h, un MRT de 18h y un t-i/2 de 15h en ratones con desactivación de FVIII, y una CL de ~2-3 ml/kg/h, un MRT de ~20h y un t-i/2 de ~14h en el hombre (datos no presentados aquí). Así, los parámetros farmacocinéticos tras la administración s.c. fueron variables, pero aproximadamente comparables a los de la administración i.v.

En conjunto, la biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla osciló entre el 11-25 %, cuando se administró a una dosis >3 mg/kg de rD'D3-FP, entre el 6-14 % cuando se administró a una dosis de 1 mg/kg de rD'D3-FP y <4 % a una dosis de 0,3 mg/kg de rD'D3-FP (Tabla 6, Fig. 6). Esta biodisponibilidad depende de la dosis de rVIII-Cadena Sencilla en el sentido de que se observó una saturación potencial a la dosis más alta probada de 400 IU/kg, que puede estar relacionada con el área de absorción disponible. Además, la dosis de rD'D3-FP limitó la disponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla, es decir, cuanto mayor era la dosis de rD'D3-FP, mejor era la disponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla. Esto puede transformarse en ratios relevantes de rD'D3-FP sobre rVIII-Cadena Sencilla probados de al menos 447 (>3 mg/kg de rD'D3-FP; excluyendo la dosis de 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla con saturación), ratios aceptables en el intervalo probado de 74-596 (1 mg/kg de rD'D3-FP) y un ratio probado desfavorable de 45 (0,3 mg/kg de rD'D3-FP). Así, se concluyó que las proporciones <50 han mostrado una biodisponibilidad desfavorable del FVIII, mientras que las superiores a 50 son favorables.

La biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla fue desproporcionadamente menor cuando se coadministró con el rD'D3-His, es decir, el 1 % a una dosis de 3 mg/kg de rD'D3-His y 200 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla, lo que sugiere una ventaja de la fusión con albúmina del rD'D3 para la biodisponibilidad del rVIIII-Cadena Sencilla.

Además, se calculó el tiempo hasta el nivel mínimo para las administraciones s.c. e i.v. (Tabla 7). En cuanto a la biodisponibilidad, las dosis más altas de rD'D3-FP y/o FVIII mostraron niveles mínimos favorables, y dentro de una dosis constante de FVIII o rD'D3-FP, un aumento de la relación rD'D3-FP:rVIII-Cadena Sencilla dio lugar a niveles mínimos más favorables.

Tabla 5: Parámetros farmacocinéticos de actividad cromogénica de FVIII después de administración s.c. o i.v. de rD’D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla en ratones con desactivación de FVIII

T ra ta m ie n to C m áxi A c la ra m ie n to MRT S em iv id a , AUCo-.m extra p. terminal

200 IU/kg rVIII-Cadena Sencilla 81 139.7 7 6 716 s.c.

3 mg/kg rD!D3-FP & 2958 1.3 25 18 74850 100 IU/kg rVIII-Cadena Sencilla i.v.

1 mg/kg rD ’D3-FP ^& 2323 1.8 23 16 54050 100 IU/kg rVIII-Cadena Sencilla i.v.

3 mg/kg rD ’D3-His & 5974 3.8 13 52824 200 IU/kg rVIII-Cadena Sencilla i.v.

* La gran similitud de los dos últimos puntos de medición conduce a un "aplanamiento" artificial de la curva de concentración plasmática en la fase terminal; por lo tanto, la estimación del aclaramiento, el MRT, la t i /2 y el AUC0-M se estimó extremadamente larga al incluir el último punto. Por lo tanto, se realizó un cálculo adicional sin el último punto de tiempo para evitar una sobreestimación de la biodisponibilidad

T a b la 6 : B io d is p o n ib ilid a d d e rV III-C a d e n a S e n c illa (a c tiv id a d c ro m o g é n ic a d e F V III) d e s p u é s de a d m in is tra c ió n s .c . en ra to n e s c o n d e s a c tiv c ió n d e FV III c a lc u la d a c o n tra tra ta m ie n to s d e re fe re n c ia i.v.

Tratamiento s.c. Biodisponibilidad [%] con tratamientos de referencia i.v.s

3 mg/kg rD’D3-FP 1 mg/kg rD'D3-FP 3 mg/kg rD’D3-His & 100 lU/kg rVMI- & 100 lU/kg rVIII- & 200 lU/kg rVIII-C a d e n a S e n c illa i.v . C a d e n a S e n c illa i.v . C a d e n a S e n c illa i.v .

10 mg/kg rD’D3-FP &

11 15 n.a.

400 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

11 15 n.a.

400 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg rD’D3 FP ^&

18 25 n.a.

200 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP &

17 23 n.a.

100 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg rD’D3-FP ^&

15 21 n.a.

50 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

1 mg/kg rD’D3-FP &

10 14 n.a.

400 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

1 mg/kg rD’D3-FP &

6 S n.a.

100 lU/kg rVIII- Cadena Sencilla s.c.

1 mg/kg rD’D3-FP &

6 8 n.a.

50 lU/kg rVIII- Cadena Sencilla s.c.

0.3 mg/kg rD'D3-FP &

3 4 n.a.

200 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg rD’D3-His &

n.a. n .a . 1 * 200 lU/kg rVIII-Cadena Sencilla s.c.

n a. = no aplicable; * = menor confianza en la estimación del AÜC de datos de s.c. (ver arriba) § el grupo de referencia con el mismo tratamiento se da en negrita

Tabla 7: Tiempo hasta niveles mínimos de rVIII-Cadena Sencilla (actividad cromogénica de FVIII) después de administración s.c. en ratones con desactivación de FVIII

T ra ta m ie n to Tiempo hasta

1% de niveles 5% de niveles 10% de niveles mínimos mínimos mínimos

thj [h] ¡h]

10 m g /kg rD ’D 3-FP &

133 97 80

400 lU /kg rV III-C ad en a sen c illa s.c.

3 m g /kg rD ’D 3-FP &

145 99 78

400 lU /kg rV III-C ad en a sen c illa s.c.

3 m g /kg rD ’D 3-FP &

111 82 68

200 lU /kg rV III-C ad en a sencilla s.c.

3 m g /kg rD ’D 3-FP &

76 55 45

100 lU /kg rV III-C a d e n a sencilla s.c.

3 m g /kg rD ’D 3-FP &

62 43 33

50 lU /kg rV III-C a d e n a sencilla s.c.

1 m g /kg rD ’D 3-FP &

90 69 59

400 lU /kg rV III-C ad en a sencilla s.c.

1 m g /kg rD ’D 3-FP &

69 34 18

100 m /k g rv m -C a d e n a sencilla s.c.

1 m g /kg rD ’D 3-FP &

38 22 6

50 lU /kg rV III-C ad en a sencilla s.c.

0.3 m g /kg rD ’D 3-FP &

50 29 20

200 lU /kg rV III-C ad en a sencilla s.c.

200 lU /kg rV III-C a d e n a sencilla s.c. ..

3 m g /kg rD D 3 -F P &

127 87 69

100 lU /kg rV III-C ad en a sen c illa i.v.

1 m g /kg rD D 3 -F P &

109 73 57

100 lU /kg rV III-C a d e n a sencilla i.v.

3 m g /kg rD D 3 -H is &

78 57 48

200 lU /kg rV III-C a d e n a sencilla i.v.

Ejemplo 1.2: Biodisponibilidad subcutánea del FVIII recombinante, rVIII-Cadena Sencilla, en presencia de rD'D3-FP en cerdos

Detalles del experimento

Los artículos de prueba se administraron por vía s.c. en los flancos o por vía i.v. en la vena de la oreja mediante una única inyección, a un volumen total que oscilaba entre 0,211 y 0,751 ml/kg. Los niveles de dosis y las vías de administración se indican en la Tabla 8.

Tabla 8: Grupos de tratamiento

rD'D3-FP [mg de rVIII-Cadena Sencilla [IU Ruta y duración de la Relación rD'D3-albúmina/kg] FVIII:C/kg] observación FP:rFVIII 10 400 sc (168h) 745

10 400 iv (168h) 745

3 200 sc (264h) 447

3 100 sc (264h) 894

3 - sc (264h) -

La rD'D3-FP se aplicó en un intervalo de dosis de 3 a 10 mg/kg basado en los valores de albúmina humana, las dosis de rVIII-Cadena Sencilla variaron de 100 a 400 IU/kg de actividad de FVIII cromogénico. El rVIII-Cadena Sencilla se reconstituyó con agua para inyección, y el rD'D3-FP se descongeló en un baño de agua.

Se tomaron muestras de sangre de la oreja o de la vena safena. Los puntos de tiempo en los grupos de 10 mg/kg de rD'D3-FP s.c. fueron predosis, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h p.a. , y en el grupo i.v. predosis 5 min, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h p.a. Los puntos de tiempo en los grupos de 3 mg/kg de rD'D3-FP s.c. fueron predosis, 1, 3, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 y 264 h p.a.

El perfil PK se tomó de animales individuales. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación del antígeno FVIII y la albúmina.

La exposición a la rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína utilizando un ELISA de albúmina humana. Los niveles plasmáticos de FVIII:Ag humano se determinaron con el ELISA FVIII Asserachrom.

Bioestadística

La estimación de la concentración máxima (Cmáx), el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf), el tiempo medio de permanencia (MRT), el aclaramiento (CL) y la semivida terminal (t-io) se realizó mediante modelización bicompartimental en los cálculos i.v., y mediante modelización bicompartimental-resorción en los cálculos s.c. Para la estimación de los parámetros, se aplicó una función de costes por mínimos cuadrados ponderados. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje del AUCü-inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v. El tiempo hasta el 1, 5 y 10 % de los niveles mínimos se calculó estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0,05 o 0,1 IU/ml y resolviendo el tiempo.

Resultados

Evaluación de los datos de D'D3

La rD'D3-FP se absorbió tras la administración s.c. y se cuantificó durante todo el periodo de observación de hasta 168 h a 3 y 10 mg/kg; es decir, se mantuvo por encima del límite de detección de 23,4 ng/ml (Fig. 7).

La Cmáx y el AUC0-¡nf mostraron dependencia de la dosis en el intervalo probado de 3-10 mg/kg de rD'D3-FP (Tabla 9). La Cmáx fue independiente del rFVIII añadido en el intervalo de 0-400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla, mientras que la AUC0-inf del rD'D3-FP aumentó con la dosis del rVIII-Cadena Sencilla añadido. El aclaramiento, el MRT y el t-i/2 mostraron un perfil PK más largo para la rD'D3-FP en los animales tratados con 200 o 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla en comparación con 100 IU/kg o con el rVIII-Cadena Sencilla administrado solo (Tabla 9), es decir, la rD'D3-FP cargada con FVIII permaneció más tiempo en el sistema que sin cantidades relevantes de FVIII.

En consonancia con esto, la biodisponibilidad del rD'D3-FP tras la administración subcutánea oscila entre el 59 y el 187 % (Tabla 10), alcanzándose valores más altos con las dosis más altas de FVIII coadministradas. En conclusión, el rVIII-Cadena Sencilla favoreció la absorción subcutánea del rD'D3-FP.

Tabla 9: Parámetros farmacocinéticos de rD'D3-FP tras la administración s.c. o i.v. de rD'D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla en cerdos

Tratamiento Cmáx, Aclaramiento MRT Semivida,

AUC0-inf _{extrap. terminal}

Albúmina

[pg/ml] _[ml/kg/h] [h] [h] [|jg*h/ml] 3 mg/kg rD'D3-FP s.c. 17,6 0,5 271 154 5968 (continuación)

Tratamiento Cmáx, Aclaramiento MRT Semivida,

AUC0-inf _{extrap. terminal}

Albúmina

[pg/ml] _[ml/kg/h] [h] [h] [pg*h/ml] 10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII-_{Cadena Sencilla s.c.} 61,7 0,16 979 671 62813 3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de rVIII-_{Cadena Sencilla s.c.} 17,4 0,18 939 644 16861

^{3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de rVIII-} 18,2 0,43 ³¹⁸ 7013 _{Cadena Sencilla s.c. 191}

Tabla 10: Biodisponibilidad de la rD'D3-FP tras su administración s.c. en cerdos calculada frente a los tratamientos de referencia i.v

Tratamiento S.c Biodisponibilidad [%] respecto al tratamiento de referencia i.v: 10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla i.v. § 3 mg/kg rD'D3-FP s.c. 59

10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c. ¹⁸⁷

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c. ¹⁶⁷

3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c. ⁷⁰

§ El grupo de referencia con el mismo tratamiento aparece en negrita

Evaluación de los datos del FVIII

El FVIII se absorbió sorprendentemente cuando se coadministró s.c. con rD'D3-FP y la actividad del FVIII soportó el proceso de absorción (Fig. 8). Dependiendo de la dosis de FVIII, la actividad del FVIII se cuantificó durante al menos 48 h (3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla) y hasta 168 h (por ejemplo, cualquier dosis con 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla y 3 o 10 mg/kg de rD'D3-FP); es decir, se mantuvo por encima del límite de detección de 117 mIU/ml.

La Cmáx y el AUCü-inf mostraron dependencia de la dosis en el intervalo probado de 100-400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla. Los valores fueron previsiblemente mayores tras la administración i.v. de los fármacos (Tabla 10). El aclaramiento de la actividad del FVIII fue mayor (2,9-4,1 ml/kg/h) después de la vía s.c. que después de la vía i.v. (1,2 ml/kg/h). No obstante, el MRT y el t-i/2 fueron comparables tras la administración s.c. e i.v. (82 y 85h frente a 77h y 52 y 59 h frente a 54 h, respectivamente) con dosis más altas de rVIII-Cadena Sencilla de 200 o 400 IU/kg. A la dosis más baja de 100 IU/kg, el MRT y el t-i/2 fueron incluso más largos para el rVIII-Cadena Sencilla (130 y 83 h, respectivamente). Así, los parámetros farmacocinéticos tras la administración s.c. fueron aproximadamente comparables a los de la administración i.v. con dosis más altas de rVIII-Cadena Sencilla, y superiores a una dosis de 100 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla.

La biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla osciló entre el 29-40 %, aumentando con la dosis de rVIII-Cadena Sencilla y/o rD'D3-FP (Tabla 12).

Además, se calculó el tiempo hasta el nivel mínimo para las administraciones s.c. e i.v. (Tabla 13). El tiempo hasta el 1 % de los niveles mínimos fue comparable para todas las dosis s.c., mientras que el tiempo hasta el 5 % o 10 % de los niveles mínimos fue comparable para 200 y 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla 3 o 10 mg/kg de rD'D3-FP, y superior para 100 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla 3 mg/kg de rD'D3-FP.

Tabla 11: Parámetros farmacocinéticos de la actividad del FVIII tras la administración s.c. o i.v. de rD'D3-FP y rVIII-Cadena Sencilla en cerdos

Tratamiento Cmáx, Aclaramiento MRT Semivida, AUC0-inf extrap. terminal

[IU/ml] FVIII:actividad [h] [h] [IU*h/ml]

[ml/kg/h]

10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII- 7,0 1,2 77 54 339 Cadena Sencilla i.v.

10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII- 1,1 4,1 85 59 97 Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de rVIII- 0,7 2,9 82 52 68 Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de rVIII- 0,2 3,1 130 83 31 Cadena Sencilla s.c.

Tabla 12: Biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla (actividad del FVIII) tras la administración s.c. en cerdos calculada frente a los tratamientos de referencia i.v

Tratamiento s.c Biodisponibilidad [%] respecto al tratamiento de referencia i.v: 10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla i.v.§

10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de

rVIII-Cadena Sencilla s.c.

§ El grupo de referencia con el mismo tratamiento aparece en negrita

Tabla 13: Tiempo hasta los niveles mínimos del rVIII-Cadena Sencilla (antígeno del FVIII) tras la administración s.c.

en cerdos

Tratamiento Tiempo hasta

1 % de niveles 5 % de niveles 10 % de niveles mínimos [h] mínimos [h] mínimos [h] 10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla i.v. ^{319 195 141} 10 mg/kg de rD'D3-FP y 400 IU/kg de rVIII-Cadena Sencilla s.c. ^{383 255 196}

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de rVIII-Cadena

Sencilla s.c. ^{349 249 198}

3 mg/kg de rD'D3-FP y 100 IU/kg de rVIII-Cadena

Sencilla s.c. ^{388 349 303}

Ejemplo 1.3: Investigación del efecto del rD'D3-FP sobre diferentes productos de FVIII, cada uno de ellos administrado por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A de ratón, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Detalles del experimento

Los artículos de prueba se administraron por vía s.c. en el cuello o por vía i.v. en la vena lateral de la cola mediante una única inyección, a un volumen total de 5 ml/kg. Los niveles de dosis y las vías de administración se indican en la Tabla 14.

Tabla 14: Grupos de tratamiento

rDD3-FP [mg de albúmina/kg] FVIII [IU FVIII:C/kg] Ruta Relación rD'D3-FP:rFVIII

3 200 Beriate® sc 322

3 200 Beriate® iv 322

- 200 Beriate® sc -3 200 Advate® sc 442

3 200 Advate® iv 442

- 200 Advate® sc -3 200 ReFacto AF® sc 410

3 200 ReFacto AF® iv 410

- 200 ReFacto AF® sc -

El rD'D3-FP se aplicó en una dosis de 3 mg/kg basada en los valores de albúmina humana, y los productos de FVIII en una dosis de 200 IU/kg de actividad cromogénica de FVIII (nominal: Advate® y ReFacto AF®, certificado de análisis: Beriate®). Advate® y ReFacto® AF se reconstituyeron según el prospecto. Beriate® se reconstituyó con agua para inyección utilizando una pipeta. rD'D3-FP se descongeló en un baño de agua y se mezcló con el respectivo producto FVIII. En todos los casos, se administró un volumen de dosis de 5 ml/kg, se utilizó tampón de dilución para el FVIII para todos los productos.

Se debe mencionar que la relación de rD'D3-FP:rFVIII estaba en un intervalo comparativamente alto de 322 a 442 para los cuatro productos diferentes, basado en sus diferentes pesos moleculares y actividades específicas.

Las muestras de sangre se tomaron por vía retrobulbar bajo anestesia de corta duración utilizando un esquema de muestreo alterno. Los puntos de tiempo en los grupos s.c. fueron 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72 y 96 h p.a., y en los grupos i.v. 5 min, 3, 8, 16, 24, 48, 72 y 96 h p.a. El perfil PK se tomó de cuatro cohortes de ratones por grupo, y n=3 por punto de tiempo. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad cromogénica del FVIII y la albúmina.

La exposición al rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina del constructo utilizando un ELISA de albúmina humana. Además, se midió la actividad cromogénica del FVIII.

Bioestadística

La estimación de la concentración máxima (Cmáx), el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf), el tiempo medio de permanencia (MRT), el aclaramiento (CL) y la semivida terminal (t-io) se realizó mediante modelización bicompartimental en los cálculos i.v., y mediante modelización bicompartimental-resorción en los cálculos s.c. Para la estimación de los parámetros, se aplicó una función de costes por mínimos cuadrados ponderados. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje del AUCü-inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v. El tiempo hasta el 1, 5 y 10 % de los niveles mínimos se calculó estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0,05 o 0,1 IU/ml y resolviendo el tiempo.

Resultados

Evaluación de los datos de D'D3

Independientemente del producto FVIII coadministrado, la rD'D3-FP fue absorbida después de la administración s.c. La rD'D3-FP pudo ser cuantificada durante todo el período de observación de 96 h y se mantuvo por encima del límite de detección de 23,4 ng/ml (Fig. 9).

No hubo diferencias visibles en los perfiles PK de rD'D3-FP después de la administración i.v. o s.c., respectivamente, en dependencia del FVIII coadministrado. En línea con esto, la estimación del aclaramiento, MRT, t-i/2 y AUC0-inf muestra una buena concordancia de los datos para todos los tratamientos s.c. o i.v., respectivamente (Tabla 15). En detalle, el aclaramiento estuvo en el intervalo de 0,9 a 1,1 ml/kg/h para i.v. y fue ligeramente mayor tras la administración s.c. (1,0 a 1,5 ml/kg/h). En consonancia con esto, el MRT y elt-i/2 oscilaron entre 40-56 h y 31-40 h para el tratamiento i.v. y entre 61-117 h y 35-89 h para el tratamiento s.c. respectivamente; es decir, el aclaramiento fue menor para el tratamiento i.v. pero el MRT y el t-i/2 fueron, sin embargo, más cortos para el tratamiento i.v.

Es importante destacar que la biodisponibilidad del rD'D3-FP tras la administración subcutánea oscila entre el 56 y el 87 % (Tabla 16), y no difiere de forma relevante entre los diferentes productos de FVIII coadministrados. Es muy comparable a la del rVIII-Cadena Sencilla (Tabla 4, intervalo 40-79 %).

T a b la 15: P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s de rD 'D 3 -F P tra s la ad m in is tra c ió n s.c. o i.v. de rD 'D 3 -F P y d ife ren te s p ro d u c to s de FV IIII en ra ton es con d e sa c tiva c ió n de FVIII

^{Tratamiento Semivida,} Cmáx, extrap. Aclaramiento MRT AUCü-inf_terminal Albúmina

[pg/ml] _[ml/kg/h] [h] [h] [pg*h/ml]

^{U/kg de}

26,2 1,5 61 35 1940

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

Beriate® i.v. 74,3 1,1 40 31 2667 3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de 35,4 1,1 85 71 2624 Advate® s.c.

3 m /k de rD'D3-FP 200 IU/k de

Tabla 16: Biodisponibilidad de rD'D3-FPtras la administración s.c. en ratones con desactivación de FVIII calculada frente a tratamientos i.v. de referencia

Tratamiento s.c Biodisponibilidad [%] respecto a los tratamientos de referencia i.v.: rD'D3-FP con el respectivo producto FVIII i.v.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

Beriate® s.c. ⁵⁶

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

Advate® s.c. ⁸⁰

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

ReFacto® AF s.c. ⁸⁷

Evaluación de los datos del FVIII

Todos los productos de FVIII fueron absorbidos cuando se coadministraron s.c. con rD'D3-FP y la actividad del FVIII soportó el proceso de absorción (Fig. 10). En cambio, ninguno de los productos mostró una biodisponibilidad s.c. relevante cuando se administró solo.

Los datos de la estimación de la Cmáx, el AUCü.inf, el aclaramiento, el MRT y el t-i/2 se indican en la Tabla 17. Mientras que los diferentes productos de FVIII mostraron diferentes perfiles PK cuando se administraron solos, el aclaramiento siempre aumentó tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v., es decir, de 3,1 a 51,5 ml/kg/h para Beriate®, de 4,4 a 78,5 ml/kg/h para Advate® y de 1,7 a 16,2 ml/kg/h para ReFacto AF®. El MRT fue aproximadamente comparable entre la administración s.c. e i.v. (Beriate® y Advate®: intervalo 17-19 h; ReFacto AF®: intervalo 21-28 h), en línea con los resultados de la coadministración de rVIII-Cadena Sencilla (ver Tabla 11). Para estos otros productos de FVIII, el t1/2 tendió a ser más largo después de la administración i.v. en comparación con la administración s.c. (Beriate: 8 h s.c. a 13 h i.v.; Advate®: 12 h s.c. a 14 h i.v.; ReFacto AF®: 11 h s.c. a 15 h i.v.).

La biodisponibilidad subcutánea de los diferentes productos de FVIII coadministrados con rD'D3-FP osciló entre el 6 y el 11 %, lo que sugiere que no hay diferencias relevantes entre los productos de FVIII (Tabla 18). Esto es ligeramente menor en comparación con el 20 % observado al coadministrar rD'D3-FP con rVIII-Cadena Sencilla (ver Tabla 12); no obstante, todas las biodisponibilidades de los productos de FVIII estuvieron dentro de un intervalo aceptable. Esto indica que el rD'D3-FP desempeña un papel clave en la reabsorción del FVIII tras la administración subcutánea. Sin embargo, una combinación de un rD'D3-FP con rVIII-Cadena Sencilla puede mejorar aún más la biodisponibilidad del FVIII.

Además, se calculó el tiempo hasta el nivel mínimo para las administraciones s.c. e i.v. (Tabla 19). En cuanto a los niveles mínimos del 1 %, los datos fueron casi comparables tras la administración i.v. y s.c. (Beriate® 60 y 79 h, Advate® 66 y 68 h, ReFacto® AF 98 y 104 h). El tiempo hasta el nivel mínimo para los niveles de 5 % o 10 % fue superior tras la administración s.c. en comparación con la i.v: Beriate demostró la superioridad de la vía s.c. sobre la vía i.v. en un 4 % (5 % de nivel mínimo) y 17 % (10 % de nivel mínimo), Advate® en un 29 % (5 % de nivel mínimo) y 50 % (10 % de nivel mínimo) y ReFacto® AF en un 50 % (5 % de nivel mínimo) y 28 % (10 % de nivel mínimo), respectivamente.

a b la 17: P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s del a n tíg e n o FV III tra s la ad m in is tra c ió n s.c. o i.v. de rD 'D 3 -F P y d ife ren te s p ro d u c to s de FV IIII en ra ton es con d e sa c tiva c ió n de FVIII

Tratamiento Cmáx, Aclaramiento MRT Semivida,

_{extrap. terminal} AUC0-inf Antígeno FVIII

[lU/ml] [ml/kg/h] [h] [h] [IU*h/ml] 200 lU/kg Beriate® s.c. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Beriate®

_s.c. 0,17 51,5 18 8 4 3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Beriate® 5,31 _i.v. 3,1 19 13 66 200 IU/kg Advate® s.c. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Advate®

_s.c. 0,13 78,5 19 12 3 3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Advate®

_i.v. 6,37 4,4 17 14 45 200 IU/kg ReFacto® AF s.c. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de ReFacto®

_{AF s.c.} 0,32 16,2 28 11 12 ^{3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de ReFacto®} 5,46 1,7 21 15 116 _{AF i.v.}

n.a.: modelización no aplicable (datos por debajo del límite de detección)

Tabla 18: Biodisponibilidad de diferentes productos de FVIIII (antígeno del FVIII) tras la administración s.c. en ratones con desactivación de FVIII calculada frente a tratamientos de referencia i.v

Tratamiento S.c Biodisponibilidad [%] respecto a los tratamientos de referencia i.v.: rD'D3-FP con el respectivo producto FVIII i.v.

200 IU/kg Beriate® s.c. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

Beriate® s.c. ⁶

200 IU/kg Advate® s.c. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

Advate® s.c. ⁶

200 IU/kg ReFacto® AF s.c. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de

ReFacto® AF s.c. ¹¹

n.a.: no aplicable

Tabla 19: Tiempo hasta los niveles mínimos de diferentes productos del FVIIII (antígeno del FVIII) tras la administración s.c. o i.v. en ratones con desactivación de FVIII

Tratamiento Tiempo hasta

1 % de niveles 5 % de niveles 10 % de niveles mínimos [h] mínimos [h] mínimos [h] 200 IU/kg Beriate® s.c. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Beriate® s.c. 60 50 42

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Beriate® i.v. 79 48 35 200 IU/kg Advate® s.c. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Advate® s.c. 66 51 44 (continuación)

Tratamiento Tiempo hasta

1 % de niveles 5 % de niveles 10 % de niveles mínimos [h] mínimos [h] mínimos [h] 3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de Advate® i.v. 68 36 22

200 IU/kg ReFacto AF® s.c. n.a. n.a. n.a.

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de ReFacto® AF

_s.c. 104 80 68

3 mg/kg de rD'D3-FP y 200 IU/kg de ReFacto®AF

_i.v. 98 64 49 n.a.: modelización no aplicable (datos por debajo del límite de detección)

Ejemplo 1.4: Investigación del efecto de una variante de afinidad rD'D3-FP, una molécula rD'D3 con HELP sin albúmina y rVIII-Cadena Sencilla administrados ambos por vía subcutánea en un modelo de hemofilia A de ratón, es decir, en ratones con desactivación de FVIII.

Detalles del experimento

Los artículos de prueba se administraron por vía s.c. en el cuello o por vía i.v. en la vena lateral de la cola mediante una única inyección, a un volumen total de 5 ml/kg. Los niveles de dosis y las vías de administración se indican en la Tabla 20.

Tabla 20: Grupos de tratamiento

variante de rD'D3 [mg/kg] rVIII-Cadena Sencilla [IU FVIII:C/kg] Ruta Relación rD'D3-FP:rFVIII

3 rD'D3-FP EYA 200 sc 447

3 rD'D3-FP EYA 200 iv 447

4,29 rD'D3-CTP 200 sc 608

4,29 rD'D3-CTP 200 iv 608

La rD'D3-FP EYA se aplicó a una dosis de 3 mg/kg basada en los valores de albúmina humana, la rD'D3-CTP a una dosis de 4,29 mg/kg basada en el contenido de proteína (lo que lleva a ambas a una variante de rD'D3 elevada: dosis de rVIII-Cadena Sencilla, Tabla 20), y los productos de FVIII a una dosis de 200 IU/kg de actividad cromogénica de FVIII. el rVIII-Cadena Sencilla se reconstituyó con agua para inyección, y el rD'D3-FP EYA así como el rD'D3-CTP se descongelaron en un baño de agua. En todos los casos, se administró un volumen de dosis de 5 ml/kg, utilizando tampón de dilución para el FVIII para la dilución.

Las muestras de sangre se tomaron por vía retrobulbar bajo anestesia de corta duración utilizando un esquema de muestreo alterno. Los puntos de tiempo en los grupos s.c. fueron 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72 y 96 h p.a., y en los grupos i.v. 5 min, 3, 8, 16, 24, 48, 72 y 96 h p.a. El perfil PK se tomó de cuatro cohortes de ratones por grupo, y n=3 por punto de tiempo. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron para obtener plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII, la albúmina y/o el rD'D3-CTP.

La exposición a rD'D3-FP EYA se determinó mediante la medición de la parte de albúmina del constructo utilizando un ELISA de albúmina humana. rD'D3-CTP se midió mediante una técnica de ELISA utilizando anticuerpos contra D'D3 humana. Además, se midió la actividad cromogénica del FVIII.

Bioestadística

La estimación de la concentración máxima (Cmáx), el área bajo la curva de concentración en el tiempo desde t=0 hasta t=~ (AUCü-inf), el tiempo medio de permanencia (MRT), el aclaramiento (CL) y la semivida terminal (t-io) se realizó mediante modelización bicompartimental en los cálculos i.v., y mediante modelización bicompartimental-resorción en los cálculos s.c. Para la estimación de los parámetros, se aplicó una función de costes por mínimos cuadrados ponderados. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje del AUCü-inf tras la administración s.c. en comparación con la administración i.v. El tiempo hasta el 1, 5 y 10 % de los niveles mínimos se calculó estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0,05 o 0,1 IU/ml y resolviendo el tiempo.

Evaluación de los datos de D'D3

Tanto el rD'D3-FP EYA como el rD'D3-CTP fueron absorbidos después de la administración s.c., y ambos pudieron ser cuantificados durante todo el período de observación de 96 h, es decir, permaneciendo por encima del límite de detección de 23,4 ng/ml (Fig. 11).

La estimación del aclaramiento, MRT, t-i/2 y AUCü.inf se da en la Tabla 21, mostrando t-i/2 y MRT más largos para el rD'D3-FP EYA en comparación con el rD'D3-CTP después de la administración i.v. así como después de la administración s.c. (t-î : 30 h i.v. y 32 h s.c. para EYA más de 22 h para CTP; MRT: 42 h i.v. y 57 h s.c. para EYA más largas que 27 h i.v. y 40 h s.c. para CTP). Estos datos también muestran que la administración s.c. fue igual o superior a la administración i.v. para ambas variantes de rD'D3-FP. La Cmáx fue mayor para el rD'D3-CTP en comparación con el rD'D3-EYA, especialmente tras la administración i.v. El AUCo-inf fue ligeramente superior para el rD'D3-EYA en comparación con el rD'D3-CTP tras la administración s.c. (1094 y 825 |jg*h/ml), pero no hubo diferencias importantes tras la administración i.v. (1669 y 1783 jg*h/ml). Estos datos muestran que el AUC0-inf es mayor tras la administración i.v., sobre todo debido a los altos valores iniciales.

La biodisponibilidad del rD'D3-FP EYA después de la administración subcutánea fue del 66 %, y del rD'D3-CTP fue del 47 % (Tabla 22), y por lo tanto en el intervalo del rD'D3-FP en ratones con desactivación de FVIII (intervalo 40-79 %, Tabla 4).

Tabla 21: Parámetros farmacocinéticos de rD'D3-FP EYA y rD'D3-CTP tras la coadministración s.c. o i.v. de rD'D3-FP EYA y rD'D3-CTP con rVIII-Cadena Sencilla en ratones con desactivación de FVIII

^Tratamiento Cmáx, extrap. Aclaramiento MRT ^Semivida, AUC0-inf_terminal

[jg/m l] [ml/kg/h] [h] [h] [jg*h/ml] 3 mg/kg rD'D3-FP EYA s.c. 15,7 2,7 57 32 1094 3 mg/kg rD'D3-FP EYA i.v. 62,8 1,8 42 30 1669

4,29 mg/kg rD'D3-CTP s.c. 16,5 5,2 40 22 825 4,29 mg/kg rD'D3-CTP i.v. 144,1 2,4 27 22 1783

Tabla 22: Biodisponibilidad de las variantes de rD'D3 tras la administración s.c. en ratones con desactivación de FVIII calculada frente a tratamientos de referencia i.v

Tratamiento S.c Biodisponibilidad [%] respecto al tratamiento de referencia i.v.

respectivo con la variante rD'D3

3 mg/kg rD'D3-FP EYA s.c. 66

4,29 rD'D3-CTP s.c. 47

Evaluación de los datos del FVIII

El FVIII fue absorbido cuando fue coadministrado s.c. con rD'D3-FP EYA o rD'D3-CTP y la actividad del FVIII soportó el proceso de absorción (Fig. 12). La actividad del FVIII se cuantificó durante todo el período de observación de 96 horas.

La estimación del aclaramiento, MRT, t-i/2 y AUC0-inf se da en la Tabla 23, mostrando MRT y t-i/2 comparables para el rD'D3-FP EYA en comparación con el rD'D3-CTP después de la administración s.c. (MRT: 27 y 29 h, t-i/213 y 12 h) y un MRT y t-i/2 ligeramente superiores para el rD'D3-FP EYA tras su administración i.v. (MRT: 30 y 25 h, t-i/221 y 18 h). No se observaron diferencias en el AUC0-inf para las dos variantes por vía de administración (16 y 18 IU*h/ml para s.c. y 111 y 110 IU*h/ml para i.v.). La Cmáx fue menor para el rD'D3-Fp EYA en comparación con el rD'D3-CTP tras la administración i.v. y s.c. (0,46 frente a 0,51 IU/ml tras s.c. y 4,63 frente a 5,49 tras i.v.).

La biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla fue del 14 % para el rD'D3-FP EYA y del 16 % para el rD'D3-CTP (Tabla 24).

Adicionalmente, se calculó el tiempo hasta el nivel mínimo para la administración s.c., que mostró resultados comparables para el rD'D3-FP EYA y el rD'D3-CTP a niveles de valle del 1 % (105 y 104 h) y del 5 % (76 y 78 h), y una muy ligera ventaja para el rD'D3-FP EYA sobre el rD'D3-CTP a niveles de valle del 10 % (64 vs. 52 h) (Tabla 25). En conjunto, estos datos demuestran que la variante rD'D3 es responsable de la mejora de la farmacocinética del FVIII, y no principalmente el tipo de principio de extensión de la semivida unido a la variante rD'D3. Sin embargo, un polipéptido rD'D3, que no contiene ningún HELP, no es capaz de mejorar la farmacocinética del FVIII o, al menos, lo hace con una eficacia reducida (véanse las tablas 5 y 7).

T a b la 23: P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s del a n tíg e n o FV III tra s la ad m in is tra c ió n s.c. o i.v. de rD 'D 3 -F P E Y A o rD 'D 3 -C T P y rV III-C a d e n a S enc illa en ra ton es con d e sa c tiva c ió n de FVIII

Tratamiento Cmáx, Semivida,

Aclaramie o MRT _extrap. nt _terminal AUCü-inf Antígeno FVIII

[IU/ml] [ml/kg/h] [h] [h] [IU*h/ml] 3 mg/kg rD'D3-FP EYA s.c. 0,46 12,8 27 13 16 3 mg/kg rD'D3-FP EYA i.v. 4,63 1,8 30 21 111 4,29 mg/kg rD'D3-CTP s.c. 0,51 11,4 29 12 18 4,29 mg/kg rD'D3-CTP i.v. 5,49 1,8 25 18 110

Tabla 24: Biodisponibilidad del rVIII-Cadena Sencilla (antígeno del FVIII) tras la administración s.c. en ratones con desactivación de FVIII calculada frente a los tratamientos de referencia i.v Tratamiento S.c Biodisponibilidad [%] respecto al tratamiento de referencia i.v.

respectivo con la variante rD'D3 y 200 IU/kg rVIII-Cadena Sencilla 3 mg/kg rD'D3-FP EYA s.c. 14

4,29 mg/kg rD'D3-CTP s.c. 16

abla 25: Tiempo hasta los niveles mínimos del rVII I-Cadena Sencilla (antígeno del FVIII) tras la administración s.

en ratones con desactivación de FVIII

Tratamiento Tiempo hasta

1 % de niveles 5 % de niveles 10 % de niveles mínimos [h] mínimos [h] mínimos [h]

3 mg/kg rD'D3-FP EYA s.c. 105 76 64

4,29 mg/kg rD'D3-CTP s.c. 104 78 52

Conclusión de los experimentos in vivo

La invención demuestra la biodisponibilidad subcutánea de rD'D3-FP en diferentes especies (Tabla 26), y la biodisponibilidad relevante de un producto de FVIII recombinante, es decir, rVIII-Cadena Sencilla, Advate®, ReFacto AF® o Beriate®, cuando se coadministra por vía subcutánea con rD'D3-FP (Tabla 27).

Tabla 26: Biodisponibilidad de la rD'D3-FP en diferentes especies

Tratamiento Biodisponibilidad

Ratón, con desactivación de FVIII Cerdo

rD'D3-FP solo 43-50 % 59 %

rD'D3-FP con FVIII 40-87 % 70-187 %

rD'D3-His 34 % n.d.

rD'D3-CTP 47 % n.d.

rD'D3-FP EYA 66 % n.d.

Tabla 27: Biodisponibilidad del FVIII en diferentes especies

Tratamiento Biodisponibilidad

Ratón, con desactivación de FVIII Cerdo

rD'D3-FP 3-25 % 29-40 %

rD'D3-His 1 % n.d.

rD'D3-CTP 16 % n.d.

rD'D3-FP EYA 14 % n.d.

n.d., no determinado

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es la hemofilia A o la enfermedad de von Willebrand, dicho tratamiento o profilaxis comprende la administración del polipéptido recombinante extravascular y una proteína de Factor VIII (FVIII) a un sujeto que tiene el trastorno de la coagulación sanguínea, en el que dicho polipéptido recombinante es capaz de unirse a dicho FVIII, en el que el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, en el que dicho polipéptido comprende una fracción de extensión de la semivida (HLEM), en el que el polipéptido está presente como un dímero en el que la relación dímero : monómero del polipéptido de la invención es de al menos 1,5, en el que el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizado por una constante de disociación Kd inferior a 1 nM, y en el que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50.

2. El polipéptido recombinante que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho tratamiento o profilaxis comprende administrar el polipéptido recombinante y la proteína del Factor VIII (FVIII) extravascularmente a un sujeto que tiene el trastorno de la coagulación sanguínea.

3. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto es un sujeto humano.

4. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido dimérico tiene una afinidad de unión al FVIII caracterizado por una constante de disociación Kd de menos de 500 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 90 pM o menos de 80 pM.

5. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular.

6. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el VWF truncado consiste en (a) los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4, o en (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEQ ID NO:4.

7. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la HLEM es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada al FVR truncado, en el que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende o consiste preferentemente en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en albúmina o fragmentos de la misma, transferrina o fragmentos de la misma, el péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica humana, una secuencia XTEN, repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse bajo condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, polipéptidos capaces de unirse al receptor Fc neonatal (FcRn), en particular a las regiones constantes de las inmunoglobulinas y a porciones de las mismas, preferentemente la porción Fc de la inmunoglobulina, y combinaciones de los mismos.

8. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la HLEM se conjuga con el polipéptido recombinante, en el que dicha HLEM se selecciona preferentemente del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosán, ácido hialurónico y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos, y combinaciones de los mismos.

9. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tiempo medio de residencia (MRT) del FVIII administrado se incrementa por la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente por un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a 50.

10. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tiempo medio de residencia (MRT) del polipéptido recombinante administrado se incrementa en un factor de al menos 1,5, al menos 2 o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a 50.

11. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la semivida terminal del FVIII administrado se incrementa por la coadministración del polipéptido recombinante, preferentemente en un factor de al menos 1,2, al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5 o al menos 3, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, salvo que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a 50.

12. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el período de tiempo para alcanzar un nivel mínimo del 1 % del FVIII coadministrado con dicho polipéptido que tiene una HLEM se prolonga en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el FVIII se administra con un polipéptido recombinante sin que tenga dicha HLEM.

13. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, , en el que la semivida plasmática del polipéptido es al menos un 100 %, al menos un 200 % o preferentemente al menos un 400 % mayor en comparación con la del FVW endógeno y/o en comparación con la del FVW del plasma humano normal (NHP).

14. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la coadministración del polipéptido recombinante y la proteína FVIII se consigue (i) mediante la administración conjunta en una única composición que comprende el polipéptido recombinante y la proteína FVIII, o (ii) mediante la administración del polipéptido recombinante (primer compuesto) y la proteína FVIII (segundo compuesto) cada uno provisto en composiciones separadas, en las que el primer compuesto se administra antes, después o simultáneamente con el segundo compuesto.

15. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el FVIII es una proteína derivada del plasma o una proteína FVIII recombinante.

16. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el FVIII se administra por vía extravascular y en el que la biodisponibilidad del FVIII administrado tras la coadministración con el polipéptido recombinante es de al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 5 %, preferentemente al menos 7 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 % o al menos 40 %.

17. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la biodisponibilidad del polipéptido recombinante es de al menos 30 %, preferentemente de al menos 35 %, más preferentemente de al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, o al menos 80 %.

18. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la dosificación de proteína FVIII coadministrada no supera las 2500 IU/kg, 1500 IU/kg, 1000 IU/kg, 600 IU/kg, 500 IU/kg o 400 IU/kg.

19. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII la concentración máxima (Cmáx) para el FVIII es de al menos 10 mIU/ml, al menos 25 mIU/ml, al menos 50 mIU/ml, al menos 100 mIU/ml, al menos 200 mIU/ml, al menos 300 mIU/ml o al menos 400 mIU/ml de actividad del FVIII, preferentemente actividad cromogénica del FVIII.

20. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII el valor de aclaramiento (CL) del polipéptido recombinante se reduce en un factor de al menos 2, al menos 5 o al menos 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a 50.

21. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que tras la coadministración de dicho polipéptido recombinante con FVIII el valor de aclaramiento (CL) del FVIII administrado se reduce en comparación con un tratamiento de referencia, preferentemente en un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7,5 o al menos 10, en el que dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto que el polipéptido recombinante que se va a administrar no comprende una HLEM y/o excepto que la relación molar del polipéptido recombinante que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es inferior a 50.

22. El polipéptido recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la relación molar del polipéptido recombinante con el FVIII que se va a administrar es de al menos 75, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500 o al menos 1000.