KR20190073576A - 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에서 혈관외 투여를 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드 - Google Patents

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체에스엘 베링 렝나우 아게
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Abstract

본 발명은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 치료 또는 예방은 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII 단백질(FVIII)을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하는, 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이다.

Description

혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에서 혈관외 투여를 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
본 발명은 혈액 응고 장애의 치료를 개선하기 위한 제품 및 방법에 관한 것이다.
혈액 응고 인자의 결핍으로 유발되는 다양한 출혈성 장애들이 존재한다. 가장 흔한 장애는 혈우병 A 및 혈우병 B이고, 이는 각각 혈액 응고 인자 VIII(FVIII) 및 IX의 결핍으로부터 초래된다. 기타 공지의 출혈 장애는 폰 빌레브란트 질환(VWD: von Willebrand's disease)이다.
혈장에 있어서, FVIII는 대부분 폰 빌레브란트 인자(VWF)와의 비공유결합적 복합체로서 존재하고, 이의 응혈 기능은 인자 X의 인자 Xa로의 인자 IXa 의존적 전환을 가속화시키는 것이다.
전형적인 혈우병 또는 혈우병 A는 유전성 출혈 장애이다. 이는 혈액 응고 FVIII의 염색체 X-관련된 결핍증으로부터 초래되고, 이는 10,000명당 1 내지 2명의 개체의 발병률로 거의 대부분 남성에게 영향을 미친다. X-염색체 결함은 이들 자신은 혈우병이 아닌 여성 보유자에 의해 전달된다. 혈우병 A의 임상학적 징후는 증가된 출혈 경향이다.
예방학적 치료를 받고 있는 중증의 혈우병 A 환자에 있어서, FVIII는 약 12 내지 14시간의 FVIII의 짧은 혈장 반감기로 인하여 주당 약 3회 정맥내(i.v.) 투여되어야만 한다. 각각의 i.v. 투여는 번거롭고, 통증과 연관되어 있으며, 특히 이는 대부분 환자 자신에 의해 또는 혈우병 A로 진단된 아동의 부모에 의해 가정에서 이루어지므로 감염의 위험을 수반한다.
따라서, 이러한 FVIII를 함유하는 약제학적 조성물이 덜 빈번하게 투여되어야만 하도록 FVIII의 반감기를 증가시키는 것이 매우 바람직할 수 있다.
세포 수용체와의 비-활성화된 FVIII의 상호작용을 감소시킴으로써(WO 2003/093313 A2, WO 2002/060951 A2), 중합체를 FVIII에 공유결합적으로 부착시킴으로써(WO 1994/15625 A1, WO 1997/11957 A1 및 US 4970300), FVIII의 캡슐화에 의해(WO 1999/55306 A1), 신규한 금속 결합 부위의 도입에 의해(WO 1997/03193 A1), 펩타이드성(WO 1997/40145 A1 및 WO 2003/087355 A1) 또는 디설파이드 연결(WO 2002/103024 A2) 중 어느 하나에 의해 A3 도메인에 A2 도메인을 공유결합적으로 부착시킴으로써 또는 A2 도메인에 A1 도메인을 공유결합적으로 부착시킴으로써(WO2006/108590 A1) 비-활성화된 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 몇몇의 시도가 이루어져 왔다.
FVIII 또는 VWF의 기능적 반감기를 증진시키기 위한 다른 접근법은 FVIII의 페길화(PEGylation)(WO 2007/126808 A1, WO 2006/053299 A2, WO 2004/075923 A2) 또는 VWF의 페길화(WO 2006/071801 A2)에 의한 것이다. 페길화된 VWF의 증가된 반감기는 또한 간접적으로 혈장에 존재하는 FVIII의 반감기를 증진시킨다. 또한, FVIII의 융합 단백질들에 대해서도 기술된 바 있다(WO 2004/101740 A2, WO2008/077616 A1 및 WO 2009/156137 A1).
손실되어 있거나, 기능적으로 결함이 있거나 또는 상이한 형태의 폰 빌레브란트 질환(VWD)에서만 감소된 양으로 입수가능한, VWF는 다중 생리학적 기능을 갖는 포유동물의 혈장에 존재하는 다량체성 부착성 당단백질이다. 1차 지혈 동안, VWF는 혈소판 표면 상의 특정 수용체들과, 콜라겐과 같은 세포외 기질의 성분들 사이에서 매개체로서 작용한다. 또한, VWF는 응혈촉진성 FVIII을 위한 운반체 및 안정화 단백질로서 작용한다. VWF는 2813개의 아미노산 전구체 분자로서 내피세포 및 거핵세포 내에서 합성된다. 야생형 VWF의 아미노산 서열 및 cDNA 서열은 문헌[Collins et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397]에 기재되어 있다. 전구체 폴리펩타이드, 프레-프로-VWF(pre-pro-VWF)는 N-말단의 22-잔기 신호 펩타이드, 이어서, 741-잔기 프로-펩타이드 및 성숙한 혈장 VWF에서 발견되는 2050-잔기 폴리펩타이드로 이루어진다(Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). 소포체 내 신호 펩타이드의 절단 후, VWF의 두 단량체들 사이에 C-말단 디설파이드 브릿지가 형성된다. 분비 경로를 통해 추가로 수송하는 동안, 12개의 N이 결합되고 10개의 O가 결합된 탄수화물 측쇄들이 부가된다. 보다 중요하게, VWF 이량체는 N-말단 디설파이드 브릿지를 통해 다량체화되고, 741개 아미노산 길이의 프로펩타이드는 후기 골지 기관(Golgi apparatus)의 효소 PACE/푸린(furin)에 의해 절단제거된다.
프로테아제 ADAMTS13은 일단 혈장 내로 분비되면, VWF의 A1 도메인 내에서 고-분자량 VWF 다량체를 절단할 수 있다. 따라서, 혈장 VWF는 500kDa의 단일 이량체부터 10,000kDa 초과의 분자량의 20개 초과의 이량체들로 이루어진 다량체까지 이르는 전체 범위의 다량체들로 이루어진다. VWF-HMWM은 이에 의해 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)에서 측정될 수 있는 가장 강력한 지혈 활성을 갖는다. VWF:RCo/VWF 항원의 비율이 높을수록, 고분자량 다량체들의 상대적인 양도 커진다.
혈장에서 FVIII는 VWF에 높은 친화성으로 결합하고, 이는 FVIII를 조기 제거(premature elimination)로부터 보호하고, 따라서 1차 지혈에서의 이의 역할에 추가하여 FVIII를 안정화시키는데 결정적인 역할을 하고, FVIII의 혈장 수준을 조절하고, 또한 결과적으로 2차 지혈을 제어하기 위한 중심 인자이다. VWF에 결합된 비-활성화 FVIII의 반감기는 혈장에서 약 12시간 내지 14시간이다. VWF가 존재하지 않거나 거의 존재하지 않는 폰 빌레브란트 질환 유형 3에서, FVIII의 반감기는 단지 약 2 내지 6시간이고, 이는 FVIII의 감소된 농도로 인하여 이러한 환자에서 경증 내지 중간 정도의 혈우병 A 증상을 유도한다. FVIII에 대한 VWF의 안정화 효과는 또한 CHO 세포에서 FVIII의 재조합 발현을 보조하는데 사용되어 왔다(Kaufman et al., 1989, Mol Cell Biol 9:1233-1242). 폰 빌레브란트 질환 유형 2N은 FVIII의 VWF로의 결합에 영향을 미치는 VWF 내 돌연변이로 인한 낮은 FVIII 수준을 특징으로 한다. VWD 유형 2N 환자에서 FVIII 수준은 VWF 내 특정 돌연변이에 의존하여 약 3 IU/dL 내지 30 IU/dL의 범위, 전형적으로 20 IU/dL 미만의 범위이다(Sadler J.E. and Blinder M., Von Willebrand Disease: Diagnosis, Classification, and Treatment; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Colman, Marder, Clowes, George, Aird, and Goldhaber, Lippincott Williams & Wilkins 2006, pp 905-921).
VWF-유래된 폴리펩타이드, 특히, VWF 단편은 시험관내에서 그리고 생체내에서 FVIII를 안정화시키는 것으로 기재되어 왔다. WO 2013/106787 A1은 FVIII 단백질 및 특정 VWF 단편을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. FVIII 및 VWF-단편의 이들 키메라 이종-이량체는 1:1의 VWF 대 FVIII의 고정된 몰 비를 갖는다.
WO 2014/198699 A2 및 WO 2013/083858 A2는 VWF 단편 및 혈우병의 치료시의 이들의 용도를 기술한다. FVIII의 생체이용률(bioavailability)은 유사한 몰량의 VWF 단편을 사용한 혈관외 동시-투여(co-administration)시 유의하게 개선될 수 있음이 밝혀졌다. FVIII에 비해 높은 몰 과량의 VWF는 바람직하지 않다고 하였고, FVIII와 함께 s.c. 동시-투여된 VWF 단편을 이용한 실험에서, VWF 용량은 FVIII 생체 이용률에 결정적이지 않았음이 밝혀졌다. 따라서, VWF 용량 뿐만 아니라 FVIII에 대한 VWF 단편의 몰비는 FVIII 생물유용성을 위해 중요하지 않은 것으로 고려되었다.
WO 2011/060242 A2는 소정 VWF 단편 및 10:1 이하의 FVIII에 대한 VWF 단편의 특정 몰 비를 제시하는 항체 Fc 영역을 포함하는 융합 폴리 펩타이드를 개시한다. 또한, 상기 Fc-융합 작제물과 관련하여 추가로 어떠한 생체내 데이터가 제공되지 않는다.
문헌[참조: Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452]은 면역글로불린 G1의 Fc 부분에 융합된 D'D3 도메인을 함유하는 VWF 단편이 VWF-결핍 마우스에서 내인성 인자 VIII를 안정화시키는데 충분함을 밝힌다. 그러나, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 FVIII-결핍 마우스에 수혈되는 경우에 현저하게 연장된 생존을 나타냈지만, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 동시-수혈된 FVIII의 생존을 연장시키지 않았다.
오늘날 까지, 혈우병 A의 표준 치료는 사람 공여자의 혈장으로부터 유래된 농축물로서 또는 재조합 FVIII를 기준으로 하는 약제학적 제제로서 FVIII의 빈번한 정맥내 주입을 포함한다. 이들 대체 치료요법은 일반적으로 예를 들어, 예방학적 치료를 받고 있는 중증의 혈우병 A 환자에 있어서 효과적이지만, 상기 언급된 바와 같이 FVIII는 약 12 시간의 인자 VIII의 짧은 혈장 반감기로 인하여 주당 약 3회 정맥내(i.v.) 투여되어야만 한다. 이미, 건강한 비-혈우병 환자에서 FVIII 활성의 1% 초과의 수준에 도달한 경우, 예를 들어, 0.01 U/mL 초과의 FVIII 수준의 상승에 의해 도달한 경우, 중증 혈우병 A는 중간 정도의 혈우병 A로 전환된다. 예방적 치료요법에서 투여 용법은 FVIII 활성의 트로프 수준이 건강한 비-혈우병 환자에서 FVIII 활성의 2 내지 3% 수준 미만으로 저하되지 않도록 디자인된다. 각각의 i.v. 투여는 번거롭고, 통증과 연관되어 있으며, 특히 이는 대부분 환자 자신에 의해 또는 혈우병 A로 진단된 아동의 부모에 의해 가정 치료에서 이루어지므로 감염의 위험을 수반한다. 추가로, 빈번한 i.v. 주사는 불가피하게 상처 형성을 유발하여 향후 주입을 방해한다. 중증 혈우병에서 예방적 치료가 인생 초기에 개시되기 때문에, 흔히 2세 미만의 아동에 대해 그러한 어린 환자 정맥으로 주당 3회 FVIII를 3회 주입하기란 보다 어렵다. 제한된 기간 동안, 포트 시스템의 이식은 대안을 제공할 수 있다. 반복되는 감염이 일어날 수 있고 포트가 신체 운동 동안에 불편을 유발할 수 있다는 사실에도 불구하고, 이들은 그럼에도 불구하고 전형적으로 정맥내 주사와 비교하여 선호될 수 있는 것으로 고려될 수 있다.
따라서, FVIII를 정맥내로 주입할 필요성을 제거할 필요성이 의학적으로 여전히 요구되고 있다. FVIII는 매우 크고 불안정한 분자이기 때문에, 이것은 피하, 근육내 또는 피내로, 즉, 혈관외로 주어지는 경우 불충분한 흡수 및 심한 분해로 인해 매우 낮은 생물유용성을 나타낸다.
EP 0710114 A1은 1000 IU/mL 초과의 농도에서 B-도메인 결실된 FVIII의 FVIII 제형이 피하 투여에 적합하여 활성 (FVIII:C)-시간 곡선 이하 면적을 측정하는, s.c. 투여 후 5 내지 10%의 생물유용성을 유도함을 기재하고 있다.
EP 0772452는 피하로 투여되는 경우, 유기 첨가제와 함께 적어도 500 IU/mL의 농도에서 B-도메인 결실된 FVIII의 FVIII 제형이 6시간 초과 동안 정상 FVIII 수준의 적어도 1.5%의 FVIII 혈장 수준을 유도할 수 있음을 기재한다. 유기 첨가제로서 가수분해된 겔라틴 또는 대두유 에멀젼 및 1100 IU/mL의 농도 및 10000 IU/kg의 용량으로 B-도메인 결실된 FVIII를 사용하여, 활성(FVIII:C)-시간 곡선 이하 면적으로서 측정된 바와 같이 50% 초과의 생물유용성은 시노몰구스 몽키에서 나타났다. 이것은 그러나 혈액 응고 장애를 갖는 환자의 치료를 위한 적당한 임상적 시나리오가 아니다.
WO 1997/11957 A1은 B-도메인 결실된 FVIII (비활성 15000 IU/mg; 용량 2500 IU/kg)이 피하로 투여되는 경우 5.3%의 생물유용성을 기재하는 반면, FVIII의 m페길화된 접합체는 시노몰구스 몽키에서 22% 또는 19%의 생물유용성을 성취하였다.
WO 2015/185758 A2에 따라, 인자 VIII 및 하나 이상의 폰 빌레브란트 인자 펩타이드의 비-공유 복합체를 포함하는 조성물이 제공되고, 여기서, 상기 폰 빌레브란트 인자 펩타이드는 적어도 아미노산 764 내지 1035 및 1691 내지 1905를 포함한다. FVIII:VWF의 분자 비는 1:1 내지 1:20이다. WO 2015/185758 A2에서, 혈우병 A 개에 단독으로 또는 에스. 아우레우스(S. aureus) V-8 프로테아제를 사용한 pdVWF의 분해에 의해 생성된 5배 몰 과량의 VWF 단편과 조합하여 재조합 B-도메인-결실된 FVIII를 s.c. 및 후속적 i.v. 주사하였다. 샘플은 전혈 응고 시간(WBCT) 및 색소성 FVIII 활성 검정에서 활성에 대해 분석하였다. FVIII와 복합체를 형성한 VWF 단편의 피하 투여는 단독의 FVIII의 s.c. 투여와 비교하여 정상 개에 대한 응고 시간을 초과하기 위해 요구되는 시간에서 1.4 배 증가를 유도하였다. FVIII와 함께 VWF 단편의 투여는 또한 단독의 FVIII의 투여와 비교하여 시간 경과에 따라 개 혈장에서 FVIII 활성을 증가시켰고 s.c. 및 i.v. 적용 둘 다에 대해 곡선이하 면적(AUC) 값을 거의 배가시켰다.
WO 2008/151817 A1에서, VWF는 면역 반응의 증가된 위험을 수반할 수 있는 임의의 안정화 공유 결합 변형 없이 혈관외로 투여되는 경우 혈류로 흡수될 수 있고 VWF를 사용하여 FVIII 비-정맥내로 동시 투여되는 경우 FVIII의 흡수를 증진시킬 수 있는 것으로 나타났다. VWF는 임의의 반감기 연장 변형 없이 적용되었다. FVIII 활성에 대한 VWF 항원의 비율은 2:1 초과였다. 전장 VWF를 포함하는 다량체 및 단량체 생성물 만이 고려되었다. 그러나, 전장 VWF를 적용함에 의해, FVIII에 대한 VWF의 높은 비율은 상승된 혈전 위험을 유발할 수 있다. 추가로, 전장 VWF를 사용하는 경우, 비율을 증가시키기 위해 요구되는 단백질 양은 투여를 위해 허용되지 않는다. 추가로 다량체 및 단량체성.
FVIII의 환자로의 정맥내 투여를 위한 대안이 의학적으로 요구되고 있다. 추가로, 혈관외로 투여되는 경우 인자 VIII 흡수를 제공하는 방법 및 상기 방법을 위해 적합한 화합물 또는 조성물이 계속 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 첫번째 목적은 혈액 응고 장애의 개선된 인자 VIII(FVIII) 단백질 기반 치료 또는 예방을 제공하는 것이다.
두번째 목적에 따라, 상기 치료는 이를 필요로 하는 대상체에게 FVIII의 투여에 대한 대안 경로를 가능하게 해야만 한다. 특히, FVIII의 피하 투여는 가능해야만 한다.
세번째 목적에 따라, 상기 치료는 적어도 투여와 관련하여 혈액 응고 장애를 갖는 대상체를 치료하기에 충분한 투여된 FVIII 약동학적 파라미터를 제공해야 한다.
네번째 목적에 따라, 상기 치료는 특히 관용성이거나 개선된 투여 빈도를 제공하기에 충분히 높은 FVIII의 반감기를 제공해야만 한다.
놀랍게도 본원 발명자들에 의해 인자 VIII(FVIII) 단백질이 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위해 혈관외 경로를 통해 성공적으로 투여될 수 있음이 밝혀졌고, 단, 상기 FVIII는 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)와 동시 투여되어야 한다. 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 동시 투여된 FVIII에 결합할 수 있다. FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게 50 초과이다. 절단된 VWF를 포함하는 재조합 폴리펩타이드는 바람직하게 반감기 연장 모이어티(HLEM)를 포함한다. 임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 절단된 VWF와 비교하여 증가된 이화작용을 유발할 수 있는 보다 큰 분자 구조를 갖는 내인성 VWF로의 동시 투여된 FVIII의 결합을 최소화하기 위해 과량으로 투여되는 재조합 폴리펩타이드를 성취하는 것이 중요한 것으로 사료된다. 여기에 제공된 FVIII와 상기 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여를 사용하여, 처음으로 FVIII 적용을 위한 혈관외 경로가 가능할 뿐만 아니라 심지어 임상적으로 적절한 양의 FVIII를 순환계에 성취할 수 있음을 입증한다.
본 발명은 추가로 재조합 폴리펩타이드의 혈관외 투여가 동시-투여된 FVIII의 생물유용성을 제공하거나 이를 증가시킴을 입증한다. 추가로, FVIII와 함께 재조합 폴리펩타이드의 피하 투여는 FVIII의 혈관외 투여를 가능하게 하고 이는 FVIII의 혈류로의 적절한 흡수로 검출한계치를 충분히 초과하고 추가로 치료학적 적용을 위해 적합한 FVIII 활성 수준을 유도하는 것과 연관된다. FVIII와 동시 투여되는 경우 재조합 폴리펩타이드는 충분히 긴 반감기를 갖고, 일단 이것이 상기 구획에 도달하는 경우 혈장에서 FVIII의 유지를 증가시킬 뿐만 아니라 치료학적 적용을 위해 적합한 FVIII의 생물유용성을 제공한다.
또한, 본 발명은 추가로 재조합 폴리펩타이드에 대해 사용되는 것과는 상이한 경로의 투여를 통한 FVIII 투여를 포함하는 치료 옵션을 가능하게 할 수 있다. 특히, 정맥내 투여되는 FVIII 및 피하 투여되는 재조합 폴리펩타이드의 조합으로부터 비롯된 이득이 입증된다.
따라서, 본 발명은 특히 하기의 구현예 [1] 내지 [73]에 관한 것이다:
[1] 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 치료 또는 예방은 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII 단백질(FVIII)을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하는, 혈액 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
[2] 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 치료 또는 예방은 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 혈관외로 재조합 폴리펩타이드를 그리고 인자 VIII 단백질(FVIII)을 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하는, 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
[3] 구현예 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티(HLEM)를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
[4] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 사람 대상체인, 재조합 폴리펩타이드.
[5] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 사람 절단된 VWF인, 재조합 폴리펩타이드.
[6] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 정맥내, 피내 또는 근육내로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
[7] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII가 피하, 피내 또는 근육내로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드. 바람직하게, FVIII 및 상기 폴리펩타이드 둘 다는 피하로 투여된다.
[8] 구현예 [2] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII가 상기 재조합 폴리펩타이드와는 상이한 투여 경로를 통해 투여되고, 바람직하게 FVIII가 정맥내로 투여되고; 보다 바람직하게는 상기 재조합 폴리펩타이드가 피하로 투여되고 상기 FVIII가 정맥내로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
[9] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
[10] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF에 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813이 결여되어 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[11] 이전의 구현예 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, (b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (c) (a) 또는 (b)의 단편으로 이루어진, 재조합 폴리펩타이드.
[12] 구현예 [3] 내지 [11] 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 HLEM이 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인, 재조합 폴리펩타이드.
[13] 구현예 [12]에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 트랜스페린 및 이의 단편, 사람 융모성 고나도트로핀의 C-말단 펩타이드, XTEN 서열, 동종-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 알부민, 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게 면역글로불린의 Fc 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나 이러한 폴리펩타이드로 이루어진, 재조합 폴리펩타이드. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 바람직하게 면역글로불린 G1의 Fc 단편, 면역글로불린 G2의 Fc 단편 또는 면역글로불린 A의 Fc 단편이다.
[14] 구현예 [3] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLEM이 상기 재조합 폴리펩타이드에 접합된, 재조합 폴리펩타이드.
[15] 구현예 [14]에 있어서, 상기 HLEM이 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예를 들면, 지방산 쇄, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
[16] 구현예 [3] 내지 [13]중 어느 한 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 상기 재조합 폴리펩타이드에 접합된 임의의 HLEM을 포함하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
[17] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 N-글리칸을 포함하는 당단백질이고, 여기서, 상기 N-글리칸 중 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 85%는 평균적으로 적어도 하나의 시알산 모이어티를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
[18] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 이량체로서 존재하거나 적어도 고비율의 이량체를 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
[19] 구현예 [18]에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 바람직하게 본원에 기재된 구현예 중 하나에 정의된 바와 같은 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 동종이량체이고, 상기 이량체를 형성하는 2개의 단량체가 절단된 VWF 내 시스테인 잔기에 의해 형성된 적어도 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통해 서로 공유적으로 연결되어 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[20] 구현예 [19]에 있어서, 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 형성하는 상기 시스테인 잔기가 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, Cys-1227 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게 Cys-1099 및 Cys-1142이고, 여기서, 상기 아미노산 넘버링은 서열번호 4를 기준으로 하는, 재조합 폴리펩타이드.
[21] 구현예 [18] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, FVIII에 대한 상기 이량체의 친화성이 FVIII에 대한 단량체성 폴리펩타이드의 친화성보다 더 크고, 상기 단량체성 폴리펩타이드는 이량체성 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
[22] 구현예 [18] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체:단량체 비율이 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 또는 적어도 3인, 재조합 폴리펩타이드. 바람직하게 본 발명의 재조합 폴리펩타이드는 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드를 포함하지 않거나 적어도 필수적으로 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드가 없다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 이량체로 존재한다.
[23] 구현예 [18] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 이량체 폴리펩타이드가 1 nM 미만, 바람직하게 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만 또는 80 pM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
[24] 구현예 [23]에 있어서, 상기 KD가 0.1 pM 내지 500 pM, 0.5 pM 내지 200 pM, 0.75 pM 내지 100 pM의 범위, 가장 바람직하게 1 pM 내지 80 pM의 범위인, 재조합 폴리펩타이드.
[25] 구현예 [18] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화성을 갖고 상기 이량체성 폴리펩타이드의 해리 상수 KD가 단량체성 폴리펩타이드의 해리 상수 KD와 비교하여 감소된, 바람직하게 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 500배 또는 적어도 1000배 만큼 감소된, 재조합 폴리펩타이드.
[26] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 야생형 VWF의 아미노산 서열과 비교되는 바와 같이 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 변형된 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화성이 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 표준 폴리펩타이드의 결합 친화성와 비교하여 상기 적어도 하나의 치환의 도입에 의해 추가로 증가되는, 재조합 폴리펩타이드.
[27] 구현예 [26]에 있어서, 상기 절단된 vWF 내 상기 치환이 투여 후 동시-투여된 FVIII의 반감기를 추가로 증가시키는 능력을 갖는, 재조합 폴리펩타이드. 이에 의해, 상기 치료는 또한 특히, 관용성이거나 개선된 투여 빈도가 가능하도록 추가로 증가된 FVIII의 생체내 반감기를 제공할 수 있다.
[28] 구현예 [26] 또는 [27]에 있어서, 상기 치환이 서열번호 4의 서열을 참조하여 상기 치환이 S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R, S764P/S766L, 및 S764E/S766Y/V1083A로 이루어진 조합 그룹으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
[29] 구현예 [28]에 있어서, 상기 치환이 조합 S764E/S766Y 또는 S764E/S766Y/V1083A인, 재조합 폴리펩타이드.
[30] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 투여된 FVIII의 평균 체류 시간(MRT)이 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만이고/이거나 어떠한 재조합 폴리펩타이드가 투여되지 않는 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[31] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 투여된 FVIII의 MRT가 적어도 10 h, 바람직하게 적어도 15 h, 적어도 20 h 또는 적어도 25 h인, 재조합 폴리펩타이드.
[32] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 투여된 재조합 폴리펩타이드의 MRT가 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2 또는 적어도 3배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만, 특히 50 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[33] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 투여된 FVIII의 말단 반감기가 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.2, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 2.5 또는 적어도 3배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만이고/이거나 어떠한 재조합 폴리펩타이드가 투여되지 않는 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드. 이에 의해, 상기 치료는 또한 특히, 관용성이거나 개선된 투여 빈도가 가능하도록 충분히 높은 FVIII의 생체내 반감기를 제공할 수 있다.
[34] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 HLEM을 갖는 상기 폴리펩타이드와 동시 투여되는 FVIII의 1% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기가 표준 치료와 비교하여 연장되고, 상기 표준 치료는 상기 FVIII가 상기 HLEM을 갖는 것 없이 재조합 폴리펩타이드와 함께 투여되고/되거나 어떠한 재조합 폴리펩타이드가 투여되지 않는 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[35] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드와 동시 투여되는 FVIII의 1% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기가
(i) 적어도 약 30h, 적어도 약 35h, 적어도 약 38h, 적어도 약 40h, 또는 적어도 약 50h이거나;
(ii) 상기 폴리펩타이드와 동시 투여되는 FVIII의 5% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기가 적어도 약 20h, 적어도 약 22h, 적어도 약 29h, 적어도 약 34h, 또는 적어도 약 43h이거나;
(iii) 상기 폴리펩타이드와 동시 투여되는 FVIII의 10% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기가 적어도약 5h, 적어도 약 6h, 적어도 약 10h, 적어도 약 18h, 또는 적어도 약 20h인, 재조합 폴리펩타이드.
[36] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 것과 비교하여 및/또는 정상 사람 혈장(NHP)의 VWF의 것과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 것 보다 및/또는 정상 사람 혈장(NHP)의 것과 비교하여 바람직하게 적어도 100%, 적어도 200% 또는 바람직하게 적어도 400%인, 재조합 폴리펩타이드.
[37] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A 또는 폰 빌레브란트 질환인, 재조합 폴리펩타이드.
[38] 구현예 [37]에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A이고 전형적으로 정상 사람 혈장 (NHP)에서 내인성 FVIII 활성 수준의 5% 내지 40%인 내인성 FVIII 활성 수준과 연관된 약한 혈우병 A, 또는 전형적으로 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 1% 내지 5%인 내인성 FVIII 활성과 연관된 중간 정도의 혈우병 A, 또는 전형적으로 NHP에서 내인성 FVIII 활성의 1% 미만인 내인성 FVIII 활성과 연관된 중증 혈우병 A인, 재조합 폴리펩타이드.
[39] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 (i) 출혈 에피소드의 온-디맨드 치료 및 제어, (ii) 특히 출혈 에피소드의 빈도를 감소시키기 위한 통상의 예방, 또는 (iii) 출혈의 수술기주위 관리를 우해 사용되는, 재조합 폴리펩타이드.
[40] 구현예 [39]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 혈우병 A를 갖는 환자의 출혈 에피소드의 빈도를 감소시키기 위한 통상의 예방을 위해 사용되는, 재조합 폴리펩타이드.
[41] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질의 동시 투여가
- (i) 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질을 포함하는 단일 조성물 중에서 함께 투여에 의해, 또는
- (ii) 상기 재조합 폴리펩타이드(제1 화합물) 및 상기 FVIII 단백질(제2 화합물)이 각각 별도의 조성물에, 임의로 조합 치료요법의 일부로서 제공되는 투여로서, 상기 제1 화합물이 제2 화합물 전에, 후에 또는 동시에 투여되는 투여에 의해 성취되는, 재조합 폴리펩타이드. 임의의 적합한 시간 간격은 상기 제1 화합물이 제2 화합물 전 또는 후에 투여되는 경우 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물의 투여를 위해 적용될 수 있다. 특히, 통상의 예방 목적을 위해, 제1 화합물의 투여 및 제2 화합물의 투여는 독립적 또는 협력적 투여 스케줄에 따라 제공될 수 있다.
[42] 구현예 [41]에 있어서, (i)의 경우에, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질의 동시 투여가 단일 조성물에 블렌딩된 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII를 포함하는 조합 생성물을 제공하거나
투여 전 혼합되도록 구성됨에 의해 제1 생성물이 상기 재조합 폴리펩타이드를 포함하고 제2 생성물이 상기 FVIII를 포함하는, 적어도 2개의 별도 생성물의 세트 또는 키트를 제공함에 의해 성취되는, 재조합 폴리펩타이드.
[43] 구현예 [41]에 있어서, (ii)의 경우에, 특히 동시에 투여되는 경우 및/또는 특히 둘 다 혈관외로 투여되는 경우 재조합 폴리펩타이드 및 FVIII 단백질은 인접 부위에서 투여되고, 바람직하게, 주사 부위가 50 mm 이하, 40 mm 이하, 30 mm 이하, 특히 20 mm 이하로 격리되어 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[44] 구현예 [41] 또는 [43]에 있어서, (ii)의 경우에, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질이 1개월 이내, 3주 이내, 2주 이내, 1주 이내, 1일 이내, 약 1시간 이내, 30분 이내, 15분 이내 또는 5분 이내에 동시 투여될 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[45] 구현예 [41], [43] 또는 [44]에 있어서, (ii)의 경우에, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질이 1 개월 이하, 3주 이하, 2주 이하, 1주 이하, 1일 이하, 약 1시간 이하, 바람직하게 30분 이내, 보다 바람직하게 15분 이내 및 가장 바람직하게 5분 이내의 시간 간격 이내에 동시 투여될 수 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[46] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 FVIII 단백질을 포함하지 않고/않거나 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
[47] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII가 혈장 유래된 FVIII 단백질 또는 재조합 FVIII 단백질이고, 바람직하게는 사람 FVIII 단백질인, 재조합 폴리펩타이드.
[48] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII가 재조합 FVIII 단백질인, 재조합 폴리펩타이드.
[49] 구현예 [48]에 있어서, 상기 재조합 FVIII가 온전한 천연 B 도메인을 갖거나 B 도메인이 결실되어 있거나, 절단된 또는 변형된 B 도메인을 갖는, 재조합 폴리펩타이드. 임의로, 상기 재조합 FVIII 단백질은 적어도 하나의 반감기 연장 모이어티(HLEM)를 포함할 수 있다. 적합한 HLEM은 본원에 기재되어 있다.
[50] 구현예 [48]에 있어서, 상기 FVIII 단백질이 재조합 단일쇄 인자 VIII, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 이루어지고, 단, 상기 단편이 FVIII 활성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
[51] 구현예 [48]에 있어서, 상기 재조합 FVIII가 B 도메인이 결실되어 있거나 절단된 B 도메인을 갖고, 단, 상기 결실되거나 절단된 B 도메인이 적어도 하나의 링커 펩타이드 및/또는 반감기 증진 폴리펩타이드의 이종성 삽입부를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
[52] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, FVIII가 혈관외로 투여되는 경우, 재조합 폴리펩타이드와 동시 투여 후 투여된 FVIII의 생물유용성이 표준 치료와 비교하는 경우 상기 재조합 폴리펩타이드에 의해 증가되고, 상기 표준 치료가, FVIII가 상기 재조합 폴리펩타이드 없이 투여되는 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드. 이에 의해, 재조합 폴리펩타이드의 혈관외 투여가 투여된 FVIII의 생물유용성을 제공하거나 이를 증가시킨다. 바람직하게, FVIII와 함께 재조합 폴리펩타이드의 피하 동시 투여는 FVIII의 혈관외 투여를 가능하게 하고 이는 FVIII의 혈류로의 적절한 흡수로 검출한계치를 충분히 초과하고 추가로 치료학적 적용을 위해 적합한 FVIII 활성 수준을 유도하는 것과 연관된다. 바람직하게, FVIII와 동시 투여되는 경우 재조합 폴리펩타이드는 충분히 긴 반감기를 갖고, 일단 이것이 상기 구획에 도달하는 경우 혈장에서 FVIII의 유지를 증가시킬 뿐만 아니라 치료학적 적용을 위해 적합한 FVIII의 생물유용성을 제공한다.
[53] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 재조합 폴리펩타이드와 동시 투여 후 혈관외 투여된 FVIII의 생물유용성이 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 바람직하게 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%인, 재조합 폴리펩타이드.
[54] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드의 생물유용성이 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 80%인, 재조합 폴리펩타이드.
[55] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 동시 투여된 FVIII 단백질의 용량이 2500　IU/kg을 초과하지 않거나, 바람직하게 2000 IU/kg을 초과하지 않거나, 1500 IU/kg을 초과하지 않거나, 1000 IU/kg을 초과하지 않거나, 600 IU/kg을 초과하지 않거나, 500 IU/kg을 초과하지 않거나, 400 IU/kg을 초과하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
[56] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, FVIII에 대한 최대 농도(Cmax)가 적어도 10 mIU/mL, 적어도 25 mIU/mL, 적어도 50 mIU/mL, 적어도 100 mIU/mL, 적어도 200 mIU/mL, 적어도 300 mIU/mL 또는 적어도 400 mIU/mL의 FVIII 활성, 바람직하게 발색성 FVIII 활성인, 재조합 폴리펩타이드.
[57] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도(Cmax)가 적어도 20　nmol/kg, 적어도 40　nmol/kg, 적어도 60 nmol/kg, 적어도 80 nmol/kg 또는 적어도 160 nmol/kg인, 재조합 폴리펩타이드. 바람직하게, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도 (Cmax)가 적어도 5 μg HLEM/mL, 적어도 10　μg HLEM/mL, 적어도 15 μg HLEM/mL, 또는 적어도 20 μg HLEM/mL이고, 여기서, 상기 값이 HLEM에 대한 계산을 기준으로 하고, 바람직하게, 상기 값은 바람직하게 사람 알부민에 특이적인 면역검정과 같은 HLEM 특이적 검정을 사용한 정량을 기준으로 한다. 추가의 바람직한 구현예는 이전의 구현예 중 어느 하나에 따른 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도 (Cmax)가 표준 치료와 비교하여 적어도 3배 높고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[58] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 동시 투여된 FVIII에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적이 적어도 1,000 mIU*h/mL, 적어도 2,000 mIU*h/mL, 적어도 3,000 mIU*h/mL, 적어도 5,000 mIU*h/mL, 적어도 10,000 mIU*h/mL 또는 적어도 20,000 mIU*h/mL의 FVIII 활성, 바람직하게 발색성 FVIII 활성인, 재조합 폴리펩타이드.
[59] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적이 적어도 2 nmol * h/kg, 적어도 3 nmol * h/mL, 적어도 4 nmol * h/mL, 적어도 20 nmol * h/mL, 적어도 40 nmol * h/mL 또는 적어도 80 nmol * h/mL인, 재조합 폴리펩타이드. 바람직하게, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시 투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적이 적어도 500 μg HLEM*h/mL, 적어도 750 μg HLEM*h/mL, 적어도 1,000 μg HLEM*h/mL, 5000μg HLEM*h/mL 또는 적어도 10,000 μg HLEM*h/mL이고, 여기서, 상기 값이 HLEM에 대한 계산을 기준으로 하고, 바람직하게, 상기 값은 바람직하게 사람 알부민에 특이적인 면역검정과 같은 HLEM 특이적 검정을 사용한 정량을 기준으로 한다. 추가의 바람직한 구현예는 이전의 구현예 중 어느 하나에 따른 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시 투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적이 표준 치료와 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 15배이고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일하다.
[60] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후 상기 재조합 폴리펩타이드의 소거율(CL) 값이 1.0 내지 2.5 mL/kg/h, 또는 1.1 내지 2.2 mL/kg/h 또는 1.2 내지 2.1 mL/kg/h 범위에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
[61] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 소거율(CL) 값이 표준 치료와 비교하여 적어도 2, 적어도 5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[62] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 투여된 FVIII 소거율(CL) 값이 표준 치료와 비교하여 감소되고, 바람직하게 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 적어도 7.5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료가 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
[63] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 투여된 FVIII의 소거율(CL) 값이 135 mL/kg/h 미만, 80 mL/kg/h 미만, 45 mL/kg/h 미만, 40 mL/kg/h 미만, 35 mL/kg/h 미만, 30 mL/kg/h 미만 또는 25 mL/kg/h 미만인, 재조합 폴리펩타이드. 투여된 FVIII의 소거율(CL) 값은 바람직하게 표준 치료의 것 보다 낮고, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일하다.
[64] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII에 대한 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 또는 적어도 1000인, 재조합 폴리펩타이드.
[65] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 적어도 0.01 mg/kg, 적어도 0.1 mg/kg, 적어도 0.2 mg/kg, 적어도 0.5 mg/kg, 적어도 1 mg/kg 또는 적어도 3 mg/kg 재조합 폴리펩타이드의 양으로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
[66] 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드가 상기 재조합 폴리펩타이드의 20 mg/kg을 초과하지 않거나, 15 mg/kg을 초과하지 않거나, 10 mg/kg을 초과하지 않거나, 5　mg/kg을 초과하지 않는 양으로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
[67] 구현예 [1] 내지 [66] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이
(i) 구현예 [1] 내지 [7] 중 어느 하나 또는 구현예 [9] 내지 [66] 중 어느 하나에 따른 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 단, 상기 재조합 폴리펩타이드가 상기 FVIII와 동일한 투여 경로를 통해 투여되어야만 하는, 재조합 폴리펩타이드, 및
(ii) 인자 VIII 단백질(FVIII)을 포함하고,
여기서, 조성물 내 FVIII에 대한 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 초과인, 약제학적 조성물.
[68] 구현예 [67]에 있어서, 상기 치료가 상기 조성물을 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 투여함을 포함하고,
상기 조성물이 혈관외 동시 투여를 위해 적합하게 제형화된, 약제학적 조성물. 바람직하게, 상기 재조합 폴리펩타이드의 적어도 일부는 FVIII에 결합되어 있다. 약제학적 조성물의 추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기 재조합 폴리펩타이드는 FVIII에 비-공유 결합되어 있다. 바람직하게, 상기 약제학적 조성물은 상기 폴리펩타이드의 고비율의 이량체를 포함한다. 추가로 바람직한 것은 상기 약제학적 조성물이 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드를 포함하지 않거나 적어도 필수적으로 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드가 없는 것이다.
[69] 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 (i) 인자 VIII 단백질(FVIII)을 포함하는 제1 조성물 및 (ii) 구현예 [1] 내지 [66] 중 어느 하나에 따른 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약제학적 키트로서, 상기 치료가 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질을, 바람직하게 혈관외로 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 FVIII 및 상기 재조합 폴리펩타이드가 키트내에 제공되는, 약제학적 키트. 바람직하게, 상기 FVIII 및 상기 재조합 폴리펩타이드는 투여 전에 상기 재조합 폴리펩타이드의 적어도 일부가 상기 FVIII에 결합하도록 하기 위해 키트내에 제공되고, 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드가 몰비는 50 초과이도록 제공된다. 바람직하게, 상기 제2 조성물은 상기 폴리펩타이드의 고비율의 이량체를 포함한다. 추가로 바람직한 것은 상기 제2 조성물이 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드를 포함하지 않거나 적어도 필수적으로 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드가 없는 것이다.
[70] 혈액 응고 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII 단백질(FVIII)의 유효량을 동시 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰비는 50을 초과하는, 방법. 상기 방법 내 재조합 폴리펩타이드는 바람직하게 구현예 [1] 내지 [66] 중 어느 하나에 따라 제공될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 상기 FVIII는 또한 피하, 피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 바람직하게, FVIII 및 상기 폴리펩타이드 둘 다는 피하로 투여된다. 또 다른 변형된 방법에 따라, 상기 FVIII는 상기 재조합 폴리펩타이드와는 상이한 투여 경로를 통해 투여되고, 바람직하게 FVIII는 이어서 정맥내로 투여되고; 보다 구체적으로는 상기 재조합 폴리펩타이드는 피하로 투여되고 상기 FVIII는 정맥내로 투여된다.
[71] 혈액 응고 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF) 및 인자 VIII 단백질(FVIII)을 상이한 투여 경로를 통해 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 FVIII에 결합할 수 있다. 상기 방법 내 재조합 폴리펩타이드는 구현예 [2] 내지 [66] 중 어느 하나에 따라 제공될 수 있다. 상기 구현예 내에서, FVIII에 대한 재조합 폴리펩타이드의 볼비의 결정은 재조합 폴리펩타이드의 투여 전 의무적인 것은 아니다. 바람직하게, 상기 FVIII는 정맥내로 투여되고, 보다 바람직하게 상기 재조합 폴리펩타이드는 피하로 투여되고 FVIII는 정맥내로 투여된다.
[72] 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 구현예 [1] 내지 [66] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 상기 치료 또는 예방은 상기 폴리펩타이드 및 인자 VIII(FVIII) 단백질을 바람직하게 혈관외 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있는 용도. 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비는 바람직하게 50 초과이다.
[73] 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약물을 제조하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 치료 또는 예방은 대상체에게 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII 단백질(FVIII)을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰비는 50을 초과하고, 단, 상기 재조합 폴리펩타이드는 구현예 [1] 내지 [66] 중 어느 하나에 따라 정의되는, 용도.
도 1은 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 피하 또는 정맥내 투여 후 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF) (이후 또한 재조합 폴리펩타이드)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 수준을 보여준다. rD’D3-FP는 알부민 성분을 통해 정량하였고 rD’D3-His 데이터는 등몰 농도로 계산한다. 데이터는 시점 당 n=1-4의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타낸다. 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 2는 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 피하 투여 후 재조합 폴리펩타이드의 최대 농도 및 AUC를 보여준다. rD’D3-FP는 이의 알부민 성분을 통해 정량하였고 rD’D3-His 데이터는 등몰 농도로 계산한다. 데이터는 시점 당 n=1-4의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. Cmax 및 AUC0-inf의 평가는 2개-격실-재흡수 모델링에 의해 수행하였고;
도 3은 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 피하 투여 후 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 생물유용성을 보여준다. rD’D3-FP는 이의 알부민 성분을 통해 정량하였고 rD’D3-His 데이터는 등몰 농도로 계산한다. 데이터는 시점 당 n=1-4 마우스로부터 계산된 평균 AUC0-inf으로부터 계산하였다. AUC0-inf의 평가는 2개-격실-재흡수 모델링에 의해 수행하였다. 생물유용성은 rFVIII의 존재 또는 부재하에 상이한 용량에서 rD’D3-FP를 사용하는 3개의 상이한 i.v. 그룹에 대한 rD’D3-FP의 경우에, i.v. 투여와 비교하여 s.c. 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였고;
도 4는 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 피하 또는 정맥내 투여 후 FVIII 활성 혈장 수준을 보여준다. FVIII는 발색성 FVIII 활성으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=2-3의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타내고; 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 5는 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP 또는 rD’D3-His의 피하 투여 후 FVIII 활성 혈장 수준의 최대 농도 및 AUC를 보여준다. FVIII는 발색성 FVIII 활성으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=2-3의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. Cmax 및 AUC0-inf의 평가는 2개-격실-재흡수 모델링에 의해 수행하였고;
도 6은 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재하에 rD’D3-FP 또는 rD’DD' D3-His의 피하 투여 후 발색성 FVIII 활성의 생물유용성을 보여준다 보여준다. 데이터는 시점 당 n=2-3 마우스로부터 계산된 평균 AUC0-inf으로부터 계산하였다. AUC0-inf의 평가는 2개-격실-재흡수 모델링에 의해 수행하였다. 생물유용성은 rFVIII의 존재 또는 부재하에 상이한 용량에서 rD’D3-FP를 사용하는 2개의 상이한 i.v. 그룹에 대한 rD’D3-FP의 경우에, i.v. 투여와 비교하여 s.c. 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. FVIII 용량 및 선택된 rD’D3-FP 용량은 그래프에서 숫자로서 나타내고;
도 7은 돼지에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP의 피하 또는 정맥내 투여 후 재조합 폴리펩타이드 혈장 수준을 보여준다. rD’D3-FP는 이의 알부민 성분으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=1-3 돼지에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타낸다. 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 8은 돼지에서 재조합 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP의 피하 또는 정맥내 투여 후 FVIII 활성 혈장 수준을 보여준다. FVIII는 발색성 FVIII 활성으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=1-3 돼지에 대한 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타내고; 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 9는 FVIII ko 마우스에서 상이한 재조합 FVIII 또는 혈장 유래된 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP의 피하 또는 정맥내 투여 후 재조합 폴리펩타이드 혈장 수준을 보여준다. rD’D3-FP는 이의 알부민 성분을 통해 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=2-3의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타낸다. 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 10은 FVIII ko 마우스에서 상이한 재조합 FVIII 또는 혈장 유래된 FVIII의 존재 또는 부재하에 rD’D3-FP의 피하 또는 정맥내 투여 후 FVIII 활성 혈장 수준을 보여준다(도 8a Beriate®, 도 8b Advate® 및 도 8c ReFacto AF®). FVIII는 발색성 FVIII 활성으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=2-3의 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타내고; 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내;
도 11은 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재하에 rD’D3-FP EYA 또는 rD’D3-CTP의 피하 또는 정맥내 투여 후 재조합 폴리펩타이드 혈장 수준을 보여준다. rD’D3-FP EYA는 이의 알부민 성분을 통해 rD’D3-CTP는 이의 D’D3 성분을 통해 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=3 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타낸다. 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내; 및
도 12는 FVIII ko 마우스에서 재조합 FVIII의 존재하에 rD’D3-FP EYA 또는 rD’D3-CTP의 피하 또는 정맥내 투여 후 FVIII 활성 혈장 수준을 보여준다. FVIII는 발색성 FVIII 활성으로서 정량하였다. 데이터는 시점 당 n=3 마우스에 대해 평균 ± SD로서 나타낸다. 실선은 s.c.를 나타내고 점선은 i.v. 치료를 나타내고; 약어: s.c.: 피하; i.v.: 정맥내.
제1 양상에서, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 치료는 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII(FVIII) 단백질을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과한다.
제2 양상에서, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은
(i) 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 본 발명의 재조합 폴리펩타이드 및
(ii) 인자 VIII 단백질 (FVIII)을 포함하고,
여기서, 상기 약제학적 조성물 내 상기 FVIII 단백질에 대한 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50을 초과하고 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 치료는 상기 약제학적 조성물을 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 투여함을 포함하고 상기 약제학적 조성물은 혈관외 동시 투여를 위해 제형화된다.
제3 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, (i) 인자 VIII (FVIII) 단백질을 포함하는 제1 조성물 및 (ii) 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약제학적 키트에 관한 것이고, 상기 치료는 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질을 혈관외로 대상체에게 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 FVIII 및 상기 재조합 폴리펩타이드는 투여 전, 상기 재조합 폴리펩타이드의 적어도 일부가 상기 FVIII에 결합하도록 하기 위해 키트 내에 제공되고, 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 초과이도록 제공된다.
제4 양상에 따라, 본 발명은 혈액 응고 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 대상체에게 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII(FVIII) 단백질의 유효량을 동시 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과한다.
제5 양상에서, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 재조합 폴리펩타이드는 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 상기 치료는 대상체에게 상기 폴리펩타이드 및 인자 FVIII(FVIII) 단백질을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과한다.
추가의 양상에 따라, 본 발명은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 약물을 제조하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 치료는 대상체에게 상기 폴리펩타이드 및 인자 FVIII(FVIII) 단백질을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과한다.
절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 폴리펩타이드는 본원에서 "본 발명의 폴리펩타이드"로서 또는 "재조합 폴리펩타이드"로서 언급된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 반감기 연장 모이어티(HELM)를 포함한다.
비율
하기 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 단량체, 이량체 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 몰비는, 실제로 단량체 또는 이량체로 존재하던 간에 본 발명의 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛의 몰 농도를 지칭한다. 비율은 동시 투여된 FVIII의 몰 농도 상에서 형성된다. 본 출원에서 FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 비율은, 달리 지시하지 않는 한, 바람직하게 투여될 이량체로서 존재하는, 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된 단량체의 양(몰로)을 투여될 FVIII의 양(몰)으로 나눈 것을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 100 μM의 본 발명의 단량체 폴리펩타이드와 1 μM의 FVIII의 동시-투여는 100의 비율을 의미한다. 100의 동일 비율은 50 μM의 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드가 1 μM의 FVIII와 동시 투여되는 경우 수득된다.
투여되는 FVIII에 대한 투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하거나, 보다 바람직하게 상기 비율은 60 초과, 또는 적어도 75, 적어도 100이거나, 또는 100 초과, 또는 적어도 200, 가장 바람직하게는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500, 또는 적어도 600, 또는 적어도 700, 또는 적어도 800, 또는 적어도 900, 또는 적어도 1,000, 또는 적어도 1,100, 또는 적어도 1,200, 또는 적어도 1,300, 또는 적어도 1,400, 또는 적어도 1,500, 또는 적어도 1,600, 또는 적어도 1,700, 또는 적어도 1,800, 또는 적어도 1,900, 또는 적어도 2,000, 또는 적어도 2,500, 또는 적어도 3,000, 또는 적어도 5,000, 또는 적어도 8,000 또는 10,000 이하이다. 투여될 FVIII에 대한 투여될 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 특정 구현예에 따라 10,000의 비율, 5,000의 비율, 2,500의 비율 또는 2,000의 비율을 초과하지 않을 수 있다.
투여될 FVIII에 대한 투여될 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 50 내지 10,000, 또는 50 초과 내지 5,000, 또는 50 초과 내지 4,000, 또는 50 초과 내지 3,000, 또는 50 초과 내지 2,000, 또는 50 초과 내지 1,000 범위일 수 있다. 바람직하게, 투여될 FVIII에 대한 투여될 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 60 내지 2,500, 또는 110 내지 2,000, 또는 150 내지 1,500, 또는 200 내지 1,000의 범위이다.
정상적인 사람 혈장 (NHP)은 1 U/mL의 농도 또는 정의상 100%의 농도로 VWF를 포함한다. 이는 대략 10 ㎍/mL의 단백질 농도에 상당한다(Haberichter S.L. and Montgomery R.R., Structure and function of von Willebrand factor; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Marder, Aird, Bennett, Schulman and White, Lippincott Williams & Wilkins 2013, pp 197-207). NHP에서의 이러한 VWF 농도 및 18-19%의 글리코실화를 포함하는 약 267,500 Da의 성숙한 VWF 단량체의 분자량을 토대로, NHP에 대하여 대략 37 x 10-9 Mol/L의 VWF 단량체 유닛의 몰 혈장 농도가 산출될 수 있다. 사람 혈장에서 내인성 VEF의 반감기는 약 16h이다 (문헌참조: Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: connecting the far ends. Blood. 2015.125(13):2019-28).
본 발명에 따른 치료에 대한 추가의 상세한 설명을 하기에 추가로 기재한다.
절단된 VWF
본원에 사용된 용어 "폰 빌레브란트 인자"(VWF)는 자연 발생(천연) VWF뿐만 아니라, 적어도 자연 발생 VWF의 FVIII 결합 활성을 보유하는 이들의 변이체, 예를 들면, 1개 이상의 잔기가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 치환된 서열 변이체도 포함한다. FVIII 결합 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정된다.
본 발명에 따른 바람직한 VWF는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열로 나타내어지는 사람 VWF이다. 서열번호 4를 암호화하는 cDNA는 서열번호 3에 나타낸다.
야생형 VWF를 암호화하는 유전자는 9kb의 mRNA로 전사되며, 이는 310,000Da의 추정 분자량을 갖는 2813개의 아미노산들의 프리-프로폴리펩티드(pre-propolypeptide)로 해독된다. 상기 프레-프로폴리펩타이드는 N-말단 22개 아미노산 신호 펩타이드, 이어서, 741개 아미노산 프로-폴리펩타이드(서열번호 4의 아미노산 23 내지 763) 및 성숙 서브유닛(서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 함유한다. N-말단에서 741개의 아미노산 프로폴리펩티드의 절단은 2050개의 아미노산들로 이루어진 성숙한 VWF를 생성시킨다. 사람 천연 VWF 프레-프로폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타낸다. 달리 지적되지 않는 경우, 본 출원에서 VWF 잔기의 아미노산 넘버링은 VWF 분자, 특히 절단된 VWF가 서열번호 4의 모든 잔기를 포함하지 않는 경우라도 서열번호 4를 참조로 한다.
천연 VWF의 프로폴리펩타이드는 다중 도메인을 포함한다. 다양한 도메인 주석(annotation)이 문헌에서 찾을 수 있다(예를 들면, 문헌[Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458]을 참조한다). VWF의 천연 프레-프로폴리펩타이드의 하기 도메인 주석이 본 출원에서 적용된다:
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
서열번호 4를 참조로 하여, 상기 D' 도메인은 아미노산 764 내지 865로 이루어지고; 상기 D3 도메인은 아미노산 866 내지 1242로 이루어진다.
본 발명의 측면에서 "절단된(truncated)"이라는 특성은 상기 폴리펩타이드가 성숙한 VWF의 전체 아미노산 서열(서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 포함하는 것이 아님을 의미한다. 전형적으로, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 모든 아미노산 764 내지 2813을 포함하는 것이 아니라, 이들의 단편만을 포함한다. 또한, 절단된 VWF는 VWF 단편으로서 또는 복수의 VWF 단편들로 지칭될 수 있다.
통상적으로, 상기 절단된 VWF는 인자 VIII에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 성숙한 형태의 사람 천연 인자 VIII에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 재조합 FVIII에, 바람직하게, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII에, 추가로 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단일쇄 인자 VIII에 결합할 수 있다. 인자 VIII로의 절단된 VWF의 결합은 실시예 2에 기술된 바와 같은 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805를 포함하거나 또는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805로 이루어진다. 본원에 달리 나타내지 않는 한, 서열 동일성은 표준 서열의 전장(예를 들면, 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805)에 대해 결정된다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864를 포함하거나 또는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 864로 이루어진다.
다른 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 사용하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 핵산은 그 자체가 공지된 기술에 의해 적합한 숙주 세포에 도입된다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포 내의 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 절단된 성숙 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 핵산은, 상기 폴리펩타이드 내의 절단된 VWF가 VWF의 아미노산 1 내지 763(예컨대, 서열번호 4)을 포함하지 않는다 하더라도 VWF의 아미노산 1 내지 763을 암호화하는 서열(예컨대, 서열번호 4)을 포함할 것이다.
바람직한 구현예에 따른 발명의 재조합 폴리펩타이드의 절단된 VWF는 서열번호 4의 VWF의 아미노산 서열 1 내지 763을 포함할 수 없다.
추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기 절단된 VWF는 각각 서열번호 4를 지칭하는 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다:
776-805; 766-805; 764-805; 776-810; 766-810; 764-810; 776-815; 766-815; 764-815;
776-820; 766-820; 764-820; 776-825; 766-825; 764-825; 776-830; 766-830; 764-830;
776-835; 766-835; 764-835; 776-840; 766-840; 764-840; 776-845; 766-845; 764-845;
776-850; 766-850; 764-850; 776-855; 766-855; 764-855; 776-860; 766-860; 764-860;
776-864; 766-864; 764-864; 776-865; 766-865; 764-865; 776-870; 766-870; 764-870;
776-875; 766-875; 764-875; 776-880; 766-880; 764-880; 776-885; 766-885; 764-885;
776-890; 766-890; 764-890; 776-895; 766-895; 764-895; 776-900; 766-900; 764-900;
776-905; 766-905; 764-905; 776-910; 766-910; 764-910; 776-915; 766-915; 764-915;
776-920; 766-920; 764-920; 776-925; 766-925; 764-925; 776-930; 766-930; 764-930;
776-935; 766-935; 764-935; 776-940; 766-940; 764-940; 776-945; 766-945; 764-945;
776-950; 766-950; 764-950; 776-955; 766-955; 764-955; 776-960; 766-960; 764-960;
776-965; 766-965; 764-965; 776-970; 766-970; 764-970; 776-975; 766-975; 764-975;
776-980; 766-980; 764-980; 776-985; 766-985; 764-985; 776-990; 766-990; 764-990;
776-995; 766-995; 764-995; 776-1000; 766-1000; 764-1000; 776-1005; 766-1005; 764-1005;
776-1010; 766-1010; 764-1010; 776-1015; 766-1015; 764-1015; 776-1020; 766-1020; 764-1020;
776-1025; 766-1025; 764-1025; 776-1030; 766-1030; 764-1030; 776-1035; 766-1035; 764-1035;
776-1040; 766-1040; 764-1040; 776-1045; 766-1045; 764-1045; 776-1050; 766-1050; 764-1050;
776-1055; 766-1055; 764-1055; 776-1060; 766-1060; 764-1060; 776-1065; 766-1065; 764-1065;
776-1070; 766-1070; 764-1070; 776-1075; 766-1075; 764-1075; 776-1080; 766-1080; 764-1080;
776-1085; 766-1085; 764-1085; 776-1090; 766-1090; 764-1090; 776-1095; 766-1095; 764-1095;
776-1100; 766-1100; 764-1100; 776-1105; 766-1105; 764-1105; 776-1110; 766-1110; 764-1110;
776-1115; 766-1115; 764-1115; 776-1120; 766-1120; 764-1120; 776-1125; 766-1125; 764-1125;
776-1130; 766-1130; 764-1130; 776-1135; 766-1135; 764-1135; 776-1140; 766-1140; 764-1140;
776-1145; 766-1145; 764-1145; 776-1150; 766-1150; 764-1150; 776-1155; 766-1155; 764-1155;
776-1160; 766-1160; 764-1160; 776-1165; 766-1165; 764-1165; 776-1170; 766-1170; 764-1170;
776-1175; 766-1175; 764-1175; 776-1180; 766-1180; 764-1180; 776-1185; 766-1185; 764-1185;
776-1190; 766-1190; 764-1190; 776-1195; 766-1195; 764-1195; 776-1200; 766-1200; 764-1200;
776-1205; 766-1205; 764-1205; 776-1210; 766-1210; 764-1210; 776-1215; 766-1215; 764-1215;
776-1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230;
776-1235; 766-1235; 764-1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242;
764-1464; 764-1250; 764-1041; 764-828; 764-865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198;
764-1268; 764-1261; 764-1264; 764-1459; 764-1463; 764-1464; 764-1683; 764-1873; 764-1482;
764-1479; 764-1672; 및 764-1874.
특정 구현예에서, 절단된 VWF는 성숙한 야생형 VWF에 상대적으로 내부 결실을 갖는다. 예를 들어, A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK 도메인 또는 이들의 조합은 결실될 수 있으며, D' 도메인 및/또는 D3 도메인은 보유된다. 추가의 구현예에 따라, 상기 절단된 VWF에는 도메인 A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6 또는 CK 중 하나 이상은 없다. 추가의 구현예에 따라, 절단된 VWF에는 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813, 즉, 도메인 A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK가 없다.
추가의 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 혈소판 당단백질 Ibα(GPIbα), 콜라겐 및/또는 인테그린 αIIbβIII(C1 도메인 내의 RGDS 서열)에 대한 결합 부위를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 GPIbα에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 콜라겐에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 인테그린 αIIbβIII에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 선행 단락에 인용된 상기 아미노산 서열들 중 하나와 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어지고, 단 상기 절단된 VWF는 FVIII에 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 2개의 단량체들이 공유결합되어 있는 경우 본 발명에서 "이량체"라고 칭한다. 바람직하게, 상기 공유 결합은 본 발명의 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치한다. 바람직하게는, 2개의 단량체성 서브유닛들은 적어도 1개의 이황화 가교를 통해, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 이황화 가교에 의해 공유결합된다. 적어도 1개의 이황화 가교를 형성하는 시스테인 잔기는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치한다. 한 구현예에서, 이들 시스테인 잔기들은 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225 또는 Cys-1227, 또는 이들의 조합이다. 바람직하게, 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치된 상기 공유 결합에 추가로 단량체를 연결하는 임의의 추가로 공유 결합을 포함하지 않고, 특히 본 발명의 HLEM 또는 HLEP 부분 내에 위치된 추가의 공유 결합을 포함하지 않는다. 대안적 구현예에 따라, 그러나, 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드는 단량체를 연결하는 폴리펩타이드의 HLEM 또는 HLEP 부분에 위치된 공유 결합을 포함할 수 있다.
상기 이량체는 바람직하게 동종-이량체이고, 여기서, 각각의 단량체는 바람직하게 본원에 기재된 바와 같은 HLEM을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 또는 아미노산 764 내지 1227과 각각 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩타이드들을 포함하거나 또는 이들 폴리펩타이드들로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 또는 아미노산 764 내지 1227과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하거나 또는 이러한 아미노산으로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 아미노산 764 내지 1227 또는 아미노산 764 내지 1242를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
상기 절단된 VWF는 WO 2013/106787 A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 또는 WO 2013/093760 A2에 개시되어 있는 VWF 단편들 중 임의의 하나일 수 있고, 상기 문헌들의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기된 바와 같은 절단된 VWF는 WO　2016/000039　A1에 기재된 바와 같은 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 변형된 버젼의 절단된 VWF는 서열번호 4에 따른 야생형 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열과 비교했을 때, D' 도메인 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 4. 상기 변형된 버젼의 절단된 VWF의 아미노산 서열은 각각의 야생형 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환들을 가질 수 있다. 상기 변형된 절단된 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 4의 D’ 도메인에 비해 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 서열번호 2의 1번 위치에 상응하는 서열번호 4의 764번 위치에서의 S가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 서열번호 2의 3번 위치에 상응하는 서열번호 4의 766번 위치에서의 S는 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것이 또한 바람직하다. 치환의 바람직한 조합은 서열번호 4의 서열을 참조로 하여, S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R 및 S764P/S766L을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화성은 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 표준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 상기 치환에 의해 추가로 증가될 수 있다. 절단된 VWF 내 상기 치환은 동시 투여된 FVIII의 반감기를 증가시키는데 기여할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "내인성 VWF"는 이의 다량체화에 상관 없이 VWF의 단량체성 서브유닛을 언급한다.
반감기 연장 모이어티(HLEM)
상기 절단된 VWF에 추가하여, 본 발명은 폴리펩타이드는 소정의 바람직한 구현예들에서 추가로 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 상기 반감기 연장 모이어티는 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열일 수 있다. 다르게는, 상기 반감기 연장 모이어티는 펩타이드 결합과 다른 공유 결합에 의해 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기는 화학적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(페길화), 글리코실화된 PEG, 하이드록실 에틸 전분(헤실화(HESylation)), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체 또는 히알루론산과 같은 반감기 연장 모이어티의 부착에 의해 연장된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적 링커를 통해 알부민과 같은 HLEP에 접합된다. 이러한 접합 기술의 원리은 컨주켐 엘엘씨(Conjuchem LLC)에 의한 예시적 방식으로 기재된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 7,256,253호를 참조한다).
다른 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 반감기 증진 단백질(HLEP)이다. 바람직하게, HLEP는 알부민 또는 이의 단편이다. 알부민의 N-말단은 상기 절단된 VWF의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 알부민의 C-말단은 상기 절단된 VWF의 N-말단에 융합될 수 있다. 1개 이상의 HLEP들은 VWF의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있고, 단, 이들은 FVIII에 대한 상기 절단된 VWF의 결합 능력을 방해하거나 상실시키지 않는다.
재조합 폴리펩타이드는 추가로 바라직하게 절단된 VWF와 HLEM 사이에 위치된 화학적 결합 또는 링커 서열을 포함한다.
상기 링커 서열은 하나 이상의 아미노산, 특히 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3(예컨대, 1, 2 또는 3)개의 아미노산들로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 바람직하게, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. 상기 링커 서열에 존재하는 바람직한 아미노산은 Gly 및 Ser을 포함한다. 상기 링커 서열은 비-면역원성이어야 한다. 바람직한 링커는 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 적합한 링커는 예를 들어, WO2007/090584에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 HLEM 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이들의 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대한 천연 관용성을 추정할 수 있다. 이의 예는 WO 2007/090584에 제공된다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기재되어 있다.
재조합 폴리펩타이드의 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF와 HLEM 사이의 링커는 서열번호 2의 아미노산 서열 480-510을 갖거나 이들로 이루어진 글리신/세린 펩타이드 링커이다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 1]
tVWF - L1 - H
상기 식 중에서, tVWF는 상기 절단된 VWF이고, L1은 화학 결합 또는 링커 서열이고, H는 HLEM, 특히 HLEP이다.
L1은 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3개(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 아미노산들로 이루어진 화학 결합 또는 링커 서열일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 통상적으로, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. L1에 존재하는 적절한 아미노산의 예로는 Gly 및 Ser이 포함된다. 상기 링커는 비면역원성이어야 하고, 절단불가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다. 절단불가능한 링커는 WO2007/090584 A1호에 예시된 바와 같이 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내의 천연 도메인간 링커로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대해 자연적 내성을 가질 수 있다고 추정할 수 있다. 그 예들은 WO2007/090584호에 제공되어 있다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있다.
바람직한 HLEP 서열들은 상기에 기술되어 있다. 마찬가지로, 각 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산"에 대한 융합 또는 정확한 "C-말단 아미노산"에 대한 융합, 또는 각 HLEP의 "N-말단 아미노산" 또는 "C-말단 아미노산"에 대한 융합이 본 발명에 포함되고, 이는 HLEP의 하나 이상의 아미노산에 대한 N-말단 결실을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 1개 초과의 HLEP 서열, 예를 들어, 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열들은 VWF의 C-말단 부분에 탠덤(tandem)식으로, 예를 들면, 연속적인 반복으로서 융합될 수 있다.
반감기 증진 폴리펩타이드(HLEP)
바람직하게, 반감기 연장 모이어티는 반감기 연장 폴리펩타이드(HLEP)이다. 보다 바람직하게 상기 HLEP는 알부민, 알부민-계열 또는 이의 단편의 구성원, 큰 수역학적 용적을 갖는 용매화된 무작위 쇄(예를 들어, XTEN (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), 동종-아미노산 반복체(HAP) 또는 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-페토단백질, 비타민 D 결합 단백질, 트랜스페린 또는 이의 변이체 또는 단편, 사람 융모성 고나도트로핀-β 서브유닛의 카르복실-말단 펩타이드(CTP), 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히, 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 예를 들어, 생리학적 조건하에서 알부민에, 알부민 계열의 구성원에 또는 이의 단편에 또는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 Fc 단편, 폴리펩타이드 또는 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 바람직하게 면역글로불린 G1의 Fc 단편, 면역글로불린 G2의 Fc 단편 또는 면역글로불린 A의 Fc 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은 반감기 증진 폴리펩타이드는 응고 인자의 치료학적 활성 또는 생물학적 활성을 안정화시키거나 연장될 수 있는, 특히 본 발명의 폴리펩타이드의 생체내 본원에 기재된 전장 반감기 증진 단백질 또는 반감기를 증가시킬 수 있는 본원에 기재된 전장 반감기 증진 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이로 이루어질 수 있거나, 또는 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 100개, 또는 그 이상의 연속된 HLEP 서열의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 HLEP 단편이 해당 HLEP 부재 하에 각 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 25%의 기능적 반감기 연장을 제공하는 한, 각 HLEP의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP 부분은 야생형 HLEP의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이 경우, 그러한 변화는 실질적으로 상기 절단된 VWF의 FVIII-결합 활성을 변화시키지 않는다.
특히, 본 발명에서 제안된 VWF HLEP 융합 작제물은 HLEP의 자연 발생형 다형성 변이체 및 HLEP의 단편을 포함할 수 있다. 상기 HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유동물 HLEP로는 수탉 및 연어가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드의 일부인 HLEM, 특히, HLEP는 또 다른 용어 "FP"로 특정될 수 있다. 바람직하게, 용어 "FP"는 사람 알부민을 나타낸다.
특정 바람직한 구현예에 따라, 상기 재조합 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 본 발명 측면에서 융합 단백질은 절단된 VWF 및 HLEP를 암호화하는 적어도 2개의 DNA 서열의 프레임 내 연결에 의해 생성되는 단백질이다. 당업자는 융합 단백질 DNA 서열의 해독이 단일 단백질 서열을 유도함을 이해한다. 추가의 바람직한 구현예에 따른 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA 서열의 프레임 내 삽입의 결과로서, 절단된 VWF, 적합한 링커 및 HLEP를 포함하는 융합 단백질이 수득될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 동시 투여된 FVIII는 본원에 기재된 HLEM 또는 HLEP 구조물 중 어느 하나도 포함하지 않는다. 특정 다른 구현예에 따라, 동시 투여된 FVIII는 본원에 기재된 HLEM 또는 HLEP 구조물 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
HLEP로서의 알부민
"인간 혈청 알부민"(HSA) 및 "인간 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)이라는 용어는 본 출원에서 상호 교환하여 사용된다. "알부민" 및 "혈청 알부민"이라는 용어가 더 광의적으로, 인간 혈청 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들) 뿐만 아니라 다른 종들의 알부민(및 그의 단편들 및 변이체들)을 망라한다.
본원에서, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를 들면, 생물학적 활성)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총괄하여 지칭한다. 특히, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원의 서열번호 6에 나타낸 인간 알부민 또는 다른 척추동의 알부민의 성숙된 형태 또는 이의 단편들, 또는 이러한 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 지칭한다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 또 다른 용어 "FP"는 HLEP를 식별하고, 특히 HLEP로서 알부민을 한정하기 위해 사용된다.
특히, 본 발명의 제안된 폴리펩타이드는 사람 알부민의 자연 발생 다형성 변이체 및 사람 알부민의 단편를 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다.
본 발명의 바람직한 구현예들은 FcRn 수용체에 대한 결합이 증강된, 본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP로서 사용된 알부민 변이체를 포함한다. 이러한 알부민 변이체는 절단된 VWF의 야생형 알부민과의 융합과 비교했을 때 상기 절단된 VWF 알부민 변이체 융합 단백질의 보다 긴 혈장 반감기를 유도할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 알부민 부분은 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인, 또는 이들의 보존적 변형을 포함할 수 있다.
HLEP로서의 면역글로불린
면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 당해 분야에 치료학적 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물, 또는 그의 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 각각 유도될 수 있다. 항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편들이 HLEP로서 사용될 수도 있다. 치료용 폴리펩타이드 부분은 바람직하게는 항체 또는 펩타이드 링커의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결되며, 이는 심지어 절단할 수도 있다. 수개의 특허 및 특허출원들이 치료용 단백질의 생체내 반감기를 개선하기 위해 면역글로불린 불변 영역에 상기 치료용 단백질을 융합시키는 것에 대하여 기술하고 있다. US 2004/0087778호 및 WO 2005/001025호는 펩타이드의 반감기를 증가시키고 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 제거되는, 생물학적으로 활성인 펩타이드를 갖는 면역글로불린 불변영역의 적어도 일부 또는 Fc 도메인의 융합 단백질에 대하여 설명하고 있다. 증강된 생물학적 활성, 연장된 순환성 반감기 및 더 큰 용해도가 달성된 Fc-IFN-β 융합 단백질에 대해서도 기술되었다(WO 2006/000448호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질은 기재되어 있고(WO 2005/063808 A1), G-CSF와 Fc 융합(WO 2003/076567 A2), 글루카곤-유사 펩타이드-1(WO 2004/000892 A2), 응혈 인자(WO 2004/101740 A2) 및 인터류킨-10(미국 특허 제6,403,077호), 이 모두는 반감기 증진 성질을 갖는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 HLEP는 WO 2013/120939 A1에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 및 시알릴화
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 N-글리칸을 포함하며, 상기 N-글리칸 중 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 부분을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 N-글리칸 중 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 부분을 포함한다. 본 발명자들은 고도로 시알릴화된 VWF 단편을 포함하는 폴리펩타이드가 자체적으로 연장된 반감기를 가질 수 있을 뿐만 아니라 동시 투여된 FVIII의 반감기를 연장시킬 수도 있다는 것을 밝혔다. 다시 말해서, 본 발명의 폴리펩타이드의 투여는 연장된 반감기 및/또는 동시 투여된 FVIII의 감소된 소거율을 유도한다.
본 발명의 폴리펩타이드 바람직하게는 N-글리칸을 포함하며, 상기 폴리펩타이드의 N-글리칸의 시알릴기 중 적어도 50%는 α-2,6-결합된 시알릴기이다. 일반적으로, 말단 시알릴기는 α-2,3- 또는 α-2,6-결합을 통해 갈락토스 기에 부착될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸은 α-2,3-결합된 시알릴기보다 α-2,6-결합된 시알릴기를 더 많이 포함한다. 바람직하게는, N-글리칸의 시알릴기 중 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 α-2,6-결합된 시알릴기이다. 이러한 구현예들은 예컨대, 포유동물 세포에서 공동 발현하는 인간 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제에 의해 얻어질 수 있다.
상기 당단백질을 생성하는 적합한 방법은 계류중인 PCT/EP2016/061440에 기재되어 있다. 따라서, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 36.0℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 당단백질의 이량체를 제조하거나, 또는 상기 당단백질의 이량체화를 증가시키는 방법이 기재되고, 상기 방법은 (i) 당단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 세포를 36.0℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 당단백질 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 적어도 하나의 시알산기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 적어도 하나의 시알산기를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 또는 8% 미만, 또는 6% 미만, 또는 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 비시알산-N-글리칸, 즉, 시알산기가 결여된 N-글리칸이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 또는 8% 미만, 또는 6% 미만, 또는 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 비시알산-N-글리칸인데, 즉, 이들은 시알산기를 함유하고 있지 않다.
본 발명의 다른 구현예들은 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 여기서 상기 절단된 VWF는 인자 VIII(FVIII)에 결합할 수 있고, 여기서 상기 당단백질은 N-글리칸을 포함하고, 여기서 상기 N-글리칸의 바람직하게는 34% 미만, 바람직하게는 33% 미만, 바람직하게는 32% 미만, 바람직하게는 31% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 29% 미만, 바람직하게는 28% 미만, 바람직하게는 27% 미만, 바람직하게는 26% 미만, 바람직하게는 25% 미만, 바람직하게는 24% 미만, 바람직하게는 23% 미만, 바람직하게는 22% 미만, 바람직하게는 21% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 19% 미만, 바람직하게는 18% 미만, 바람직하게는 17% 미만, 바람직하게는 16% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 바람직하게는 14% 미만, 바람직하게는 13% 미만, 바람직하게는 12% 미만, 바람직하게는 11% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 9% 미만, 바람직하게는 8% 미만, 바람직하게는 7% 미만, 바람직하게는 6% 미만, 바람직하게는 5% 미만이 평균적으로 2개 이상의 말단 및 비-시알릴화딘 갈락토스 잔기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예들은 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 여기서 상기 절단된 VWF는 인자 VIII(FVIII)에 결합할 수 있고, 여기서 상기 절단된 VWF는 N-글리칸을 포함하고, 여기서 상기 N-글리칸의 6% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 바람직하게는 3% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 그리고 바람직하게는 1% 미만이 평균적으로 3개 이상의 말단 및 비-시알릴화된 갈락토스 잔기를 포함한다.
상기된 구현예들은 서로 조합될 수 있다. 상기 언급한 N-글리칸의 임의의 비율, 또는 시알릴화의 정도에 대한 임의의 표시는, 평균 비율 또는 정도로서 이해되며, 즉 이들은 단일 분자가 아니라 분자의 집단에 대하여 언급하고 있는 것이다. 당단백질의 군 내에서 개개의 당단백질 분자의 글리코실화 또는 시알릴화는 일부 이종성을 나타낼 것이라는 것은 명백하다.
이량체
본 발명의 폴리펩타이드는 높은 비율의 이량체를 갖는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 이량체로 존재한다. 하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 약 100%가 이량체로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체:단량체 비율은 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 또는 적어도 3이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 이량체로 존재한다. 추가로 바람직한 것은 본 발명의 폴리펩타이드가 다량체 형태를 포함하지 않는다는 것이다. 이량체가 단량체에 비해 인자 VIII에 대해 개선된 친화성을 가지기 때문에, 이량체의 사용이 선호된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체 함량 및 단량체에 대한 이량체의 비는 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 인자 VIII로의 친화성은 동일한 인자 VIII 분자에 대한 사람 고유의 VWF의 친화성 보다 크다. 폴리펩타이드의 인자 VIII 친화성은 사람 본래의, 혈장 유래된 또는 재조합 인자 VIII를 언급할 수 있고, 특히 절단되거나 결실된 B-도메인을 갖는 재조합 인자 VIII 분자를 언급할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5를 특징으로 하는 인자 VIII 분자를 언급할 수 있다.
높은 이량체 비율을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드의 제조는 인자 VIII에 대하여 친화성이 증가된다는 점도 밝혀졌다. 이러한 인자 VIII에 대해 증가된 친화성은 본 발명의 폴리펩타이드에 의한 인자 VIII의 증강된 안정화를 유도하게 된다. 증가된 이량체 비율과 다르게, 또는 이와 조합하여, 인자 VIII에 대한 친화성을 증가시키는 인자 VIII 결합 도메인 내에 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩타이드도 본 발명의 바람직한 구현예가다. 적절한 돌연변이는 예컨대, WO 2013/120939 A1호에 개시되어 있다.
폴리펩타이드의 제조
발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 사람 고유 VWF(서열번호 3)의 프레-프로 형태의 cDNA 서열(서열번호 3)에 기초하여, 상기 언급된 절단된 절단된 VWF 작제물을 암호화하는 재조합 DNA를 설계하여 제조할 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 사람 본래의 VWF의 프레-프로 형태의 아미노산 1 내지 763을 포함하지 않는 경우라도, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들면, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 바람직하게는 아미노산 1 내지 763과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 서열번호 4의 아미노산 1 내지 763을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
DNA가 발현 플라스미드에 정확한 배향으로 삽입된 전체 오픈 리딩 프레임을 포함하는 작제물을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 통상적인 발현 벡터는 플라스미드를 함유하는 세포 내에서 상기 삽입된 핵산에 상응하는 대량의 mRNA의 합성을 지시하는 프로모터를 포함한다. 또한, 이들은 숙주 유기체 내에서 이들의 자가 복제를 가능케 하는 복제 기원의 서열 및 합성된 mRNA가 번역되는 효능을 증가시키는 서열을 포함할 수도 있다. 안정한 장기 벡터는 예를 들어, 바이러스의 조절 요소(예컨대, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 게놈 유래의 OriP 서열)를 사용함으로써 자유롭게 복제하는 독립체로서 유지될 수 있다. 게놈성 DNA에 벡터를 통합한 세포주도 제조될 수 있으며, 이러한 방식으로 유전자 생성물은 지속적으로 생산된다.
통상적으로, 제공되는 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유동물 숙주 세포에 도입함으로써 수득된다.
세포 배양물 및 당단백질의 발현에 대해 민감한 임의의 숙주 세포를 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 포유동물 세포의 비-제한적 예로는 BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/1, ECACC No: 85110503); 사람 망막모세포(PER.C6(CruCell, Leiden, The Netherlands)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(HepG2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; PS4 세포; 사람 양수 세포(CAP); 및 사람 간세포암 세포주(Hep G2)가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포주는 설치류 세포주이고, 특히 CHO 또는 BHK와 같은 햄스터 세포주이다.
원하는 당단백질의 발현을 달성하기에 충분한 핵산을 포유동물 숙주 세포 내에 도입하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al. EP 117,060; 및 EP 117,058]을 참조한다. 포유동물 세포의 경우, 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하는 통상의 방법으로는 Graham 및 van der Erb(Virology, 52:456-457, 1978)의 칼슘 포스페이트 침전법 또는 Hawley-Nelson(Focus 15:73, 1993)의 리포펙타민™(Gibco BRL) 방법이 포함된다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적 양상은 US. Pat. No. 4,399,216에 Axel에 의해 기술되어 있다. 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하기 위한 각종 기법에 대해서는, 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988]을 참조한다.
세포는 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양된다. 상기 폴리펩타이드는 당업계의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 회수 및 정제될 수 있다.
최대 농도, 시간-농도 곡선 이하 면적, 말단 반감기, MRT, 소거율 및 생물유용성
본 발명의 또 다른 양상은 혈관외 투여 후 FVIII의 생물유용성을 제공하거나 증가시키기 위해 상기 정의된 바와 같은 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드의 용도이다. 추가로, 본 발명의 양상은 투여될 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 다른 몰비 미만, 특히 50의 몰비 미만, 60 미만, 75 미만, 100 미만, 200 미만, 300 미만, 400 미만 또는 1000 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한 표준 치료와 비교하여 Cmax, AUC, 말단 반감기 및/또는 평균 체류 시간(MRT)을 증가시키고/시키거나 인자 VIII의 소거율을 감소시키기 위한 이의 용도이다.
약동학 데이터의 평가를 위해, 2개-격실 모델(2단계 약동학 프로필)을 적용하였다.
최대 농도(Cmax)는 모델에 의해 주어진 최고의 혈장 농도이다. 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, FVIII에 대한 최대 농도(Cmax)는 적어도 10 mIU/mL, 적어도 25 mIU/mL, 적어도 50 mIU/mL, 적어도 100 mIU/mL, 적어도 200 mIU/mL, 적어도 300 mIU/mL 또는 적어도 400 mIU/mL, 바람직하게 발색성 FVIII 활성일 수 있다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도(Cmax)는 특정 구현예에 따라 적어도 20　nmol/kg, 적어도 40　nmol/kg, 적어도 60 nmol/kg, 적어도 80 nmol/kg 또는 적어도 160 nmol/kg이다. 바람직하게, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도 (Cmax)가 적어도 5 μg HLEM/mL, 10　μg HLEM/mL, 적어도 15 μg HLEM/mL, 또는 적어도 20 μg HLEM/mL이고, 여기서, 상기 값이 HLEM에 대한 계산을 기준으로 하고, 바람직하게, 상기 값은 바람직하게 사람 알부민에 특이적인 면역검정과 같은 HLEM 특이적 검정을 사용한 정량을 기준으로 한다. 재조합 폴리펩타이드에 대한 최대 농도(Cmax)는 표준 치료와 비교하여 적어도 3배 높을 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일하다.
AUC0-inf 는 제로에서 무제한의 혈장 농도-시간 곡선 이하의 면적이다. 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 동시 투여된 FVIII에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적은 적어도 1000 mIU*h/mL, 적어도 2000 mIU*/mL, 적어도 3000 mIU*h/mL, 적어도 5000 mIU*h/mL, 적어도 10000 mIU*h/mL 또는 적어도 20000 mIU*h/mL의 FVIII 활성, 바람직하게 발색성 FVIII 활성이다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적은 적어도 2 nmol * h/mL, 적어도 3 nmol * h/mL, 적어도 4 nmol * h/mL, 적어도 20 nmol * h/mL, 적어도 40nmol * h/mL 또는 적어도 80 nmol * h/mL이다. 바람직하게, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시 투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적은 적어도 500 μg HLEM*h/mL, 적어도 750 μg HLEM*h/mL, 적어도 1000 μg HLEM*h/mL, 5000 μg HLEM*h/mL 또는 적어도 10000 μg HLEM*h/mL이고, 여기서, 상기 값은 HLEM에 대한 계산을 기준으로 하고, 바람직하게, 상기 값은 바람직하게 사람 알부민에 특이적인 면역검정과 같은 HLEM 특이적 검정을 사용한 정량을 기준으로 한다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 동시 투여된 재조합 폴리펩타이드에 대한 t=0에서 t=∞ (AUC0-inf)까지의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적은 표준 치료와 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 15배 높을 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 치료와 동일하다.
특정 시점 t에서의 "반감기" T1/2(t)는 시점 t에서 존재하는 혈장 농도 C(t)가 반으로 줄어드는데 걸리는 시간이다. "말단 반감기"(후자 문장에서 t1/2로서 약칭됨)는 t가 무한대로 향할 때 T1/2(t)의 한계이다. 이것은 2의 자연 로그를 말단 제거 상수로 나눔에 의해 계산된다.
투여된 FVIII의 말단 반감기는 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가될 수 있고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.2, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 2.5 또는 적어도 3배 만큼 증가할 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만이다. 바람직하게, 동시투여된 FVIII의 말단 반감기는 표준 치료와 비교하여 증가하고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 본 발명에 따른 치료와 동일하다.
재조합 폴리펩타이드의 동시 투여로 이어지는 투여된 FVIII의 말단 반감기는 적어도 5h, 적어도 6h, 적어도 7h, 적어도 9h, 적어도 10h 또는 적어도 15h에 이를 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 혈장 반감기는 내인성 VWF의 것과 비교하여 증가될 수 있고, 여기서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기는 바람직하게 내인성 VWF의 것 보다 적어도 100%, 적어도 200% 또는 바람직하게 적어도 400% 높다.
FVIII와의 동시 투여로 이어지는 재조합 폴리펩타이드의 말단 반감기는 표준 치료와 비교하여, 적어도 10 h, 적어도 15 h, 적어도 20 h, 적어도 25 h, 적어도 30 h 또는 적어도 35 h에 이를 수 있다. 재조합 폴리펩타이드의 말단 반감기는 표준 치료와 비교하여 증가될 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 본 발명에 따른 치료와 동일하다.
본원에서 사용된 "MRT"라는 용어는 약물 분자(예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 FVIII)가 체내에 체류하는 평균 시간을 의미한다. 불변 소거율을 갖는 선형 약동학적 시스템에서, MRT는 AUC0-inf으로 나눈 제1 모멘트 곡선 하의 면적(AUMC0-inf)으로서 계산할 수 있다. 제1 모멘트 곡선은 해당 시점에서의 혈장 농도를 곱한 시간이다. AUMC0-inf는 AUC0-inf에 대해 계산된 아날로그이다.
투여된 FVIII의 평균 체류 시간은 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5배 만큼 증가할 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 비율이 본 발명에 따른 몰비 미만이다.
투여된 FVIII의 MRT는 적어도 10 h, 바람직하게 적어도 15 h, 적어도 20 h 또는 적어도 25 h에 이를 수 있다.
투여된 재조합 폴리펩타이드의 MRT가 증가될 수 있고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2 또는 적어도 3배 만큼 증가될 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 비율이 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는 본 발명의 치료와 동일하다.
본원에 사용되는 "소거율"이라는 용어는 혈장에서 약물이 소거되는 속도를 말한다. 구체적으로, 이는 약물의 현재 혈장 농도로 나눈 약물의 현재 제거 속도이다. 단일 정맥내 투여 후 약동학적 시스템에서, 소거율은 혈장 AUC0-inf에 대한 투여량의 비율로서 계산될 수 있으며, 단, 상기 소거율은 일정하다. 소거율이 낮을수록 혈장에서 약물이 소거될 때까지는 시간이 더 오래 걸린다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 투여된 FVIII 소거율(CL) 값이 표준 치료와 비교하여 감소되고, 바람직하게 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 적어도 7.5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 비율이 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는 본 발명의 치료와 동일하다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 투여된 FVIII의 소거율(CL) 값은 135 mL/kg/h 미만, 80 mL/kg/h 미만, 45 mL/kg/h 미만, 40 mL/kg/h 미만, 35 mL/kg/h 미만, 30 mL/kg/h 미만 또는 25 mL/kg/h 미만이다. 투여된 FVIII의 소거율(CL) 값은 바람직하게 표준 치료의 것 보다 낮고, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일하다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후 상기 재조합 폴리펩타이드의 소거율(CL) 값이 1.0 내지 2.5 mL/kg/h, 또는 1.1 내지 2.2 mL/kg/h 또는 1.2 내지 2.1 mL/kg/h 범위에 이를 수 있다.
상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 소거율(CL) 값은 표준 치료와 비교하여 적어도 2, 적어도 5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드가 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만인 것을 제외하고는, 상기 치료와 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 생물유용성은 본 발명의 폴리펩타이드, 예를 들어, i.v. 투여 후 rD’D3-FP의 AUC0-inf에 상대적으로, 본 발명의 폴리펩타이드, 예를 들어, s.c. 투여 후 rD’D3-FP의 AUC0-inf 퍼센트로서 정의된다.
본 발명은 추가로, 상기 본원에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이지만 예를 들어, 피하 FVIII 투여를 가능하게 위해 상기 구현예 [1] 내지 [66]으로 제한되지 않는다. 본 발명은 특히 추가로 FVIII의 생물유용성을 제공하거나 증가시키기 위한 상기 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
투여된 FVIII의 생물유용성은 재조합 폴리펩타이드와의 동시 투여 후 표준 치료와 비교하여, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 10배 만큼 증가할 수 있고, 여기서, 상기 표준 치료는 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 본 발명에 따른 몰비 미만이다.
상기 재조합 폴리펩타이드와의 동시 투여 후 투여된 FVIII의 생물유용성은 바람직하게 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 바람직하게 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%이다. 재조합 폴리펩타이드와 동시 투여 후 투여된 FVIII의 생물유용성에 대한 추가의 바람직한 범위는 5-80%, 5-70%, 5-60%, 5-50%, 5-40%, 5-30%, 5-25%, 10-25%, 10-15%, 또는 5-15%이다.
상기 FVIII와의 동시 투여 후 재조합 폴리펩타이드의 생물유용성은 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 80%이다.
본 발명의 추가의 양상은 혈액 응고 장애를 치료하는 방법이고, 상기 방법은 상기 본원에 정의된 바와 같은 유효량의 폴리펩타이드를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함한다.
추가의 양상은, 혈우병 A의 치료시 FVIII의 투여 빈도를 감소시키기 위한, 상기 정의되어 있지만, 예를 들면, 상기 구현예들 [1] 내지 [66]에 한정되는 것은 아닌 폴리펩타이드의 용도이다. FVIII의 피하 투여의 빈도는 주당 2회로 감소될 수 있다. 다르게는, FVIII의 피하 투여의 빈도는 주당 1회, 또는 그 미만으로, 예를 들어, 10일마다 1회 또는 14일마다 1회로 감소될 수 있다. FVIII는 매주 2회, 5일마다, 매주 1회, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다 또는 매월 1회, 또는 상기한 수치들 중 임의의 두 수치 사이의 임의의 범위로, 예를 들어, 4일마다 내지 매월, 10일마다 내지 2주마다 등으로 투여될 수 있다.
용어 "트로프 수준"은 본원에서 예방학적 세팅에서 FVIII의 다음 용량이 적용될 혈장 FVIII 농도를 정의하기 위해 사용된다. 현재, 중증 혈우병 A를 갖는 환자에 대해, 추천된 트로프 수준(즉, 신체에 존재하는 응고 인자의 최저 수준)은 1%로 설정된다. 1, 5 및 10% 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL와 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산한다.
바람직하게, HLEM을 갖는 폴리펩타이드와 함께 동시 투여되는 FVIII의 1%, 5% 또는 10% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기는 표준 치료와 비교하여 연장되고, 상기 표준 치료는 FVIII가 상기 HLEM을 갖지 않는 재조합 폴리펩타이드와 함께 투여되는 것을 제외하고는 본 발명에 따른 치료와 동일하다.
상기 폴리펩타이드와 함께 동시 투여되는 FVIII의 1% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기는 적어도 약 30h, 적어도 약 35h, 적어도 약 38h, 적어도 약 40h, 또는 적어도 약 50h이고; 상기 폴리펩타이드와 함께 동시 투여되는 FVIII의 5% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기는 적어도 약 20h, 적어도 약 22h, 적어도 약 29h, 적어도 약 34h, 또는 적어도 43h이거나; 상기 폴리펩타이드와 함께 동시 투여되는 FVIII의 10% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기는 적어도약 5h, 적어도 약 6h, 적어도 약 10h, 적어도 약 18h, 또는 적어도 약 20h이다.
응고 장애의 치료
본 발명의 폴리펩타이드는 혈우병 A 및 폰-빌레브란트 질환을 포함하는 응고 장애를 치료하기 위해 유용하다. "A형 혈우병"이라는 용어는 일반적으로 유전되는 기능적 응고 FVIII에서의 결핍을 가리킨다. 일부 바람직한 구현예에 따른 폰-빌레브란트 질환은 폰-빌레브란트 질환 유형 2N, 폰-빌레브란트 질환 유형 3, 및 폰-빌레브란트 질환 유형 1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 혈액 응고 장애는 중간 정도의 혈우병 A이다. 중간 정도의 혈우병 A는 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII 활성의 약 1% 내지 약 5%인 내인성 FVIII 활성을 특징으로 한다. 전형적으로, 중간 정도의 혈우병 A를 갖는 대상체는 혈장 중 0.01 내지 0.05 IU/mL의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 혈액 응고 장애는 약한 혈우병 A이다. 약한 혈우병 A는 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 약 5% 내지 약 40%인 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다. 전형적으로, 약한 혈우병 A를 갖는 대상체는 혈장 중 0.05 내지 0.4 IU/mL의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서 혈액 응고 장애는 바람직하게 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 1% 미만인 내인성 FVIII 활성 수준과 연관된 중증 혈우병 A이다.
또 다른 구현예에서, 혈액 응고 장애는 폰-빌레브란트 질환 유형 2N이다. 폰-빌레브란트 질환 유형 2N은 바람직하게 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 3% 내지 약 30%에 상응하는 약 3 IU/dL 내지 30 IU/dL FVIII 활성 수준에 있는, 내인성 FVIII 활성 수준을 특징으로 한다. 대부분의 환자들은 20 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 20% 미만의 수준을 갖는다. 따라서, 폰-빌레브란트 질환 유형 2N을 갖는 대상체는 혈장 내 0.03 IU/mL 내지 0.3 IU/mL, 전형적으로 0.2 IU/mL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에서 혈액 응고 장애는 폰-빌레브란트 질환 유형 3이고, 이는 바람직하게 치료 전 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준의 약 1% 내지 약 20%에 상응하는 약 1 IU/dL 내지 20 IU/dL FVIII 활성 수준의 범위에 있음을 특징으로 한다. 대부분의 환자들은 10 IU/dL 미만의 내인성 FVIII 활성 수준을 갖고, 따라서 NHP에서 내인성 FVIII 활성 수준의 10% 미만의 수준을 갖는다.
또 다른 구현예에 따라, 상기 혈액 응고 장애는 치료 전 내인성 FVIII 활성 수준이 NHP 내 내인성 FVIII 활성 수준과 비교하여 감소되어 있음을 특징으로 하는 폰-빌레브란트 질환 유형 1이다.
질환의 치료는 임의의 임상학적 단계 또는 징후의 임의 형태의 질환을 갖는 것으로 이미 진단된 환자의 치료; 상기 질환의 증상 또는 징후의 개시 또는 진전 또는 악화 또는 격화의 지연; 및/또는 상기 질환의 예방 및/또는 상기 질환의 중증도의 감소를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드가 투여되는 "대상체" 또는 "환자"는 사람인 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 상기 사람은 소아 환자이다. 다른 양태에서, 상기 인간은 성인 환자이다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 임의로 FVIII를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 상기 조성물은 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공된다. 이러한 조성물은 (환자에게 이를 투여하는 소정의 방법에 따라) 임의 적절한 형태로 존재할 수 있다.
"인자 VIII" 및 "FVIII" 또는 "인자 VIII 단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환하여 사용되며, 혈장 유래된 FVIII 및 재조합 FVIII 둘 다를 포함한다. 재조합 FVIII는 전장 FVIII 뿐만 아니라, 단일쇄 B-도메인 결실 또는 절단된 변이체 및 2쇄 B-도메인 결실 또는 절단된 변이체, 예를 들어, WO 2004/067566 A1호에 기술된 것들과, B-도메인 외부에 돌연변이를 갖지만 FVIII의 생물학적 활성을 갖는 다른 FVIII 변이체도 제한없이 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 혈관외 경로, 예를 들어, 피하, 경피 또는 근육내로 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 투여 경로는 특정 폴리펩타이드, 대상체 및 질환의 성질 및 중증도 및 대상체의 생리학적 조건에 의존할 것이다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 정맥내 투여될 것이다.
상기 폴리펩타이드 및 FVIII는 바람직하게 피하 동시 투여된다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 FVIII를 사용한 총 투여 횟수 및 치료 기간의 결정은 당업자의 능력 범위내에 있다. 투여될 FVIII 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩타이드의 용량은 투여될 FVIII의 농도, 치료될 환자에서의 내인성 VWF의 농도, 또는 상기 둘 다에 따라 다르다. 본원의 발명자들에 의해 정의된 비율을 기초로 한 유효 용량은 투여될 FVIII의 분자량 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩타이드의 분자량을 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 혈액 응고 장애의 중증도의 정도는 또한 투여될 FVIII 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩타이드의 적당한 용량을 결정하기 위해 고려될 수 있다. FVIII에 대해 전형적인 용량은 약 20 IU/kg 체중 내지 약 1000 IU/kg 체중, 바람직하게 약 20 IU/kg 체중 내지 약 500 IU/kg 체중의 범위일 수 있고, 추가로 약 20 IU/kg 체중 내지 약 400 IU/kg 체중인 것이 추가로 바람직하고 약 20 IU/kg 체중 내지 약 300 IU/kg 체중인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드로 치료 받는 환자는 또한 혈액 응고 인자 FVIII로 치료된다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 인자 VIII는 바람직하게 동시에, 즉, 함께 투여될 수 있지만, 연속 방식의 투여가 또한 수행될 수 있고, 투여 방식 둘 다는 "병용 치료요법" 및 "동시 투여"라는 용어에 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 인자 VIII 혼합물로서, 즉, 동일한 조성물 내에서, 또는 개별적으로, 즉, 별도의 조성물로서 투여될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드와 FVIII 단백질의 동시-투여는 바람직하게 재조합 폴리펩타이드 및 FVIII 단백질을 포함하는 단일 조성물 중에서 함께 투여함에 의해 성취된다. 추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기 재조합 폴리펩타이드와 상기 FVIII 단백질의 동시 투여는 단일 조성물에 블렌딩된 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII를 포함하는 조합 생성물을 제공하거나 투여 전 혼합되도록 구성됨에 의해 제1 생성물이 상기 재조합 폴리펩타이드를 포함하고 제2 생성물이 상기 FVIII를 포함하는, 적어도 2개의 별도 생성물의 세트 또는 키트를 제공함에 의해 성취된다.
특히, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 FVIII 단백질이 동시투여 전 혼합될 별도의 조성물 또는 생성물로 제공되는 경우에, 상기 혼합물은 투여 전 트야 잔 상기 재조합 폴리펩타이드 일정 비율이 상기 FVIII에 결합하도록 허용하는 방식으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합물은 특정 시간 동안 항온처리될 수 있다. 상기 항온처리는 주위 온도에서, 또는 적당한 경우 승온에서, 그러나 바라직하게 40℃의 온도에서 1분 미만 또는 5분 미만에서 수행될 수 있다. 상기 신속한 항온처리 단계는 또한 단일 조성물 중에 블렌딩된 재조합 폴리펩타이드 및 FVIII를 포함하는 조합 생성물을 위한 재구성 동안에 적당할 수 있다.
사용된 조성물 중의 인자 VIII의 농도는 전형적으로 10 내지 10,000 IU/mL의 범위 내이다. 서로 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 FVIII의 농도는 10 내지 8,000 IU/mL, 또는 10 내지 5,000 IU/mL, 또는 20 내지 3,000 IU/mL, 또는 50 내지 1,500 IU/mL의 범위 내이거나, 3,000 IU/mL, 또는 2,500 IU/mL, 또는 2,000 IU/mL, 또는 1,500 IU/mL, 또는 1,200 IU/mL, 또는 1,000 IU/mL, 또는 800 IU/mL, 또는 750 IU/mL, 또는 600 IU/mL, 또는 500 IU/mL, 또는 400 IU/mL, 또는 300 IU/mL, 또는 250 IU/mL, 또는 200 IU/mL, 또는 150 IU/mL, 또는 125 IU/mL, 또는 100 IU/mL, 또는 62.5 IU/mL, 또는 50 IU/mL이며, 단, 본원에 정의된 VWF 본 발명의 폴리펩타이드에 있어서 비율에 관한 요건을 충족한다.
"국제 단위" 또는 "IU"는 "IU"로 국제 표준품(international standard preparation)에 대해 "IU"에서 교정된 표준을 사용하는 1단계 응혈 검정 또는 발색성 기질 FVIII 활성 검정과 같은 FVIII 활성 검정에 의해 측정된 바와 같은 FVIII의 혈액 응고 활성(효능)의 측정 단위이다. 1단계 응혈 분석은 문헌[N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983)]에 기술된 것들과 같이 당업계에 공지되어 있다. 1단계 분석의 원리: 본 시험은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)-분석의 변형된 버전으로서 실행된다: 인지질 및 표면 활성화제와 혈장의 항온배양은 고유의 혈액 응고 시스템의 인자들의 활성화를 유도한다. 칼슘 이온의 부가는 혈액 응고 캐스케이드(cascade)를 촉발시킨다. 측정가능한 피브린 응괴의 형성까지의 시간이 측정된다. 본 분석은 인자 VIII가 결핍된 혈장의 존재 하에 수행된다. 결핍된 혈장의 응혈 능력은 시험될 샘플 중에 포함된 혈액 응고 인자 VIII에 의해 회복된다. 혈액 응고 시간의 단축은 샘플 중에 존재하는 인자 VIII의 양에 비례한다. 혈액 응고 인자 VIII의 활성은 국제 단위에서 인자 VIII의 공지의 활성을 갖는 표준품과의 직접적 비교에 의해 정량화된다.
또 다른 표준 검정은 발색성 기질 검정이다. 발색성 기질 검정은 코어매틱(oamatic) FVIII 시험 키트(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italy)와 같이 상업적으로 구매할 수 있다. 발색성 검정의 원리: 칼슘 및 인지질의 존재 하에, 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이러한 반응은 보조 인자로서의 인자 VIIIa에 의해 자극된다. FVIIIa는 측정하고자 하는 샘플 중의 FVIII로부터의 반응 혼합물 중의 소량의 트롬빈에 의해 형성된다. Ca2+, 인지질과 인자 IXa 및 과량의 인자 X의 최적 농도를 사용하는 경우, 인자 X의 활성화는 인자 VIII의 효능에 비례한다. 활성화된 인자 X는 발색성 기질 S-2765로부터 발색단 pNA를 방출한다. 따라서, 405 nm에서 측정된 pNA의 방출은 형성된 FXa의 양에 비례하며, 그에 따라 샘플의 인자 VIII 활성에도 비례한다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 방법에 적합한 본 발명의 폴리펩타이드의 치료학적 제형은 보관을 위해 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 부형제 또는 안정화제(이의 전부는 본원에서 "담체"로서 나타냄), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 기타 다양한 첨가제와 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수성 용액으로서 조제될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에 대해 비독성이어야만 한다.
완충제는 생리학적 조건을 비슷하게 하는 범위 내로 pH를 유지하는 것을 도와준다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적절한 완충제로는 유기산 및 무기산 모두 및 이들의 염, 예컨대, 시트르산염 완충제(예를 들면, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨염 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 석신산염 완충제(예를 들면, 석신산-석신산일나트륨 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-석신산이나트륨 혼합물 등), 타르타르산염 완충제(예를 들면, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충제(예를 들면, 푸마르산-푸마르산나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루콘산염 완충제(예를 들면, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살산염 완충제(예를 들면, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락트산염 완충제(예를 들면, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등) 및 아세트산염 완충제(예를 들면, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)를 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예컨대, Tris가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 저지하기 위해 첨가될 수 있고, 0.2% 내지 1%(w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적절한 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드 및 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다. 때로 "안정화제"로서 알려져 있는 등장화제는 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 첨가될 수 있으며, 이의 예로는 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 당알콜, 예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는 벌킹제(bulking agnet)에서부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 예방하는 것을 돕는 첨가제까지 기능상 다양할 수 있는 광범위한 범주의 부형제를 지칭한다. 통상적인 안정화제는 다가 당알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당알콜, 예를 들면, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등(이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제, 예를 들면, 우레아, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들면, 10개 이하의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예컨대, 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 디사카라이드, 예를 들면, 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트리사카라이드, 예를 들면, 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들면, 엑스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 1중량부당 0.1 내지 10,000 중량 범위 내로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는, 치료제를 가용화시키는 것을 돕기 위해서 뿐만 아니라 교반으로 유도된 응집에 대해 치료학적 단백질을 보호하기 위해서도 첨가될 수 있으며, 또한 제제가 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받는 전단 표면에 노출되도록 한다. 적절한 비이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml의 범위, 또는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
기타 다양한 부형제로는 벌킹제(예를 들면, 전분), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 산화방지제(예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매를 포함한다.
본원의 제제는 본 발명의 폴리펩타이드 이외에 제2 치료제를 함유할 수 있다. 적합한 제2 치료제의 예는 하기에 제공된다.
투약 스케쥴은 질환의 유형, 질환의 중증도 및 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 환자의 민감도를 비롯한 다수의 임상학적 요인들에 따라 매월 1회 내지 매일 1회로 다를 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 매주 2회, 5일마다, 매주 1회, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다 또는 매월 1회, 또는 상기한 수치들 중 임의의 두 수치 사이의 임의의 범위로, 예를 들어, 4주마다 내지 매월, 10일마다 내지 2주마다 등으로 투여된다.
투여되는 본 발명의 폴리펩타이드의 용량은 특정 폴리펩타이드, 대상체 및 질환의 특성 및 중증도, 대상체의 생리학적 조건, 치료학적 용법(예를 들면, 제2 치료학적 제제가 사용되는지의 여부), 및 선택된 투여 경로에 따라 다양할 것이고; 적절한 용량은 당해 분야 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 최적의 양 및 개별 용량의 간격은 치료되는 병태의 특성 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료되는 특정 대상체의 연령 및 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 궁극적으로 사용되는 적절한 용량을 결정할 것임이 당해 분야 숙련가에 의해 인지될 것이다. 이러한 용량은 적절하게 자주 반복될 수 있다. 부작용이 발생하는 경우에는, 정상적인 임상 실무에 따라서 용량의 양 및/또는 빈도가 변경되거나 감소될 수 있다.
약제학적 조성물은 바람직하게 혈관외로 투여되도록, 바람직하게 피하 투여되도록 제형화한다.
당업자는 본원에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것들과 다른 변화 및 변형에 민감할 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명은 취지 및 범위내에 속하는 모든 상기 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다. 본 발명은 또한 본 명세서 내에 개별적으로 또는 총괄적으로 언급되거나 지적된 특성, 조성물, 단계 및 화합물 모두, 및 상기 특성, 조성물, 단계 및 화합물 중 임의의 2개 이상의 모든 조합을 포함한다.
서열 목록에 나타낸 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 표 1에 요약한다.
[표 1]
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본 발명의 특정 구현예는 지금 단지 설명을 목적으로 의도된 하기의 실시예를 참조로 기재되고 이전에 기재된 일반론의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
D'D3 알부민 융합 단백질(D'D3-FP)의 생성:
VWF 아미노산 1 내지 1242를 암호화하는 cDNA, 글리신/세린 링커 및 사람 알부민의 cDNA로 이루어진 D'D3-FP에 대한 발현 카세트는 커스텀(custom) 유전자 합성(Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)에 의해 제조하였다. 플랭킹(flanking) 제한 부위(EcoRI, NotI)를 통해 발현 카세트는 공급된 클로닝 벡터로부터 절제되었고, EcoRI 및 NotI를 이용하여 선형화된 pIRESneo3 벡터(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에 삽입되었다. 수득한 발현 플라스미드는 CMV 프로모터 제어 하에 짧은 링커 암호화 서열을 통해 알부민 암호화 서열에 융합된 VWF 프로펩타이드, D' 및 D3(서열번호 4의 VWF 아미노산 1 내지 1242)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하였다. 암호화 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로서 표시되고, 성숙한 D'D3-FP의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 나타낸다. 발현 동안에 D1D2 VWF 프로펩타이드(741 아미노산)의 존재는 합성된 폴리펩타이드의 이량체화를 위해 중요하다.
유사한 접근법을 사용하여 His-태그된 D'D3 단백질(글리신/세린 링커에 의해 링크된 D'D3과 His8) 및 또한 글리신/세린 링커를 통해 링크되고 D'D3 융합 단백질의 C-말단에서 8개의 히스티딘에 의해 태그된 사람 융모성 고나도트로핀- 서브유닛의 C-말단 펩타이드에 대한 D'D3 융합 단백질에 대한 발현 플라스미드를 생성하였다. 성숙 D'D3-His의 아미노산 서열은 서열번호 7로서 나타내고, 성숙 D'D3-CTP의 아미노산 서열은 서열번호 8로서 나타낸다.
상기 기술된 발현 플라스미드는 XL10 Gold(Agilent Technologies)에서 성장시켰고 표준 프로토콜(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 정제하였다.
CHO K1 세포는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 형질감염시켰고, 500 내지 1000 ㎍/ml 제네티신(Geneticin)의 존재 하에 무혈청 배지(CD-CHO, Invitrogen)에서 성장시켰다. WO2007/144173 A1에 기재된 바와 같은 PACE/푸린(pFu-797)을 암호화하는 발현 플라스미드를 공동-형질감염시켜 프로펩타이드 절단 효능을 최대화하였다. 단일 세포 유도된 클론을 성장시켰고, 알부민 특이적 효소 면역검정(하기 참조)에 의해 정량된 이들의 D'D3-FP 발현 수율에 따라 선별하였다. D'D3-FP 발효에 대해 최종 선별된 세포주를 T2050-CL3이라고 호칭하였다.
D'D3-FP의 생산은 관류 방식으로 발효 공정을 적용하는 생물반응기(bioreactor)에서 수행하였다. D'D3-함유 폴리펩타이드의 생산을 위한 발효 공정은 세포주 T2050-CL3의 해동으로 시작하였고, 진탕 플라스크에서의 세포 확장 및 마지막으로 Sartorius BioStat B-DCU 5L 생물반응기 및 BioStat STR 50L 단일-사용 생물반응기를 사용한 관류 방식으로의 발효 공정으로 이어졌다. BioSeps 10L 또는 200L(Applikon)은 각각 세포 보유 장치로 사용되었다. 세포 배양 배지는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3(Lonza BESP1204) 또는 10 mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5(Lonza BESP1072)이었다.
진탕 플라스크에서의 씨드 트레인(seed train)은 160 rpm의 진탕 속도로 37℃, 7.5% CO2에서 수행하였다.
5L 생물반응기에 2.5 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3에서 +37.0℃의 온도, 7.00의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. +37.0℃에서 실행된 생물반응기로부터의 최초 수거물을 취한 후 +34.0℃(평가된 범위 +31.0℃ 내지 +35.0℃)로의 온도 이동(shift)을 수행하였다. pH는 산으로서의 살포된(sparged) CO2 및 염기로서의 NaHCO3를 이용하여 제어하였다. 오버레이 기류 속도(overlay air flow rate)를 0.5 L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 링 스파저(ring sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식(down pull mode)의 2배 피치 블레이드 임펠러(2fold pitch blade impeller)를 이용하여 150 rpm이었다.
50L 생물반응기에 3.0 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 10 mm의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5 배지에서 +37.0℃의 온도, 6.90의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. 최초 1 또는 2회의 수거 후 +34.0℃로의 온도 이동을 수행하였다. pH는 상기와 같이 제어하였고, 오버레이 기류 속도를 2 L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 마이크로 스파저(micro sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식의 2배 피치 블레이드 임펠러를 이용하여 90 rpm이었다.
생물반응기 내의 VCD가 1.0 x 106 세포/mL 이상이었을 때에 관류를 개시하였다. 관류 속도를 1.0 용적/용적/일로 설정하였다. BioSep은 5(10)분 실행 시간 및 7(30) W의 전력 입력으로 10초의 역 플러시(back flush)를 이용한 역 플러시 방식으로 작동되었다(괄호 안의 숫자는 50L 생물반응기를 나타낸다). 관류액 및 혈액은 직렬(inline) 여과되었고 +2℃ 내지 +8℃에서 48시간에 걸쳐 백(bag)에 수집하였다. VCD는 2 g/L 글루코스의 표적을 갖는 파라미터로서 글루코스 소비를 이용한 혼탁도 프로브를 사용하여 활성 출혈에 의해 제어되었다. 수거물 및 혈액은 직렬 여과되었고 일회용 필터와 일회용 백으로 구성된 수거 시스템은 2일마다 교체되었다.
하기 기술되는 PK 분석을 위한 재료를 제조하기 위해서 D'D3 알부민 융합 단백질 수거물을 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, 생물반응기로부터의 세포-불포함 수거물은 30kD 막(예를 들면, Pall Centramate OS030T12)을 갖는 TFF 시스템(예를 들면, Pall Centramate 500 S)을 이용하여 30배 농축시켰다. 해당 농축물은 0.75 M NaCl 및 5 mM EDTA의 최종 농도로 NaCl 및 EDTA를 급등시켰고(spiked), 20 mM Tris 완충액 pH 7.4를 이용하여 사전-평형화된(pre-equilirated) CaptureSelect 사람 알부민 컬럼(Life Technologies)에 밤새 부하하였다. 평형화 완충액으로 상기 컬럼을 세척한 후, 용출 완충액(20 mM Tris, 2M MgCl2, pH 7.4)을 이용하여 rD'D3-FP를 용출시켰다. 이어서, 상기 용출물을 10배 농축시켰고, 30kD 컷오프(cut-off)를 갖는 초 원심분리 필터(예를 들면, Amicon. UFC903024)를 이용하여 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석시켰다. 단량체 부분으로부터 rD'D3-FP 이량체를 분리하기 위해, 해당 재료를 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4로 사전-평형화된 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare Code: 17-1069-01) 상에 로딩하고 D’D3-FP 이량체를 항유하는 피크 분획물을 모았다. 이량체 및 단량체 피크 분획에 대한 곡선 아래 면적은 이량체 대 단량체 비를 계산하는데 사용하였다. 상기 D'D3-알부민 융합 단백질의 이량체 제제는 약동학 실험에 사용하였다. 상기 이량체 제제는 하기에서 달리 지적되지 않는 경우 D’D3-FP로 언급된다.
rD’D3-FP EYA 변이체는 균등한 방법 단계에 의해 생성되었다.
His-태그된 D'D3 단백질을 Ni-킬레이트 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, 농축된 세포-불포함 생물반응기 수거물(상세설명에 대해서는 상기를 참조한다)을 사전평형화된(20 mM 나트륨 포스페이트/500 mM NaCl, pH 7.4) Ni-세파로스 컬럼(HisTrapTM, GE Healthcare)에 밤새 부하하였다. 상기 컬럼을 20 mM 나트륨 포스페이트 / 500 mM NaCl / 30 mM 이미다졸, pH 7.4를 이용하여 세척한 후, 20 mM 나트륨 포스페이트 + 500 mM NaCl + 500 mM 이미다졸, pH 7.4를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 이어서, 상기 용출물을 농축시켰고, Amicon 초원심분리 필터(상기 참조)를 이용하여 투석시켰다(TBS, pH 7.4). 이어서, 최종 생성물을 SEC 컬럼(상기 참조) 상에 부하하였고, 이량체를 함유한 피크 분획을 풀링하였고, 약 7　mg/mL OD280-320으로 농축시켰다. His-태그된 D'D3 단백질의 이량체 제제는 약동학 실험을 위해 사용하였다. 상기 이량체 제제는 하기에서 달리 지적되지 않는 경우 D’D3-His로 언급된다.
실시예 1 rD’D3-FP 또는 이의 변이체의 존재하에 재조합 FVIII의 피하 생물유용성
혈관외 주사가 FVIII와의 개선된 치료요법을 위해 옵션이 될 수 있는지를 평가하기 위해, 혈관외 치료요법, 즉, 피하(s.c.) 주사를 위해 전형적으로 대표적인 것이 선택되었다. 본원 발명자들은 상이한 접근법에서 FVIII의 피하 생물유용성에 대한, 절단된 VWF를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 영향을 특징 분석하는 것을 목적으로 하였다:
ㆍ 실시예 1.1 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 마우스에서 둘 다 피하로 투여된 rD’D3-FP 및 rVIII-단일쇄의 조사.
ㆍ 실시예 1.2 생리학적 내인성 FVIII를 갖는 모델에서, 즉 돼지에서 둘 다 피하로 투여된 rD’D3-FP 및 rVIII-단일쇄의 조사.
ㆍ 실시예 1.3 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 마우스에서 각각 피하로 투여된 상이한 FVIII 제품에 대한 rD’D3-FP의 효과 조사.
ㆍ 실시예 1.4 마우스 혈우병 A 모델, 즉, FVIII ko 마우스에서 둘 다 피하로 투여된, 비-알부민 HELP 및 rVIII-단일쇄를 갖는 rD’D3 분자인 rD’D3-FP 친화성 변이체의 효과 조사.
따라서, 본원 발명자는 재조합 FVIII와 피하로 동시에 투여되는 경우 링커 펩타이드를 통해 알부민에 융합된 VWF의 D' 및 D3 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 영향을 조사하였다.
실시예를 위해, 서열번호 2에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 사용하였다. 상기 특정 융합 단백질은 VWF D'D3 영역을 나타내는 1 내지 479의 N-말단 아미노산 서열(사람 고유 VWF의 아미노산 764 - 1242)에 이어서 31 아미노산 글리신/세린 링커 펩타이드 및 511 - 1095의 C-말단 사람 알부민 아미노산 서열로 이루어진다. 서열번호 2에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 상기 융합 단백질은 하기에서 rD’D3-FP 또는 rD’D3-FP WT로서 언급된다.
실시예의 목적을 위해, 서열번호 5에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 재조합 B-도메인-결실된 단일쇄 FVIII, 즉, rVIII-단일쇄를 사용하였다. 실시예 1.3에서, 상이한 재조합 FVIII 제품을 시험하였다.
추가로, 본원 발명자는 rVIII-단일쇄에 대한 rD’D3-FP의 상이한 비율의 영향을 조사하였다.
피하 가용성을 위한 잠재적 매개체로서 알부민 융합의 영향은 rD’D3-FP의 생물유용성을 His-태그된 rD’D3(rD’D3-His)의 것과 비교함에 의해 조사하였다. 성숙한 rD’D3-His의 아미노산 서열은 서열번호 7에 나타내고, 여기서, D' D3 및 His8은 글라이신/세린 링커에 의해 연결된다.
반감기 연장 폴리펩타이드(HLEP)로서 알부민에 대한 대안으로서, 일부 실시예에서 알부민 대신 글라이신/세린 링커를 통해 rD’D3에 융합된 CTP(사람 융모성 고나도트로핀 -ß 서브유닛의 C-말단 펩타이드)(이후부터 rD’D3-CTP로서 언급됨)를 갖는 rD’D3-FP 변이체를 사용하였다. 융합 단백질 rD’D3-CTP는 서열번호 8에 한정된 바와 같은 서열을 갖는다.
특정 실시예에서, rD’D3-FP의 또 다른 고친화성 변이체를 사용하였다. 상기 특정 변이체 융합 단백질은 VWF D' D3 영역을 나타내는 1-479의 N-말단 아미노산 서열(사람 고유 VWF의 아미노산 764 - 1242)에 이어서 31 아미노산 글리신/세린 링커 펩타이드 및 511 - 1095의 말단 사람 알부민 아미노산 서열로 이루어지고, 단 상기 폴리펩타이드의 D' 도메인 내에는 3개의 아미노산 치환, 즉, S764E, S766Y 및 V1083A가 존재한다. 상기 융합 단백질은 D’D3 영역 내에 상기 3개의 치환, 즉 S764E, S766Y 및 V1083A를 갖는 서열번호 2에 정의된 바와 같은 서열로 이루어진다. 상기 변이체는 이후 rD’D3-FP EYA로서 언급된다.
재료 및 방법
배경 정보
상이한 rD‘D3-FP:rVIII-단일쇄 조합의 비율을 계산하기 위해, 다음과 같은 가정이 이루어졌다:
ㆍ 약물은 이들의 투여 후 체중 kg당 40mL의 혈장에 희석된다.
ㆍ 사용되는 본 발명의 폴리펩타이드의 분자량: 단량체성 서브유닛 (글리코실화를 포함하는)의 rD'D3-FP 분자량: 127,000 Da (HLEM = 사람 알부민); 단량체성 중량은 계산된 비율로 사용하였다
ㆍ rD’D3-His의 분자량: 단량체성 서브유닛(글리코실화를 포함하는)의 rD'D3-His 분자량: 64,000 Da; 단량체성 중량은 계산된 비율로 사용하였다
ㆍ rD’D3-FP EYA 변이체의 분자량: 단량체성 서브유닛 (글리코실화를 포함하는)의 rD'D3-FP 분자량: 127,000 Da; 단량체성 중량은 계산된 비율로 사용하였다
ㆍ rD’D3-CTP의 분자량: 단량체성 서브유닛(글리코실화를 포함하는)의 rD'D3-CTP 분자량: 69,800 Da; 단량체성 중량은 계산된 비율로 사용하였다
ㆍ 사용된 FVIII의 분자량: rVIII-단일쇄 분자량(글리코실화 존재): 180,000Da 및 비활성: 180,000 Da 및 비활성(specific activity): 11,000 IU/mg
ㆍ 사용되는 다른 FVIII 제품의 분자량:
o Beriate®: 분자량: 285,000 Da 및 비활성(specific activity): 5,000 IU/mg
o Advate®: 분자량: 280,000 Da 및 비활성(specific activity): 7,000 IU/mg
o ReFacto AF®: 분자량: 170,000 Da 및 비활성(specific activity): 10,700 IU/mg
Beriate®는 제조원(CSL Behring) 기원의 혈장 유래된 사람 FVIII 생성물이다.
Advate®는 제조원(Baxter AG, Vienna, Austria)으로부터 구매하였고 재조합 전장 인자 VIII 제제이다.
ReFacto AF®는 제조원(Pfizer Limited, Kent, United Kingdom)으로부터 구매하였고 B-도메인이 결실된 재조합 인자 VIII 제제이다.
분석
rD’D3-FP(EYA 변이체 뿐만 아니라 야생형)는 사람 알부민 ELISA에 의해 정량된, 즉 단백질의 알부민 부분을 측정하는 용량 수준으로 적용하였다. 상기 rD’D3-FP ELISA는 또한 혈장 샘플을 위해 사용하였다.
사람 알부민 ELISA는 제조원(Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, USA))으로부터의 폴리클로날 염소 항-사람 알부민 포획 항체를 사용하였다. 검출 용액은 폴리클로날 퍼옥시다제 표지된 항-사람 알부민 검출 항체 제제(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, USA)로 이루어진다. 발색성 판독, 즉, 제조원 (Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터의 TMB는 중단 후 직접적으로 450/650 nm에서 마이크로플레이트 판독기(ELx808, BioTek, USA)에서 정량을 위해 사용하였다. 표준물로서, rD’D3-FP를 함유하는 약물 제형을 사용하였다. rD’D3-FP 양은 mg 알부민으로 주어지고, 즉, 분자의 D’D3 부분에 대해 어떠한 조정도 수행하지 않았다.
rD’D3-His 및 rD’D3-CTP 작제물의 용량 수준은 OD280에서 측정하였고 단백질 양은 rD’D3-His에 대한 rD’D3-FP 양과 등몰 농도로 조정하였다. 이에 의해, rD’D3-His에 대한 유닛은 rD’D3-FP에 대한 것과 동일하고, 즉. 이것은 그래프에서 이론적mg 알부민으로서 플롯팅한다. rD’D3-CTP는 rD’D3-FP (EYA 변이체)와 유사한 몰비로 투여하였고 상기 유닛은 알부민에 전달되지 않지만 rD’D3-CTP로서 주어진다. rD’D3-His 및 rD’D3-CTP를 함유하는 PK의 혈장 샘플은 항-D’D3 ELISA에서 측정하였다. 상기 D’D3 ELISA는 모노클로날 항-사람 D’D3 포획 항체를 사용하였다(실험실 연구 제조에서). 검출 용액은 또 다른 모노클로날 퍼옥시다제 표지된 항-사람 D’D3 검출 항체로 이루어진다(실험실 연구 제조에서). 발색성 판독, 즉, 제조원(Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터의 TMB는 중단 후 직접적으로 450/650 nm에서 마이크로플레이트 판독기(ELx808, BioTek, Vermont, USA)에서 정량을 위해 사용하였다. 표준물로서, rD’D3-His 및 rD’D3-CTP를 함유하는 약물 제형을 사용하였고 이전과 같이 rD’D3-FP와 비교하여 등몰 농도로 계산된 rD’D3-FP에 대해서는 즉, 다시, 양은 이론적 mg 알부민으로 투여된다. rD’D3-CTP 양은 rD’D3-CTP 농도로서 투여된다.
FVIII 발색성 활성 혈장 수준은 제조업자의 시험 지침 매뉴얼에 따라 COAMATIC® FVIII 검정(FVIII:C 발색성 검정, Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milan, Italy)에 의해 검출하였다. FVIII 발색성 활성은 FVIII:C로서 약칭한다.
사람 FVIII:Ag 혈장 수준은 시험 지침 매뉴얼에 따라 제조원(Stago, S.A.S., France)으로부터 FVIII 아서라크롬(Asserachrom) ELISA 시험 키트를 사용하여 결정하였다. 아서라크롬 시험키트는 중단 용액을 제외하고는 모든 시약을 함유하였고, 상기 중단 용액은 제조원(Siemens Healthcare (Eschborn, Germany))으로부터 수득하였다. 표준물로서, rVIII-단일쇄를 함유하는 약물 제형을 사용하였다.
동물
FVIII ko 마우스
FVIII ko 녹아웃(ko) 마우스(혈우병 A 표현형을 나타내는)를 선택하였는데 그 이유는 이들이 FVIII 유전자의 엑손 16 및 17이 결여되어 있음에 따라서 혈장 인자 VIII 활성을 갖지 않기 때문이다(Bi L. et al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121; Bi L. et al, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450). 이것은 이들 마우스의 혈장 중 FVIII 활성의 정량에 의해, FVIII를 사용한 치료 후 FVIII 활성 수준의 분석을 가능하게 한다.
17 내지 35 g의 체중 범위에서 수컷 및 암컷 ko 마우스는 연구소(harles River Laboratories (Sulzfeld, Germany))에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물들을 표준 하우징(housing) 조건으로, 즉, 12h/12h 명암 사이클 하에서 20 내지 24℃로 유지하였다. 동물들은 표준 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest, Germany)로 자유 급식하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
그룹 크기는 n=12이었고, 3 또는 4개의 코호트(cohort)로 나뉘었다. 따라서, 시점당 n=3-4 마리의 동물이 사용되었다.
돼지
돼지는 이들이 인간에 대한 예측과 관련하여 피하 생물유용성에 대해 양호한 모델을 나타내기 때문에 선택되었다.
23-27 kg의 체중 범위에서 수컷 돼지는 연구소(Schlosser (Schwalmtal, Germany))에서 사육하였다. 실험실 내에서, 상기 동물은 18-21°C에서 스트로우 상에서 안정한 상태로 유지하였다. 동물에게 상처난 낟알을 공급하였다. 수돗물을 자유 공급하였다. 가축 사육 및 연구 절차는 독일 동물 복지법 및 유럽 연합 규정을 준수하였다.
상기 그룹 크기는 2 (정맥내) 또는 3 (피하)이었다.
실시예 1.1 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 마우스에서 둘 다 피하로 투여된 rD’DD' D3-FP 및 rVIII-단일쇄의 조사.
실험의 세부사항
시험 제품을 총 5 mL/kg의 용적으로 단일 주사에 의해 목에서 s.c. 또는 측면 꼬리 정맥으로 i.v. 투여하였다. 투여된 용량 수준 및 경로는 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
rD’D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 0.3 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 적용하고, rVIII-단일쇄 용량은 50 내지 400 IU/kg 발색성 FVIII 활성 범위이다. rVIII-단일쇄는 주사용수로 재구성하고 rD’D3-His 뿐만 아니라 rD’D3-FP를 물 욕조에서 해동시켰다. 동시 투여를 위해, 화합물은 +37℃에서 대략 30분동안 함께 항온처리하였다. 모든 경우에, 5 mL/kg의 용량 용적을 투여하고 FVIII에 대한 희석 완충액은 필요한 만큼 화합물의 용해를 위해 사용한다.
혈액 샘플은 교호 샘플링 계획을 사용하여 단기 마취하에 안구뒤에서 취하였다. s.c. 그룹에서 시점은 3, 8, 16, 24, 48, 72, 및 96 h p.a. (400 IU/kg rVIII-단일쇄 및 10 mg/kg rD’D3-FP + 400 IU/kg rVIII-단일쇄 그룹을 제외하고는)이고, i.v. 그룹에서는 5 분, 3, 8, 24, 48, 72, 및 96 h p.a이다. PK 프로파일은 그룹 당 마우스의 3 또는 4 코호트 및 시점 당 n=3-4 동물로부터 로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성, 알부민 및/또는 D’D3-His의 결정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성 및 선택된 그룹에서, 사람 FVIII 활성을 측정하였다.
생물통계학
최대 농도(Cmax), t=0 내지 t=∞ (AUC0-inf)의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적, 평균 체류 시간(MRT), 소거율(CL) 및 말단 반감기(t1/2)의 평가는 i.v. 계산에서 2-격실 모델링에 의해 그리고 s.c. 계산에서 2-격실-흡착 모델링에 의해 수행하였다. 파라미터 평가를 위해, 중량 최소-제곱 비용 함수를 적용하였다. 생물유용성은 i.v. 투여와 비교하여 s.c 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. 1, 5 및 10% 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL와 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산하였다.
결과
D’D3 데이터의 평가
D’D3(rD’D3-FP 및 rD’D3-His, 각각 알부민 융합의 존재 또는 부재)의 2개의 작제물은 s.c. 투여 후 흡수하였다. rD’D3-FP는 심지어 0.3mg/kg의 최적 용량에서도 96 h의 전체 관찰 기간에서 정량될 수 있고, 즉, 이것은 23.4 ng/mL의 검출 한계치 초과로 남았다(도 1). 그러나, rD’D3-FP는 rD’D3-His와 비교하여 상당히 높은 수준에서, 특히 후반 시점에서 검출될 수 있다.
곡선의 일부는 마지막 2개 측정 포인트에서 높은 유사성을 보여주었고, 이것이 말단 단계에서 혈장 농도 곡선의 "평탄화"를 유도하였다. 이에 의해, 소거율, MRT, t1/2 및 AUC0-inf의 평가는 마지막 시점을 포함하는 경우 극히 길게 평가되었다. 제2 계산은 생물활성의 과대평가를 피하기 위해 마지막 시점 없이 수행하였고; 데이터의 비교는 표 3에 나타내고 마지막 시점이 없는 데이터와 다른 데이터와 양호하게 일치함을 보여준다. 따라서, 표 및 그래프에서(도 1을 제외하고), 96 h 데이터포인트 없이 제2 데이터세트를 사용하고 이는rD’D3-FP의 생물유용성을 과소평가할 수 있다.
Cmax 및 AUC0-inf는 부가된 rFVIII와는 독립적으로 0.3-10 mg/kg rD’D3-FP 및 0-400 IU/kg rVIII-단일쇄의 시험된 범위에서 용량-의존성을 보여주었다(표 3, 도 2). 보다 낮은 노출과 관련하여, rD’D3-His의 Cmax 및 AUC0-inf 둘 다는 상응하는 rD’DD' D3-FP 용량에 대한 것 보다 관련성 있게 낮았다. 세부적으로, s.c. 투여에 대해, Cmax는 >3-배 낮고 AUC0-inf는 >16-배 낮았다.
소거율, MRT 및 t1/2는 rD’D3-FP에 대해 용량 의존성을 보여주지 않았다. s.c. 평가에서 높은 가변성은 시간 곡선에 대한 고른 노출을 위해 올바른 곡선을 피팅하는 것이 어려운 경향이 있다. 소거율 값은 s.c. 후 1.2-2.1 mL/kg/h의 범위내에 있고 i.v. 투여 후 약간 낮았다(0.8-0.9 mL/kg/h). 이와 일치하여, MRT(t1/2) 범위는 s.c.에 대해 41-117 h(15-90 h)이었고 i.v. 투여에 대해서는 55-83 h (39-69 h)이었다. 대조적으로, rD’D3-His의 제거는 보다 신속하였고, 즉. 소거율은 s.c. 후 34.8 mL/kg/h이었고 i,v, 투여 후 11.8 mL/kg/h(>13 배 차이)이었고, MRT는 s.c. 후 11 h 및 i.v. 투여 후 5 h(>3 배 차이)이었고 t1/2은 s.c. 후 7 h 및 i.v. 투여 후 6h((>2 배 차이)이었다.
중요하게, 피하 투여 후 rD’D3-FP의 생물유용성은 40-79%의 범위이고 다시 실험 내 상이한 그룹의 매우 높은 가변성을 갖는다(표 4, 도 3). 그럼에도 불구하고, 이러한 생물유용성은 본 실험에 사용된 rVIII-단일쇄 또는 rD’D3-FP 용량과는 무관하다. rD’D3-His는 34%의 보다 낮은 생물유용성을 보여주었다.
[표 3]
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 4]
Figure pct00005
FVIII 데이터의 평가
본 발명의 임의의 폴리펩타이드 없이, 즉 임의의 D’D3-FP 작제물 없이 투여된 rVIII-단일쇄는 s.c. 투여된 경우 적절히 흡수되지 않았고, 적어도 검출 한계치 초과의 어떠한 FVIII 활성도 측정될 수 없었다. 그러나 놀랍게도, FVIII는 2개의 D’DD' D3 작제물(rD’D3-FP 및 rD’D3-His, 각각 알부민 융합 존재 및 부재)의 어느 하나와 s.c. 동시 투여된 경우 흡수되었고; FVIII 활성은 흡수 공정을 견뎌 냈다(도 3).
또한 FVIII 활성에 대한 하나의 곡선은 마지막 2개 측정 포인트에서 높은 유사성을 보여주었고, 이것은 말단 단계에서 혈장 농도 곡선의 "평탄화"를 유도하였다. 이에 의해, 소거율, MRT, t1/2 및 AUC0-inf의 평가는 마지막 포인트를 포함하는 경우 극히 길게 평가되었다. 제2 계산은 생물유용성의 과대평가를 피하기 위해 마지막 시점 없이 수행하였고; 데이터의 비교는 표 5에 나타낸다. 따라서, 표 및 그래프에서(도 4을 제외하고), 마지막 데이터포인트 없이 제2 데이터세트를 사용하고 이는 rD’D3-His의 생물유용성을 과소평가할 수 있다.
FVIII 용량에 의존하여, FVIII 활성은 적어도 32 h(1 mg/kg rD’D3-FP & 50 IU/kg rVIII-단일쇄) 동안 및 96h의 마지막 시점까지(예를 들어, 400 IU/kg rVIII-단일쇄 및 1-10 mg/kg rD’D3-FP와 함께 임의의 용량) 정량하였고; 즉. 이것은 3 또는 10 mIU/mL의 검출 한계치 초과로 유지되었다(도 4). 예로서, 도 4는 200 IU/kg rVIII-단일쇄를 갖는 3 mg/kg rD’D3-His와 비교하여 100 IU/kg rVIII-단일쇄를 갖는 1 또는 3 mg/kg rD’D3-FP의 s.c. 또는 i.v. 투여 후 FVIII 혈장 노출을 나타낸다(보다 높은 용량은 노출을 모니터링할 수 있도록 투여하였다). 어떠한 D' D3 작제물이 투여되지 않은 경우, rVIII-단일쇄는 400 IU/kg의 s.c. 용량에서도 검출 한계치 미만으로 유지되었다(데이터는 나타내지 않음).
Cmax 및 AUC0-inf는 동시 투여된 rD’D3-FPI와는 무관하게 0.3-10 mg/kg rD’D3-FP 및 0-400 IU/kg rVIII-단일쇄의 시험된 범위에서 용량-의존성을 보여주었고, 노출은 rD’D3-His가 투여되는 경우 매우 낮았다(표 5, 도 5).
rD’D3-FP 및 rVIII-단일쇄 >50의 몰비로 투여되는 경우, rVIII-단일쇄에 대한 CL은 7.5-23.7 mL/kg/h 범위였고, 따라서 0.3 mg/kg rD’D3-FP & 200 IU/kg rVIII-단일쇄 s.c.(비율 45) 또는 rD’D3-His 동시 투여에 대한 것 보다 낮았다. 이와 일치하여, rVIII-단일쇄에 대한 MRT 및 t1/2는 50 IU/kg의 rVIII-단일쇄의 매우 낮은 용량을 제외하고는 rD’D3-His와 비교하여 >50의 비율로 투여되는 rD’D3-FP 및 rVIII-단일쇄에 대해서 보다 높았다(범위 MRT: 24-37 h, 범위 t1/2: 8-20 h). 비교를 위해, rD’D3-FP 없이 i.v. 투여된 rVIII-단일쇄는 FVIII ko 마우스에서 ~2-3 mL/kg/h의 CL, 18h의 MRT 및 15h의 t1/2을 갖는 것으로 나타났고 인간에서는 ~2-3 mL/kg/h의 CL, ~20h의 MRT 및 ~14h의 t1/2을 갖는 것으로 나타났다(여기서 데이터는 제공되지 않음). 따라서, s.c. 투여 후 약동학 파라미터는 가변적이었지만 대략적으로 i.v. 투여 후의 것들에 상응하였다.
이를 종합해 보면, rVIII-단일쇄의 생물유용성은 ≥3 mg/kg rD’D3-FP의 용량으로 투여되는 경우 11 내지 25%의 범위이고, 1 mg/kg rD’D3-FP의 용량으로 투여되는 경우 6 내지 14%의 범위이고 0.3 mg/kg rD’D3-FP의 용량에서는 ≤4% 범위이다(표 6, 도 6). 이러한 생물유용성은 잠재적 포화가 400 IU/kg의 시험된 최고 용량에서 관찰되어 이것이 유용한 흡수 면적과 관련될 수 있다는 의미에서 rVIII-단일쇄의 용량에 의존한다. 추가로, rD’D3-FP 용량은 rVIII-단일쇄의 유용성을 제한하였고, 즉, rD’D3-FP 용량이 높을 수록, rVIII-단일쇄 유용성은 우수하였다. 이것은 적어도 447의 rVIII-단일쇄 시험된 비율에 대한 관련 rD’D3-FP(≥3 mg/kg rD’D3-FP; 포화와 함께 400 IU/kg rVIII-단일쇄 용량을 제외한), 74-596의 시험된 범위에서 허용되는 비율(1 mg/kg rD’D3-FP) 및 45의 불리한 시험된 비율(0.3 mg/kg rD’D3-FP)로 전환될 수 있다. 따라서, 비율 <50은 FVIII의 불리한 생물유용성을 보여주고 50 초과의 생물유용성은 양호한 것으로 결론지워졌다.
rVIII-단일쇄의 생물유용성은 rD’D3-His와 동시 투여되는 경우 비례하는 것 없이 낮았고, 즉, 3 mg/kg rD’D3-His 및 200 IU/kg rVIII-단일쇄의 용량에서 1%였고, 이는 rVIII-단일쇄의 생물유용성에 대해 rD’D3의 알부민 융합의 이점을 시사한다.
추가로 트로프까지의 시간은 s.c. 및 i.v. 투여 동안 계산하였다(표 7). 생물유용성에 관하여, 보다 높은 용량의 rD’D3-FP 및/또는 FVIII는 양호한 트로프 수준을 보여주었고, 일정한 FVIII 또는 rD’D3-FP 용량 내에서, rD’D3-FP:rVIII-단일쇄 비율의 증가는 트로프 수준까지의 보다 양호한 시간을 유도하였다.
[표 5]
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 6]
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 7]
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 1.2 돼지에서 rD’D3-FP의 존재하에, 재조합 FVIII, rVIII-단일쇄의 피하 생물유용성
실험의 세부사항
시험 제품을 0.211 내지 0.751 mL/kg 범위의 총 용적으로 옆구리에서 s.c.로 또는 귀 정맥으로 i.v.로 투여하였다 . 투여된 용량 수준 및 경로는 표 8에 나타낸다.
[표 8]
Figure pct00012
rD’D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 3 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 적용하고, rVIII-단일쇄 용량은 100 내지 400 IU/kg 발색성 FVIII 활성 범위이다. rVIII-단일쇄는 주사용수로 재구성하고 rD’D3-FP를 물 욕조에서 해동시켰다.
혈액 샘플은 귀 또는 복재 정맥으로부터 취하였다. 10 mg/kg rD’D3-FP s.c. 그룹에서 시점은 사전 용량, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 h p.a.이고, i.v. 그룹에서는 사전 용량, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 및 168 h p.a이다. 3 mg/kg rD’D3-FP s.c. 그룹에서 시점은 사전 용량, 1, 3, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 및 264 h p.a.이다.
PK 프로파일은 개별 동물로부터 취하였다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성 및 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 단백질의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 사람 FVIII:Ag 혈장 수준은 FVIII 아서라크롬 ELISA를 사용하여 결정하였다.
생물통계학
최대 농도(Cmax), t=0 내지 t=∞ (AUC0-inf)의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적, 평균 체류 시간(MRT), 소거율(CL) 및 말단 반감기(t1/2)의 평가는 i.v. 계산에서 2-격실 모델링에 의해 그리고 s.c. 계산에서 2-격실-흡착 모델링에 의해 수행하였다. 파라미터 평가를 위해, 중량 최소-제곱 비용 함수를 적용하였다. 생물유용성은 i.v. 투여와 비교하여 s.c 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. 1, 5 및 10% 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL와 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산하였다.
결과
D’D3 데이터의 평가
rD’D3-FP는 s.c. 투여 후 흡수되었고 3 및 10 mg/kg에서 168h까지의 전체 관찰 기간동안 정량하고; 즉, 이것은 23.4 ng/mL의 검출 한계치 초과로 잔류하였다(도 7).
Cmax 및 AUC0-inf은 3-10 mg/kg rD’D3-FP의 시험된 범위에서 용량-의존성을 보여주었다(표 9). Cmax는 0-400 IU/kg rVIII-단일쇄의 범위에서 부가된 rFVIII와는 무관하고, rD’D3-FP의 AUC0-inf는 부가된 rVIII-단일쇄의 용량과 함께 증가하였다. 소거율, MRT 및 t1/2은 단독으로 투여된 100 IU/kg 또는 rVIII-단일쇄와 비교하여 200 또는 400 IU/kg rVIII-단일쇄로 치료된 동물에 대한 rD’D3-FP에 대해 보다 긴 PK 프로파일을 보여주었고(표 9), 즉, FVIII가 로딩된 rD’D3-FP는 적절한 양의 FVIII가 없는 경우보다 시스템내에서 보다 길에 잔류하였다.
이와 일치하여, 피하 투여 후 rD’D3-FP의 생물유용성은 59-187%의 범위이고(표 10), 보다 높은 값에 도달하였고 FVIII 용량이 동시 투여되는 경우 최고 값에 도달하였다. 결론적으로, rVIII-단일쇄는 rD’D3-FP의 피하 흡수를 지지하였다.
[표 9]
Figure pct00013
[표 10]
Figure pct00014
FVIII 데이터의 평가
FVIII는 놀랍게도 rD’D3-FP와 s.c.로 동시 투여되는 경우 흡수되었고 FVIII 활성은 흡수 공정을 견뎌냈다(도 8). FVIII 용량에 의존하여, FVIII 활성은 적어도 48 h(3 mg/kg rD’D3-FP & 100 IU/kg rVIII-단일쇄) 동안 및 168 h까지(예를 들어, 400 IU/kg rVIII-단일쇄 및 3 또는 10 mg/kg rD’D3-FP와 함께 임의의 용량) 정량하였고; 즉. 이것은 117 mIU/mL의 검출 한계치 초과로 유지되었다(도 4).
Cmax 및 AUC0-inf은 100-400 IU/kg rVIII-단일쇄의 시험된 범위에서 용량-의존성을 보여주었다. 값은 예측적으로 약물의 i.v. 투여 후 보다 높았다(표 10). FVIII 활성의 소거율은 i.v. (1.2 mL/kg/h) 투여 후 보다 s.c. 투여 후 보다 높았다(2.9-4.1 mL/kg/h). 그럼에도 불구하고, MRT 및 t1/2는 s.c. 및 i.v. 투여 후 상응하였고(각각 82 & 85 h 대 77 h 및 52 & 59 h 대 54 h) 보다 높은 rVIII-단일쇄 용량은 200 또는 400 IU/kg이다. 100 IU/kg의 보다 낮은 용량에서, MRT 및 t1/2는 심지어 rVIII-단일쇄에 대해서 보다 길었다(각각 130 및 83 h). 따라서, s.c. 투여 후 약동학 파라미터는 대략적으로 보다 높은 용량의 rVIII-단일쇄와 함께 i.v. 투여 후의 것들에 상응하였고 100 IU/kg rVIII-단일쇄의 용량에서의 것 보다 우수하였다.
rVIII-단일쇄의 생물유용성은 29 내지40%의 범위이고, rVIII-단일쇄 및/또는 rD’D3-FP의 용량과 함께 증가한다(표 12).
추가로 트로프까지의 시간은 s.c. 및 i.v. 투여 동안 계산하였다(표 13). 1% 트로프 수준까지의 시간은 모든 s.c. 용량에 대해 상응하였고, 5% 또는 10% 트로프까지의 시간은 200 및 400 IU/kg rVIII-단일쇄 + 3 또는 10 mg/kg rD’D3-FP에 대한 것에 상응하였고, 100 IU/kg rVIII-단일쇄 + 3 mg/kg rD’D3-FP에 대해서 우수하였다.
[표 11]
Figure pct00015
[표 12]
Figure pct00016
[표 13]
Figure pct00017
실시예 1.3 혈우병 A 모델, 즉 FVIII ko 마우스에서 각각 피하로 투여된 상이한 FVIII 제품에 대한 rD’D3-FP의 효과 조사.
실험의 세부사항
시험 제품을 총 5 mL/kg의 용적으로 단일 주사에 의해 목에서 s.c. 또는 측면 꼬리 정맥으로 i.v. 투여하였다. 투여된 용량 수준 및 경로는 표 14에 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00018
rD’D3-FP는 사람 알부민 값을 기준으로 3 mg/kg의 용량으로 적용하였고 FVIII 제품은 200 IU/kg의 발색성 FVIII 활성의 용량으로 적용하였다(대표적인 것: Advate® 및 ReFacto AF®, 분석 증명: Beriate®). Advate® 및 ReFacto® AF는 팩키지 삽입물에 따라 재구성하였다. Beriate®는 피펫을 사용한 주사를 위해 물로 재구성하였다. rD’D3-FP는 물 욕조에서 해동시키고 각각의 FVIII 생성물과 혼합하였다. 모든 경우에, 5 mL/kg의 용량 용적을 투여하고 FVIII에 대한 희석 완충액은 모든 제품에 대해 사용하였다.
rD’D3-FP:rFVIII의 비율은 이들의 상이한 분자량 및 비활성을 기준으로 4개의 상이한 생성물에 대한 322 내지 442의 높은 범위에 있는 것으로 언급된다.
혈액 샘플은 교호 샘플링 계획을 사용하여 단기 마취하에 안구뒤에서 취하였다. s.c. 그룹 내 시점은 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72, 및 96 h p.a이고. i.v. 그룹에서는 5분, 3, 8, 16, 24, 48, 72 및 96 h p.a.이다. PK 프로파일은 그룹 당 마우스의 4개의 코호트로부터 취하였고 시점 당 n=3이다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)을 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, 발색성 FVIII 활성 및 알부민의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. 추가로, FVIII 발색성 활성을 측정하였다.
생물통계학
최대 농도(Cmax), t=0 내지 t=∞ (AUC0-inf)의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적, 평균 체류 시간(MRT), 소거율(CL) 및 말단 반감기(t1/2)의 평가는 i.v. 계산에서 2-격실 모델링에 의해 그리고 s.c. 계산에서 2-격실-흡착 모델링에 의해 수행하였다. 파라미터 평가를 위해, 중량 최소-제곱 비용 함수를 적용하였다. 생물유용성은 i.v. 투여와 비교하여 s.c 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. 1, 5 및 10% 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL와 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산하였다.
결과
D’D3 데이터의 평가
동시 투여된 FVIII 제품과 무관하게, rD’D3-FP는 s.c. 투여 후 흡수되었다. rD’D3-FP는 96시간의 전체 관찰 기간 동안 정량될 수 있고; 즉, 이것은 23.4 ng/mL의 검출 한계치 초과로 잔류하였다(도 9).
동시 투여된 FVIII와는 무관하게 각각 i.v. 또는 s.c. 투여 후 rD’D3-FP의 PK 프로파일에서 어떠한 가시적 차이가 없었다. 이와 일치하여, 소거율, MRT, t1/2 및 AUC0-inf의 평가는 각각 모든 s.c. 또는 i.v. 치료 동안 데이터의 우수한 일치를 보여준다(표 15). 상세하게는, 소거율은 i.v.에 대해서는 0.9 내지 1.1 mL/kg/h의 범위로 있고 s.c. 투여 후에는 약간 보다 높았다(1.0 내지 1.5 mL/kg/h). 이와 일치하여, MRT 및 t1/2는 각각 i.v.에 대해 40-56 h 및 31-40 h의 범위이고 s.c. 치료에 대해서는 61-117 h 및 35-89 h이고; 즉, 소거율은 i.v.에 대해서 보다 낮았지만. 전형적으로 MRT 및 t1/2는 그럼에도 불구하고 i.v. 치료에 대해서 보다 짧았다.
중요하게는, 피하 투여 후 rD’D3-FP의 생물유용성은 56-187 %의 범위이고 (표 16), 상이한 동시-투여된 FVII 제품 간에 관련되게 상이하지 않다. 이것은 rVIII-단일쇄의 것과 매우 상응하였다(표 4, 범위 40-79%).
[표 15]
Figure pct00019
[표 16]
Figure pct00020
FVIII 데이터의 평가
모든 FVIII 제품은 rD’D3-FP와 s.c.로 동시 투여되는 경우 흡수되었고 FVIII 활성은 흡수 공정을 견뎌냈다(도 10). 대조적으로, 제품의 어떠한 것도 단독으로 투여되는 경우 적절한 s.c. 생물유용성을 보여주지 않았다.
Cmax, AUC0-inf, 소거율, MRT 및 t1/2의 평가로부터의 데이터는 표 17에 나타낸다. 상이한 FVIII 제품은 단독으로 투여되는 경우 상이한 PK 프로파일을 보여주지만, 소거율은 항상 i.v. 투여와 비교하여 s.c. 투여 후 증가하였고, 즉. Beriate®에 대해서는 3.1 내지 51.5 mL/kg/h, Advate®에 대해서는 4.4 내지 78.5 mL/kg/h 및 ReFacto AF®에 대해서는 1.7 내지 16.2 mL/kg/h이다. MRT는 s.c.와 i.v. 투여 간에 대략 상응하였고(Beriate® 및 Advate®: 범위 17-19 h; ReFacto AF®: 범위 21-28 h), 이는 rVIII-단일쇄의 동시 투여로부터의 결과와 일치한다(표 11 참조). 이들 다른 FVIII 제품에 대해, t1/2는 s.c. 투여와 비교하여 i.v. 투여 후 보다 긴 경향이 있다(Beriate: 8 h s.c. 내지 13 h i.v.; Advate®: 12 h s.c. 내지 14 h i.v.; ReFacto AF®: 11 h s.c. 내지 15 h i.v.).
rD’D3-FP와 동시 투여된 상이한 FVIII 제품의 피하 생물유용성은 6-11% 범위이고 이는 FVIII 제품 들간에 어떠한 관련된 차이가 없음을 시사한다(표 18). 이것은 rD’D3-FP와 rVIII-단일쇄가 동시 투여되는 경우 관찰된 20%와 비교하여 약간 적었지만(표 12 참조); 그럼에도 불구하고, FVIII 제품의 모든 생물유용성은 허요되는 범위내에 있다. 이것은 rD’D3-FP가 피하 투여 후 FVIII 재흡수를 위해 주요 역할을 수행함을 지적한다. 그러나, rD’D3-FP와 rVIII-단일쇄의 조합은 추가로 FVIII의 생물유용성을 개선시킬 수 있다.
추가로 트로프까지의 시간은 s.c. 및 i.v. 투여 동안 계산하였다(표 19). 1% 트로프 수준에 대해, 데이터는 대략 i.v. 및 s.c. 투여 후 상응하였다(Beriate® 60 및 79 h, Advate® 66 및 68 h, ReFacto® AF 98 및 104 h). 5% 내지 10% 수준에 대한 트로프까지의 시간은 i.v. 투여와 비교하여 s.c. 투여 후 우수하였다: Beriate는 4%(5% 트로프) 및 17%(10% 트로프)로 i.v. 보다 s.c.의 우수성을 보여주었고, 각각 Advate®는 29%(5% 트로프) 및 50%(10% 트로프)로 우수하고 ReFacto® AF는 50%(5% 트로프) 및 28%(10% 트로프)로 우수하다.
[표 17]
Figure pct00021
[표 18]
Figure pct00022
[표 19]
Figure pct00023
실시예 1.4 마우스 혈우병 A 모델, 즉, FVIII ko 마우스에서 둘 다 피하로 투여된, 비-알부민 HELP 및 rVIII-단일쇄를 갖는 rD’D3 분자인 rD’D3-FP 친화성 변이체의 효과 조사.
실험의 세부사항
시험 제품을 총 5 mL/kg의 용적으로 단일 주사에 의해 목에서 s.c. 또는 측면 꼬리 정맥으로 i.v. 투여하였다. 투여된 용량 수준 및 경로는 표 20에 나타낸다.
[표 20]
Figure pct00024
rD’D3-FP EYA는 사람 알부민 값을 3 mg/kg의 용량으로 적용하고 rD’D3-CTP는 단백질 함량을 기준으로 4.29 mg/kg의 용량으로 적용하고(둘 다 높은 rD’D3 변이체 : rVIII-단일쇄 용량, 표 20), FVIII 제품은 200 IU/kg 발색성 FVIII 활성 용량으로 적용하였다. rVIII-단일쇄는 주사용수로 재구성하고 rD’D3-CTP 뿐만 아니라 rD’D3-FP EYA를 물 욕조에서 해동시켰다. 모든 경우에, 5 mL/kg의 용량 용적을 투여하고 희석을 위해 FVIII에 대한 희석 완충액을 사용하였다.
혈액 샘플은 교호 샘플링 계획을 사용하여 단기 마취하에 안구뒤에서 취하였다. s.c. 그룹 내 시점은 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72, 및 96 h p.a이고. i.v. 그룹에서는 5분, 3, 8, 16, 24, 48, 72 및 96h p.a.이다. PK 프로파일은 그룹 당 마우스의 4개의 코호트로부터 취하였고 시점 당 n=3이다. 혈액 샘플을 나트륨 시트레이트(1부 나트륨 시트르레이트 3.13% + 9부 혈액)를 사용하여 응고를 억제하고, 혈장으로 프로세싱하였고, FVIII 활성. 알부민 및/또는 rD’D3-CTP의 측정을 위해 -70℃에서 저장하였다.
D'D3-FP EYA 노출은 사람 알부민 ELISA를 이용한 작제물의 알부민 부분의 측정에 의해 결정되었다. rD’D3-CTP는 항-사람 D’D3에 대한 항체를 사용한 ELISA 기술에 의해 측정하였다. 추가로, FVIII 발색성 활성을 측정하였다.
생물통계학
최대 농도(Cmax), t=0 내지 t=∞ (AUC0-inf)의 시간 곡선에 대한 농도 이하 면적, 평균 체류 시간(MRT), 소거율(CL) 및 말단 반감기(t1/2)의 평가는 i.v. 계산에서 2-격실 모델링에 의해 그리고 s.c. 계산에서 2-격실-흡착 모델링에 의해 수행하였다. 파라미터 평가를 위해, 중량 최소-제곱 비용 함수를 적용하였다. 생물유용성은 i.v. 투여와 비교하여 s.c 투여 후 AUC0-inf의 퍼센트로서 계산하였다. 1, 5 및 10% 트로프 수준까지의 시간은 0.01, 0.05 또는 0.1 IU/mL와 동일한 모델 방정식을 설정하고 시간에 대해 계산함에 의해 계산하였다.
결과
D’D3 데이터의 평가
rD’D3-FP EYA 및 rD’D3-CTP 둘 다는 96시간의 전체 관찰 기간 동안 정량될 수 있고; 즉, 이것은 23.4 ng/mL의 검출 한계치 초과로 잔류하였다(도 11).
소거율, MRT, t1/2 및 AUC0-inf의 평가는 표 21에 나타내고, s.c. 투여 후 뿐만 아니라 i.v. 투여 후 rD’D3-CTP와 비교하여 rD’D3-EP EYA에 대해 보다 긴 t1/2 및 MRT를 보여준다(EYA에 대해서 t1/2: 30 h i.v. 및 32 h s.c.이고 이는 CT에 대한 22h 보다 길고; MRT: EYA에 대해서 42 h i.v. 및 57 h s.c.이고 이는 CTP에 대한 27 h i.v. 및 40 h s.c.보다 길다). 이들 데이터는 또한 s.c. 투여가 rD’D3-FP 변이체 둘 다에 대해 i.v. 투여와 동일하거나 우수함을 보여준다. Cmax는 특히 i.v. 투여 후 rD’D3-EYA와 비교하여 rD’D3-CTP에 대해서 보다 높았다. AUC0-inf는 s.c. 투여 (1094 및 825 μg*h/mL) 후 rD’D3-CTP와 비교하여 rD’D3-EYA에 대해 보다 높았지만, i.v. 투여 (1669 및 1783 μg*h/mL) 후 어떠한 주요 차이가 없었다. 이들 데이터는 AUC0-inf가 대부분 높은 초기 값으로 인해 i.v. 투여 후 보다 높음을 보여준다.
피하 투여 후 rD’D3-FP EYA의 생물유용성은 66% 였고, rD’D3-CTP의 생물유용성은 47%였고(표 22), 따라서, FVIII ko 마우스에서 rD’D3-EP의 범위(범위 40-79%, 표 4).
[표 21]
Figure pct00025
[표 22]
Figure pct00026
FVIII 데이터의 평가
FVIII는 rD’D3-FP EYA 또는 rD’D3-CTP와 s.c.로 동시 투여되는 경우 흡수되었고 FVIII 활성은 흡수 공정을 견뎌냈다(도 12). FVIII 활성은 96h의 전체 관찰 기간 동안 정량하였다.
소거율, MRT, t1/2 및 AUC0-inf의 평가는 표 23에 나타내고, 이는 s.c. 투여 후 rD’D3-CTP(MRT: 27 및 29 h, t1/2 13 및 12 h)와 비교하여 rD’D3-FP EYA에 대해 상응하는 MRT를 보여주고 i.v. 투여 후 rD’D3-FP EYA(MRT: 30 및 25 h, t1/2 21 및 18 h)에 대해 약간 보다 높은 MRT 및 t1/2 을 보여준다 . 투여 경로 당 2개의 변이체에 대해 어떠한 차이가 AUC0-inf에 대해 관찰되지 않았다(s.c.에 대해 16 및 18 IU*h/mL 및 i.v.에 대해 111 및 110 IU*h/mL). Cmax는 i.v. 및 s.c. 투여 둘 다 후 (s.c. 후 0.46 대 0.51 IU/mL 및 i.v. 후 4.63 대 5.49) rD’D3-CTP와 비교하여 rD’D3-FP EYA에 대해 보다 낮았다.
rVIII-단일쇄의 생물유용성은 rD’D3-FP EYA에 대해 14%이고 rD’D3-CTP에 대해 16%이다(표 24).
추가로, 트로프까지의 시간은 s.c, 투여에 대해 계산하였고, 이는 1% (105 및 104 h) 및 5% (76 및 78 h) 트로프에서 rD’D3-FP EYA 및 rD’D3-CTP에 대한 상응하는 결과를 보여주었고 이는 10% (64 대 52 h) 트로프 수준에서 rD’D3-CTP에 대한 rD’D3-FP EYA에 대해 매우 약간의 이점을 보여주었다(표 25). 종합하여, 이들 데이터는 rD’D3 변이체가 주로 rD’D3 변이체에 부착된 반감기 연장 원리의 유형이 아닌 FVIII의 개선된 약동학에 관여한다. 그러나, 임의의 HELP를 함유하지 않는 rD’D3 폴리펩타이드는 FVIII 또는 손상된 효능을 갖는 적어도 하나를 개선시킬 수 없다(표 5 및 7 참조).
[표 23]
Figure pct00027
[표 24]
Figure pct00028
[표 25]
Figure pct00029
생체내 동물 실험으로부터의 결론　
본 발명은 상이한 종에서 rD’D3-FP의 피하 생물유용성(표 26) 및 rD’D3-FP와 동시에 투여되는 경우, 재조합 FVIII 제품, 즉. rVIII-단일쇄, Advate®, ReFacto AF® 또는 Beriate®의 관련 생물유용성을 입증한다(표 27).
[표 26]
Figure pct00030
[표 27]
Figure pct00031
사실, 본 결과는 FVIII와 함께 rD’D3-FP의 피하 투여가 혈류로의 FVIII의 전례없는 흡수(rVIII-단일쇄와 3 내지 40%로부터의 생물유용성 범위)와 연관된 재조합 FVIII 제품, 즉, rVIII-단일쇄 또는 다른 FVIII 제품, 예를 들어, Beriate®, Advate® 또는 ReFacto AF®의 세포외 투여를 가능하게 하여 검출 한계 상당히 초과의 FVIII 활성 수준을 유도함을 입증한다. rD’D3-CTP 및 rD’D3-FP EYA는 rD’D3-FP와 대략적으로 상응하는 데이터를 보여주었다. 상기 수득한 FVIII 활성 수준은 치료학적 적용을 위해 적합하다.
rD’D3-FP 또는 이의 변이체는 rD’D3-FP 또는 이의 변이체와 동시 투여되는 경우, rD’D3-His와 비교하여 이것이 격실에 도달하면 혈장에서 FVIII의 유지를 증가시키는 rD’D3-FP의 보다 긴 반감기 뿐만 아니라 rVIII-단일쇄의 생물유용성에서 비례적이지 않은 높은 증가에 대해 rD’D3-His 보다 양호하다. 이것은 알부민 또는 다른 HLEP를 사용한 반감기 연장이 양호한 접근법임을 지지한다.
실시예 2: VWF 단편 이량체 및 단량체에 대한 FVIII의 친화성 측정
VWF 단편 (1-1242) 알부민 융합체 (D' D3-FP)를 생물반응기에서 발현시키고; 상기된 바와 같이 정제하고 단량체 및 이량체를 단리시킨 후, 이들 제제에 대한 FVIII의 친화성을 바이오코어 장비(Biacore instrument (T200, GE Healthcare))를 통해 표면 플라스몬 공명을 통해 평가하였다.
항-알부민 항체(MA1-20124, Thermo Scientific)는 이의 N-말단을 통해 제조원(GE Healthcare)으로부터의 아민 커플링 키트(BR1000-50)에 둘 다 함유된 NHS(N-하이드록시석신이미드) 및 EDC(에탄올아민 하이드로클로라이드)에 의해 활성화된 CM 3 칩에 공유결합으로 커플링시켰다. 고정화를 위해, 3 μg/mL의 항체를 나트륨 아세테이트 완충액(10 mM, pH 5.0)에서 희석시키고 항체 용액을 7분 동안 10 μL/min의 유속으로 칩상에 유동시켰다. 고정화 과정 후, 비-커플링된 덱스트란 필라멘트는 5분 동안 10 μL/min의 유속으로) 칩 상에 에탄올아민 용액(1M, pH 8.3)을 유동시킴에 의해 포화시켰다. 유동 세포를 포화시키는 것의 목적은 상기 칩에 대한 분석물의 비특이적 결합을 최소화하기 위한 것이었다. 참조 유동 세포는 상기와 동일한 절차를 이용함으로써 에탄올아민으로 빈(empty) 플로우 세포를 포화시킴으로써 설정되었다.
이량체성 및 단량체성 D'D3-FP 단백질은 각각 3분 동안 칩 상에 D'D3-FP 단백질(5 ㎍/mL)을 유동(10 ㎕/분의 유속)시켜 공유결합으로 커플링된 항-알부민 항체에 고정화하였다.
FVIII에 대한 결합 곡선을 생성하기 위해, 각각의 D'D3-FP 단백질 제제를 전개 완충액(HBS-P+: 0.1M HEPES, 1.5M NaCl 및 0.5% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4; 제품 코드 BR100671, GE Healthcare)에 0.25 nM, 0.5 nM, 1 nM, 3 nM 및 4 nM의 농도로 희석시켰다. 단일 주기 동역학을 수행함으로써, 각각의 희석액의 상승하는 농도를 갖는 샘플을 2분 동안 칩 상애 유동시키고(유속 30 μL/분), 전개 완충액 HBS-P+를 이용한 10분의 해리 시간이 이어졌다. 모든 측정은 2회 실행하였다. 모든 측정 과정에 대한 온도는 25℃로 조정하였다.
결합 파라미터는 BiaEvaluation 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 곡선 맞춤(curve fitting) 방법은 랭뮤어(Langmuir) 방정식에 기초하였다. 상기 계산을 위한 입력 데이터는 분석물 FVIII(rVIII-단일쇄)의 몰량이었고, 최대 RU와 같은 기타 파라미터들 및 기울기는 핏팅된(fitted) 회합 및 해리 곡선으로부터 자동으로 얻어졌다. BioEvaluation 소프트웨어의 출력값은 회합 속도 상수 및 해리 속도 상수이고, 이로부터 친화성 상수가 계산되었다. 상기 결과는 표 28에 나타낸다.
[표 28]
Figure pct00032
이량체성 D'D3-FP는 rVIII-단일쇄의 보다 신속한 결합 및 보다 느린 해리 둘 다로부터 비롯되는 D'D3-FP 단량체(KD = 30 nM)와 비교하여 FVIII에 대해 상당히 (KD = 34 pM) 증가된 친화성을 보여준다.
<110> CSL Behring Recombinant Facility AG <120> Truncated Von Willebrand Factor Polypeptides for Extravascular Administration in the Treatment or Prophylaxis of a Blood Coagulation Disorder <130> 2016_L004_A267 <150> EP 16198497.6 <151> 2016-11-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5616 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding construct VWF fragment - G/S Linker - albumin <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction enzyme cleavage site <220> <221> misc_feature <222> (32)..(3757) <223> coding sequence for VWF amino acids 1 to 1242 <220> <221> misc_feature <222> (3758)..(3850) <223> coding sequence for glycine/serine linker <220> <221> misc_feature <222> (3851)..(5608) <223> coding sequence for human albumin <220> <221> misc_feature <222> (5609)..(5616) <223> NotI restriction enzyme cleavage site <400> 1 gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60 gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc 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tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat 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Claims (30)

  1. 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 치료 또는 예방은 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 FVIII 단백질(FVIII)을 혈관외로 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하는, 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
  2. 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 치료 또는 예방은 혈액 응고 장애를 갖는 대상체에게 혈관외로 상기 재조합 폴리펩타이드 및 인자 VIII 단백질(FVIII)을 투여함을 포함하고, 여기서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 FVIII에 결합할 수 있고, 상기 투여될 FVIII에 대한 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰 비는 50을 초과하는, 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티(HLEM)를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 사람 대상체인, 재조합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이량체로서 존재하거나 적어도 고비율의 이량체를 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이량체 폴리펩타이드가 1 nM 미만, 바람직하게 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만 또는 80 pM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 피하내, 피내 또는 근육내로 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, (b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (c) (a) 또는 (b)의 단편으로 이루어진, 재조합 폴리펩타이드.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLEM이 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인, 재조합 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 및 이의 단편, 사람 융모성 고나도트로핀의 C-말단 펩타이드, XTEN 서열, 동종-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게 면역글로불린의 Fc 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나 이러한 폴리펩타이드로 이루어진, 재조합 폴리펩타이드.
  12. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLEM이 상기 재조합 폴리펩타이드에 접합된, 재조합 폴리펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 HLEM이 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예를 들면, 지방산 쇄, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
  14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여된 FVIII의 평균 체류 시간(MRT)이 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여된 재조합 폴리펩타이드의 평균 체류 시간(MRT)이 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.5, 적어도 2 또는 적어도 3배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 FVIII의 말단 반감기가 재조합 폴리펩타이드의 동시 투여에 의해 증가되고, 바람직하게 표준 치료와 비교하여, 적어도 1.2, 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 2.5 또는 적어도 3배 만큼 증가되고, 여기서, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  17. 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HLEM을 갖는 상기 폴리펩타이드와 동시 투여되는 FVIII의 1% 트로프 수준에 도달하기 위한 시기가 표준 치료와 비교하여 연장되고, 상기 표준 치료는 상기 FVIII가 상기 HLEM을 갖는 것 없이 재조합 폴리펩타이드와 함께 투여되는 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 것과 비교하여 및/또는 정상 사람 혈장(NHP)의 VWF의 것과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 폴리펩타이드의 혈장 반감기가 내인성 VWF의 것 보다 및/또는 정상 사람 혈장(NHP)의 것과 비교하여 바람직하게 적어도 100%, 적어도 200% 또는 바람직하게 적어도 400%인, 재조합 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A 또는 폰 빌레브란트 질환인, 재조합 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질의 동시 투여가 (i) 상기 재조합 폴리펩타이드 및 상기 FVIII 단백질을 포함하는 단일 조성물 중에서 함께 투여함에 의해, 또는 (ii) 상기 재조합 폴리펩타이드(제1 화합물) 및 상기 FVIII 단백질(제2 화합물)이 각각 별도의 조성물에 제공되어 투여됨에 의해 성취되며, 상기 제1 화합물이 제2 화합물 전에, 후에 또는 동시에 투여되는, 재조합 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII가 혈장 유래된 단백질 또는 재조합 FVIII 단백질인, 재조합 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII가 혈관외로 투여되고 상기 재조합 폴리펩타이드와 동시 투여 후 혈관외 투여된 FVIII의 생물유용성이 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 바람직하게 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40%인, 재조합 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드의 생물유용성이 적어도 30%, 바람직하게 적어도 35%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 80%인, 재조합 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 동시 투여된 FVIII 단백질 용량의 투여가 2500 IU/kg, 1500 IU/kg, 1000 IU/kg, 600 IU/kg, 500 IU/kg 또는 400 IU/kg을 초과하지 않는, 재조합 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, FVIII에 대한 최대 농도(Cmax)가 적어도 10 mIU/mL, 적어도 25 mIU/mL, 적어도 50 mIU/mL, 적어도 100 mIU/mL, 적어도 200 mIU/mL, 적어도 300 mIU/mL 또는 적어도 400 mIU/mL의 FVIII 활성, 바람직하게 발색성 FVIII 활성인, 재조합 폴리펩타이드.
  26. 제3항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 재조합 폴리펩타이드에 대한 소거율(CL) 값이 표준 치료와 비교하여 적어도 2, 적어도 5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  27. 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드와 FVIII의 동시 투여 후, 상기 투여된 FVIII 소거율(CL) 값이 표준 치료와 비교하여 감소되고, 바람직하게 적어도 1.5, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 적어도 7.5 또는 적어도 10배 만큼 감소되고, 여기서, 상기 표준 치료가, 투여될 상기 재조합 폴리펩타이드는 HLEM을 포함하지 않고/않거나 투여될 FVIII에 대한 투여될 재조합 폴리펩타이드의 몰비는 50 미만인 것을 제외하고는 상기 치료와 동일한, 재조합 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 투여될 상기 FVIII에 대한 상기 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 또는 적어도 1000인, 재조합 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이
    (i) 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드, 및
    (ii) 인자 VIII 단백(FVIII)을 포함하고;
    여기서, 상기 약제학적 조성물 내 FVIII 단백질에 대한 재조합 폴리펩타이드의 몰비가 50 초과이고 상기 재조합 폴리펩타이드가 상기 FVIII에 결합할 수 있고,
    상기 치료가 상기 약제학적 조성물을 혈액 응고 장애를 앓는 대상체에게 혈관외 투여함을 포함하고,
    상기 약제학적 조성물이 혈관외 동시 투여를 위해 제형화된, 약제학적 조성물.
  30. (i) 인자 VIII (FVIII) 단백질을 포함하는 제1 조성물 및 (ii) 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따라 제공되는 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 제2 조성물을 포함하는 약제학적 키트.
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