ES2770501T3 - Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos - Google Patents

Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2770501T3
ES2770501T3 ES13816031T ES13816031T ES2770501T3 ES 2770501 T3 ES2770501 T3 ES 2770501T3 ES 13816031 T ES13816031 T ES 13816031T ES 13816031 T ES13816031 T ES 13816031T ES 2770501 T3 ES2770501 T3 ES 2770501T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fviii
xten
domain
amino acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13816031T
Other languages
English (en)
Inventor
Ekta Chhabra
Tongyao Liu
Pei-Yun Chang
Robert Peters
John Kulman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioverativ Therapeutics Inc
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2770501T3 publication Critical patent/ES2770501T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una proteína quimérica que comprende (i) un fragmento del factor de von Willebrand Factor (VWF) que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de polipéptidos de longitud extendida (XTEN), (iii) una proteína del factor VIII (FVIII), (iv) una primera región constante de Ig o una porción de esta, y (v) una segunda región constante de Ig o una porción de esta, en donde el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN están enlazados por un enlazador opcional, en donde la secuencia de XTEN o el fragmento de VWF están enlazados a la primera región constante de Ig o una porción de esta, en donde la proteína FVIII está enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta, y en donde la primera región constante de Ig o una porción de esta se asocia o enlaza a la segunda región constante de Ig o una porción de esta mediante un enlace covalente.

Description

DESCRIPCIÓN
Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos
Antecedentes de la invención
La hemofilia A es un trastorno de la sangre causado por defectos en el gen que codifica el factor de coagulación VIII (FVIII) y afecta a 1-2 en 10.000 nacimientos masculinos. Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Los pacientes afectados con hemofilia A pueden ser tratados con infusión de FVIII purificado o producido en forma recombinante. No obstante, se sabe que todos los productos de FVIII comercialmente disponibles tienen una semivida de aproximadamente 8-12 horas, que requiere la administración intravenosa frecuente a los pacientes. Ver Weiner M.A. y Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Supl 4:S2-8 (2008). Además, se ha intentado una serie de planteamientos con el fin de extender la semivida del FVIII. Por ejemplo, los planteamientos en el desarrollo para extender la semivida de los factores de coagulación incluyen pegilación, glucopegilación y conjugación con albúmina. Ver Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (publicado en internet el 13 de enero de 2012). Independientemente de la modificación de la proteína utilizada, no obstante, se describe que los productos de FVIII de acción prolongada actualmente en desarrollo tienen semividas limitadas - solamente hasta aproximadamente 1,5 a 2 horas en modelos animales preclínicos. Ver id. Se han demostrado resultados contundentes en seres humanos, por ejemplo, se describió que el rFVIIIFc mejora la semivida hasta ~ 1,7 veces en comparación con ADVATE® en pacientes con hemofilia A. Ver Id. Por lo tanto, los aumentos de la semivida, a pesar de los avances leves, pueden indicar la presencia de otros factores limitantes de T1/2. Ver Liu, T. et al., junta de la ISTH 2007, resumen #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 junta de la ISTH, resumen #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 junta de la ISt H, resumen #P-WE-131.
El factor de von Willebrand (VWF) en el plasma tiene una semivida de aproximadamente 12 horas (que oscila de 9 a 15 horas). http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2 scientificoverview.htm (última visita el 22 de octubre de 2011). La semivida del VWF puede estar afectada por una serie de factores: el patrón de glucosilación, ADAMTS-13 (una desintegrina y metaloproteasa con el motivo de trombospondina 13), y varias mutaciones en el VWF.
En el plasma, el 95-98% del FVIII circula en un complejo no covalente tenso con VWF de longitud total. La formación de este complejo es importante para el mantenimiento de niveles de FVIII en plasma apropiados in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). El FVIII de tipo salvaje de longitud total está principalmente presente como un heterodímero que tiene una cadena pesada (PM 200kD) y una cadena ligera (PM 73kD). Cuando se activa el FVIII debido a la proteólisis en las posiciones 372 y 740 en la cadena pesada y en la posición 1689 en la cadena ligera, el VWF unido a FVIII se quita del FVIII activado. El FVIII activado, junto con el factor IX activado, calcio y fosfolípido ("complejo de tenasa"), induce la activación del factor X, generando grandes cantidades de trombina. La trombina, a su vez, escinde entonces fibrinógeno para formar monómeros de fibrina soluble, que luego se polimerizan espontáneamente para formar el polímero de fibrina soluble. La trombina también activa el factor XIII, que, junto con el calcio, sirve para reticular y estabilizar el polímero de fibrina soluble, formando fibrina reticulada (insoluble). El FVIII activado se aclara rápido de la circulación por proteólisis.
Debido a la administración frecuente y la inconveniencia causada por el esquema de dosificación, todavía existe la necesidad de desarrollar productos de FVIII que requieran la administración menos frecuente, es decir, un producto de FVIII que tenga una semivida más larga que la limitación de 1,5 a 2 veces de semivida.
La publicación internacional WO 2011/060242 describe métodos, composiciones y kits para preparar FVIII y emplearlos. Este documento también describe polipéptidos de VWF y moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de VWF.
La publicación internacional WO 2011/069164 describe métodos para administrar FVIII y polipéptidos quiméricos e híbridos que comprenden FVIII. También describe polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos quiméricos e híbridos, células que comprenden dichos polinucleótidos y métodos para producir polipéptidos quiméricos e híbridos usando esas células.
Schellenberger et al. (Nat. Biotechnol. (2009) 27(12):1186-90) demuestran que la fusión genética de XTEN a un péptido o proteína proporciona un planteamiento para extender la semivida en el plasma.
Breve compendio de la invención
En base a la descripción contenida en este documento, la presente invención da a conocer una proteína quimérica que comprende (i) un fragmento del Factor von Willebrand (VWF) que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de polipéptido de longitud extendida (XTEN), (iii) una proteína del factor VIII (FVIII), (iv) una primera región constante de Ig o una porción de esta, y (v) una segunda región constante de Ig o una porción de esta,
en donde el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN están enlazados por un enlazador opcional,
en donde la secuencia de XTEN o el fragmento de VWF está enlazado a la primera región constante de Ig o una porción de esta,
en donde la proteína FVIII está enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta, y
en donde la primera región constante de Ig o una porción de esta está asociada con o enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta mediante un enlace covalente.
En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende una fórmula que comprende:
(g) V-L2-X-L1-F1 :FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1 :F2-L3-FVIII;
(i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;
(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1 -F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-LL1-X-L2-V;
(m) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; o
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII,
en donde V es un fragmento de VWF,
cada uno de L1, L2 y L3 es un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible,
L4 es un enlazador opcional, p. ej., un enlazador procesable,
FVIII comprende una proteína FVIII,
X comprende una o más secuencias de XTEN,
F1 es una primera región constante de Ig o una porción de esta,
F2 es una segunda región constante de Ig o una porción de esta, y
(:) es un enlace covalente.
Los ejemplos no limitativos de las proteínas quiméricas pueden comprender una fórmula, que comprende:
(1) FVI11 (X1 )-L1 -F1 :V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVI 11 (X1 )-L1 -F1 :F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1 -L1 -FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1 -L1 -FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVI11 (X1 )-L1 -F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVI 11 (X1 )-L1 -F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1 -L1 -FVIII(X1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2,
o
(8) F1 -L1 -FVIII(X1 )-L4-F2-L3-X2-L2-V,
en donde FVIII(X1) comprende una proteína FVIII y una o más secuencias de XTEN, en donde una o más de las secuencias de XTEN están enlazadas al término N o al término C de la proteína FVIII o insertadas inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos en la proteína FVIII (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN); cada uno de L1, L2 o L3 es un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible;
L4 es un enlazador, p. ej., un enlazador procesable;
X2 es una segunda secuencia de XTEN;
F1 es una región constante de Ig o una porción de esta;
F2 es una región constante de Ig opcional adicional o una porción de esta, y V es un fragmento de VWF;
(-) es un enlace peptídico; y
(:) es un enlace covalente.
Un aspecto de la invención es que el fragmento de VWF útil para la proteína quimérica no se une al receptor de aclaramiento de VWF, que previene o inhibe la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno. La proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF por lo tanto posee menor aclaramiento o no se aclara mediante el aclaramiento de la vía de VWF. Otro aspecto de la invención es que el fragmento de VWF es capaz de proteger a la proteína FVIII contra una o más escisiones de proteasa, protegiendo la proteína FVIII contra activación, estabilizando la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína FVIII, o previniendo el aclaramiento de la proteína FVIII mediante uno o más receptores depuradores.
Debido a la capacidad de los fragmentos de VWF para prevenir o inhibir la interacción entre la proteína FVIII y el VWF endógeno, la semivida de la proteína FVIII se extiende en comparación con la proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces, o por lo menos aproximadamente 12 veces más que FVIII de tipo salvaje. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII es por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 11 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 13 horas, por lo menos aproximadamente 14 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 16 horas, por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas, o por lo menos aproximadamente 108 horas.
La región constante de Ig o una porción de esta útil en la presente invención y la región constante de Ig adicional o una porción de esta útil en la presente invención son idénticas o diferentes.
En algunos aspectos, la proteína FVIII está enlazada a una secuencia de XTEN en el término C o en el término N de la proteína FVIII o se inserta inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos en el FVIII humano nativo maduro (p. ej., uno o más sitios de inserción) o cualquiera de sus combinaciones. Uno o más sitios de inserción en la proteína FVIII se pueden localizar dentro de uno o más dominios de la proteína FVIII seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1, la región ácida a1, el dominio A2, la región ácida a2, el dominio A3, el dominio B, el dominio C1, el dominio C2, y cualquiera de sus combinaciones o entre uno o más dominios de la proteína FVIII seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1 y una región ácida a1, la región ácida a1 y el dominio A2, el dominio A2 y la región ácida a2, la región ácida a2 y el dominio B, el dominio B y el dominio A3, el dominio A3 y el dominio C1, el dominio C1 y el dominio C2, y cualquiera de sus combinaciones o entre dos dominios de la proteína FVIII seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1 y la región ácida a1, la región ácida a1 y el dominio A2, el dominio A2 y la región ácida a2, la región ácida a2 y el dominio B, el dominio B y el dominio A3, el dominio A3 y el dominio C1, el dominio C1 y el dominio C2, y cualquiera de sus combinaciones.
En una realización, uno o más de los sitios de inserción se localizan inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos en el FVIII humano nativo maduro (p. ej., SEQ ID NO: 4 [secuencia de FVIII maduro-longitud total]) seleccionados del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos de las Tablas 7, 8, 9, 10, 11, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización, uno o más de los sitios de inserción se localizan en uno o más bucles permisivos del FVIII nativo maduro humano. En otras realizaciones, uno o más de los sitios de inserción están localizados en la región a3 del FVIII humano nativo maduro. Por ejemplo, una secuencia de XTEN se puede insertar inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 (FVIII maduro de longitud total). En otras realizaciones, una proteína FVIII está enlazada a por lo menos dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada dentro de una región a3, y una segunda secuencia de XTEN insertada dentro de un bucle permisivo en la proteína FVIII (p. ej., A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 o A3-2). Incluso en otras realizaciones, una proteína FVIII está enlazada a por lo menos tres secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada dentro de la región a3 y una segunda secuencia de XTEN y una tercera secuencia de XTEN insertadas dentro de uno o dos bucles permisivos en la proteína FVIII (p. ej., A1 -1, A1 -2, A2-1, A2-2, A3-1 o A3-2).
En determinadas realizaciones, uno o más de los sitios de inserción para una o más inserciones de XTEN están inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos (numerados en relación a la secuencia de FVIII madura) seleccionados del grupo que consiste en:
(1) aminoácido 3, (2) aminoácido 18, (3) aminoácido 22, (4) aminoácido 26, (5) aminoácido 32, (6) aminoácido 40, (7) aminoácido 60, (8) aminoácido 65, (9) aminoácido 81, (10) aminoácido 116, (11) aminoácido 119, (12) aminoácido 130, (13) aminoácido 188, (14) aminoácido 211, (15) aminoácido 216, (16) aminoácido 220, (17) aminoácido 224, (18) aminoácido 230, (19) aminoácido 333, (20) aminoácido 336, (21) aminoácido 339, (22) aminoácido 375, (23) aminoácido 399, (24) aminoácido 403, (25) aminoácido 409, (26) aminoácido 416, (26) aminoácido 442, (28) aminoácido 487, (29) aminoácido 490, (30) aminoácido 494, (31) aminoácido 500, (32) aminoácido 518, (33) aminoácido 599, (34) aminoácido 603, (35) aminoácido 713, (36) aminoácido 745, (37) aminoácido 1656, (38) aminoácido 1711, (39) aminoácido 1720, (40) aminoácido 1725, (41) aminoácido 1749, (42) aminoácido 1796, (43) aminoácido 1802, (44) aminoácido 1827, (45) aminoácido 1861, (46) aminoácido 1896, (47) aminoácido 1900, (48) aminoácido 1904, (49) aminoácido 1905, (50) aminoácido 1910, (51) aminoácido 1937, (52) aminoácido 2019, (53) aminoácido 2068, (54) aminoácido 2111, (55) aminoácido 2120, (56) aminoácido 2171, (57) aminoácido 2188, (58) aminoácido 2227, (59) aminoácido 2277, y (60) dos o más combinaciones de estos.
En algunas realizaciones, se inserta un XTEN en la proteína FVIII. En algunas realizaciones, se insertan dos XTEN en la proteína FVIII. En algunas realizaciones, se insertan 3 XTEN en la proteína FVIII.
En un ejemplo particular, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 (FVIII maduro de longitud total). En otro ejemplo, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunos ejemplos, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otros ejemplos, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, se inserta inmediatamente un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 (FVIII maduro de longitud total), se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 2, se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un cuarto XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otro ejemplo, se inserta un XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En un ejemplo adicional, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otro ejemplo, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se inserta un primer XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena dual. En algunas realizaciones, la proteína FVIII es una isoforma de FVIII de cadena sencilla.
En algunas realizaciones, el XTEN que se inserta es la SEQ ID NO: 39 (AE288). En algunos ejemplos, los XTEN que se insertan son las SEQ ID NO: 38 y 37 (AG144 y AE144). En algunos ejemplos, los XTEN que se insertan son las SEQ ID NO: 37, 38 y 37 (AE144, AG144 y AE144). En algunas realizaciones, los XTEN que se insertan son las SEQ ID NO: 37 y 40 (AE144 y AE288). En algunas realizaciones, los XTEN que se insertan son AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ ID NO: 128), AE1443B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ ID NO: 131), AE144_6B (SEQ ID NO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ ID NO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ ID NO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ ID NO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38), y cualquiera de sus combinaciones.
La proteína FVIII útil en la invención puede comprender el dominio B o una porción de este, p. ej., el FVIII con el dominio SQ B eliminado. En una realización, la proteína FVIII comprende FVIII de cadena sencilla. En otra realización, el FVIII de cadena sencilla contiene por lo menos una sustitución de aminoácidos en un residuo correspondiente al residuo 1648, residuo 1645, o ambos del polipéptido del Factor VIII maduro de longitud total (SEQ ID NO: 4) o el residuo 754, residuo 751, o ambos del Factor VIII de SQ BDD VIII (SEQ ID NO: 6). En otras realizaciones, la sustitución de aminoácidos consiste en un aminoácido distinto de arginina. En algunas realizaciones, la proteína FVIII comprende una cadena pesada de FVIII y una cadena ligera de FVIII, en donde la cadena pesada y la cadena ligera están asociadas entre sí con un enlace metálico.
La proteína FVIII puede tener una baja afinidad hacia o puede no unirse a una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP), p. ej., conteniendo por lo menos una sustitución de aminoácido que reduce la afinidad hacia o elimina la unión a LRP. Dicha por lo menos una sustitución de aminoácido puede ser un residuo correspondiente al residuo 471, residuo 484, residuo 487, residuo 490, residuo 497, residuo 2092, residuo 2093 o dos o más de sus combinaciones de FVIII maduro de longitud total. En una realización particular, la sustitución del aminoácido en el residuo 471, 484 o 497 es un aminoácido distinto de arginina, la sustitución del aminoácido en el residuo 487 es un aminoácido distinto de tirosina, la sustitución del aminoácido en el residuo 2092 es un aminoácido distinto de lisina, o la sustitución del aminoácido en el residuo 2093 es un aminoácido distinto de fenilalanina.
En algunas realizaciones, la proteína FVIII contiene por lo menos una sustitución de aminoácido que induce a la proteína FVIII a ser más estable que la proteína FVIII sin la sustitución. Dichas sustituciones se pueden localizar en el dominio A2 y en el dominio A3 de la proteína FVIII, p. ej., en un residuo correspondiente al residuo 664, residuo 1826, residuo 662, residuo 1828, o dos o más combinaciones de estos del FVIII maduro de longitud total.
El fragmento de VWF útil para la presente invención comprende un dominio D' y un dominio D3, que juntos son capaces de unirse a FVIII. El fragmento de VWF puede comprender la secuencia de aminoácidos del dominio D' que es por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 764 a 866 de la SEQ ID NO: 2 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio D3 que es por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 867 a 1240 de la SEQ ID NO: 2. En una realización, el fragmento de VWF es un monómero. En otra realización, el fragmento de VWF comprende por lo menos dos VWF, por lo menos tres fragmentos de VWF, por lo menos cuatro fragmentos de VWF, por lo menos cinco fragmentos de VWF o por lo menos seis fragmentos de VWF. En una realización, los dos o más fragmentos de VWF pueden ser idénticos o pueden ser diferentes. El fragmento de VWF puede comprender un aminoácido por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a los aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF puede consistir esencialmente en o consistir en los aminoácidos 764 a 1240 de la SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF puede contener por lo menos una sustitución de aminoácido en un residuo correspondiente al residuo 1099, residuo 1142, o ambos residuos 1099 y 1142 de la SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, el fragmento de VWF comprende además el dominio D1, el dominio D2, o los dominios D1 y D2 de VWF.
El fragmento de VWF puede además comprender un dominio de VWF seleccionado del grupo que consiste en el dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio D4, el dominio B1, el dominio B2, el dominio B3, el dominio C1, el dominio C2, el dominio CK, uno o más de sus fragmentos, y cualquiera de sus combinaciones. Por ejemplo, el fragmento de VWF puede consistir esencialmente en o consistir en: (1) los dominios D' y D3 de VWF o sus fragmentos; (2) los dominios D1, D' y D3 de VWF o sus fragmentos; (3) los dominios de D2, D' y D3 de VWF o sus fragmentos; (4) los dominios D1, D2, D' y D3 de VWF o sus fragmentos; o (5) los dominios D1, D2, D', D3 y A1 de VWF o sus fragmentos. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF comprende además un péptido de señalización de VWF o FVIII que está operativamente enlazado al fragmento de VWF.
Uno o más de los enlazadores útiles en la invención tienen una longitud de por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, o 2000 aminoácidos. En algunas realizaciones, uno o más de los enlazadores tienen una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000 aminoácidos. En una realización, uno o más de los enlazadores tienen una longitud de por lo menos aproximadamente 20, 35, 42, 48, 73, 75, 95, 98, 144, 288, 324, 333, 576 o 864 aminoácidos. En otra realización, uno o más de los enlazadores comprenden un péptido gly/ser, una secuencia de XTEN o ambos. Los ejemplos del péptido gly/ser incluyen, aunque sin limitarse a ello, una fórmula de (Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 139) o S(Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 140), en donde n es un número entero positivo seleccionado del grupo que consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Por ejemplo, el enlazador de (Gly4Ser)n puede ser (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 63) o (Gly4Ser)4 (SEQ ID nO: 138). En una realización, el enlazador comprende por lo menos un primer sitio de escisión en el término N del enlazador, por lo menos un segundo sitio de escisión en el término C del enlazador, o ambos. En otra realización, el enlazador comprende 20 aminoácidos, 35 aminoácidos, 48 aminoácidos, 73 aminoácidos o 95 aminoácidos del enlazador escindible de trombina. Los enlazadores escindibles pueden comprender uno o más sitios de escisión por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en el factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), Elastasa-2, Granzima-B, TEV, Enterocinasa, Proteasa 3C, Sortasa A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20, p. ej., TLDPRs FlLRNPNDkYe PfWe DEEK (SeQ ID NO: 8). Los ejemplos no limitativos de uno o más sitios de escisión comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en RRRR (SEQ ID NO: 9), RKRRKR (SEQ ID NO: 10), RRRRS (SEQ ID NO: 11), TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 12), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 13), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 14), TTKIKPR (SEQ ID NO: 15), LVPRG (SEQ ID NO: 16), ALRPR (SEQ ID NO: 17), KLTRAET (SEQ ID NO: 18), DFTRVVG (SEQ ID NO: 19), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 20), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 21), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 22), PLGRIVGG (SEQ ID NO: 23), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 24), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 25), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 26), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 27), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 28), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 29), APLGLRLR (SEQ ID NO: 30), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 31), ENLYFQG (SEQ ID NO: 32), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 33), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 34), y LPKTGSES (SEQ ID NO: 35). En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión y el segundo sitio de escisión son idénticos o diferentes.
La secuencia de XTEN útil para la invención se puede seleccionar del grupo que consiste en AE42 (SEQ ID NO: 36), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG144 (SEQ ID NO: 38), AE288 (SEQ ID NO: 39), AG288 (SEQ ID NO: 40), AE576 (SEQ ID NO: 41). AG576 (SEQ ID NO: 42), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ ID NO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ ID NO: 131), AE144_6B (SEQ ID NO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ ID NO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ ID nO: 136), Ae288_2 (SEQ ID NO: 137), o AG864 (SEQ ID No : 44). En una realización particular, la secuencia de XTEN comprende AE288 o AG288.
La proteína quimérica de la invención puede ser polisialilada, pegilada o hesilada.
La presente invención también se refiere a un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifican la proteína quimérica de la invención. El polinucleótido puede además comprender una cadena de polinucleótido que codifica PC5 o PC7. En otro aspecto, la presente invención da a conocer un vector que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención y uno o más promotores operativamente enlazados al polinucleótido o al conjunto de polinucleótidos de la invención. El vector puede además comprender un vector adicional, que comprende una cadena de polinucleótidos que codifica PC5 o PC7. La invención también se refiere a una célula hospedante que comprende el polinucleótido o el vector de la invención. La célula hospedante puede ser una célula mamífera, p. ej., una célula HEK293, célula CHO o célula BHK. En algunas realizaciones, el PC5 o PC7 de la célula hospedante escinde los dominios D1D2 de VWF.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector o la célula hospedante de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de la invención tiene por lo tanto una semivida extendida en comparación con la proteína FVIII de tipo salvaje. La semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2.5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces o por lo menos aproximadamente 12 veces más que FVIII de tipo salvaje. La semivida del Factor VIII es por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 26 horas, por lo menos aproximadamente 27 horas, por lo menos aproximadamente 28 horas, por lo menos aproximadamente 29 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 31 horas, por lo menos aproximadamente 32 horas, por lo menos aproximadamente 33 horas, por lo menos aproximadamente 34 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas o por lo menos aproximadamente 108 horas.
La composición de la presente invención se puede administrar por una ruta seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral. En un caso, la composición se administra por administración parenteral, p, ej., administración intravenosa o subcutánea. La composición de la invención es útil para tratar una enfermedad o afección de la sangre en un sujeto que lo necesita. La enfermedad o afección de la sangre se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de la coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intracraneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del psoas ilíaco y cualquiera de sus combinaciones. En un caso, el sujeto tratado con la proteína quimérica se somete a una cirugía. En otro caso, el tratamiento es profiláctico o a demanda.
La invención también se refiere a un método para prevenir o inhibir la unión de una proteína FVIII con VWF endógeno que comprende añadir una cantidad eficaz de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedante o la composición a un sujeto que lo necesita, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII y por lo tanto previene o inhibe la unión de VWF endógeno. La presente invención se refiere además a un método para extender o aumentar la semivida de la proteína FVIII, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedante o la composición a un sujeto que lo necesita, en donde el fragmento de VWF se une a la proteína FVIII y por lo tanto se extiende o aumenta la semivida de la proteína FVIII. También se da a conocer un método para prevenir o inhibir el aclaramiento de la proteína FVIII de una célula, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína quimérica, el polinucleótido, el vector, la célula hospedante o la composición a una célula que comprende una proteína FVIII o un polinucleótido que codifica la proteína FVIII, en donde la proteína que tiene actividad de VWF se une a la proteína FVIII. El sujeto útil para los presentes métodos es un animal, p. ej., un ser humano, p. ej., un paciente que padece hemofilia A.
En otro aspecto, la presente invención da a conocer la proteína quimérica de la invención, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos de la invención, la célula hospedante de la invención o la composición de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la sangre en un sujeto que lo necesita. La enfermedad o el trastorno de la sangre se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia en los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra-craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en el recubrimiento del psoas ilíaco. El tratamiento puede ser profiláctico o a demanda. En una realización, la cantidad eficaz es 0,1 pg/kg a 500 mg/kg.
En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método para elaborar la proteína quimérica de la invención, que comprende transfectar una o más células hospedantes con el polinucleótido o el vector de la invención y expresar la proteína quimérica en la célula hospedante. La presente invención y sus realizaciones se exponen en las reivindicaciones anejas.
Breve descripción de los dibujos/figuras
Figura 1A-D. Diagramas esquemáticos de los fragmentos de VWF. La Fig. 1A muestra tres fragmentos de VWF ilustrativos útiles para la invención, p. ej., VWF-002, VWF-010 y VWF-013. VWF-002 contiene los aminoácidos 1 a 477 de la SEQ ID NO: 124 (aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2) y se sintetiza sin secuencias de pre/propéptido. VWF-010 contiene los dominios D1D2 además de los dominios D'D3. VWF-013 contiene los dominios D1D2D'D3 además de residuos alanina que sustituyen cisteínas en los residuos 336 y 379 de la SEQ ID NO: 123. La Fig. 1B muestra VWF-031, que contiene los dominios D1D2D'D3 condensados a una región constante de Ig o su porción, p. ej., una región de Fc, por un enlazador escindible, p. ej., un enlazador escindible de trombina de 48 aminoácidos. La Fig. 1C muestra VWF-025, que es una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios D1 D2D'D3 contenidos en el vector pLIVE, y VWF-029, que es una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios D1 D2D'D3 con dos sustituciones de aminoácidos, C336A y C379A, en el vector pLIVE. La Fig. 1D muestra el fragmento de VWF de longitud total que comprende propéptido (los dominios D1 y D2) y subunidades maduras (los dominios D', D3, A1, A2, A3, D4, B1 -3, C1 -2). El fragmento de VWF tiene una proteína de aproximadamente 250 kDa y forma multímeros (> 20 MDa) por enlace de disulfuros. El fragmento de VWF se asocia con FVIII (95-98%) en el complejo no covalente y luego extiende la semivida del FVIII protegiéndolo contra la escisión/activación de proteasa, estabilizando las cadenas pesada y ligera y previniendo el aclaramiento de FVIII por receptores depuradores. El fragmento de VWF también puede limitar la semivida de FVIII por aclaramiento del complejo FVIII-VWF a través de los receptores de VWF y previniendo la pinocitosis y reciclando rFVIIIFc.
Figura 2. Perfil de farmacocinética de rFVIII-XTEN (rFVIII-AE288 o rFVIII-288AE) en ratones que expresan VWF D'D3 o en ratones con doble inactivación de FVIII y VWF (DKO). La Figura 2A muestra la línea de tiempo de la inyección hidrodinámica (HDI) del dominio D'D3 que codifica el ADN plasmídico (VWF-025) (día -5), la administración intravenosa de rFVIII-XTEN AE288 (día 0) y la recolección de la muestra de PK (día 5). La Figura 2B muestra la actividad de FVIII medida por un ensayo cromogénico de FVIII después de la administración intravenosa de rFVIII-XTEN288 en ratones D1D2D'D3 (triángulo invertido) y rFVIII-XTEN288 en ratones DKO (rombo). La Fig. 2C muestra el nivel en plasma de D'D3 (ng/ml) después de la administración de VWF-025. El eje X representa el tiempo en horas.
Figura 3. Diagrama esquemático de constructos de heterodímero de VWF:FVIII ilustrativos. Los constructos tienen la estructura común representada como la fórmula FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2, pero contienen ejemplos de diferentes enlazadores variables. El constructo (FVIII-161) que se muestra contiene un FVIII heterodimérico (la cadena pesada y la cadena ligera se asocian mediante un enlace metálico) enlazado a una primera región de Fc y un fragmento de VWF, que consiste en los dominios D' y D3 de VWF (es decir, los aminoácidos 1 a 477 de la SEQ ID NO: 2 con sustituciones de aminoácidos C336A y C379A) enlazadas a una secuencia de XTEN, que además se enlaza a un enlazador escindible y una segunda región Fc. La secuencia de XTEN contenida en FVIII-161 es una secuencia XTEN AE288, y el enlazador es un enlazador escindible de trombina, que tiene 35 aminoácidos. En FVIII-161, la proteína FVIII enlazada a la primera región Fc se enlaza al fragmento de VWF mediante un enlazador procesable. Tras la expresión, el enlazador procesable se puede escindir mediante una enzima de procesamiento intracelular, haciendo que las cadenas de tres polipéptidos del constructo se asocien unas con otras.
La Figura 4 consiste en diagramas esquemáticos de ejemplos de heterodímeros o monómeros de FVIII-VWF. FVIII-168, FVIII-175, FVIII-172, FVIII-174 y FVIII170. El constructo FVIII-168 comprende una secuencia de FVIII de cadena sencilla (que tiene un residuo alanina que sustituye los residuos arginina en los residuos 1645 y 1648) enlazados a una primera región Fc, que luego se condensa a un fragmento de VWF enlazado a una segunda región Fc por un enlazador escindible de trombina, que tiene 48 aminoácidos. AE288 XTEN se inserta en el dominio B de la secuencia FVIII de cadena sencilla. El enlace entre la primera región Fc y el fragmento de VWF comprende un enlazador capaz de ser escindido por una enzima de procesamiento intracelular, es decir, un enlazador procesable. El constructo FVIII-175 comprende un FVIII de cadena sencilla (que tiene un residuo alanina que sustituye los residuos arginina en los residuos 1645 y 1648) enlazado a AE288 XTEN y una primera región Fc, enlazada a una segunda región Fc por un enlazador, p. ej., un enlazador procesable. AE288 XTEN se inserta en el dominio B de la secuencia FVIII de cadena sencilla. El constructo FVIII-172 comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende una secuencia de FVIII de cadena pesada condensada a AE288 XTEN, una segunda cadena que comprende una secuencia FVIII de cadena ligera, una primera región Fc, un enlazador (p. ej., un enlazador procesable), un fragmento de VWF, un enlazador escindible de trombina (p. ej., 48 aminoácidos), y una segunda región Fc. El constructo FVIII-174 comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende una secuencia de FVIII de cadena pesada condensada a AE288 XTEN y una segunda cadena que comprende un FVIII de cadena ligera, una primera región Fc, un enlazador (p. ej., un enlazador procesable), y una segunda región Fc. El constructo FVIII-170 comprende un fragmento de VWF, AE288 XTEN, un enlazador (p. ej., un enlazador escindible de trombina, que tiene 35 aminoácidos de longitud) y una secuencia de FVIII de cadena sencilla.
Figura 5. Perfil de farmacocinética de heterodímeros de FVIII/VWF que contienen una secuencia de XTEN en combinación con una región de Fc. Los constructos FVIII-161, FVIII-168 y FVIII-172 se administraron a ratones doblemente inactivados FVIII:VWF (DKO) con inyección hidrodinámica (HDI) en una dosis de 100 ug/ratón. El constructo FVIII-170 se administró a ratones FVIII:VWF DKO por HDI en una dosis de 50 pg/ratón. La actividad de FVIII en plasma post-HDI se analizó por ensayo cromogénico de FVIII durante 24 h post-HDI. La actividad del FVIII de los heterodímeros FVIII:VWF que contenían una secuencia de XTEN y dominios de Fc se comparó con la actividad del FVIII de BDD-FVIII sin el fragmento de VWF, la secuencia de XTEN y los dominios de Fc.
Figura 6. Diagramas esquemáticos ilustrativos del sistema de co-transfección del heterodímero FVIII-VWF. Fig. 6A. El constructo FVIII-169 contiene la secuencia de FVIII de longitud total (con un residuo alanina que sustituye los residuos arginina en 1645 y 1648 y con una secuencia de XTEN insertada en la secuencia de FVIII de cadena sencilla), que está enlazada a una región Fc. VWF-031 contiene el fragmento D1D2D'D3 (con un residuo alanina que sustituye los residuos cisteína en 336 y 379) que está enlazado a otra región Fc con un enlazador escindible de 48 trombinas. Después del procesamiento intracelular, el constructo FVIII-169 produce un FVIII de cadena sencilla de longitud total (SCFVIII) condensado a un fragmento de Fc y una secuencia de XTEN, y el constructo VWF-031 produce un fragmento D'D3 de 477 aminoácidos enlazado a otro fragmento de Fc. Se pueden formar dos enlaces covalentes entre los fragmentos de Fc que están enlazados a SC FVIII o al fragmento de D'D3, esto, a su vez, permite una asociación no covalente de FVIII y D'D3. Fig. 6B. El constructo FVIII-173 contiene una secuencia de FVIII heterodinámica, una secuencia de FVIII de cadena pesada enlazada a una secuencia de XTEN y una secuencia de FVIII de cadena ligera enlazada a una región Fc. VWF-031 es como se describió anteriormente. Después del procesamiento intracelular, el constructo FVIII-173 produce una proteína heterodinámica, un FVIII de cadena pesada condensado a una secuencia de XTEN, un FVIII de cadena ligera condensado a un fragmento de Fc, y el constructo VWF-031 produce un fragmento D'D3 de 477 aminoácidos enlazado a otro fragmento de Fc. Se pueden formar dos enlaces covalentes entre los fragmentos de Fc que se enlazan al FVIII de cadena ligera o al fragmento de D'D3, esto a su vez permite la asociación no covalente de FVIII y D'D3.
Figura 7. Afinidad de unión de FVIII:VWF ilustrativo que contiene una secuencia de XTEN y dominios de Fc a hVWF inmovilizado en el ensayo Octet. La afinidad de unión hacia FVIII-169/VWF-031 y FVIII-057 (rFVIIIFc) condensados a hVWF inmovilizado se ensayó utilizando mediciones basadas en interferometría de biocapas (ensayo Octet). La Figura 7A muestra la respuesta de la unión en nanomoles de sustancia de fármaco con FVIII169 y FVIIIFc (un control positivo) a hVWF inmovilizado. La Figura 7B muestra la respuesta de la unión de IgG1 humana (un control negativo) a VWF inmovilizado humano.
Figura 8. Perfil de farmacocinética (PK) de FVIII-169 en ratones con genes doblemente inactivados HemA y FVIII:VWF (DKO). La Figura 8A muestra el perfil de PK de FVIII-169/VWF-031 y FVIIIFc en ratones HemA. Los ratones HemA fueron tratados con una sola dosis intravenosa de FVIII-169/VWF-031 a 200 IU/kg. Se recogieron muestras de plasma de los ratones y se ensayaron por ensayo cromogénico de FVIII. Se calculó la semivida de FVIII-169/VWF-031 usando el programa WinNonlin. La Figura 8B muestra el perfil de PK de FVIII-169/VWF-031, FVIII-169/Fc y FVIIIFc en ratones FVIII/VWF DKO.
Figura 9. Perfil de PK de variantes de FVIII-XTEN en ratones FVIII/VWF DKO que expresan D'D3. La Figura 9A muestra una comparación del perfil de PK de las variantes de FVIII-XTEN, FVIII con un XTEN, FVIII con dos XTEN y FVIII con tres XTEN. Se insertaron uno, dos o tres XTEN en distintas porciones del FVIII, incluidos el término C y el dominio B. CT indica que un XTEN está enlazado al término C de FVIII. El sitio de inserción B/CT indica que un XTEN se inserta entre el residuo de aminoácido 745 y el residuo de aminoácido 746 de la proteína FVIII y otro XTEN se enlaza al término C de la proteína FVIII. La numeración del residuo de aminoácido corresponde a la secuencia de la proteína SQ BDD FVIII. El sitio de inserción 1900/B/CT indica que un primer XTEN se inserta entre el residuo de aminoácido 1900 y el residuo de aminoácido 1901 de FVIII, un segundo XTEN se inserta entre el residuo de aminoácido 745 y el residuo de aminoácido 746 de FVIII, y un tercer XTEN se enlaza al término C de FVIII. La cepa del ratón utilizada para administrar las variantes de FVIII-XTEN es una cepa de ratón DKO que expresa los dominios D'D3. La Figura 9B muestra el perfil de PK de FVIII-XTEN con tres inserciones de XTEN. La variante FVIII-XTEN (1900/B/CT) se administró o bien a los ratones FVIII/VWF DKO o a los ratones HemA. Se compara la semivida de FVIII-XTEN (1900/B/CT).
Figura 10. Actividad del FVIII de FVIIIFc (triángulo hueco), FVIII169:Fc (círculo relleno) y FVIII 169:VWF31 (triángulo hueco) en plasma de ratones DKO medida por ensayo cromogénico. FVIII:Fc contiene un FVIII de cadena dual (cadena pesada y cadena ligera) condensado a un dímero Fc (es decir, híbrido de monómero-dímero). FVIII169 se describió anteriormente (contiene AE288 en el dominio B, inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la secuencia de FVIII maduro). FVIII169:Fc contiene FVIII169 condensado a un dímero Fc. FVIII169:VWF31 contiene VWF31, además del dímero Fc, FVIII169 condensado a la primera región Fc y VWF31 condensado a la segunda región Fc, en donde la primera región Fc y la segunda región Fc forman un enlace covalente, p. ej., uno o más enlaces disulfuro.
Figura 11. Efectos de Fc, XTEN, y fragmentos de VWF-D'D3 sobre la extensión de la semivida de FVIII. Se administraron BDD-FVIII (REFACTO®) (cuadrado), FVIIFc (círculo), FVIII169/Fc (triángulo) y FVIII169/VWF031 (triángulo invertido) a ratones FVIII y VWF (DKO) con genes doblemente inactivados. Se midió la actividad de FVIII por ensayo cromogénico, y se calculó la semivida usando el programa WinNonlin-Phoenix. El eje X muestra el tiempo, y el eje Y la actividad en el plasma de FVIII en mU/ml.
Figura 12A-C. Efectos de diferentes XTEN en el heterodímero rFVIII-XTEN/VWF en ratones HemA. La Figura 12A muestra la actividad de FVIII en plasma normalizada hasta un valor de 5 min (%) de dos XTEN insertados inmediatamente en dirección 3’ de los residuos 1900 y 1656 correspondientes a la secuencia de FVIII maduro (es decir, FVIII-195 (isoforma FVIII de cadena dual) y FVIII-199 (isoforma FVIII de cadena sencilla)), en comparación con FVIII-169 que contenía un XTEN inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 correspondiente a la secuencia de FVIII maduro. Se administraron FVIII-169/VWF-031 (círculo relleno), FVIII-199/VWF-031 (cuadrado relleno) y FVIII-195/VWF031 (cuadrado hueco) a ratones HemA para medir la actividad de FVIII en el plasma. La Figura 12B muestra el efecto de extensión de la semivida de la segunda inserción de XTEN inmediatamente en dirección 3’ de los residuos 403 (dominio A2) y 745 (dominio B) (es decir, FVIII-203) y los residuos 745 (dominio B) y 1900 (dominio A3) (FVIII-204) correspondientes a la secuencia de FVIII maduro en comparación con FVIII-169 (una inserción de XTEN en el dominio B solamente). Se administraron FVIII-204/VWF031 (triángulo relleno), fViII-169/VWF-031 (círculo relleno), FVIII-203/VWF-031 (cuadrado relleno) y scBDD-FVIII (rombo hueco) a ratones HemA. El eje X muestra la actividad en el plasma de FVIII normalizada a un valor de 5 min (%), y el eje muestra el tiempo en horas.
La Figura 12C muestra el efecto de extensión de la semivida de las dos inserciones de XTEN inmediatamente en dirección 3’ de los residuos 18 (dominio A1) y 745 (dominio B) (es decir, FVMI-205) en comparación con FVIII-169 (una sola inserción de XTEN en el dominio B) y FVIII de cadena sencilla sin ninguna región Fc o ningún XTEN (es decir, FVMI-207). La Figura 12C muestra además el efecto de extensión de la semivida de tres inserciones de XTEN incorporadas inmediatamente en dirección 3’ de los residuos 26 (dominio A1), 1656 (dominio A3) y 1900 (dominio A3) (es decir, FVIII-201) en comparación con FVIII-169 (una sola inserción de XTEN inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745). Se administraron FVIII-205/VWF-031 (cuadrado relleno), FVIII-201/VWF-031 (triángulo invertido), FVIII-169/VWF-031 (círculo relleno) y FVMI-207 (rombo hueco) a ratones HemA. Se midió la actividad de FVIII en el plasma normalizada a un valor de 5 min (%) (eje X) en el transcurso del tiempo en horas (eje Y).
Figura 13. Actividad de FVIII del heterodímero rFVIII-XTEN/VWF-XTEN en ratones FVIII/VWF DKO. Se analizó la actividad de FVIII en muestras de plasma por ensayo cromogénico de FVIII, y se trazó la curva de regresión de la actividad de FVIII en el plasma (eje X) en función del tiempo (eje Y). Se co-expresó FVIII-155 (scFVIIIFc sin ningún XTEN) con VWF-034 (VWF-Fc con Ae 288 XTEN más un enlazador escindible de trombina de 35 residuos). La semivida de FVIII-155/VWF-034 se comparó con aquella de FVIII-169/VWF-031, que tiene un AE 288 XTEN insertado en la unión del dominio B (inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 correspondiente al polipéptido de FVIII maduro) de FVIII.
Figura 14A-H. Diagramas esquemáticos de diversos constructos de rFVIII-XTEN/VWF. Estos constructos también se describen en otras secciones de la presente invención. La Fig. 14A muestra la proteína FVIII eliminada del dominio B de cadena sencilla (algunas veces indicada en este documento como scBDD-FVIII). Los constructos scBDD-FVIII contienen dos sustituciones en los residuos 1645 y 1648 de Arg a Ala. La Figura 14B muestra el constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII155/VWF031), en donde la primera cadena comprende FVIII de cadena sencilla enlazado a una región Fc sin ningún XTEN y la segunda cadena comprende el fragmento VWF D'D3 enlazado a una región Fc. Este constructo se usa como control. La Fig. 14C muestra un constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII199/VWF031), en donde la primera cadena comprende FVIII de cadena sencilla enlazado a una región Fc, en donde un primer XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 1900 correspondiente a la secuencia madura de FVIII y un segundo XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 1656 correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y la segunda cadena comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc. La Fig. 14D muestra el constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII201/VWF031), en donde la primera cadena comprende la proteína FVIII de cadena sencilla enlazada a una región Fc, en donde un primer XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 26 correspondiente a la secuencia madura de FVIII, un segundo XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 1656 correspondiente a la secuencia madura de FVIII y un tercer XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 1900 correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y una segunda cadena comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc. La Fig. 14E muestra constructos de dos cadenas de polipéptidos (FVIII169/VWF031), en donde la primera cadena comprende la proteína FVIII de cadena sencilla enlazada a una región Fc, en donde un XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 (se indica como "B") correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y la segunda cadena comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc. La Fig. 14F muestra el constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII203/VWF031), en donde la primera cadena comprende la proteína FVIII de cadena sencilla, en donde un primer XTEN se inserta en el residuo 745 ("B") correspondiente a la secuencia madura de FVIII y un segundo XTEN se inserta en el residuo 1900 correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y la segunda cadena comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc. La Fig. 14G muestra el constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII204/VWF031), en donde la primera cadena comprende la proteína FVIII de cadena sencilla enlazada a una región Fc, en donde un primer XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 403 correspondiente a la secuencia madura de FVIII y un segundo XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 ("B") correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y una segunda cadena que comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc. La Fig. 14H muestra el constructo de dos cadenas de polipéptidos (FVIII205/VWF031), en donde la primera cadena comprende FVIII de cadena sencilla, en donde un primer XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 18 correspondiente a la secuencia madura de FVIII y un segundo XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 ("B") correspondiente a la secuencia madura de FVIII, y la segunda cadena comprende el fragmento de VWF D'D3 enlazado a una región Fc.
Figura 15. Actividad FVIII de rFVIII-XTEN/VWF y BDD-FVIII en ratones FVIII/VWF DKO. Se analizó la actividad FVIII de muestras de plasma por ensayo cromogénico de FVIII, y se trazó la curva de regresión de la actividad de FVIII en el plasma (eje X) en función del tiempo (eje Y). Se comparó la semivida de rFVIII-XTEN/VWF (FVIII-205/VWF-031) con aquella de BDD-FVIII y rFVIIIFc.
Figura 16. Eficacia de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc en ratones HemA usando el modelo de sangrado por corte en el rabo. Se usó el sangrado por corte en el rabo de ratones HemA para comparar la eficacia de FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF031 y BDD-FVIII. La mediana de la pérdida de sangre en ml para 200 IU/kg de FVIII169/VWF034 y FVIII205/VWF031 se compara con 200 IU/kg de BDD-FVIII, 65 IU/kg de BDD-FVIII, 20 IU/kg de BDD-FVIII y vehículo.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Se ha de entender que el término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "una secuencia de nucleótidos" representa una o más secuencias de nucleótidos. Como tales, los términos "una" "un"), "uno o más," y "por lo menos uno " se usan en este documento de manera intercambiable.
El término "polinucleótido" o "nucleótido" tiene como fin abarcar un ácido nucleico en singular además de ácidos nucleicos en plural, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, p. ej., ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). En determinadas realizaciones, un polinucleótido comprende un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (p. ej., un enlace amida, como se halla en los ácidos nucleicos de péptidos (PNA)). La expresión "ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, p. ej., fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se hace referencia a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha eliminado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido del Factor VIII contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedantes heterólogas o purificadas (parcialmente o sustancialmente) a partir de otros polinucleótidos en una disolución. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas en forma sintética. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico pueden incluir elementos reguladores como promotores, potenciadores, sitios de unión al ribosoma o señales de terminación de la transcripción.
Tal como se emplea en esta memoria, una "región codificante" o "secuencia codificante" es una porción de polinucleótido que consiste en codones traducibles en aminoácidos. Si bien un "codón finalizador" (TAG, TGA o TAA) típicamente no se traduce en un aminoácido, se puede considerar parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo promotores, sitios de unión al ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares, no son parte de una región codificante. Los límites de una región codificante típicamente se determinan con un codón de inicio en el término 5' que codifica el término amino del polipéptido resultante y un codón finalizador de traducción en el término 3', que codifica el término carboxilo del polipéptido resultante. Dos o más regiones codificantes de la presente invención pueden estar presentes en un constructo de un solo polinucleótido, p. ej., en un solo vector o en constructos de polinucleótidos separados, p. ej., en vectores separados (diferentes). Luego le sigue que un soIo vector puede contener solo una región codificante, o comprender dos o más regiones codificantes, p. ej., un solo vector puede codificar separadamente un dominio de unión A y un dominio de unión B como se describe a continuación. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar las regiones codificantes heterólogas, o bien condensadas o no condensadas a un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de la invención. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, como un péptido de señalización secretorio o un dominio funcional heterólogo.
Ciertas proteínas segregadas por células mamíferas se asocian con un péptido de señalización secretorio que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la cadena de exportación de la proteína de crecimiento por el retículo endoplasmático bruto. Los expertos en la técnica saben que los péptidos de señalización en general se condensan al término N del polipéptido, y se escinden del polipéptido completo o de "longitud total" para producir una forma segregada o "madura" del polipéptido. En determinadas realizaciones, un péptido de señalización natural o un derivado funcional de esa secuencia retiene la capacidad de dirigir la segregación del polipéptido que está operativamente unido a este. Alternativamente, se puede usar un péptido de señalización mamífero heterólogo, p. ej., un activador de plasminógeno de tejido humano (TPA) o péptido de señalización de B-glucuronidasa de ratón, o su derivado funcional.
La expresión "en dirección 3’" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza 3' a una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en dirección 3’ se refieren a secuencias que siguen el punto de partida de la transcripción. Por ejemplo, el codón de iniciación de la traducción de un gen se localiza en dirección 3’ del sitio de inicio de la transcripción.
La expresión "en dirección 5’" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se localiza en 5' hacia una secuencia de nucleótidos de referencia. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos en dirección 5’ se relacionan con secuencias que están localizadas en el lado 5' de una región codificante o el punto de partida de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se localizan en dirección 5’ del sitio de inicio de la transcripción.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos localizadas en dirección 5’ (secuencias 5' no codificantes), dentro, o en dirección 3’ (secuencias 3' no codificantes) de una región codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento de ARN, la estabilidad o la traducción de la región codificante asociada. Las regiones reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión al efector y estructuras de tallo-bucle. Si una región codificante está destinada a la expresión en una célula eucariota, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la trascripción habitualmente estarán ubicadas 3' hacia la secuencia codificante.
Un polinucleótido que codifica un producto génico, p. ej., un polipéptido, puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción operativamente asociados con una o más regiones codificantes. En una asociación operativa, una región codificante para un producto génico, p. ej., un polipéptido, se asocia con una o más regiones reguladoras en un modo tal como para disponer la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la región o regiones reguladoras. Por ejemplo, una región codificante y un promotor están "operativamente asociados" si la inducción del promotor resulta en la transcripción de ARNm que codifica el producto génico codificado por la región codificante, y la naturaleza del enlace entre el promotor y la región codificante no interfiere con la capacidad del promotor de dirigir la expresión del producto génico o no interfiere con la capacidad del molde de ADN que se ha de transcribir. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden también asociarse operativamente con una región codificante para la expresión directa del producto génico. Se conoce en la técnica una diversidad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células vertebradas, como por ejemplo, entre otros, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con intrón A), virus simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrados como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, además de otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos del tejido, además de promotores inducibles de linfocina (p. ej., promotores inducibles por interferones o interleucinas).
De modo similar, los expertos en la técnica conocen una diversidad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, entre otros, sitios de unión al ribosoma, codones de inicio y terminación de la traducción, y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma o IRES, también llamado secuencia CITE).
El término "expresión" tal como se usa en este documento se refiere a un procedimiento mediante el cual un polinucleótido produce un producto génico, por ejemplo, un ARN o un polipéptido. Incluye, entre otros, la transcripción del polinucleótido a ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (shRNA), ARN pequeño de interferencia (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de un ARMm a un polipéptido. La expresión produce un "producto génico". Tal como se emplea en este documento, un producto génico puede ser o bien un ácido nucleico, p. ej., un ARN mensajero producido por transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce de un transcrito. Los productos génicos de este documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones post traducción, p. ej., poliadenilación o empalme, o polipéptidos con modificaciones post traducción, p. ej., metilación, glucosilación, la adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas o escisión proteolítica.
Un "vector" hace referencia a cualquier vehículo para la clonación y/o la transferencia de un ácido nucleico a una célula hospedante. Un vector puede ser un replicón al cual se le puede unir otro segmento de ácido nucleico como para generar la replicación del segmento unido. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento genético (p. ej., plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio control. El término "vector" incluye tanto vehículos víricos como no víricos para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se conocen y usan en la técnica un gran número de vectores, como por ejemplo plásmidos, virus eucariotas modificados o virus bacterianos modificados. La inserción de un polinucleótido en un vector adecuado se puede lograr ligando los fragmentos de polinucleótidos apropiados en un vector seleccionado que tenga términos cohesivos complementarios
Los vectores se pueden modificar para codificar marcadores o indicadores seleccionables que proporcionan la selección o identificación de células que han incorporado el vector. La expresión de marcadores o indicadores seleccionables permite la identificación y/o selección de células hospedantes que incorporan y expresan otras regiones codificantes contenidas en el vector. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos y utilizados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a la ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida bialaphos, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir genes reguladores de, antocianina, gen isopentanil transferasa y similares. Los ejemplos de los indicadores conocidos y utilizados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), -galactosidasa (LacZ), -glucuronidasa (Gus) y similares. Los marcadores seleccionables pueden también considerarse indicadores.
El término "plásmido" se refiere a un elemento extra-cromosómico que a menudo porta un gen que no es parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de moléculas de ADN bicatenarios circulares. Dichos elementos pueden ser secuencias que se pueden replicar en forma autónoma, secuencias que integran genomas, secuencias de fagos o nucleótidos, ADN o ARN monocatenario o bicatenario lineal, circular o superbobinado, derivado de cualquier fuente, en donde una serie de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula.
Los vectores víricos eucariotas que se pueden utilizar incluyen, entre otros, vectores de adenovirus, vectores de retrovirus, vectores de virus adeno-asociados y virus de la viruela, p. ej., vectores del virus variolovacunal, vectores de baculovirus o vectores de herpesvirus. Los vectores no víricos incluyen plásmidos, liposomas, lípidos eléctricamente cargados (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros.
Un "vector de clonación" se refiere a un "replicón", que es una longitud unitaria de un ácido nucleico que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual se puede unir otro segmento de ácido nucleico como para generar la replicación del segmento unido. Ciertos vectores de clonación son capaces de replicación en un tipo de célula, p. ej., bacteria y expresión en otras, p. ej., células eucariotas. Los vectores de clonación típicamente comprenden una o más secuencias que se pueden utilizar para la selección de células que comprenden el vector y/o uno o más sitios de clonación múltiple para la inserción de las secuencias de ácido nucleico de interés.
La frase "vector de expresión" hace referencia a un vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada después de la inserción en una célula hospedante. La secuencia de ácido nucleico insertada se dispone en asociación operativa con las regiones reguladoras anteriormente descritas.
Los vectores se introducen en las células hospedantes por métodos conocidos en la técnica, p. ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación de fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola de genes o un transportador de un vector de ADN.
"Cultivo" y "cultivar", tal como se emplean en este documento, significan incubar células bajo condiciones in vitro que permiten el crecimiento o la división celular o para mantener células en un estado lisado. "Células cultivadas", tal como se emplea en este documento, significa células que se propagan in vitro.
Tal como se emplea en este documento, el término "polipéptido" tiene como fin abarcar un "polipéptido" en singular como así también "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) linealmente enlazados por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína," "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término utilizado para hacer referencia a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o en forma intercambiable con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también tiene como fin hacer referencia a los productos de modificaciones post-expresión del polipéptido, incluidos sin limitación, glucosilación, acetilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido puede derivar de una fuente biológica natural o producida por tecnología recombinante, pero no necesariamente se traduce de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluso por síntesis química.
Un polipéptido "aislado" o su fragmento, variante o derivado hace referencia a un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede simplemente extraerse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos en forma recombinante expresados en células hospedantes se consideran aislados para los fines de la invención, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.
También se incluyen en la presente invención fragmentos de variantes de polipéptidos y cualquiera de sus combinaciones. El término "fragmento" o "variante", cuando hace referencia a dominios de unión al polipéptido o moléculas de unión de la presente invención, incluye cualquier polipéptido que retenga por lo menos algunas de las propiedades (p. ej., afinidad de unión de FcRn hacia un dominio de unión de FcRn o variante Fc, actividad de coagulación para una variante de FVIII o actividad de unión de FVIII para el fragmento de VWF) del polipéptido de referencia. Los fragmentos de polipéptidos incluyen fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de eliminación, además de fragmentos de anticuerpos específicos analizados en otras partes de este documento, pero no incluyen el polipéptido de longitud total que ocurre naturalmente (o polipéptido maduro). Las variantes de dominios de unión al polipéptido o moléculas de unión de la presente invención incluyen los fragmentos anteriormente descritos, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ocurrir en forma natural o no natural. Las variantes que ocurren en forma no natural se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en el campo. Las variantes de polipéptidos pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos no conservadoras.
Las expresiones "fragmento de VWF" o "fragmentos de VWF" utilizadas en este documento significan cualquier fragmento de VWF que interactúa con FVIII y retiene por lo menos una o más propiedades normalmente provistas a FVIII por VFW de longitud total, p. ej., previniendo la activación prematura a FVIIIa, previniendo la proteólisis prematura, previniendo la asociación con membranas de fosfolípido que podrían provocar el aclaramiento prematuro, previniendo la unión a los receptores de aclaramiento de FVIII que se pueden unir a FVIII desnudo pero no a FVIII unido a VWF y/o estabilizando las interacciones de la cadena ligera y la cadena pesada de FVIII.
Una "sustitución conservadora del aminoácido" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluidas cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido de la misma familia de la cadena lateral, la sustitución se considera conservadora. En otra realización, una serie de aminoácidos pueden reemplazarse de forma conservadora con una serie estructuralmente similar que difiere en orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral.
Como se conoce en la técnica, la "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se analiza en este documento, si cualquier polipéptido particular es por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% idéntico a otro polipéptido se puede determinar usando métodos y programas de ordenador/software conocidos en la técnica como, aunque sin limitarse a ello, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se predeterminan, por supuesto, de modo tal que el porcentaje de identidad se calcula en la longitud total de la secuencia de polipéptidos de referencia y se permite esa brecha en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia.
Tal como se emplea en este documento, un "aminoácido correspondiente a" o un "aminoácido equivalente" en una secuencia de VWF o una secuencia de proteína FVIII se identifica por alineación para maximizar la identidad o similitud entre una primera secuencia de VWF o FVIII y una segunda secuencia de VWF o FVIII. El número utilizado para identificar un aminoácido equivalente en una segunda secuencia de VWF o FVIII se basa en el número utilizado para identificar el correspondiente aminoácido en la primera secuencia de VWF o FVIII.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "sitio de inserción" se refiere a una posición en un polipéptido de FVIII, o su fragmento, variante o derivado, que está inmediatamente en dirección 5’ de la posición en la cual se puede insertar un resto heterólogo. Un "sitio de inserción" se especifica como un número, en donde el número es el número del aminoácido en el FVIII nativo maduro (SEQ ID NO: 4) al que corresponde el sitio de inserción, que está inmediatamente N-terminal a la posición de la inserción. Por ejemplo, la frase "a3 comprende un XTEN en el sitio de inserción que corresponde al aminoácido 1656 de SEQ ID NO: 4" indica que el resto heterólogo está ubicado entre dos aminoácidos correspondientes al aminoácido 1656 y al aminoácido 1657 de la SEQ ID NO: 4.
La frase "inmediatamente en dirección 3’ de un aminoácido" tal como se emplea en este documento se refiere a la posición justo próxima al grupo carboxilo terminal del aminoácido. De modo similar, la frase "inmediatamente en dirección 5’ de un aminoácido" se refiere a la posición justo próxima al grupo amina terminal del aminoácido. En consecuencia, la frase "entre dos aminoácidos de un sitio de inserción", tal como se emplea en este documento, se refiere a una posición en la que un XTEN o cualquier otro polipéptido se inserta entre dos aminoácidos adyacentes. Por lo tanto, las frases "inmediatamente insertado en dirección 3’ de un aminoácido" e "insertado entre dos aminoácidos de un sitio de inserción" se utilizan como sinónimos con "insertado en un sitio de inserción".
Los términos "insertado", "se inserta", "insertado en" o términos gramaticalmente relacionados, tal como se emplean en este documento, se refieren a la posición de un XTEN en un polipéptido quimérico en relación a la posición análoga en FVIII nativo maduro humano. Tal como se usan en este documento, los términos se refieren a las características del polipéptido de FVIII recombinante en relación al FVIII nativo maduro humano, y no indican, implican ni infieren ningún método o procedimiento mediante el cual se elaboró el polipéptido quimérico. Por ejemplo, en referencia a un polipéptido quimérico provisto en este documento, la frase "un XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo 745 del polipéptido de FVIII" significa que el polipéptido quimérico comprende un XTEN inmediatamente en dirección 3’ de un aminoácido que corresponde al aminoácido 745 en el FVIII nativo maduro humano, p, ej., unido por aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 745 y 746 del FVIII nativo maduro humano.
Una proteína de "fusión" o proteína "quimérica" comprende una primera secuencia de aminoácidos enlazada a una segunda secuencia de aminoácidos con la que no está naturalmente enlazada por naturaleza. Las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en proteínas separadas se pueden unir en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en la misma proteína se pueden disponer en una nueva ordenación en el polipéptido de fusión, p. ej., fusión de un dominio del Factor VIII de la invención con un dominio de Ig Fc. Se crea una proteína de fusión, por ejemplo, por síntesis química, o creando y traduciendo un polinucleótido en donde las regiones de péptido se codifican en la relación deseada. Una proteína quimérica comprende además una segunda secuencia de aminoácidos asociada con la primera secuencia de aminoácidos por un enlace covalente, enlace no peptídico o enlace no covalente.
Tal como se usa en esta memoria, el término "semivida" se refiere a una semivida biológica de un polipéptido particular in vivo. La semivida puede estar representada por el tiempo requerido para que la mitad de la cantidad administrada a un sujeto se aclare de la circulación y/u otros tejidos en el animal. Cuando una curva de aclaramiento de un polipéptido determinado se construye en función del tiempo, la curva es usualmente bifásica con una a-fase rápida y una p-fase más larga. La a-fase típicamente representa un equilibrio del polipéptido Fc administrado entre el espacio intra- y extra-vascular y se determina, en parte, por el tamaño del polipéptido. La p-fase típicamente representa el catabolismo del polipéptido en el espacio intravascular. En algunas realizaciones, FVIII y las proteínas quiméricas que comprenden FVIII son monofásicos, y por lo tanto no tienen una fase alfa, sino simplemente la fase beta. Por ende, en determinadas realizaciones, el término semivida utilizado en este documento se refiere a la semivida del polipéptido en la p-fase. La semivida típica de la p-fase de un anticuerpo humano en seres humanos es 21 días.
El término "enlazado", tal como se emplea en este documento, se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos unida de manera covalente o no covalente a una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, respectivamente. La primera secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos se puede unir directamente o yuxtaponerse a la segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos, o alternativamente una secuencia interviniente puede unir la primera secuencia a la segunda secuencia. El término "enlazado" significa no solamente una fusión de una primera secuencia de aminoácidos a una segunda secuencia de aminoácidos en el término C o el término N, sino que también incluye la inserción de toda la primera secuencia de aminoácidos (o la segunda secuencia de aminoácidos) en cualquiera de dos aminoácidos en la segunda secuencia de aminoácidos (o la primera secuencia de aminoácidos, respectivamente). En una realización, la primera secuencia de aminoácidos se puede enlazar a una segunda secuencia de aminoácidos mediante un enlace de péptidos o un enlazador. La primera secuencia de aminoácidos se puede enlazar a una segunda secuencia de nucleótidos con un enlace de fosfodiéster o un enlazador. El enlazador puede ser un péptido o un polipéptido (para cadenas de polipéptidos) o un nucleótido o cadena de nucleótidos (para cadenas de nucleótidos) o cualquier resto químico (tanto para cadenas de polipéptidos como de polinucleótidos). El término "enlazado" también se indica con un guion (-).
Tal como se emplea en este documento, la expresión "asociado con" se refiere a un enlace covalente o no covalente formado entre una primera cadena de aminoácidos y una segunda cadena de aminoácidos. En una realización, la expresión "asociado con" significa un enlace covalente no peptídico o un enlace no covalente Esta asociación se puede indicar con dos puntos, es decir, (:). En otra realización, significa un enlace covalente excepto un enlace peptídico. Por ejemplo, el aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un grupo tiol en un segundo residuo cisteína. En la mayoría de las moléculas de IgG que ocurren naturalmente, las regiones CH1 y CL se asocian con un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas se asocian con dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 usando el sistema de numeración Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración de la UE). Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen, aunque sin limitarse a ello, un enlace peptídico, un enlace metálico, un enlace hidrógeno, un enlace disulfuro, un enlace sigma, un enlace pi, un enlace delta, un enlace glucosídico, un enlace agnóstico, un enlace curvado, un enlace dipolar, un retrodonación Pi, un doble enlace, un triple enlace, un cuádruple enlace, un quíntuple enlace, un séxtuple enlace, conjugación, hiperconjugación, aromaticidad, hapticidad o antienlazamiento. Los ejemplos no limitativos de un enlace no covalente incluyen enlace iónico (p. ejemplo enlace de sal o enlace de cationes pi), un enlace metálico, un enlace hidrógeno (p. ej., enlace dihidrógeno, complejo de dihidrógeno, hidrógeno de barrera baja, o enlace de hidrógeno simétrico), fuerza van der Walls, fuerza de dispersión de London, un enlace mecánico, un enlace halógeno, aurofilicidad, intercalación, apilamiento, fuerza entrópica o polaridad química.
La expresión "híbrido de monómero-dímero" utilizada en este documento hace referencia a una proteína quimérica que comprende una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptidos, que se asocian unas con otras mediante un enlace disulfuro, en donde la primera cadena comprende un factor de coagulación, p. ej., Factor VIII, y una primera región Fc y la segunda cadena comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda región Fc sin el factor de coagulación. El constructo de híbrido monómero-dímero es por lo tanto un híbrido que comprende un aspecto de monómero que tiene solamente un factor de coagulación y un aspecto de dímero que tiene dos regiones Fc.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "sitio de escisión" o "sitio de escisión enzimática" se refiere a un sitio reconocido por una enzima. Ciertos sitios de escisión enzimática comprenden un sitio de procesamiento intracelular. En una realización, un polipéptido tiene un sitio de escisión enzimática escindido por una enzima que se activa durante la cascada de coagulación, de modo tal que la escisión de dichos sitios ocurre en el sitio de formación de coágulos. Los ejemplos de dichos sitios incluyen aquellos reconocidos por trombina, Factor XIa o Factor Xa. Los sitios de escisión de FXIa ilustrativos incluyen, p. ej., TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 45) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 46). Los sitios de escisión de trombina ilustrativos incluyen, p. ej., d FlAEGGGVR (SEQ ID NO: 47), TTKIKPR (SEQ ID NO: 48), LVPRG (SEQ ID NO: 49) y ALRPR (aminoácidos 1 a 5 de SEQ ID NO: 50). Otros sitios de escisión enzimática se conocen en la técnica.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "sitio de procesamiento" o "sitio de procesamiento intracelular" se refiere a un tipo de sitio de escisión enzimática en un polipéptido que es una diana para enzimas que funcionan después de la traducción del polipéptido. En una realización, dichas enzimas funcionan durante el transporte desde el lumen Golgi hacia el compartimiento trans-Golgi. Las enzimas de procesamiento Intracelular escinden los polipéptidos antes de la segregación de la proteína de la célula. Los ejemplos de dichos sitios de procesamiento incluyen, p. ej., aquellos dirigidos por PACE/furina (en donde PACE es un acrónimo para la familia de enzimas endopeptidasa de escisión de aminoácidos apareados). Estas enzimas se localizan hacia la membrana Golgi y escinden proteínas en el lado carboxiterminal del motivo de secuencia Arg-[cualquier residuo]-(Lys o Arg)-Arg. Tal como se emplea en este documento, la familia de enzimas "furina" incluye, p. ej., PCSK1 (también conocido como PC1/Pc3), PCSK2 (también conocido como PC2), PCSK3 (también conocido como furina o PACE), PCSK4 (también conocido como PC4), PCSK5 (también conocido como PC5 o PC6), PCSK6 (también conocido como PACE4), o PCSK7 (también conocido como PC7/LPC, PC8, o SPC7). Se conocen en la técnica otros sitios de procesamiento. En constructos que incluyen más de un sitio de procesamiento o escisión, se ha de entender que dichos sitios pueden ser iguales o diferentes.
El término "Furina" se refiere a las enzimas correspondientes a EC No. 3.4.21.75. Furina es una proproteína convertasa de tipo subtilisina, que también se conoce como PACE (enzima de escisión de aminoácidos apareados). La Furina elimina secciones de proteínas precursoras inactivas para convertirlas en proteínas biológicamente activas. Durante su transporte intracelular, el pro-péptido de VWF se puede escindir de la molécula de VWF madura por una enzima Furina. En algunas realizaciones, la Furina se escinde de D1D2 del D'D3 de VWF. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica Furina se puede expresar junto con la otra secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de VWF como para que los dominios D1D2 puedan ser escindidos en forma intracelular por Furina.
En constructos que incluyen más de un sitio de procesamiento o escisión, se ha de entender que dichos sitios pueden ser iguales o diferentes.
Un enlazador "procesable", tal como se emplea en este documento, se refiere a un enlazador que comprende por lo menos un sitio de procesamiento intracelular, que se describe en otra parte de este documento.
Trastorno hemostático, tal como se emplea en este documento, significa una afección genéticamente hereditaria o adquirida caracterizada por una tendencia a hemorragia, o bien espontáneamente o como consecuencia de traumatismo, debido a una incapacidad impedida o a una incapacidad de formar un coágulo de fibrina. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen las hemofilias. Las tres formas principales son hemofilia A (deficiencia del factor VIII), hemofilia B (deficiencia del factor IX o "enfermedad de Navidad") y hemofilia C (deficiencia del factor XI, tendencia a sangrado leve). Otros trastornos hemostáticos incluyen, p. ej., enfermedad de Von Willebrand, deficiencia del Factor XI (deficiencia de PTA), deficiencia del Factor XII, deficiencias o anomalías estructurales en fibrinógeno, protrombina, Factor V, Factor VII, Factor X o factor XIII, síndrome de Bernard-Soulier, que es un defecto o deficiencia en GPIb. GPIb, el receptor para VWF, puede ser defectuoso y provocar la falta de formación de coágulos primarios (hemostasia primaria) y mayor tendencia al sangrado), y trombastenia de Glanzman y Naegeli (trombastenia de Glanzmann). En falla hepática (formas aguda y crónica), hay una producción insuficiente de factores de coagulación por parte del hígado, esto puede aumentar el riesgo de sangrado.
Las moléculas quiméricas de la invención se pueden utilizar en forma profiláctica. Tal como se emplea en este documento, la expresión "tratamiento profiláctico" se refiere a la administración de una molécula antes de un episodio de sangrado. En una realización, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo, o se está por someter, a una cirugía. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes o después de la cirugía como tratamiento profiláctico. La proteína quimérica de la invención se puede administrar durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo. La cirugía puede incluir, aunque sin limitarse a ello, trasplante de hígado, extirpación de hígado, procedimientos dentales o trasplante de células madre.
La proteína quimérica de la invención también se usa para tratamiento a demanda. La expresión "tratamiento a demanda" se refiere a la administración de una molécula quimérica en respuesta a síntomas de un episodio de sangrado o antes de una actividad que puede causar sangrado. En un aspecto, el tratamiento a demanda puede administrarse a un sujeto cuando comienza el sangrado, tal como después de una lesión, o cuando se espera el sangrado, como antes de una cirugía. En otro aspecto, el tratamiento a demanda puede administrarse antes de actividades que incrementan el riesgo de sangrado, tal como deportes de contacto.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "sangrado agudo" se refiere a un episodio de sangrado independientemente de la causa del sangrado. Por ejemplo, un sujeto puede tener un traumatismo, uremia, un trastorno de sangrado hereditario (p. ej., deficiencia del factor VII) un trastorno de plaquetas o resistencia debida al desarrollo de anticuerpos a los factores de coagulación.
Tratar, tratamiento, como se usan en este documento, hacen referencia, p. ej., a la reducción de la gravedad de una enfermedad o afección; la reducción en la duración del curso de una enfermedad; el alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o afección; el aporte de efectos beneficiosos a un sujeto con una enfermedad o afección, sin necesariamente curar la enfermedad o afección, o la profilaxis de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o afección. En una realización, el término "tratar" o "tratamiento" significa mantener un nivel de FVIII de por lo menos aproximadamente 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL o 20 IU/dL en un sujeto, administrando una proteína quimérica o un fragmento de VWF de la invención. En otra realización, tratar o tratamiento significa mantener un nivel de FVIII entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 2 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 3 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 4 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 5 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 6 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 7 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 8 y aproximadamente 20 IU/dL, aproximadamente 9 y aproximadamente 20 IU/dL o aproximadamente 10 y aproximadamente 20 IU/dL. Tratamiento o tratar una enfermedad o afección puede también incluir mantener la actividad de FVIII en un sujeto en un nivel comparable a por lo menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% de la actividad de FVIII en un sujeto no hemofílico. El nivel mínimo requerido para el tratamiento se puede medir con uno o más métodos y se puede ajustar (aumentar o reducir) en cada persona.
Proteínas quiméricas
La presente invención se refiere a extender la semivida de una proteína del Factor VIII que usa un fragmento de VWF y una secuencia de XTEN previniendo o inhibiendo que un factor limitante de la semivida del FVIII, es decir, VWF endógeno, se asocie con la proteína FVIII. El VWF endógeno se asocia con aproximadamente 95% a aproximadamente 98% de FVIII en complejos no covalentes. Si bien el VWF endógeno es un factor limitante de la semivida del FVIII, también se sabe que el VWF endógeno unido a una proteína FVIII protege al FVIII de diversas maneras. Por ejemplo, el VWF de longitud total (como un multímero que tiene aproximadamente 250 kDa) puede proteger al FVIII de la escisión de proteasa y la activación de FVIII, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de FVIII y prevenir el aclaramiento del FVIII por receptores depuradores. Pero, al mismo tiempo, el VWF endógeno limita la semivida del FVIII previniendo la pinocitosis y aclarando el complejo FVIII-VWF del sistema a través de la vía de aclaramiento del VWF. Se cree, sin estar influenciados por la teoría, que el VWF endógeno es un factor limitante de la semivida que previene que la semivida de una proteína FVIII condensada extensora de la semivida sea aproximadamente más larga que aquella de FVIII de tipo salvaje. Por lo tanto, la presente invención se refiere a prevenir o inhibir la interacción entre el VWF endógeno y una proteína FVIII usando un fragmento de VWF, aumentando de este modo la semivida de la proteína FVIII al usar una secuencia de XTEN sola o una secuencia de XTEN en combinación con una región constante de Ig o su porción. La secuencia de XTEN puede estar enlazada a la proteína FVIII o al fragmento de VWF. La proteína FVIII asociada con el fragmento de VWF se aclara por lo tanto de la circulación más lentamente por uno o más receptores de aclaramiento de VWF y luego puede tener la extensión plena de la semivida de la secuencia de XTEN o la secuencia de XTEN en combinación con la región constante de Ig, en comparación con FVIII de tipo salvaje o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF.
En una realización, un fragmento de VWF se asocia (o enlaza) con la proteína FVIII por enlace covalente. En algunos casos el bloqueo físico o la asociación química (p. ej., enlace no covalente) entre el fragmento de VWF y la proteína FVIII puede no ser lo suficientemente fuerte como para proveer un complejo estable que comprenda la proteína FVIII y el fragmento de VWF en presencia de VWF endógeno. Por ejemplo, un fragmento de VWF que forma un enlace no covalente con una proteína FVIII sin ninguna otra conexión puede disociarse fácilmente in vivo de la proteína FVIII en presencia de VWF endógeno, reemplazando el fragmento de VWF (p. ej., VWF recombinante, es decir, rVWF) con VWF endógeno. Por lo tanto, la proteína FVIII no covalentemente unida a VWF endógeno se sometería a la vía de aclaramiento de VWF y se aclararía fácilmente del sistema. Con el fin de prevenir la disociación del fragmento de VWF con la proteína FVIII, la asociación o enlace entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF es un enlace covalente, p. ej., un enlace peptídico, o un enlace disulfuro. En determinadas realizaciones, la asociación (es decir, el enlace) es un enlace peptídico o un enlazador entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF ("enlazador de FVIII/VWF"). Los ejemplos no limitativos del enlazador se describen en otra parte de este documento. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF es un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en por lo menos aproximadamente 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 o 4000 aminoácidos. Los ejemplos no limitativos del fragmento de VWF se describen en otra parte de este documento.
En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF se une químicamente (p. ej., en forma no covalente) a, o bloquea físicamente, uno o más sitios de unión a VWF en una proteína FVIII. El sitio de unión a VWF en una proteína FVIII se localiza dentro del dominio A3 o el dominio C2 de la proteína FVIII. Incluso en otras realizaciones, el sitio de unión a VWF en una proteína FVIII se localiza dentro del dominio A3 y el dominio C2. Por ejemplo, el sitio de unión a VWF en una proteína FVIII puede corresponder a los aminoácidos 1669 a 1689 y/o 2303 a 2332 de la SEQ ID NO: 4 [FVIII maduro de longitud total].
La descripción también da a conocer una proteína quimérica (que comprende una proteína FVIII y un fragmento de VWF) que además comprende una o más secuencias de XTEN, que proporcionan propiedades adicionales de extensión de la semivida. Una o más de las secuencias de XTEN se pueden insertar dentro de la proteína FVIII o el fragmento de VWF o enlazarse al término N o al término C de la proteína FVIII o al fragmento de VWF. La descripción también incluye una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN (un primer resto que extiende la semivida) y una región constante de Ig o su porción (un segundo resto que extiende la semivida) de manera tal que los dos restos extienden la semivida de la proteína FVIII mediante dos mecanismos diferentes.
En algunos casos, una proteína quimérica comprende una proteína FVIII enlazada a una primera región constante de Ig o su porción (p. ej., un primer elemento ligante de FcRn), un fragmento de VWF enlazado a una segunda región constante de Ig o su porción (p. ej., un segundo elemento ligante de FcRn) y una o más secuencias de XTEN insertadas o enlazadas a la proteína FVIII o al fragmento VWF, en donde el fragmento VWF previene que el factor limitante de la semivida de FVIII (p. ej., VWF endógeno) se una a la proteína FVIII, en donde la primera y la segunda regiones constantes de Ig o sus porciones forman un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro, y una o más de las secuencias de XTEN extienden la semivida de la proteína FVIII.
En ciertos casos, una proteína quimérica de la descripción comprende una proteína FVIII enlazada a un fragmento de VWF por un enlazador opcional (es decir, el enlazador de FVIII/VWF) y una o más secuencias de XTEN insertadas o enlazadas a la proteína FVIII o al fragmento de VWF, en donde el fragmento de VWF previene que el factor limitante de la semivida del FVIII (p. ej., VWF endógeno) se una a la proteína FVIII y una o más de las secuencias de XTEN extienden la semivida de la proteína FVIII. En un caso, el enlazador opcional (enlazador de FVIII/VWF) comprende un motivo de reconocimiento de sortasa. En otro caso, el enlazador opcional (enlazador de FVIII/VWF) comprende un sitio escindible. Los ejemplos del enlazador de escisión (es decir, el enlazador que contiene uno o más sitios escindibles) se describen en otra parte de este documento.
La proteína quimérica de la presente invención incluye, aunque sin limitarse a ello:
(1) un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3, una secuencia de XTEN y FVIII, en donde la secuencia de XTEN está enlazada al fragmento de VWF;
(2) una proteína FVIII, una secuencia de XTEN y una región constante de Ig o una porción de esta, en donde la proteína FVIII está enlazada a una secuencia de XTEN y a la región constante de Ig o una porción de esta, o (3) una proteína FVIII, una secuencia de XTEN y un fragmento de VWF, en donde la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII en el término C o en el término N o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más de los sitios de inserción de XTEN) de FVIII, y el fragmento de VWF y la proteína FVIII se asocian uno con el otro.
(1) Fragmento del Factor de Von Willebrand (VWF) enlazado a XTEN y FVIII
La presente invención se refiere a una proteína quimérica que comprende (i) un fragmento de VWF que comprende un dominio D' y un dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de XTEN y (iii) una proteína FVIII, en donde (i), (ii) y (iii) están enlazados o asociados entre sí. El fragmento de VWF enlazado a la secuencia de XTEN, como una parte de una proteína quimérica en la presente invención, se asocia con la proteína FVIII, previniendo o inhibiendo de este modo la interacción entre VWF endógeno y la proteína FVIII. En ciertos casos, el fragmento de VWF, que es capaz de prevenir o inhibir la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno, puede a la vez tener por lo menos una propiedad protectora de FVIII de tipo VWF. Los ejemplos de las propiedades protectoras de FVIII de tipo VWF incluyen, entre otros, proteger FVIII contra escisión de proteasa y activación de FVIII, estabilizar la cadena pesada de FVIII y o la cadena ligera y prevenir el aclaramiento del FVIII por receptores depuradores. Como consecuencia, el fragmento de VWF puede prevenir el aclaramiento de la proteína FVIII a través de la vía de aclaramiento de VWF, reduciendo de este modo el aclaramiento de FVIII del sistema circulatorio. En algunos casos, los fragmentos de VWF de la presente invención se unen o asocian con una proteína FVIII y/o física o químicamente bloquean el sitio de unión a VWF en la proteína FVIII. La proteína FVIII asociada con el fragmento de VWF por lo tanto se aclara de la circulación más lentamente, en comparación con FVIII de tipo salvaje o FVIII no asociado con el fragmento de VWF.
En un caso, la descripción se refiere a una proteína quimérica que comprende (i) un fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de XTEN y (iii) una proteína FVIII, en donde la secuencia de XTEN está enlazada al fragmento de VWF (p. ej., (a1) V-X o (a2) X-V, en donde V comprende un fragmento de VWF y X comprende una secuencia de XTEN), y el fragmento de VWF está enlazado a o asociado con la proteína FVIII. En otro caso, el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN pueden estar enlazados por un enlazador (p. ej., (a3) V-L-X o (a4) X-L-V) o un enlace peptídico. El enlazador puede ser un enlace escindible, p. ej., un enlazador escindible de trombina, que puede escindirse en el sitio de coagulación. En otros casos, el fragmento de VWF, la secuencia de XTEN y la proteína FVIII se disponen en una cadena de polinucleótidos sencilla. Incluso en otros casos, la proteína quimérica comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN y una segunda cadena que comprende la proteína FVIII. Incluso en otros casos, la proteína quimérica comprende tres cadenas de polipéptidos, una primera cadena que comprende el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN, una segunda cadena que comprende una cadena ligera de FVIII y una tercera cadena que comprende una cadena pesada de FVIII, en donde la primera cadena y la segunda cadena están asociada entre sí (p. ej., enlace covalente, p. ej, enlace disulfuro), y la segunda cadena y la tercera cadena están asociadas entre sí (p. ej., enlace metálico). Incluso en otros casos, la secuencia de XTEN puede estar enlazada al término N o al término C del fragmento de VWF o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos en el fragmento de VWF.
En ciertos casos, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula que comprende:
(a) V-X-FVIII,
(b) FVIII-X-V,
(c) V-X:FVIII,
(d) X-V:FVIII,
(e) FVI11 :V-X,
(f) FVIII :X-V,
o
(a5) X-V-FVIII,
en donde V comprende un fragmento de VWF,
X comprende una o más secuencias de XTEN,
FVIII comprende una proteína FVIII;
(-) representa un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y
(:) es una asociación química o una asociación física. En un caso, (:) representa una asociación química, p. ej., por lo menos un enlace no peptídico. En otro caso, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otros casos, la asociación química, es decir, (:) es una interacción no covalente, p. ej., una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals o un enlace hidrógeno. En otros casos, (:) es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otros casos, (:) es un enlace peptídico. Incluso en otros casos, (:) representa una asociación física entre dos secuencias, en donde una porción de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo tal que la primera secuencia protege o bloquea una porción de la segunda secuencia para que interactúe con otro resto, y además esta asociación física se mantiene sin permitir que la segunda secuencia interactúe con otros restos. La orientación de las fórmulas de polipéptidos en este documento se menciona del término N (izquierda) al término C (derecha). Por ejemplo, la fórmula V-X-FVIII significa la fórmula NH2-V-X-FVMI -COOH. En un caso, las fórmulas descritas en este documento pueden comprender cualquier secuencia adicional entre los dos restos. Por ejemplo, la fórmula V-X-FVIII puede además comprender cualquier secuencia en el término N de V entre V y X, entre X y FVIII, o en el término C de FVIII, a menos que se indique algo distinto. En otro caso, el guion (-) indica un enlace peptídico.
En otros casos, una proteína quimérica de la invención comprende una fórmula que comprende:
(a) V(X1)-X2-FVIII,
(b) FVIII-X2-V(X1),
(c) V(X1):FVIII,
(d) FVIII :V(X1),
o
(a5) X2-V(X1)-FVIII,
en donde V(X1) comprende un fragmento de VWF y una primera secuencia de XTEN (X1),
en donde la secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos en el fragmento de VWF,
X2 comprende una o más secuencias de XTEN opcionales,
FVIII comprende una proteína FVIII;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y
(:) es una asociación química o una asociación física.
En algunos casos, una proteína quimérica comprende (i) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una proteína FVIII, (iv) un primer enlazador opcional y (v) un segundo enlazador opcional, en donde la secuencia de XTEN está enlazada al fragmento de VWF y/o a la proteína FVIII por el enlazador. En ciertos casos, una proteína quimérica comprende una fórmula que comprende:
(b1) V-L1-X-L2-FVIII,
(b2) FVIII-L2-X-L1-V,
(b3) V-L1-X:FVIII,
(b4) X-L1-V:FVIII,
(b5) FVIII :V-L1 -X,
(b6) FVIII :X-L1 -V,
(b7) X-L1-V-L2-FVIII, o
(b8) FVIII-L2-V-L1-X,
en donde V comprende un fragmento de VWF,
X comprende una o más secuencias de XTEN,
FVIII comprende una proteína FVIII,
L1 comprende un primer enlazador opcional, p. ej., un primer enlazador escindible,
L2 comprende un segundo enlazador opcional, p. ej., un segundo enlazador escindible o un enlazador procesable opcional;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y
(:) es una asociación química o una asociación física. En un caso, (:) representa una asociación química, p. ej., por lo menos un enlace no peptídico. En otro caso, la asociación química, es decir, (:) es un enlace covalente. En otros casos, la asociación química, es decir, (:) es una interacción no covalente, p. ej., una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals o un enlace hidrógeno. En otros casos, (:) es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otros casos, (:) es un enlace peptídico. Incluso en otros casos, (:) representa una asociación física entre dos secuencias, en donde una porción de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo tal que la primera secuencia protege o bloquea una porción de la segunda secuencia para que interactúe con otro resto, y además esta asociación física se mantiene sin permitir que la segunda secuencia interactúe con otros restos. La orientación de las fórmulas del polipéptido de este documento se menciona desde el término N (izquierda) hacia el término C (derecha). Por ejemplo, la fórmula (b1) V-L1-X-L2-FVIII significa la fórmula NH2-V-L1-X-L2-FVIII-COOH. En un caso, las fórmulas descritas en este documento pueden comprender cualquier secuencia adicional entre los dos restos. En otro caso, el guion (-) indica un enlace peptídico.
Otro caso de la presente invención consiste en proveer una proteína quimérica FVIII que tiene menos interacciones o ninguna interacción con un factor limitante de la semivida de FVIII, p. ej., VWF endógeno, y al mismo tiempo maximizar la semivida de la proteína FVIII usando una secuencia de XTEN (un primer extensor de la semivida) en combinación con un segundo extensor de la semivida o un resto que proporciona un enlace covalente entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF, p. ej., una región constante de Ig o su porción. En un caso, una proteína quimérica de la invención comprende (i) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una proteína FVIII, y (iv) una región constante de Ig o su porción (también denominada en este documento F), en donde (1) el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN por un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible, (2) el fragmento de VWF está asociado con o enlazado a la proteína FVIII por un enlazador opcional adicional, p. ej., un enlazador escindible, y (3) la región constante de Ig o su porción está enlazada al fragmento de VWF, la secuencia de XTEN o la proteína FVIII. Una proteína quimérica de la invención comprende (i) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una proteína FVIII, (iv) una región constante de Ig o su porción (F1 o una primera región constante de Ig o su porción), y (v) una región constante de Ig adicional o su porción (F2 o una segunda región constante de Ig o su porción), en donde (1) el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN por un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible, (2) la secuencia de XTEN o el fragmento de VWF está enlazado a la región constante de Ig o su porción, (3) el FVIII está enlazado a la región constante de Ig adicional o su porción, y (4) la región constante de Ig o su porción está asociada con o enlazada a la región constante de Ig adicional o su porción, por un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro. En otra realización, la asociación o el enlace entre las dos regiones constantes de Ig o su porción es un enlazador procesable, en donde el enlazador procesable se procesa en forma intracelular mediante una proteasa. Por ejemplo, la proteína quimérica comprende una fórmula que comprende:
(g) V-L2-X-L1-F1: FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1 :F2-L3-FVIII;
(i) F-L1-X-L2-V: FVIII-L3-F2;
(j) F-L1-X-L2-V: F2-L3-FVI11;
(k) V-L2-X-L1 -F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-LL1-X-L2-V
(m) FVIII-L2-F2-L4-V-L2-X-L1 -F1
o
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII,
en donde V comprende un fragmento de VWF,
cada uno de L1 y L3 comprende un enlazador opcional,
L2 comprende un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible,
L4 es un enlazador opcional, p. ej., un enlazador procesable,
FVIII comprende una proteína FVIII,
X comprende una o más secuencias de XTEN,
F1 comprende la primera región constante de Ig o una porción de esta,
F2 comprende la segunda región constante de Ig o una porción de esta;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y
(:) es un enlace covalente.
En algunas realizaciones, la proteína FVIII en cualquier constructo o fórmulas descritas en este documento puede además comprender por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco o por lo menos seis secuencias de XTEN, cada una de las secuencias de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos en la proteína FVIII o enlazada al término N o al término C de la proteína FVIII. Los ejemplos no limitativos de los sitios de inserción de XTEN se describen en otra parte de este documento.
En una realización, (:) representa un enlace covalente. En otras realizaciones, (:) es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otras realizaciones (:) es un enlace peptídico. La orientación de las fórmulas de polipéptidos en este documento se menciona desde el término N (izquierda) hacia el término C (derecha). Por ejemplo, la fórmula (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII significa la fórmula NH2-F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII -COOH. En una realización, las fórmulas descritas en este documento pueden comprender cualquier secuencia adicional entre los dos restos. En otra realización, el guion (-) indica un enlace peptídico.
En una realización, una o ambas de la región constante de Ig o una porción de esta (a veces se indica en este documento con "F" o "F1") y la región constante de Ig adicional o una porción de esta (a veces se indica en este documento con "F2") enlazada al fragmento de VWF o la proteína FVIII puede extender la semivida del fragmento de VWF, la proteína FVIII o ambos. En otra realización, la región constante de Ig o una porción de esta (a veces se indica en este documento con "F" o "F1") y la región constante de Ig adicional o una porción de esta (a veces se indica en este documento con "F2"), cada una de las cuales se enlaza al fragmento de VWF y la proteína FVIII, proporciona un enlace más fuerte que el enlace no covalente entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF, es decir, un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro, previniendo de este modo que el VWF endógeno reemplace al fragmento de VWF in vivo. F1 o F2 pueden comprender una región Fc o un elemento ligante de FcRn. En otras realizaciones, o bien uno o ambos de F1 y F2 enlazado al fragmento de VWF y/o a la proteína FVIII forma un enlace covalente (p. ej., un enlace disulfuro) entre F1 y F2, disponiendo así al fragmento de VWF y la proteína FVIII próximos para prevenir la interacción de la proteína FVIII con el fragmento de VWF. En algunas realizaciones, F1 y F2 son idénticos o diferentes. Los ejemplos no limitativos de F1 y F2 se pueden seleccionar del grupo que consiste en un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, un dominio bisagra, cualquier fragmento funcional, sus derivados o análogos, y dos o más de sus combinaciones. En una realización, F1, F2 o ambos comprenden por lo menos un dominio CH1, por lo menos un dominio CH2, por lo menos un dominio CH3, por lo menos un dominio CH4, o sus fragmentos funcionales, derivados o análogos de estos. En otra realización, F1, F2 o ambos comprenden por lo menos un dominio bisagra o una porción de este y por lo menos un dominio CH2 o una porción de este (p. ej., en la orientación bisagra-CH2). En otras realizaciones, F1, F2 o ambos comprenden por lo menos un dominio CH2 o una porción de este y por lo menos un dominio CH3 o una porción de este (p. ej., en la orientación CH2-CH3). Los ejemplos de la combinación incluyen, aunque sin limitarse a ello, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio bisagra, que también se conocen como región Fc (o dominio Fc), p. ej., una primera región Fc o un primer elemento ligante FcRn para F1 y una segunda región Fc o un segundo elemento ligante FcRn para F2. En otras realizaciones, F1 se enlaza al fragmento de VWF por un enlazador, y/o F2 se enlaza a la proteína FVIII por un enlazador. En algunas realizaciones, F1 y/o F2 comprende, consiste esencialmente en o consiste en una región bisagra. Los ejemplos no limitativos adicionales de las regiones Fc o los elementos ligantes FcRn se describen en otra parte de este documento.
En determinadas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena de polipéptidos que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3, una secuencia de XTEN, una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región de Fc), y un enlazador opcional entre el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN o la secuencia de XTEN o la primera región constante de Ig o una porción de esta y una segunda cadena de polipéptidos que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una proteína FVIII y una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc). El enlazador entre el fragmento de VWF y la primera región constante de Ig o una porción de esta puede ser un enlazador escindióle, p. ej., un enlazador escindióle de tromóina, que se puede escindir en el sitio de coagulación. La primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están asociadas entre sí. La asociación entre la primera cadena y la segunda cadena previene el reemplazo de la primera cadena que comprende el fragmento de VWF con VWF endógeno in vivo. La asociación entre la primera cadena y la segunda cadena es un enlace covalente. En una realización particular, el enlace covalente es un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, la proteína FVIII en la segunda cadena comprende además una o más secuencias de XTEN enlazadas al término C o al término N de la proteína FVIII o insertadas inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., por lo menos un sitio de inserción descrito en este documento) en la proteína FVIII. Los ejemplos no limitativos de los sitios de inserción se descrióen en otra parte de este documento.
En otras realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende tres cadenas de polipéptidos, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente o consiste en una cadena pesada de una proteína FVIII, una segunda cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cadena ligera de una proteína FVIII condensada a una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región Fc) y una tercera cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente en o consiste en un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3, una secuencia de XTEN, una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc) y un enlazador opcional entre la secuencia de XTEN y la segunda región constante de Ig o una porción de esta o el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN. El enlazador en la tercera cadena puede ser un enlazador escindióle, que se escinde en el sitio de coagulación, p. ej., un sitio de escisión de tromóina. En algunas realizaciones, el FVIII de la cadena pesada o el FVIII de la cadena ligera está enlazado a una o más secuencias de XTEN, que pueden estar enlazadas al término N, al término C, o insertadas dentro de uno o más sitios de inserción dentro de la secuencia de FVIII. Los ejemplos no limitativos de los sitios de inserción se descrióen en otra parte de este documento.
Incluso en otros casos, una proteína quimérica de la descripción comprende dos cadenas de polipéptidos, una primera cadena de polipéptidos que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una cadena pesada de una proteína FVIII y una segunda cadena de polipéptidos que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una cadena ligera de una proteína FVIII, una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región Fc), un primer enlazador (p. ej., un enlazador procesaóle, que contiene uno o más sitios de escisión de proteasa que comprenden uno o más sitios de procesamiento intracelular), un fragmento de VWF, un segundo enlazador (p. ej., un enlazador escindióle de tromóina), una secuencia de XTEN y una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc), en donde la cadena ligera de la proteína FVIII está enlazada a la primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., la primera región Fc), que se enlaza además al fragmento de VWF por el primer enlazador, y donde el fragmento de VWF se enlaza a la secuencia de XTEN, que además se enlaza a la segunda región constante de Ig o una porción de esta mediante el segundo enlazador. En ciertos casos, el primer enlazador es un enlazador procesaóle, y el segundo enlazador es un enlazador escindióle. Tras la expresión, la proteína quimérica se puede procesar por una enzima de procesamiento intracelular, que escinde el enlazador procesaóle, y por lo tanto la proteína quimérica puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en tres cadenas de polipéptidos. Además, el fragmento de VWF se puede escindir en el sitio de coagulación deóido al enlazador escindióle.
En determinadas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una cadena de polipéptidos, que comprende una proteína FVIII de cadena sencilla, una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región Fc), un primer enlazador (p. ej., un enlazador procesaóle), un fragmento de VWF, una secuencia de XTEN, un segundo enlazador (p. ej., un enlazador escindióle de tromóina) y una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc), en donde la proteína FVIII de cadena sencilla está enlazada a una primera región constante de Ig o una porción de esta, que además está enlazada al fragmento de VWF por el primer enlazador, y el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN, que además está enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta. En una realización, el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN están enlazados por el segundo enlazador. En otra realización, la secuencia de XTEN y la segunda región constante de Ig o una porción de esta están enlazadas por el segundo enlazador. En otras realizaciones, la segunda cadena comprende además un tercer enlazador. La cadena de polipéptidos sencilla puede además comprender el fragmento de VWF enlazado a la secuencia de XTEN por el segundo enlazador y la secuencia de XTEN puede estar enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta por el tercer enlazador. El segundo enlazador y el tercer enlazador pueden ser idénticos o diferentes. En una realización, el primer enlazador es un enlazador procesaóle. En otra realización, el segundo enlazador o el tercer enlazador consisten en un enlazador escindióle que comprende uno o dos sitios escindióles. En una realización específica, el segundo enlazador es un enlazador escindióle de tromóina. Los enlazadores útiles en la invención se descrióen en otra parte de este documento.
(2) FVIII, XTEN y Fc
Una proteína quimérica de la invención comprende además (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN (un primer extensor de la semivida), y (iii) una región constante de Ig o una porción de esta (un segundo extensor de la semivida), en donde la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII por un enlazador opcional y la región constante de Ig o una porción de esta por un enlazador adicional opcional. La secuencia de XTEN y la región constante de Ig o una porción de esta se pueden usar juntas para extender la semivida de la proteína FVIII. En un caso, la proteína quimérica es un monómero. En otro caso, la proteína quimérica es un dímero (un homodímero o un heterodímero).
La presente invención también se refiere a una proteína quimérica que comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una región constante de Ig o una porción de esta (es decir, una primera región constante de Ig o una porción de esta, "F," o "F1"), y (iv) una región constante de Ig adicional o una porción de esta (es decir, una segunda región constante de Ig o una porción de esta o "F2"). En un caso, la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII en el término C o en el término N o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos en la proteína FVIII (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN), la proteína FVIII está enlazada a la primera región constante de Ig o una porción de esta, y la primera región constante de Ig o una porción de esta y la segunda región constante de Ig o una porción de esta están asociadas con o enlazadas entre sí mediante un enlazador opcional. En ciertos aspectos, la proteína quimérica es un híbrido de monómero-dímero, que comprende una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena de polipéptidos comprende una proteína FVIII, una secuencia de XTEN, y una primera región constante de Ig o una porción de esta, y la segunda cadena de polipéptidos comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda región constante de Ig o una porción de esta sin la proteína FVIII y en donde la primera cadena y la segunda cadena están asociadas entre sí. La asociación entre la región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., la primera región Fc) y la región constante de Ig adicional o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc) es una asociación química o una asociación física. En ciertos casos, la asociación química es un enlace covalente. En otros casos, la asociación química es una interacción no covalente, p. ej., una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals o un enlace hidrógeno. En otros casos, la asociación es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otros casos, la asociación es un enlace peptídico.
En otros casos, la proteína quimérica es una cadena sencilla de polipéptidos que comprende una proteína FVIII, una secuencia de XTEN, una primera región constante de Ig o una porción de esta, un enlazador, p. ej., un enlazador procesable, y una segunda región constante de Ig o una porción de esta, en donde la cadena sencilla de polipéptidos se procesa después de la expresión por una enzima intracelular y se convierte en dos cadenas de polipéptidos.
En un caso, la región constante de Ig o una porción de esta (a veces indicada por "F" o "F1") enlazada a la proteína FVIII puede extender la semivida de la proteína FVIII junto con la secuencia de XTEN. En otro caso, la región constante de Ig o una porción de esta ("F" o "F1") es una región Fc o un elemento ligante FcRn descrito en otra parte de este documento.
En otros casos, la región constante de Ig adicional o una porción de esta (a veces indicada en este documento por "F2" o una segunda región constante de Ig o una porción de esta) asociada con o enlazada a la primera región constante de Ig o una porción de esta puede además extender la semivida de la proteína FVIII. En otros casos, la segunda región constante de Ig o una porción de esta ("F2") junto con la primera región constante de Ig o una porción de esta y la secuencia de XTEN pueden extender la semivida de la proteína FVIII. La región constante de Ig adicional o una porción de esta puede ser una región Fc o un elemento ligante de FcRn descrito en otra parte de este documento.
En ciertos casos, la segunda región constante de Ig o una porción de esta asociada con la primera región constante de Ig o una porción de esta se enlaza además a un fragmento de VWF descrito en otra parte de este documento y a una secuencia de XTEN opcional.
En algunos casos, o bien una o ambas de la región constante de Ig o una porción de esta ("F" o "F1" o una primera región constante de Ig o una porción de esta) y la región constante de Ig adicional o una porción de esta (es decir, una segunda región constante de Ig o una porción de esta o "F2") (indicada en este párrafo como "las regiones constantes de Ig o una porción de estas") pueden incluir, entre otros, un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, un dominio bisagra, cualquier fragmento funcional, sus derivados o análogos o dos o más de sus combinaciones. En un caso, la región constante de Ig o una porción de esta comprende por lo menos un dominio CH1, por lo menos un dominio CH2, por lo menos un dominio CH3, por lo menos un dominio CH4 o sus fragmentos funcionales, derivados o análogos. En otro caso, la región constante de Ig o una porción de esta comprende por lo menos un domino bisagra o una porción de este y por lo menos un dominio CH2 o una porción de este (p. ej., en la orientación bisagra-CH2). En otros casos, el dominio constante de Ig o una porción de este comprende por lo menos un dominio CH2 o una porción de este y por lo menos un dominio CH3 o una porción de este (p. ej., en la orientación CF2-CH3). Los ejemplos de la combinación incluyen, aunque sin limitarse a ello, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio bisagra, que también se conocen como una región Fc (o dominio Fc), p.
ej., primera región Fc. Otros ejemplos de las regiones constantes de Ig o sus porciones se describen en otra parte de este documento.
La proteína quimérica de la invención puede tener una semivida extendida de la proteína FVIII en comparación con FVIII de tipo salvaje. En una realización, la semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces o por lo menos aproximadamente 12 veces más que la semivida de FVIII de tipo salvaje. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII es de por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 11 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 13 horas, por lo menos aproximadamente 14 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 16 horas, por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas o por lo menos aproximadamente 108 horas.
(3) FVIII, XTEN y VWF
En un caso, una proteína quimérica de la presente invención comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN y (iii) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, en donde la proteína FVIII está enlazada a la secuencia de XTEN y en donde la proteína FVIII está asociada o enlazada al fragmento de VWF. En un caso, el fragmento de VWF de la proteína quimérica descrita en este documento no es capaz de unirse a un receptor de aclaramiento de VWF. En otro caso, el fragmento de VWF es capaz de proteger a la proteína FVIII contra una o más escisiones de proteasa, de proteger a la proteína FVIII contra activación, estabilizar la cadena pesada y/o la cadena ligera de la proteína FVIII o de prevenir el aclaramiento de la proteína FVIII por uno o más receptores depuradores. En otros casos, el fragmento de VWF previene o inhibe la unión de VWF endógeno al sitio de unión a VWF en la proteína FVIII. El sitio de unión a VWF puede estar localizado en el dominio A3 o en el dominio C2 de la proteína FVIII o en el dominio A3 y en el dominio C2. En un caso específico, el sitio de unión a VWF comprende la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 1669 a 1689 y/o los aminoácidos 2303 a 2332 de la SEQ ID NO: 2.
En otro caso, una proteína quimérica comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) un fragmento de VWF, que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, y (iv) una región constante de Ig o una porción de esta, en donde la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII en el término C o el término N o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN descritos en la presente invención) en la proteína FVIII, el fragmento de VWF está enlazado a o asociado con la proteína FVIII o la secuencia de XTEN, y la región constante de Ig o una porción de esta está enlazada a la proteína FVIII, la secuencia de XTEN, el fragmento de VWF, o cualquiera de sus combinaciones. La región constante de Ig o una porción de esta útil para las proteínas quiméricas de la invención se describe en otra parte de este documento. En un caso, la región constante de Ig o una porción de esta es capaz de extender la semivida de una proteína FVIII. En otro caso, la región constante de Ig o una porción de esta comprende una primera región Fc o un primer elemento ligante de FcRn. Incluso en otros casos, la región constante de Ig o una porción de esta está enlazada a la proteína FVIII por un enlazador opcional. Incluso en otros casos, el enlazador comprende un enlazador escindible. La proteína quimérica puede ser una cadena de polipéptidos sencilla, es decir, un monómero (una cadena sencilla), que contiene (i), (ii), (iii) y (iv) o dos cadenas que contienen una primera cadena que comprende (i) y (ii) y una segunda cadena que comprende (iii) y (iv). En otros casos, la proteína quimérica es un dímero (p. ej., un homodímero o un heterodímero). En un caso, la proteína quimérica comprende dos cadenas, en donde cada una comprende (i), (ii), (iii) y (iv).
En ciertos casos, una proteína quimérica comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) un fragmento de VWF, que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, (iv) una región constante de Ig o una porción de esta (a veces se indica como "F," "una primera región constante de Ig o una porción de esta", o "F2"), y (v) una región constante de Ig adicional o una porción de esta (a veces también se indica como "F2" o "una segunda región constante de Ig o una porción de esta”), en donde (1) la proteína FVIII está enlazada a la secuencia de XTEN en el término C o el término N de la proteína FVIII o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN descritos en este documento) en la proteína FVIII, (2) o bien la secuencia de XTEN o la proteína FVIII está enlazada a la región constante de Ig o una porción de esta, (3) el fragmento de VWF está enlazado a la segunda región constante de Ig o una porción de esta, y (4) la región constante de Ig o una porción de esta está asociada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta. En un caso, la región constante de Ig o una porción de esta está enlazada a la proteína FVII o la secuencia de XTEN está además enlazada al fragmento de VWF por un enlazador, p. ej., un enlazador procesable. En otro caso, la región constante de Ig adicional o una porción de esta útil para las proteínas quiméricas de la invención puede además estar enlazada a la proteína FVIII o la región constante de Ig o una porción de esta por un enlazador opcional, p. ej., un enlazador procesable. En algunos casos, un par de la región constante de Ig o una porción de esta y la región constante de Ig adicional o una porción de esta, cada una de las cuales está enlazada al fragmento de VWF y la proteína FVIII, provee un enlace más fuerte que el enlace no covalente entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF, es decir, un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro, previniendo así que el VWF endógeno reemplace al fragmento de VWF in vivo. En otros casos, la región constante de Ig o una porción de esta y la región constante de Ig adicional o una porción de esta son capaces de extender la semivida de la proteína FVIII o el fragmento de VWF. En otros casos, la región constante de Ig adicional o una porción de esta comprende una segunda región Fc o un elemento ligante de FcRn. La región constante de Ig o una porción de esta y la región constante de Ig adicional o una porción de esta en las proteínas quiméricas son idénticas o diferentes.
En ciertos casos, la región constante de Ig o una porción de esta y la región constante de Ig adicional o una porción de esta están asociadas mediante una asociación química o una asociación física. En un caso, la asociación química, es decir, (:), es por lo menos un enlace no peptídico. En cierto caso, la asociación química, es decir, (:), es un enlace covalente. En otro caso, la asociación química, es decir, (:), es una interacción no covalente, p. ej., una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals o un enlace hidrógeno. En otro caso, (:) es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otro caso, (:) es un enlace peptídico. Incluso en otro caso, (:) representa una asociación física entre dos secuencias, en donde una porción de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo tal que la primera secuencia protege o bloquea una porción de la segunda secuencia para que no interactúe con otro resto. En algunos casos, la asociación entre la región constante de Ig o una porción de esta y la región constante de Ig adicional o una porción de esta puede ser un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro, que previene el reemplazo del fragmento de VWF o el polipéptido que contiene el fragmento de VWF con VWF endógeno. Por lo tanto, prevenir la interacción entre la proteína FVIII y el VWF endógeno reduce o elimina este factor limitante de la semivida para la proteína FVIII, y en consecuencia la semivida de la proteína FVIII se extiende comparada con una proteína FVIII sin la proteína VWF o FVIII de tipo salvaje.
En otros aspectos, una proteína quimérica comprende una fórmula que comprende:
(1) FVIII(X1 )-L1 -F1 :V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1 :F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1 -L1 -FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1 -L1 -FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1 )-L1 -F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1 )-L1 -F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1 -L1 -FVIII(X1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2,
o
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4- F2-L3-X2-L2-V,
en donde FVIII(X1) comprende una proteína FVIII y una o más secuencias de XTEN, en donde una o más de las secuencias de XTEN están enlazadas al término N o al término C de la proteína FVIII o insertadas inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más de los sitios de inserción de XTEN descritos en este documento) en la proteína FVIII;
cada uno de L1, L2 o L3 comprende un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible;
L4 es un enlazador, p. ej, un enlazador procesable;
X2 comprende una o más secuencias de XTEN opcionales;
F1 comprende la primera región constante de Ig o una porción de esta;
F2 comprende la segunda región constante de Ig o una porción de esta, y
V comprende un fragmento de VWF;
(-) es un enlace peptídico o uno o más aminoácidos; y
(:) comprende un enlace covalente. En otras realizaciones, (:) es un enlace covalente no peptídico. Incluso en otras realizaciones, (:) es un enlace peptídico. La orientación de las fórmulas del polipéptido en este documento se menciona desde el término N (izquierda) hacia el término C (derecha). Por ejemplo, la fórmula V-X-FVIII significa la fórmula NH2-V-X-FVIII -COOH. En una realización, las fórmulas descritas en este documento pueden comprender cualquier secuencia adicional entre los dos restos. Por ejemplo, la fórmula V-X-FVIII puede además comprender cualquier secuencia en el término N de V entre V y X, entre X y FVIII, o el término C de FVIII a menos que se especifique otra cosa. En otra realización, el guion (-) indica un enlace peptídico.
En un aspecto, la proteína quimérica comprende dos cadenas de polipéptidos, (A) una primera cadena que comprende (i) una proteína FVIII de cadena sencilla (ii) una secuencia de XTEN y (iii) una primera región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una primera región Fc o un elemento ligante de FcRn, en donde la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII en el término N o en el término C o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos de la proteína FVIII (p. ej., uno o más de los sitios de inserción de XTEN descritos en la presente invención) y la primera región constante de Ig o una porción de esta está enlazada a la secuencia de XTEN cuando la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII en el término N o en el término C o la proteína FVIII cuando la secuencia de XTEN está insertada dentro de la proteína FVIII, y (B) una segunda cadena que comprende (iv) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3, (v) un enlazador, y (vi) una segunda región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una segunda región Fc o un segundo elemento ligante de FcRn, en donde el fragmento de VWF está enlazado al enlazador, p. ej., un enlazador escindible, que además se enlaza a la segunda región constante de Ig o una porción de esta, y en donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están asociadas entre sí por un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro. En una realización, el enlazador es un enlazador escindible descrito en otra parte de este documento, p. ej., un enlazador escindible de trombina. La segunda cadena comprende una o más secuencias de XTEN entre (iv) y (v) o (v) y (vi).
En otros aspectos, la proteína quimérica comprende una cadena de polipéptidos que comprende (i) una proteína FVIII de cadena sencilla (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una primera región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una primera región Fc o un primer elemento ligante de FcRn, (iv) un primer enlazador, (v) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3, (vi) un segundo enlazador, y (vii) una segunda región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una segunda región Fc o un segundo elemento ligante de FcRn, en donde (i) a (vii) están enlazados en orden o en cualquier orden. En una realización, el primer enlazador es un enlazador procesable, que puede procesarse en forma intracelular o escindirse después de la expresión y que hace que la cadena sencilla de polipéptidos se convierta en dos cadenas de polipéptidos. En otra realización, el segundo enlazador es un enlazador escindible descrito en este documento, p. ej., un enlazador de trombina. La secuencia de XTEN utilizada en este documento puede estar enlazada a la proteína FVIII por un enlazador opcional en el término N o en el término C de la proteína FVIII o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII.
En ciertos casos, una proteína quimérica comprende las tres cadenas de polipéptidos, (A) una primera cadena de polipéptidos que comprende (i) una cadena pesada de una proteína FVIII y (ii) una secuencia de XTEN, que están enlazadas entre sí y (B) una segunda cadena de polipéptidos que comprende (iii) una cadena ligera de la proteína FVIII y (iv) una primera región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una primera región Fc o un primer elemento ligante de FcRn, que están enlazados entre sí, y (C) una tercera cadena de polipéptidos que comprende (v) un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3, (vi) un enlazador, y (vii) una segunda región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una segunda región Fc o un segundo elemento ligante de FcRn, en donde la segunda cadena se asocia con la primera cadena y la tercera cadena. En un caso, la asociación entre la primera cadena y la segunda cadena es una asociación química o una asociación física. Por ejemplo, la asociación entre la primera cadena y la segunda cadena puede ser un enlace metálico. En otro caso, la asociación entre la segunda cadena y la tercera cadena es también una asociación química o una asociación física, p. ej., un enlace covalente o un enlace no covalente. En ciertos casos, la asociación entre la segunda cadena y la tercera cadena es a través de las dos regiones constantes de Ig o una porción de esta y es un enlace disulfuro. El enlace entre la segunda cadena y la tercera cadena previene o inhibe la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno, previniendo así que la FVIII se aclare de la ruta de aclaramiento del VWF. En algunos casos, el enlazador es un enlazador procesable, que se escinde en forma intracelular después de la expresión en una célula hospedante. La secuencia de XTEN utilizada en este documento está enlazada a la proteína FVIII por un enlazador opcional en el término N o en el término C de la proteína FVIII o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII.
En ciertos casos, el fragmento de VWF está directamente enlazado a la proteína FVIII, que comprende uno o más XTEN, mediante un enlace peptídico o un enlazador. Como una forma de enlazar el fragmento de VWF y la proteína FVIII, se pueden emplear, en donde se insertan o enlazan uno o más XTEN, a través de un enlace directo (p. ej., un enlace peptídico) o un enlazador, una ligadura enzimática (p. ej., sortasa). Por ejemplo, sortasa se refiere a un grupo de enzimas procariotas que modifican las proteínas superficiales reconociendo y escindiendo una señal de clasificación carboxilo-terminal. Para la mayoría de los sustratos de enzimas sortasa, la señal de reconocimiento consiste en el motivo LPXTG (Leu-Pro-any-Thr-Gly (SEQ ID NO: 51), luego una secuencia transmembrana altamente hidrófoba, luego un racimo de residuos básicos como arginina. La escisión ocurre entre Thr y Gly, con la sujeción transitoria a través del residuo Thr al residuo Cys del sitio activo de un elemento de ligadura, seguido de transpeptidación que sujeta la proteína en forma covalente a la pared celular. En algunos casos, el elemento de ligadura contiene Gly(n). En otros casos, la proteína quimérica comprende además un motivo de reconocimiento de sortasa. En algunos casos, el fragmento de VWF se sujeta a FVIII que comprende uno o más XTEN insertados dentro de o enlazados usando ligadura de proteína in vitro mediada por sortasa.
En un caso, un fragmento de VWF enlazado a un motivo de reconocimiento de sortasa por un enlazador opcional se puede condensar a una proteína FVIII enlazada a Gly(n) por una sortasa, en donde n puede ser cualquier número entero y en donde uno o más XTEN se insertan dentro o se enlazan a la proteína FVIII. Un constructo de ligadura comprende el fragmento de VWF (porción N-terminal del constructo) y la proteína FVIII, en donde uno o más XTEN se insertan o enlazan (porción C-terminal del constructo), en donde el motivo de reconocimiento de sortasa se inserta intercalado. Otro constructo de ligadura comprende el fragmento de VWF (porción N-terminal del constructo, el enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa y la proteína FVIII, en donde uno o más XTEN se insertan o enlazan (porción C-terminal del constructo). En otro caso, una proteína FVIII enlazada a un motivo de reconocimiento de sortasa por un enlazador opcional se puede condensar a un fragmento de VWF enlazado a Gly(n) por una sortasa, en donde n es cualquier número entero. Un constructo de ligadura resultante comprende la proteína FVIII (porción N-terminal del constructo), en donde uno o más XTEN se insertan o enlazan, y el fragmento de VWF (porción C-terminal del constructo), en donde el motivo de reconocimiento de sortasa se inserta intercalado. Otro constructo de ligadura resultante comprende la proteína FVIII (porción N-terminal del constructo), en donde uno o más XTEN se insertan o enlazan, el enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa y el fragmento de VWF (porción C-terminal del constructo). En otros casos, un fragmento de VWF enlazado a un motivo de reconocimiento de sortasa por un primer enlazador opcional se puede condensar a un resto heterólogo, p. ej., una región constante de inmunoglobulina o una porción de esta, p. ej., una región Fc, enlazada a un sitio de escisión de trombina por un segundo enlazador opcional. Un constructo resultante puede comprender el fragmento de VWF (porción N-terminal), el primer enlazador, el motivo de reconocimiento de sortasa, el sitio de escisión de proteasa, el segundo enlazador opcional y el resto heterólogo.
En algunos casos, el fragmento de VWF se asocia con la proteína FVIII. La asociación entre el fragmento de VWF y la proteína FVIII puede ser una asociación química o una asociación física. La asociación química puede ser una interacción no covalente, p. ej., una interacción iónica, una interacción hidrófoba, una interacción hidrófila, una interacción de Van der Waals o un enlace hidrógeno. Incluso en otros casos, la asociación entre la proteína FVIII y el fragmento de VWF es una asociación física entre dos secuencias, p. ej., debido a una asociación adicional entre la secuencia que tiene la proteína FVIII y la secuencia que tiene el fragmento de VWF, en donde una porción de una primera secuencia está próxima a una segunda secuencia de modo tal que la primera secuencia protege o bloquea una porción de la segunda secuencia para que no interactúe con otro resto.
Como consecuencia de prevenir o inhibir la interacción de VWF endógeno con la proteína FVIII por el fragmento de VWF, la proteína quimérica descrita en este documento tiene una semivida extendida en comparación con FVIII de tipo salvaje o la proteína quimérica correspondiente sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces o por lo menos aproximadamente 12 veces más que una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII es de por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 11 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 13 horas, por lo menos aproximadamente 14 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 16 horas, por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas o por lo menos aproximadamente 108 horas. En una realización particular, la semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos 10 horas, por lo menos aproximadamente 11 horas, por lo menos aproximadamente 12 horas, por lo menos aproximadamente 13 horas, por lo menos aproximadamente 14 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 16 horas, por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 26 horas o por lo menos aproximadamente 27 horas en ratones HemA.
A) Fragmentos del Factor de Von Willebrand (VWF)
VWF (también conocido como F8VWF) es una glucoproteína multimérica grande presente en el plasma y producida constitutivamente en el endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade), megacariocitos (a-gránulos de plaquetas) y tejido conjuntivo del subendotelio. El monómero de VWF básico es una proteína de 2813 aminoácidos. Cada monómero contiene una serie de dominios específicos con una función específica, el dominio D'/D3 (que se une al Factor VIII), el dominio A1 (que se une al receptor de plaquetas GPIb, heparina y/o posiblemente colágeno), el dominio A3 (que se une a colágeno), el dominio C1 (en donde el dominio RGD se une a la integrina de plaquetas aiibp3 cuando se activa) y el dominio del "nudo cisterna" en el extremo C-terminal de la proteína (en donde VWF comparte el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), transformando el factor de crecimiento p (TGFP) y la gonadotropina coriónica humana p (PHCG).
La expresión "un fragmento de VWF" tal como se emplea en este documento incluye, aunque sin limitarse a ello, fragmentos de VWF funcionales que comprenden un dominio D’ y un dominio D3, capaces de inhibir la unión de VWF endógeno a FVIII. En una realización, el fragmento de VWF se une a la proteína FVi i i. En otra realización, el fragmento de VWF bloquea el sitio de unión de VWF en la proteína FVIII, inhibiendo así la interacción de la proteína FViii con VWF endógeno. Los fragmentos de VWF incluyen derivados, variantes, mutantes o análogos que retienen estas actividades del VWF.
La secuencia de monómeros de 2813 aminoácidos para el VWF humano se indica como número de acceso NP_000543.2_ en Genbank. La secuencia de nucleótidos que codifica el VWF humano se indica como número de acceso_NM_000552.3_ en Genbank. La secuencia de nucleótidos del VWF humano se designa como SEQ iD NO: 1. SEQ iD NO: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ iD NO: 1. Cada dominio de VWF se enumera en la Tabla 1.
Tabla 1. Secuencias de VWF
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
El fragmento de VWF tal como se utiliza en este documento puede ser un fragmento de VWF que comprende un dominio D’ y un dominio D3 de VWF, en donde el fragmento de VWF se une al Factor VIII (FVIII) e inhibe la unión de VWF endógeno (VWF de longitud total) a FVIII. El fragmento de VWF que comprende el dominio D' y el dominio D3 puede además comprender un dominio VWF seleccionado del grupo que consiste en un dominio A1, un dominio A2, un dominio A3, un dominio D1, un dominio D2, un dominio D4, un dominio B1, un dominio B2, un dominio B3, un dominio C1, un dominio C2, un dominio CK, uno o más fragmentos de estos, y cualquiera de sus combinaciones. En una realización, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en: (1) los dominios D' y D3 de VWF o sus fragmentos; (2) los dominios D1, D' y D3 de VWF o sus fragmentos; (3) los dominios D2, D' y d3 de VWF o sus fragmentos; (4) los dominios D1, D2, D' y D3 de VWF o sus fragmentos; o (5) los dominios D1, d2, D', D3 y A1 de VWF o sus fragmentos. El fragmento de VWF descrito en este documento no contiene un sitio de unión a un receptor de aclaramiento de VWF. En otra realización, el fragmento de VWF descrito en este documento no consiste en los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2. El fragmento de VWF puede comprender cualquier otra secuencia enlazada o condensada al fragmento de VWF. Por ejemplo, un fragmento de VWF descrito en este documento puede además comprender un péptido de señalización.
En una realización, el fragmento de VWF se une a o se asocia con una proteína FVIII. Al unirse a o asociarse con una proteína FVIII, un fragmento de VWF de la invención protege a FVIII contra la escisión de proteasa y la activación de FVIII, estabiliza la cadena pesada y la cadena ligera de FVIII y previene el aclaramiento de FVIII por receptores depuradores. En otra realización, el fragmento de VWF se une a o se asocia con una proteína FVIII y bloquea o previene la unión de la proteína FVIII a fosfolípido y Proteína C activada. Al prevenir o inhibir la unión de la proteína FVIII con VWF endógeno de longitud total, el fragmento de VWF de la invención reduce el aclaramiento de FVIII por receptores de aclaramiento de VWF y por lo tanto extiende la semivida de la proteína FVIII. En una realización, la extensión de la semivida de una proteína FVIII se debe por lo tanto a la unión o a la asociación con el fragmento de VWF que carece de un sitio de unión del receptor de aclaramiento del VWF a la proteína FVIII y al resguardo o la protección de la proteína FVIII por el fragmento de VWF contra VWF endógeno que contiene el sitio de unión al receptor de aclaramiento del VWF. La proteína FVIII unida o protegida por el fragmento de VWF puede además reciclar una proteína FVIII. Al eliminar los sitios de unión al receptor de la vía de aclaramiento del VWF contenidos en la molécula de VWF de longitud total, los heterodímeros FVIII/VWF de la invención se protegen contra la vía de aclaramiento del VWF, extendiendo más la semivida del FVIII.
En una realización, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en donde el dominio D' es por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a los aminoácidos 764 a 866 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF previene la unión de VWF endógeno a FVIII. En otra realización, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, en donde el dominio D3 es por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a los aminoácidos 867 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF previene la unión de VWF endógeno a FVIII. En algunas realizaciones, un fragmento de VWF descrito en este documento comprende, consiste esencialmente en o consiste en el dominio D' y el dominio D3 de VWF, que son por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF previene la unión de VWF endógeno a FVIII. En otras realizaciones, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en los dominios D1, D2, D' y D3 por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a los aminoácidos 23 a 1240 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF previene la unión de VWF endógeno a FVIII. Incluso en otras realizaciones, el fragmento de VWF comprende además un péptido de señalización operativamente unido.
En algunas realizaciones, un fragmento de VWF consiste esencialmente en o consiste en (1) el dominio D'D3, el dominio D1D'D3, el dominio D2D'D3 o el dominio D1D2D'D3 y (2) una secuencia de VWF adicional de hasta aproximadamente 10 aminoácidos (p. ej., cualquier secuencia de los aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1250 de SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 15 aminoácidos (p. ej., cualquier secuencia de aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1255 of SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 20 aminoácidos (p. ej., cualquier secuencia de aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1260 de SEQ ID NO: 2), hasta aproximadamente 25 aminoácidos (p. ej., cualquier secuencia de aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID NO: 2 a aminoácidos 764 a 1265 de SEQ ID NO: 2), o hasta aproximadamente 30 aminoácidos (p. ej., cualquier secuencia de aminoácidos 764 a 1240 de SEQ ID nO: 2 a aminoácidos 764 a 1260 de SEQ ID NO: 2). En una realización particular, el fragmento de VWF que comprende o que consiste esencialmente el dominio D' y el dominio D3 no es ninguno de los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2 ni el VWF maduro de longitud total. En algunas realizaciones, el dominio D1D2 se expresa en trans con el dominio D'D3. En algunas realizaciones, el dominio D1D2 se expresa en cis con el dominio D'D3.
En otras realizaciones, el fragmento de VWF que comprende los dominios D'D3 enlazados a los dominios D1D2 comprende además un sitio de escisión intracelular, p. ej., (un sitio de escisión por PACE (furina) o PC5), permitiendo la escisión de los dominios D1D2 de los dominios D'D3 tras la expresión. Los ejemplos no limitativos del sitio de escisión intracelular se describen en otra parte de este documento.
Incluso en otras realizaciones, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3, pero no comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (1) aminoácidos 1241 a 2813 de SEQ ID NO: 2, (2) aminoácidos 1270 a aminoácidos 2813 de SEQ iD NO: 2, (3) aminoácidos 1271 a aminoácidos 2813 de SEQ iD NO: 2, (4) aminoácidos 1272 a aminoácidos 2813 de SEQ ID NO: 2, (5) aminoácidos 1273 a aminoácidos 2813 de SEQ ID NO: 2, (6) aminoácidos 1274 a aminoácidos 2813 de SEQ ID NO: 2, y cualquiera de sus combinaciones.
Incluso en otras realizaciones, un fragmento de VWF comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio D', dominio D3 y dominio A1, en donde la secuencia de aminoácidos es por lo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 764 a 1479 de SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento de VWF previene la unión de VWF endógeno a FVIII. En una realización particular, el fragmento de VWF no consiste en los aminoácidos 764 a 1274 de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, un fragmento de VWF comprende el dominio D' y el dominio D3, pero no comprende por lo menos un dominio VWF seleccionado del grupo que consiste en (1) un dominio A1, (2) y un dominio A2, (3) un dominio A3, (4) un dominio D4, (5) un dominio B1, (6) un dominio B2, (7) un dominio B3, (8) un dominio C1, (9) un dominio C2, (10) un dominio CK, (11) un dominio CK y un dominio C2, (12) un dominio CK, un dominio C2 y un dominio C1, (13) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, (14) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, (15) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2 y un dominio B1, (16) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1 y un dominio D4, (17) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4 y un dominio A3, (18) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3 y un dominio A2, (19) un dominio CK, un dominio C2, un dominio C1, un dominio B3, un dominio B2, un dominio B1, un dominio D4, un dominio A3, un dominio A2 y un dominio A1, y (20) cualquiera de sus combinaciones.
Incluso en otras realizaciones, el fragmento de VWF comprende los dominios D'D3 y uno o más dominios o módulos. Los ejemplos de dichos dominios o módulos incluyen, aunque sin limitarse a ello, los dominios y módulos descritos en Zhora et al., Blood publicado el 6 de abril de 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Por ejemplo, el fragmento de VWF puede comprender el dominio D'D3 y uno o más dominios o módulos seleccionados del grupo que consiste en el dominio A1, dominio A2, dominio A3, módulo D4N, módulo VWD4, módulo C8-4, módulo TIL-4, módulo C1, módulo C2, módulo C3, módulo C4, módulo C5, módulo C5, módulo C6, y cualquiera de sus combinaciones.
Incluso en otras realizaciones, el fragmento de VWF está enlazado a un resto heterólogo, en donde el resto heterólogo está enlazado al término N o al término C del fragmento de VWF o insertado inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII en el fragmento de VWF. Por ejemplo, los sitios de inserción para el resto heterólogo en el fragmento de VWF pueden estar en el dominio D', el dominio D3, o ambos. El resto heterólogo puede ser un extensor de la semivida.
En determinadas realizaciones, un fragmento de VWF forma un multímero, p. ej., dímero, trímero, tetrámero, pentámero, heptámero, o multímeros de orden superior. En otras realizaciones, el fragmento de VWF es un monómero que tiene solamente un fragmento de VWF. En algunas realizaciones, el fragmento de VWF puede tener una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones o modificaciones de aminoácidos. En una realización, el fragmento de VWF puede incluir sustituciones, eliminaciones, adiciones o modificaciones de aminoácidos tales que el fragmento de VWF no sea capaz de formar un enlace disulfuro o formar un dímero o un multímero. En otra realización, la sustitución de aminoácidos está dentro del dominio D' y el dominio D3. En una realización particular, un fragmento de VWF contiene por lo menos una sustitución de aminoácidos en un residuo correspondiente al residuo 1099, residuo 1142, o ambos residuos 1099 y 1142 de SEQ ID NO: 2. Al menos una sustitución de aminoácido puede ser cualquier aminoácido que no ocurra naturalmente en el VWF de tipo salvaje. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína, p. ej., Isoleucina, Alanina, Leucina, Asparagina, Lisina, Ácido aspártico, Metionina, Fenilalanina, Ácido glutámico, Treonina, Glutamina, Triptófano, Glicina, Valina, Prolina, Serina, Tirosina, Arginina o Histidina. En otro ejemplo, la sustitución de aminoácidos tiene uno o más aminoácidos que previenen o inhiben que el fragmento de VWF forme multímeros.
En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF útil en la presente invención puede además modificarse para mejorar su interacción con FVIII, p. ej., mejorar la afinidad de unión hacia FVIII. Como ejemplo no limitativo, el fragmento de VWF comprende un residuo serina en el residuo correspondiente al aminoácido 764 de SEQ ID NO: 2 y un residuo lisina en el residuo correspondiente al aminoácido 773 de SEQ ID NO: 2. Los residuos 764 y/o 773 pueden contribuir a la afinidad de unión del fragmento de VWF a FVIII. En otras realizaciones, el fragmento de VWF útil en la invención puede tener otras modificaciones, p. ej., la proteína puede pegilarse, glucosilarse, hesilarse o polisialilarse.
B) Secuencias de XTEN
Tal como se emplea en la presente memoria, "secuencia de XTEN" se refiere a polipéptidos de longitud extendida con secuencias no naturales, sustancialmente no repetitivas compuestas principalmente por pequeños aminoácidos hidrófilos, en donde la secuencia tiene un bajo grado o ninguna estructura secundaria o terciaria bajo condiciones fisiológicas. Como un socio de una proteína quimérica, los XTEN pueden tener un vehículo, que confiere ciertas propiedades deseables de farmacocinética, fisicoquímicas y farmacéuticas cuando se enlazan a un fragmento de VWF o una secuencia de FVIII de la invención para crear una proteína quimérica. Dichas propiedades deseables incluyen, aunque sin limitarse a ello, mejores parámetros de farmacocinética y características de solubilidad. Tal como se emplea en este documento, "XTEN" excluye concretamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos de Fc de una cadena ligera o una cadena pesada.
En algunas realizaciones, la secuencia de XTEN de la invención es un péptido o un polipéptido que tiene más de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 o 2000 residuos de aminoácidos. En determinadas realizaciones, XTEN es un péptido o polipéptido que tiene más de aproximadamente 20 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos, más de 30 a aproximadamente 2500 residuos, más de 40 a aproximadamente 2000 residuos, más de 50 a aproximadamente 1500 residuos, más de 60 a aproximadamente 1000 residuos, más de 70 a aproximadamente 900 residuos, más de 80 a aproximadamente 800 residuos, más de 90 a aproximadamente 700 residuos, más de 100 a aproximadamente 600 residuos, más de 110 a aproximadamente 500 residuos o más de 120 a aproximadamente 400 residuos.
La secuencia de XTEN de la invención puede comprender uno o más motivos de secuencia de 9 a 14 residuos de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica al motivo de secuencia, en donde el motivo comprende, consiste esencialmente en o consiste en 4 a 6 tipos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P). Ver US 2010-0239554 A1.
En algunas realizaciones, el XTEN comprende motivos de secuencias no superpuestos en donde aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o aproximadamente 91%, o aproximadamente 92%, o aproximadamente 93%, o aproximadamente 94%, o aproximadamente 95%, o aproximadamente 96%, o aproximadamente 97%, o aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% o aproximadamente 100% de la secuencia consiste en múltiples unidades de secuencias no superpuestas seleccionadas entre una familia de un motivo sencillo de la Tabla 2A, que resulta en una secuencia familiar. Tal como se emplea en este documento, "familia" significa que el XTEN tiene motivos seleccionados solamente de una categoría de motivos sencillos de la Tabla 2A; es decir, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC o BD XTEN, y que cualquier otro aminoácido en el XTEN no de un motivo familiar se selecciona para lograr una propiedad necesaria, como permitir la incorporación de un sitio de restricción por nucleótidos codificantes, incorporación de una secuencia de escisión, o para lograr un mejor enlace a FVIII o VWF. En algunas realizaciones de las familias de XTEN, una secuencia de XTEN comprende múltiples unidades de motivos de secuencias que no se superponen de la familia de motivos AD, o la familia de motivos AE, o la familia de motivos AF, o la familia de motivos AG, o la familia de motivos AM, o la familia de motivos AQ, o la familia de motivos BC, o la familia BD, en donde el XTEN resultante exhibe el intervalo de homología anteriormente descrito. En otras realizaciones, el XTEN comprende múltiples unidades de secuencias de motivos de dos o más de las familias de motivos de la Tabla 2A. Estas secuencias se pueden seleccionar para lograr las características físico-químicas deseadas, incluidas propiedades tales como carga neta, hidrofobicidad, falta de estructura secundaria o falta de repetitividad que son conferidas por la composición del aminoácido de los motivos, que se describe más completamente en lo sucesivo. En las realizaciones anteriormente expuestas en este párrafo, los motivos incorporados en el XTEN se pueden seleccionar y unir usando los métodos descritos en este documento para lograr un XTEN de aproximadamente 36 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos.
Tabla 2A. Motivos de secuencias de XTEN de 12 aminoácidos y familias de motivos
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
• Indica secuencias de motivos individuales que, cuando se usan juntas en varias permutaciones, resultan en una "secuencia familiar"
XTEN puede tener longitudes variables para inserción o enlace a FVIII o VWF. En una realización, la longitud de la secuencia(s) de XTEN se seleccionan en función de la propiedad o función que se ha de lograr en la proteína de fusión. Dependiendo de la propiedad o función a la que esté destinado, el XTEN puede ser una secuencia de longitud corta o intermedia o de secuencia más larga que sirve como vehículo. En determinadas realizaciones, el XTEN incluye segmentos cortos de aproximadamente 6 a aproximadamente 99 residuos de aminoácidos, longitudes intermedias de aproximadamente 100 a aproximadamente 399 residuos de aminoácidos, y longitudes más largas de aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 y hasta aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, el XTEN insertado en o enlazado a FVIII o VWF puede tener longitudes de aproximadamente 6, aproximadamente 12, aproximadamente 36, aproximadamente 40, aproximadamente 42, aproximadamente 72, aproximadamente 96, aproximadamente 144, aproximadamente 288, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 576, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 864, aproximadamente 900, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500 o hasta aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de largo. En otras realizaciones, las secuencias de XTEN tienen aproximadamente 6 a aproximadamente 50, aproximadamente 50 a aproximadamente 100, aproximadamente 100 a 150, aproximadamente 150 a 250, aproximadamente 250 a 400, aproximadamente 400 a aproximadamente 500, aproximadamente 500 a aproximadamente 900, aproximadamente 900 a 1500, aproximadamente 1500 a 2000 o aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de longitud. La longitud precisa de un XTEN insertado en o enlazado a FVIII o VWF puede variar sin afectar en forma adversa la actividad de FVIII o VWF. En una realización, uno o más de los XTEN utilizados en este documento tienen 36 aminoácidos, 42 aminoácidos, 72 aminoácidos, 144 aminoácidos, 288 aminoácidos, 576 aminoácidos o 864 aminoácidos de longitud y se pueden seleccionar entre una o más de las secuencias de familias de XTEN; es decir, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC o BD.
En algunas realizaciones, la secuencia de XTEN utilizada en la invención es por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 y AG2004. Ver el documento US 2010-0239554 A1.
En una realización, la secuencia de XTEN es por lo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ ID NO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ ID NO: 131), AE144_6B (SEQ ID NO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ ID NO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ ID NO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ ID NO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID nO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38), y cualquiera de sus combinaciones.
En algunas realizaciones, menos de 100% de los aminoácidos de un XTEN se seleccionan entre glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P), o menos de 100% de la secuencia consiste en los motivos de secuencias de la Tabla 2A o las secuencias de XTEN de la Tabla 2B. En dichas realizaciones, los residuos de aminoácidos restantes del XTEN se seleccionan entre cualquiera de los otros 14 L-aminoácidos naturales, pero preferiblemente se pueden seleccionar entre aminoácidos hidrófilos de modo tal que la secuencia de XTEN contenga por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o por lo menos aproximadamente 99% aminoácidos hidrófilos. El contenido de los aminoácidos hidrófilos en el XTEN utilizado en los constructos de conjugación puede ser menos de 5%, o menos de 2%, o menos de 1% contenido de aminoácidos hidrófobos. Los residuos hidrófobos que están menos favorecidos en la construcción de XTEN incluyen triptófano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina y metionina. Además, las secuencias de XTEN pueden contener menos de 5% o menos de 4% o menos de 3% o menos de 2% o menos de 1% o ninguno de los siguientes aminoácidos: metionina (por ejemplo, para evitar la oxidación) o asparagina y glutamina (para evitar la desamidación).
En otra realización, la secuencia de XTEN se selecciona del grupo que consiste en AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ ID NO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ ID NO: 131), AE144_6B (SEQ ID NO: 132), AG144_A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ ID NO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ ID NO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ ID NO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SeQ ID NO: 38), y cualquiera de sus combinaciones. En una realización específica, la secuencia de XTEN es AE288. Las secuencias de aminoácidos para ciertas secuencias de XTEN de la invención se muestran en la Tabla 2B.
Tabla 2B. Secuencias de XTEN
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
En otras realizaciones, la secuencia de XTEN utilizada en la invención afecta la propiedad físico-química, p. ej., farmacocinética, de la proteína quimérica de la presente invención. La secuencia de XTEN utilizada en la presente invención puede exhibir una o más de las siguientes propiedades ventajosas: flexibilidad conformacional, mayor solubilidad acuosa, alto grado de resistencia a proteasa, baja inmunogenicidad, baja unión a receptores mamíferos o mayor radio de hidrodinámica (o Stokes). En una realización específica, la secuencia de XTEN enlazada a una proteína FVIII en esta invención aumenta las propiedades de farmacocinética tales como semivida terminal más prolongada o mayor área debajo de la curva (AUC), de forma tal que la proteína quimérica descrita en este documento permanece in vivo por un mayor periodo de tiempo en comparación con FVIII de tipo salvaje. En otras realizaciones, la secuencia de XTEN utilizada en la presente invención aumenta las propiedades de farmacocinética tales como mayor semivida terminal o mayor área debajo de la curva (AUC), de modo tal que la proteína FVIII permanece in vivo por un periodo de tiempo más prolongado que FVIII de tipo salvaje.
Se puede emplear una diversidad de métodos y ensayos para determinar las propiedades físico-químicas de las proteínas que comprenden la secuencia de XTEN. Dichos métodos incluyen, aunque sin limitarse a ello, centrifugación analítica, EPR, HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión de tamaño, HPLC-fase inversa, dispersión de luz, electroforesis capilar, dicroismo circular, calorimetría de barrido diferencial, fluorescencia, HPLC-intercambio iónico, HPLC-exclusión de tamaño, IR, RMN, espectroscopia Raman, refractometría y espectroscopia UV/Visible. Se describen métodos adicionales en Amau et al., Prot Expr y Purif 48, 1-13 (2006).
Los ejemplos adicionales de secuencias de XTEN que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención se describen en las publicaciones de patentes de EE. UU. núm. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 o 2011/0172146 A1, o en las solicitudes de patentes internacionales núm. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 o WO 2011028344 A2.
C) Proteína del Factor VIII (FVIII)
"Una proteína FVIII", tal como se emplea en este documento, significa un polipéptido FVIII funcional en su función normal en la coagulación, a menos que se indique otra cosa. El término proteína FVIII incluye su fragmento funcional, variante, análogo o derivado que retiene la función del Factor VIII de tipo salvaje de longitud total en la vía de coagulación. "Una proteína FVIII" se usa de manera intercambiable con polipéptido FVIII (o proteína) o FVIII. Los ejemplos de las funciones de FVIII incluyen, aunque sin limitarse a ello, la capacidad de activar la coagulación, la capacidad de actuar como un cofactor para el factor IX o la capacidad de formar un complejo tenasa con el factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos, que luego convierten el Factor X en la forma activada Xa. La proteína FVIII puede ser proteína FVIII humana, porcina, canina, de rata o murina. Además, las comparaciones entre FVIII de seres humanos y otras especies han identificado residuos conservados que probablemente se requieren para la función (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6.251.632).
Están disponibles una serie de pruebas para evaluar el funcionamiento del sistema de coagulación: prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), ensayo cromogénico, ensayo ROTEM, prueba de tiempo de protrombina (PT) (también utilizada para determinar INR), prueba de fibrinógeno (a menudo por el método de Clauss), recuento de plaquetas, pruebas del funcionamiento de plaquetas (a menudo por PFA-100), TCT, tiempo de sangrado, pruebas mixtas (si una anomalía se corrige si el plasma del paciente se mezcla con plasma normal), ensayos del factor de coagulación, anticuerpos antifosfolípidos, D-dímero, pruebas genéticas (p. ej., factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A), ensayo del veneno de víbora de Russell diluido (dRVVT), pruebas varias del funcionamiento de las plaquetas, tromboelastografía (TEG o Sonoclot), tromboelastometría (TEM®, p. ej., ROTEM®) o tiempo de lisis de euglobulina (ELT).
La prueba de aPTT es un indicador del desempeño que mide la eficacia de la vía "intrínseca" (también denominada vía de activación de contacto) y las vías de coagulación comunes. Esta prueba se utiliza comúnmente para medir la actividad de coagulación de factores de coagulación recombinantes comerciales, p. ej., FVIII o FIX. Se utiliza junto con el tiempo de protrombina (PT), que mide la vía extrínseca.
El análisis de ROTEM brinda información sobre toda la cinética de la hemostasia: tiempo de la coagulación, formación de la coagulación, estabilidad de la coagulación y lisis. Los distintos parámetros en tromboelastometría dependen de la actividad del sistema de coagulación plasmática, la función de las plaquetas, la fibrinólisis, o muchos factores que influyen en estas interacciones. Este ensayo puede proporcionar una vista completa de hemostasia secundaria.
Se conocen el polipéptido de FVIII y las secuencias de polinucleótidos, como muchos fragmentos funcionales, mutantes y versiones modificadas. Los ejemplos de secuencias de FVIII humanas (longitud total) se exponen a continuación.
Tabla 3. Secuencia de aminoácidos del Factor VIII de longitud total
FVIII de longitud total (péptido de señalización de FVIII subrayado; cadena pesada de FVIII subrayada doble; dominio B en cursiva; y cadena ligera de FVIII en texto sin formato)
Péptido de señalización: (SEQ ID NO: 3)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Factor maduro VIII (SEQ ID NO: 4)* ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIOAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASE
gaey ddqtsor ekeddk vtpggs1ítyv wovekeñ qpmasd¥ lclits ylshvdIjV
kdlñ sgliga llvcreg slakek tqtlhk fillfav fdegks whsetkn slmqdr
DA ASAR AWPK MHTV ÑG^
FLVRNHRQAS LEIS PITFLTAQT LLMDLGOFLL FCHIS SHOHDGMEAYVKVD SCP EEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHY IAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSOYLNNGPORIGRKYKKVRFMAYTDETFKTRE
Á iÓH ÉS Gñ^ PLL YGÉVG DTLL i ÍF^^
KHLKDFPIL PGEIFKYKWTVTVEDG PTKS DPRCLTRYY SSFVNMERDLAS GLIGP
llic ykesvd órgñóim sdkrñv ilfsvf deñrswy lteñio rflpñpa gvoled PEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKH KMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRS FS QNS REPS TR OKQ FNA TT1 PENI) IEKTD PWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEÁKYETFSDDPSPGAI DSNNS ASERIE EbRPQLEHSGDtTVb'TPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSS TSNNLISTIPSDNLAÁGTDNTSSLGPPSMPVHYDSGLDTTLF'GKKSSPLTESGGP LSLSEENNDSKLLESGLPíNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNñL FEVSISLLKTNKTSNNSATNRETHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFEKVTPL IHDRMLMDKNATÁLRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDÁQNPDMSEFKML EL PESAR WIQR TEGKNSLNSGGGPS PKQL VSLGPEKS VEGQNFL SEKNKWVGKG EFTKDVGLKEMVFPSSRNLELTNLDNLHENN!ENQE KKJQEE1EKKETL1QENVV
L PQ1E T VTG TKNFMKNL IRLES TRONVEGS YDGA. YAPVLQDFRS LNDS TNR TKKET AHFSKKGEEENLEGLGNGTEQIVEKYACETRESPNTSGQEGETQRSKRALKQERL PL EETELEKR11VDD ES TQ WSKNP1KEL TPSTLTQXD ENE KEKGA. ITQS PL S D CL T
ESES IPQANR S PL PIA.KVS S EPS ERRE YL TRVLFQDNSSHLPAA.S YRKKDSGVQE SSHFLQGAKKNNLSEAILELEMEGDQREVGSLGESATNSVTYKKVENTVLPKPDL PKTSGKVELLPEVEIYQKDLFPTETSNGSPGELDLVEGSLLGGTEGAIKWNEÁNR PGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAíM)NHYGTOIPKlPEWKSQEKSPEKTAiPKKK
trtt lqsdqe eidyddt isvemk kedfdi ydedenq sprsfq kktrhyf iaaver
lwdy gmsssp hvlrnra qsgsvp qfkkvvf qeftdg sftqpl yrgelne hlgllg
pyir aevedni mvtfrn qasrpy sfyssli syeedq rqgaep rknfvk pnetkt y
fwkv qhhmapt kdefdc kawayf sdvdle kdvhsgl igpllv chtntl npahgr q
vtvqe falffti fdetks wyften merncr apcniq medptfk enyrfh aingyi
mdtlp glvmaq dqrirw yllsmg snenihs ihfsgh vftvrk keeykm alynly p
gvfet vemlps kagiwr veclig ehlhag mstlflv ysnkcq tplgma sghird f
qita sgqygqw apklar lhysgs inawst kepfsw ikvdlla pmiih giktqga r
qkfs slyisq fiimysl dgkkwq tyrgns tgtlmvf fgnvds sgikhni fnppii
aryir lhpthy sirstl rmelmg cdlnsc smplgme skaisd aqitas syftnm f
atwsp skarlh lqgrsn awrpqv nnpkew lqvdfq ktmkvtg vttqg vksllt sm
yvkef lisssq dghqwt lffqng kvkvfqg nqdsft pvvnsl dppllt rylrih p
QSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
T a b la 4. S e cu e n c ia de nu c le ó tid o s q u e co d ifica n FV III de lo ng itud to ta l (S E Q ID NO : 5)
66 i ATG CAAATAGAGC TCTCCACCTG CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGCCACC AGAAGATACT ACCTGGGTGC
781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG
841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC ■ TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC
901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT
961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA
1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC
1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT
1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC
1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG GACCTGGTAA AAGACTTGAA
1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC
1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT GATGAAGGGA AAAGTTGGCA
1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC
1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA
1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT
T a b la 4. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n FVIII de lo ng itud to ta l (S E Q ID N O : 5)
1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC
1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT
1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG
1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA
1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT GACAACTCTC CTTCCTTTAT
1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG GTACATTACA TTGCTGCTGA
1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC GATGACAGAA GTTATAAAAG
1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT
2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT
2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC
2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG
2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT
2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT
2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG
2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA
2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA
2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA
2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT
2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT
2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC
2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT
2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC
2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA
2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC
3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC
T a b la 4. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n FVIII de lo ng itud to ta l (S E Q ID N O : 5)
3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA
3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA
3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA
3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT
3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC
3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT
3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT
3481 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT
3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA
3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG
3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC
3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC
3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG
3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG
3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CTACAGCTTT GAGGCTAAAT CATATGTCAA ATAAAACTAC
3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA TGGTCCAACA GAAAAAAGAG GGCCCCATTC CACCAGATGC
4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT TCTTTAAGAT GCTATTCTTG CCAGAATCAG CAAGGTGGAT
4 081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA ACTCTCTGAA CTCTGGGCAA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT
4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA AATCTGTGGA AGGTCAGAAT TTCTTGTCTG AGAAAAACAA
4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG AATTTACAAA GGACGTAGGA CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC
4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC TTACTAACTT GGATAATTTA CATGAAAATA ATACACACAA
4 321 TCAAGAAAAA AAAATTCAGG AAGAAATAGA AAAGAAGGAA ACATTAATCC AAGAGAATGT
4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA CAGTGACTGG CACTAAGAAT TTCATGAAGA ACCTTTTCTT
4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG TAGAAGGTTC ATATGACGGG GCATATGCTC CAGTACTTCA
4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG ATTCAACAAA TAGAACAAAG AAACACACAG CTCATTTCTC
T a b la 4. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n FVIII de lo ng itud to ta l (S E Q ID N O : 5)
4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA ACTTGGAAGG CTTGGGAAAT CAAACCAAGC AAATTGTAGA
4621 GAAATATGCA TGCACCACAA GGATATCTCC TAATACAAGC CAGCAGAATT TTGTCACGCA
4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA AACAATTCAG ACTCCCACTA GAAGAAACAG AACTTGAAAA
4 741 AAGGATAATT GTGGATGACA CCTCAACCCA GTGGTCCAAA AACATGAAAC ATTTGACCCC
4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG ACTACAATGA GAAGGAGAAA GGGGCCATTA CTCAGTCTCC
4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GGAGTCATAG CATCCCTCAA GCAAATAGAT CTCCATTACC
4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TTCCATCTAT TAGACCTATA TATCTGACCA GGGTCCTATT
4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC TTCCAGCAGC ATCTTATAGA AAGAAAGATT CTGGGGTCCA
5 041 AGAAAGCAGT CATTTCT TAC AAGGAGCCAA AAAAAATAAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC
5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC AAAGAGAGGT TGGCTCCCTG GGGACAAGTG CCACAAATTC
5161 AGTCACATAC AAGAAAGTTG AGAACACTGT TCTCCCGAAA CCAGACTTGC CCAAAACATC
5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC CAAAAGTTCA CATTTATCAG AAGGACCTAT TCCCTACGGA
5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GCCATCTGGA TCTCGTGGAA GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC
5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA ATGAAGCAAA CAGACCTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT
5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA AGACTCCCTC CAAGCTATTG GATCCTCTTG CTTGGGATAA
5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA
5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC
5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA
5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA
5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG ATACCATATC
5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG
5 821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA
5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA
5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG
6 001 TGGAGAACTA AATGAACAT T TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA
T a b la 4. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n FVIII de lo ng itud to ta l (S E Q ID N O : 5)
6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT
6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC
6 3.81 TAATGAAACC AAAACTTAC T TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA
6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC
6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG
6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG
6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA
64 81 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT
6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG
6601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA
6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT
6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG
6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC
6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA
6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC
6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC
7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG
7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA
7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT
7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG
7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA
7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG
7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG
7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA
7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA
T a b la 4. S e cu e n c ia de nu c le ó tid o s q u e co d ifica n FV III de lo n g itu d to ta l
(S E Q ID NO : 5)
Figure imgf000056_0001
GTTCTGGGCT GCGAGGCACA
7741 GGACCTCTAC
*Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido de señalización
Los polipéptidos FVIII incluyen FVIII de longitud total, FVIII de longitud total menos Met en el término N, FVIII maduro (menos la secuencia de señalización), FVIII maduro con un Met adicional en el término N y/o FVIII con una eliminación total o parcial del dominio B. En determinadas realizaciones, las variantes de FVIII incluyen eliminaciones del dominio B, ya sea eliminaciones parciales o totales.
La secuencia de FVIII nativo maduro humano se presenta como SEQ ID NO: 4. Una proteína FVIII nativa tiene la siguiente fórmula: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, en donde A1, A2 y A3 son los “dominios A” estructuralmente relacionados," B es el "dominio B," C1 y C2 son los "dominios C" estructuralmente relacionados y a1, a2 y a3 son las regiones espaciadoras ácidas. Haciendo referencia a la posición de la secuencia de aminoácidos primaria en la SEQ ID NO: 4, el dominio A1 de FVIII humano se extiende desde Ala1 hasta aproximadamente Arg336, la región del espaciador a1 se extiende desde aproximadamente Met337 hasta aproximadamente Val374, el dominio A2 se extiende desde aproximadamente Ala375 hasta aproximadamente Tyr719, la región del espaciador a2 se extiende desde aproximadamente Glu720 hasta aproximadamente Arg740, el dominio B se extiende desde aproximadamente Ser741 hasta aproximadamente Arg 1648, la región del espaciador a3 se extiende desde aproximadamente Glu1649 hasta aproximadamente Arg1689, el dominio A3 se extiende desde aproximadamente Ser1690 hasta aproximadamente Leu2025, el dominio C1 se extiende desde aproximadamente Gly2026 hasta aproximadamente Asn2072, y el dominio C2 se extiende desde aproximadamente Ser2073 hasta Tyr2332. Al margen de los sitios de escisión proteolítica específicos, la designación de las localizaciones de los límites entre los dominios y las regiones de FVIII puede variar en distintas referencias bibliográficas. Los límites expuestos en este documento están designados por lo tanto como aproximados por el uso del término "aproximadamente".
El gen de FVIII humano se aisló y expresó en células mamíferas (Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; y patente de EE. UU. núm. 4.757.006). La secuencia de aminoácidos FVIII se dedujo del ADNc como se muestra en la patente de EE. UU. núm. 4.965.199. Además, FVIII con el dominio B eliminado parcialmente se muestra en las patentes de EE. UU. núm. 4.994.371 y 4.868.112. En algunas realizaciones, el dominio B de FVIII humano se reemplaza con el dominio B del Factor V humano como se muestra en la patente de EE. UU. núm. 5.004.803. La secuencia de ADNc que codifica el Factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos se muestran en las SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente, de la publicación de solicitud de patente núm. 2005/0100990.
La secuencia de FVIII porcina está publicada en Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). A su vez, la secuencia de ADNc porcina completa obtenida de la ampliación PCR de secuencias de FVIII de una biblioteca de ADNc de bazo de cerdo se describió en Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996). La FVIII híbrida humana/porcina que tiene sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades y secuencias de aminoácidos específicas se describieron en la patente de EE. UU. núm. 5.364.771 por Lollar y Runge, y en la publicación internacional WO 93/20093. Más recientemente, las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los dominios A1 y A2 de FVIII porcino y un FVIII quimérico con dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos con los dominios humanos correspondientes se describieron en la publicación internacional WO 94/11503. La patente de EE. UU. núm. 5.859.204, Lollar, J. S., también describe ADNc porcino y dedujo secuencias de aminoácidos. La patente de EE. UU. núm. 6.458.563 describe FVIII porcino con el dominio B eliminado.
La patente de EE. UU. núm. 5.859.204 para Lollar, J. S. describe mutantes funcionales de FVIII que tienen menos antigenicidad y menos inmunorreactividad. La patente de EE. UU. núm. 6.376.463 para Lollar, J. S. también describe mutantes de FVIII que tienen menos inmunorreactividad. La publicación de solicitud de EE. UU. núm.
2005/0100990 para Saenko et al. describe mutaciones funcionales en el dominio A2 de FVIII.
En una realización, el FVIII (o una porción de FVIII de una proteína quimérica) puede ser por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la secuencia de aminoácidos de FVIII 1 a 1438 de SEQ ID NO: 6 o aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 4 (sin una secuencia de señalización) o una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 3 y 1 a 1438 de SEQ ID NO: 6 o aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 3 y aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 4 (con una secuencia de señalización), en donde el FVIII tiene una actividad de coagulación, p. ej, activa el Factor IX como un cofactor para convertir el Factor X en el Factor X activado. El FVIII (o una porción de FVIII de una proteína quimérica) puede ser idéntico a una secuencia de aminoácidos de FVIII de aminoácidos 1 a 1438 de SeQ ID NO: 6 o aminoácidos 1 a 2332 de SEQ ID NO: 4 (sin una secuencia de señalización). El FVIII puede además comprender una secuencia de señalización.
El "dominio B" de FVIII, tal como se emplea en este documento, es el mismo que el dominio B conocido en la técnica que se define por la identidad de secuencia de aminoácidos interna y los sitios de escisión proteolítica, p. ej., residuos Ser741-Arg1648 de FVIII humano de longitud total. Los otros dominios de FVIII humanos se definen por los siguientes residuos de aminoácidos: A1, residuos Ala1-Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; A3, residuos Ser1690-Asn2019; C1, residuos Lys2020-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia de A3-C1-C2 incluye los residuos Ser1690-Tyr2332. La secuencia remanente, residuos Glu1649-Arg1689, usualmente se denomina región ácida a3. Las localizaciones de los límites para todos los dominios, incluidos los dominios B, para FVIII porcino, de ratón y canino también se conocen en la técnica. En una realización, el dominio B de FVIII se elimina ("Factor VIII con el dominio B eliminado" o "BDD FVIII"). Un ejemplo de un BDD FVIII es REFACTO® (BDD FVIII recombinante), que tiene la misma secuencia que la porción del Factor VIII de la secuencia en la Tabla 5. (la cadena pesada BDD FVIII está subrayada doble; el dominio B está en cursiva; y la cadena ligera BDD FVIII está en texto sin formato). Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 7) se muestra en la Tabla 6.
Tabla 5. Secuencia de aminoácidos del Factor VIII con el dominio B eliminado (BDD FVIII)
BDD FVIII (SEQ ID NO: 6)
ATRRYYLGAVELSWDYMOSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFT
Figure imgf000057_0001
GDYYÉDSYÉDISAYLLSKNNAJEEES^
DDTIS'VE^KEDFDÍYDÉDEÑQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLR NRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVT FRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDE FDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFD ETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQR IRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAG IWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPK LARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIM YSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIR STLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQG RSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGH QWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVL GCEAQDLY
T a b la 6. S e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q u e co d ifica n B D D FV III (S E Q ID NO : 7)
Figure imgf000058_0001
GCTCTCCACC TGCTTCTTTC
721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA CTACCTGGGT GCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC TGTGGACGCA AGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT GTACAAAAAG ACTCTGTTTG
901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC
961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT CATTACACTT AAGAACATGG
1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG
1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA TGATAAAGTC TTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG TCCAATGGCC TCTGACCCAC
1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT AAAAGACTTG AATTCAGGCC
1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC CAAGGAAAAG ACACAGACCT
1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG GAAAAGTTGG CACTCAGAAA
1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC TCGGGCCTGG CCTAAAATGC
1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT GATTGGATGC CACAGGAAAT
1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA AGTGCACTCA ATATTCCTCG
1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC CTTGGAAATC TCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA GTTTCTACTG TTTTGTCATA
a b la 6. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n B D D FV III (S E Q ID NO : 7)
1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA AGTAGACAGC TGTCCAGAGG
1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA CTATGATGAT GATCTTACTG
1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC TCCTTCCTTT ATCCAAATTC
1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA CATTGCTGCT GAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG AAGTTATAAA AGTCAATATT
1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA AGTCCGATTT ATGGCATACA
2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA ATCAGGAATC TTGGGACCTT
2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT TAAGAATCAA GCAAGCAGAC
2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC TTTGTATTCA AGGAGATTAC
2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC AGGAGAAATA TTCAAATATA
2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA TCCTCGGTGC CTGACCCGCT
2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC AGGACTCATT GGCCCTCTCC
2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA GATAATGTCA GACAAGAGGA
2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG GTACCTCACA GAGAATATAC
2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA GCTGGAGTGC AGCTTGAGGA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GGCTATGTTT TTGATAGTTT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC
2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC ATTCTAAGCA TTGGAGCACA GACTGACTTC CTTTCTGTCT
2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AAACACAAAA TGGTCTATGA AGACACACTC ACCCTATTCC
276]. CATTCT CAGG AGAAACTGTC TTCATGTCGA TGGAAAACCC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT
2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG AACAGAGGCA TGACCGCCTT ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG
2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TACGAGGACA GTTATGAAGA TATTTCAGCA TACTTGCTGA
2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCAAGAAGCT TCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC
3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GACTATGATG
3061 ATACCATATC AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC
3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC
a b la 6. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n B D D FV III (S E Q ID NO : 7)
81 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA
41 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC
01 CCTTATACCG TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG
61 AAGTTGAAGA TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT
21 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAAC T
81 TTGTCAAGCC TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA
41 CTAAAGATGA GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG
bb01 ATGTGCACTC AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG
Ib 61 CTCATGGGAG ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA
21 CCAAAAGCTG GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC
81 AGATGGAAGA TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA
41 TGGATACACT ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA
01 GCATGGGCAG CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC
61 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG
21 TGGAAATGTT ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC
81 TACATGCTGG GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG
41 GAATGGCTTC TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT
01 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG
61 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA
21 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA
81 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT
4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG
01 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT
4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT
:b21 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT
T a b la 6. S e c u e n c ia de n u c le ó tid o s qu e co d ifica n B D D FV III (S E Q ID NO : 7)
4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG
GAGACCTCAG GTGAATAATC
4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA
AGTCACAGGA GTAACTACTC
4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA
GTTCCTCATC TCCAGCAGTC
4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA
AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA
4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC
ACCGTTACTG ACTCGCTACC
4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT
GAGGATGGAG GTTCTGGGCT
5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC
* Los ácidos nucleicos subrayados codifican un péptido de señalización.
Un "FVIII con eliminación del dominio B" puede tener las eliminaciones totales o parciales descritas en las patentes de EE. UU. núm. 6.316.226, 6.346.513, 7.041.635, 5.789.203, 6.060.447, 5.595.886, 6.228.620, 5.972.885, 6.048.720, 5.543.502, 5.610.278, 5.171.844, 5.112.950, 4.868.112 y 6.458.563. En algunas realizaciones, una secuencia de FVIII con eliminación del dominio B de la presente invención comprende una cualquiera de las eliminaciones descritas en la. col. 4, renglón 4 a col. 5, renglón 28 y en los Ejemplos 1-5 de la patente de EE. UU. núm. 6.316.226 (también en el documento US 6.346.513). En otra realización, un Factor VIII con eliminación del dominio B es el Factor VIII con eliminación del dominio B S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (p. ej., Factor VIII que tiene la eliminación del aminoácido 744 al aminoácido 1637, p. ej., Factor VIII que tiene aminoácidos 1-743 y aminoácidos 1638-2332 de SEQ ID NO: 4, es decir, SEQ ID nO: 6). En algunas realizaciones, un FVIII con eliminación del dominio B de la presente invención tiene una eliminación descrita en la col. 2, renglones 26-51 y en los ejemplos 5-8 de la patente de EE. UU. núm. 5.789.203 (también los documentos US 6.060.447, US 5.595.886 y US 6.228.620). En algunas realizaciones, un Factor VIII con eliminación del dominio B descrito en la col. 1, renglones 25 a col. 2, renglón 40 de la patente de EE. UU. núm. 5.972.885; col. 6, renglones 1-22 y el ejemplo 1 de la patente de EE. UU. núm. 6.048.720; col. 2, renglones 17-46 de la patente de EE. UU. núm. 5.543.502; col. 4, renglón 22 a col. 5, renglón 36 de la patente de EE. UU. núm. 5.171.844; col. 2, renglones 55-68, figura 2, y ejemplo 1 de la patente de EE. UU. núm. 5.112.950; col. 2, renglón 2 a col. 19, renglón 21 y tabla 2 de la patente de EE. UU. núm. 4.868.112; col. 2, renglón 1 a col. 3, renglón 19, col. 3, renglón 40 a col. 4, renglón 67, col. 7, renglón 43 a col. 8, renglón 26 y col. 11, renglón 5 a col. 13, renglón 39 de la patente de EE. UU núm. 7.041.635; o col. 4, renglones 25-53, de la patente de EE. UU. núm. 6.458.563. En algunas realizaciones, un FVIII con eliminación del dominio B presenta una eliminación de la mayor parte del dominio B, pero aún contiene secuencias amino-terminales del dominio B que son esenciales para procesamiento proteolítico in vivo del producto de traducción primario en dos cadenas de polipéptidos, como se describe en la publicación internacional WO 91/09122. En algunas realizaciones, un FVIII con eliminación del dominio B se construye con una eliminación de aminoácidos 747-1638, es decir, virtualmente una eliminación completa del dominio B. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Un Factor VIII con eliminación del dominio B puede además contener una eliminación de los aminoácidos 771-1666 o los aminoácidos 868-1562 de FVIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Las eliminaciones del dominio B adicionales que son parte de la invención incluyen: eliminación de los aminoácidos 982 a 1562 o 760 a 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 a 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 a 1646 (Kaufman (solicitud publicada PCT núm. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al., ADN (1987) 6:553-564)), 741 a 1648 (Pasek (solicitud PCT núm. 88/00831)), u 816 a 1598 o 741 a 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) núm 82:16-25, EP 295597)). En otras realizaciones, BDD FVIII incluye un polipéptido de FVIII que contiene fragmentos del dominio B que retienen uno o más sitios de glucosilación enlazados en N, p. ej., residuos 757, 784, 828, 900, 963, y opcionalmente 943, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de la secuencia FVIII de longitud total. Los ejemplos de fragmentos del dominio B incluyen 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B como se describe en Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), y Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (es decir se retienen los primeros 226 aminoácidos o 163 aminoácidos del dominio B). Incluso en otras realizaciones, BDD FVIII comprende además una mutación puntual en el residuo 309 (de Phe a Ser) para mejorar la expresión de la proteína BDD FVIII. Ver Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). Incluso en otras realizaciones, BDD FVIII incluye un polipéptido de FVIII que contiene una porción del dominio B, pero no contiene uno o más sitios de escisión de furina (p. ej., Arg1313 y Arg 1648). Ver Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Cada una de las eliminaciones anteriores se puede efectuar en cualquier secuencia de FVIII.
En algunas realizaciones, el FVIII tiene un dominio B parcial. En algunas realizaciones, la proteína FVIII con un dominio B parcial es FVIII 198 (SEQ ID NO: 89). FVIII198 es un dominio B parcial que contiene una molécula FVIIIFc de cadena sencilla -226N6. 226 representa los 226 aminoácidos en el término N del dominio FVIII B, y N6 representa los seis sitios de N-glucosilación en el dominio B.
En una realización, FVIII se escinde justo después de arginina en el aminoácido 1648 (en el Factor VIII de longitud total o la SEQ ID NO: 4), aminoácido 754 (en el Factor VIII con eliminación del dominio B S743/Q1638 o la SEQ ID NO: 6), o el correspondiente residuo arginina (en otras variantes), resultando así en una cadena pesada y una cadena ligera. En otra realización, FVIII comprende una cadena pesada y una cadena ligera, que están enlazadas o asociadas por un enlace no covalente mediado por iones metálicos.
En otras realizaciones, FVIII es un FVIII de cadena sencilla que no se ha escindido justo después de Arginina en el aminoácido 1648 (en FVIII de longitud total o la SEQ ID NO: 4), aminoácido 754 (en el FVIII con eliminación del dominio BS743/Q1638 o la SEQ ID NO: 6), o el correspondiente residuo Arginina (en otras variantes). Un FVIII de cadena sencilla puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos. En una realización, la sustitución de aminoácidos es en un residuo correspondiente al residuo 1648, residuo 1645, o tanto al polipéptido del Factor VIII maduro, de longitud total (SEQ ID nO: 4) o el residuo 754, residuo 751, o ambos del SQ BDD Factor VIII (SEQ ID NO: 6). La sustitución de aminoácidos puede ser cualquiera de los aminoácidos distintos de arginina, p. ej., isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, selenocisteína, serina, tirosina, histidina, ornitina, pirrolisina o taurina.
FVIII puede además escindirse por trombina y luego activarse como FVIIIa, sirviendo como cofactor para el Factor IX activado (FIXa). Y FIX activado junto con FVIII activado forma un complejo Xase y convierte el Factor X en el Factor X activado (FXa). Para la activación, se escinde FVIII por trombina después de tres residuos Arginina, en los aminoácidos 372, 740 y 1689 (correspondientes a los aminoácidos 372, 740 y 795 en la secuencia de FVIII con eliminación del dominio B), en donde la escisión genera FVIIIa que tiene cadenas 50kDa A1, 43kDa A2 y 73kDa A3-C1-C2. En una realización, la proteína FVIII útil para la presente invención es FVIII no activo. En otra realización, la proteína FVIII es un FVIII activado.
La proteína que tiene el polipéptido de FVIII enlazado o asociado al fragmento de VWF puede comprender una secuencia por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEQ ID NO: 4 o 6, en donde la secuencia tiene una actividad de coagulación del FVIII, p. ej., activando el Factor IX como un cofactor para convertir al Factor X en el Factor X activado (FXa).
Polipéptidos y proteínas "híbridos" o "quiméricos", tal como se emplean en este documento, incluyen una combinación de una primera cadena de polipéptidos, p. ej., el fragmento de VWF, opcionalmente condensada a una primera región constante de Ig o una porción de esta, con una segunda cadena de polipéptidos, p. ej., una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN, opcionalmente condensada a una segunda región constante de Ig o una porción de esta, formando de este modo un heterodímero. En otra realización, el primer polipéptido y el segundo polipéptido en un híbrido se asocian unos con otros mediante disulfuro u otro(s) enlace(s) covalente(s). Los híbridos se describen, por ejemplo, en los documentos US 2004/101740 y US 2006/074199. En otra realización, el primer polipéptido comprende un fragmento de una proteína de fusión VWF-XTEN-Fc, y el segundo polipéptido comprende la proteína de fusión FVIII-Fc, convirtiendo al híbrido en un heterodímero. Incluso en otras realizaciones, el primer polipéptido comprende un fragmento de la proteína de fusión VWF-XTEN-Fc, y el segundo polipéptido comprende la proteína de fusión FVIII(X)-Fc. El primer polipéptido y el segundo polipéptido se asocian a través de un enlace covalente, p. ej., un enlace disulfuro, entre la primera región Fc y la segunda región Fc. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden además asociarse entre sí por unión entre el fragmento de VWF y la proteína FVIII. Una proteína FVIII útil en la presente invención puede incluir FVIII que tiene una o más secuencias de XTEN adicionales, que no afectan la actividad de coagulación del FVIII. Dichas secuencias de XTEN se pueden condensar al término C o al término N de la proteína FVIII o insertarse entre uno o más de los dos residuos de aminoácidos en la proteína FVIII en donde las inserciones no afectan la actividad de coagulación del FVIII o la función del FVIII. En una realización, las inserciones mejoran las propiedades de farmacocinética de la proteína FVIII (p. ej., semivida). En otra realización, las inserciones pueden ser múltiples inserciones, p. ej., más de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez inserciones. Los ejemplos de sitios de inserción incluyen, entre otros, los sitios enumerados en las Tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o cualquier combinación de estos.
La proteína FVIII enlazada a una o más secuencias de XTEN se puede representar como FVIII(X), FVI11 (X1), FVMUa^X-FVIIIa^,;, en donde FVIII comprende, consiste esencialmente en o consiste en una primera porción de una proteína FVIII del residuo de aminoácidos "a" al residuo de aminoácidos "b"; X o XI comprende, consiste esencialmente en o consiste en una o más secuencias de XTEN, FV IIIa^ comprende, consiste esencialmente en o consiste en una segunda porción de una proteína FVIII del residuo de aminoácidos "c" al residuo de aminoácidos "d"; a es el residuo de aminoácidos N-terminal de la primera porción de la proteína FVIII,
b es el residuo de aminoácidos C-terminal de la primera porción de la proteína FVIII pero también es el residuo de aminoácidos N-terminal de los dos aminoácidos de un sitio de inserción en donde se inserta la secuencia de XTEN, c es el residuo de aminoácidos N-terminal de la segunda porción de la proteína FVIII pero es también el residuo de aminoácidos C-terminal de los aminoácidos de un sitio de inserción en donde se inserta la secuencia de XTEN, y
d es el residuo de aminoácidos C-terminal de la proteína FVIII, y
en donde la primera porción de la proteína FVIII y la segunda porción de la proteína FVIII no son idénticas una con la otra y son de longitud suficiente juntas como para que la proteína FVIII tenga actividad de coagulación del FVIII.
En una realización, la primera porción de la proteína FVIII y la segunda porción de la proteína FVIII son fragmentos de SEQ ID NO: 4 [secuencia de FVIII maduro de longitud total] o SEQ ID NO: 6 [FVIII con eliminación del dominio B], p. ej., porción N-terminal y porción C-terminal, respectivamente. En determinadas realizaciones, la primera porción de la proteína FVIII comprende el dominio A1 y el dominio A2 de la proteína FVIII. La segunda porción de la proteína FVIII comprende el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. Incluso en otras realizaciones, la primera porción de la proteína FVIII comprende el dominio A1 y el dominio A2, y la segunda porción de la proteína FVIII comprende una porción del dominio B, el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. Incluso en otras realizaciones, la primera porción de la proteína FVIII comprende el dominio A1, el dominio A2 y una porción del dominio B de la proteína FVIII, y la segunda porción de la proteína FVIII comprende el dominio A3, el dominio C1 y opcionalmente el dominio C2. Incluso en otras realizaciones, la primera porción de la proteína FVIII comprende el dominio A1, el dominio A2, y una primera porción del dominio B de la proteína FVIII. La segunda porción de la proteína FVIII comprende una segunda porción del dominio B, el dominio A3, el dominio C1, y opcionalmente el dominio C2. En algunas realizaciones, los dos aminoácidos ("b" y "c") pueden ser cualquiera de uno o más de los sitios de inserción de los residuos de aminoácidos que se exponen en las Tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15. Por ejemplo, "b" puede ser el residuo de aminoácidos inmediatamente en dirección 5’ del sitio en donde se insertan o enlazan una o más secuencias de XTEN, y "c" puede ser el residuo de aminoácidos inmediatamente en dirección 3’ del sitio en donde se insertan o enlazan una o más secuencias de XTEN. En algunas realizaciones, "a" es la primera secuencia de aminoácidos maduros de una FVIII, y "d" es la última secuencia de aminoácidos de una proteína FVIII. Por ejemplo, FVIIIa^ty puede ser una secuencia de aminoácidos por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a los aminoácidos 1 a 745 de SEQ ID NO: 6 [secuencia de aminoácidos de FVIII con eliminación del dominio B] o SEQ ID NO: 4 [FVIII de longitud total] y FVIII^d,) pueden ser los aminoácidos 746 a 1438 de SEQ ID NO: 6 o aminoácidos 1641 a 2332 de SEQ ID NO: 4, respectivamente.
En algunos aspectos, el sitio de inserción en la proteína FVIII se localiza en uno o más dominios de la proteína FVIII, que es el término N, el dominio A1, el dominio A2, el dominio A3, el dominio B, el dominio C1, el dominio C2, el término C, o dos o más de sus combinaciones o entre dos dominios de FVIII, que son el dominio A1 y la región ácida a1, y la región ácida a1 y el dominio A2, el dominio A2 y la región ácida a2, la región ácida a2 y el dominio B, el dominio B y el dominio A3, y el dominio A3 y el dominio C1, el dominio C1 y el dominio C2, o cualquiera de sus combinaciones. Por ejemplo, los sitios de inserción en donde se puede insertar la secuencia de XTEN se seleccionan del grupo que consiste en el término N y el dominio A1, el término N y el dominio A2, el término N y el dominio A3, el término N y el dominio B, el término N y el dominio C1, el término N y el dominio C2, el término N y el término C, los dominios A1 y A2, los dominios A1 y A3, los dominios A1 y B, los dominios A1 y C1, los dominios A1 y C2, el dominio A1 y el término C, los dominios A2 y A3, los dominios A2 y B, los dominios A2 y C1, los dominios A2 y C2, el dominio a 2 y el término C, los dominios A3 y B, los dominios A3 y C1, los dominios A3 y C2, el dominio A3 y el término C, los dominios B y C1, los dominios B y C2, el dominio B y el término C, los dominios C1 y C2, C1 y el término C, el dominio C2, y el término C, y dos o más combinaciones de estos. Los ejemplos no limitativos de los sitios de inserción se enumeran en las Tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.
La proteína FVIII, en donde la secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII o se enlaza al término C o al término N, retiene la actividad de FVIII después del enlace a o la inserción por la secuencia de XTEN. La secuencia de XTEN se puede insertar en la proteína FVIII una vez o más de una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o seis veces de manera tal que las inserciones no afecten la actividad del FVIII (es decir, la proteína FVIII aún retiene la propiedad de coagulación).
La proteína FVIII útil en la presente invención se puede enlazar a uno o más polipéptidos de XTEN en el término N o en el término C de la proteína FVIII mediante un enlazador opcional o se puede insertar inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos (p. ej., uno o más sitios de inserción de XTEN) en la proteína FVIII mediante uno o más enlazadores opcionales. En una realización, los dos residuos de aminoácidos en donde se inserta la secuencia de XTEN o el residuo de aminoácidos al que se enlaza la secuencia de XTEN corresponden a los dos o uno de los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 [FVIII maduro de longitud total] seleccionados del grupo que consiste en los residuos de la Tabla 7, Tabla 8, Tabla 9 y Tabla 10, y cualquiera de sus combinaciones.
En otras realizaciones, por lo menos una secuencia de XTEN se inserta en uno cualquiera o más de los sitios de inserción de XTEN descritos en este documento o cualquiera de sus combinaciones. En un aspecto, por lo menos una secuencia de XTEN se inserta en uno o más sitios de inserción de XTEN descritos en uno o más de los aminoácidos descritos en la Tabla 7.
Tabla 7: Sitios de inserción de XTEN ilustrativos
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
* Indica un punto de inserción para XTEN basado en el número de aminoácidos del FVII humano maduro de longitud total, en donde la inserción podría ser o bien en el lado N o C-terminal del aminoácido indicado.
En algunas realizaciones, una o más secuencias de XTEN se insertan dentro de aproximadamente seis aminoácidos hacia 5' o 3' de los aminoácidos 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 o 1910, correspondientes a la SEQ ID NO: 4 o cualquiera de sus combinaciones.
Tabla 8. intervalos de inserción de XTEN ilustrativos
Figure imgf000068_0001
‘ Distancia desde el residuo de inserción se refiere al número relativo de aminoácidos fuera del término N (números negativos) o el término C (números positivos) del residuo de inserción designado (residuo "0") en donde se puede efectuar una inserción. La designación "-x" se refiere a un sitio de inserción que está x aminoácidos fuera del lado N-terminal del residuo de inserción designado. De modo similar, la designación "+x" se refiere a un sitio de inserción que está x aminoácidos fuera del lado C-terminal del residuo de inserción designado.
Por ejemplo, "-1, 2" indica que la inserción se realiza en el término N o el término C de los residuos de aminoácidos indicados -1,0, 1 o 2.
En otras realizaciones, una o más secuencias de XTEN se insertan inmediatamente en dirección 3’ de uno o más aminoácidos correspondientes al FViii humano maduro de longitud total seleccionados del grupo que consiste en uno o más sitios de inserción en la Tabla 9.
Tabla 9. Sitios o intervalos de inserción de XTEN ilustrativos
Figure imgf000068_0002
* indica el intervalo de los sitios de inserción en relación al número de aminoácidos del FViii humano maduro incluso en otras realizaciones, uno o más XTEN se insertan en el dominio B de FViii. En un ejemplo, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 740 y 1640 correspondientes a la SEQ iD NO: 4, en donde la secuencia de FViii entre los aminoácidos 740 y 1640 opcionalmente no está presente. En otro ejemplo, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 741 y 1690 correspondientes a la SEQ iD NO: 4, en donde la secuencia de FViii entre los aminoácidos 740 y 1690 opcionalmente no está presente. En otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 741 y 1648 correspondientes a la SEQ iD NO: 4, en donde la secuencia de FViii entre los aminoácidos 741 y 1648 opcionalmente no está presente. incluso en otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 743 y 1638 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 743 y 1638 opcionalmente no está presente. Incluso en otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1656 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1656 opcionalmente no está presente. En algunos ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1657 opcionalmente no está presente. en ciertos casos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1667 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1667 opcionalmente no está presente. Incluso en otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 745 y 1686 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 745 y 1686 opcionalmente no está presente. En algunos otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 747 y 1642 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 747 y 1642 opcionalmente no está presente. Incluso en otros ejemplos, se inserta un XTEN entre los aminoácidos 751 y 1667 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, en donde la secuencia de FVIII entre los aminoácidos 751 y 1667 opcionalmente no está presente.
En algunas realizaciones, uno o más XTEN se insertan en uno o más aminoácidos inmediatamente en dirección 3’ de un aminoácido de un sitio de inserción seleccionado del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos de la Tabla 10.
Tabla 10: Sitios de inserción de FVIII XTEN y designaciones de constructos
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
* Indica el número de aminoácidos de la proteína FVIII madura
En una realización, uno o más de los sitios de inserción de XTEN se localizan dentro de una o más estructuras de bucle flexibles expuestas a la superficie de la proteína FVIII (p. ej., un bucle permisivo). Por ejemplo, por lo menos una secuencia de XTEN se puede insertar en cada dominio "A" del FVIII que comprende por lo menos dos "bucles permisivos" en donde se puede insertar por lo menos un polipéptido de XTEN sin eliminar la actividad pro­ coagulante de la proteína recombinante, o la capacidad de las proteínas recombinantes de expresarse in vivo o in vitro en una célula hospedante. Los bucles permisivos son regiones que permiten la inserción de por lo menos una secuencia de XTEN con, entre otros atributos, gran exposición a la superficie o disolvente y gran flexibilidad de conformación. El dominio A1 comprende una región de bucle permisivo 1 (A1-1) y una región de bucle permisivo 2 (A1-2), el dominio A2 comprende una región de bucle permisivo 1 (A2-1) y una región de bucle permisivo 2 (A2-2), el dominio A3 comprende una región de bucle permisivo 1 (A3-1) y una región de bucle permisivo 2 (A3-2).
En un aspecto, un primer bucle permisivo en el dominio FVIII A1 (A1-1) se localiza entre la hebra beta 1 y la hebra beta 2, y un segundo bucle permisivo en el dominio A2 del FVIII (A1-2) se localiza entre la hebra beta 11 y la hebra beta 12. Un primer bucle permisivo en el domino A2 del FVIII (A2-1) se localiza entre la hebra beta 22 y la hebra beta 23, y un segundo bucle permisivo en el dominio A2 del FVIII (A2-2) se localiza entre la hebra beta 32 y la hebra beta 33. Un primer bucle permisivo en el domino A3 del FVIII (A3-1) se localiza entre la hebra beta 38 y la hebra beta 39, y un segundo bucle permisivo en el dominio A3 del FVIII (A3-2) se localiza entre la hebra beta 45 y la hebra beta 46. En ciertos aspectos, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A1-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 15 a aproximadamente el aminoácido 45 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 18 a aproximadamente el aminoácido 41 de la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A1-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 201 a aproximadamente el aminoácido 232 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 218 a aproximadamente el aminoácido 229 de la SEQ ID NO: 4. Incluso en otros aspectos, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A2-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 395 a aproximadamente el aminoácido 421 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 397 a aproximadamente el aminoácido 418 de la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A2-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 577 a aproximadamente el aminoácido 635 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 595 a aproximadamente el aminoácido 607 de la SEQ ID NO: 4. En ciertos aspectos, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A3-1 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 1705 a aproximadamente el aminoácido 1732 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 1711 a aproximadamente el aminoácido 1725 de la SEQ ID NO: 4. Incluso en otros aspectos, la estructura de bucle flexible expuesta a la superficie que comprende A3-2 corresponde a una región en el FVIII humano maduro nativo de aproximadamente el aminoácido 1884 a aproximadamente el aminoácido 1917 de la SEQ ID NO: 4, p. ej., de aproximadamente el aminoácido 1899 a aproximadamente el aminoácido 1911 de la SEQ ID NO: 4.
En otra realización, uno o más de los aminoácidos en donde se inserta por lo menos una secuencia de XTEN se localiza dentro de un dominio a3, p. ej., aminoácidos 1649 a 1689, correspondientes al polipéptido de FVIII maduro de longitud total. En una realización particular, se inserta una secuencia de XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 de la SEQ ID NO: 4 (FVIII maduro de longitud total). En una realización específica, una proteína FVIII que comprende una secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 comprende además una eliminación del aminoácido 745 al aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, uno o más de los sitios de inserción para una o más inserciones de XTEN están inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (1) aminoácido 3, (2) aminoácido 18, (3) aminoácido 22, (4) aminoácido 26, (5) aminoácido 32, (6) aminoácido 40, (7) aminoácido 60, (8) aminoácido 65, (9) aminoácido 81, (10) aminoácido 116, (11) aminoácido 119, (12) aminoácido 130, (13) aminoácido 188, (14) aminoácido 211, (15) aminoácido 216, (16) aminoácido 220, (17) aminoácido 224, (18) aminoácido 230, (19) aminoácido 333, (20) aminoácido 336, (21) aminoácido 339, (22) aminoácido 375, (23) aminoácido 399, (24) aminoácido 403, (25) aminoácido 409, (26) aminoácido 416, (26) aminoácido 442, (28) aminoácido 487, (29) aminoácido 490, (30) aminoácido 494, (31) aminoácido 500, (32) aminoácido 518, (33) aminoácido 599, (34) aminoácido 603, (35) aminoácido 713, (36) aminoácido 745, (37) aminoácido 1656, (38) aminoácido 1711, (39) aminoácido 1720, (40) aminoácido 1725, (41) aminoácido 1749, (42) aminoácido 1796, (43) aminoácido 1802, (44) aminoácido 1827, (45) aminoácido 1861, (46) aminoácido 1896, (47) aminoácido 1900, (48) aminoácido 1904, (49) aminoácido 1905, (50) aminoácido 1910, (51) aminoácido 1937, (52) aminoácido 2019, (53) aminoácido 2068, (54) aminoácido 2111, (55) aminoácido 2120, (56) aminoácido 2171, (57) aminoácido 2188, (58) aminoácido 2227, (59) aminoácido 2277 y (60) dos o más combinaciones de estos.
En una realización, una proteína FVIII útil para la invención comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción de XTEN y una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción de XTEN. Los ejemplos no limitativos del primer sitio de inserción de XTEN y el segundo sitio de inserción de XTEN se enumeran en la Tabla 11.
Tabla 11. Sitios de inserción ilustrativos para dos XTEN
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Los dos XTEN insertados o enlazados a la proteína FVIII pueden ser idénticos o diferentes. En algunas realizaciones, una proteína FVIII útil para la invención comprende dos secuencias de XTEN insertadas en la proteína FVIII, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 2332 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 (el término C). En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26, 40, 1656 o 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 599 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905 o 2332 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 399 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26 o 40 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una segunda secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En una realización particular, la proteína FVIII comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 2332 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, en donde la proteína FVIII presenta además una eliminación del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 al aminoácido 1685 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una mutación o sustitución en el aminoácido 1680 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., Y1680F, una mutación o sustitución en el aminoácido 1648 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., R1648A, o por lo menos dos mutaciones o sustituciones en el aminoácido 1648 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., R1648A, y el aminoácido 1680 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., Y1680F. En una realización específica, la proteína FVIII comprende dos secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 y una segunda secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 2332 de la SEQ ID NO: 4, en donde la proteína FVIII presenta además una eliminación del aminoácido 745 al aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, una proteína FVIII comprende tres secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción de XTEN, una segunda secuencia de XTEN insertada en una segunda secuencia de XTEN y una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción de XTEN. La primera, segunda o tercera secuencias de XTEN pueden ser idénticas o diferentes. El primero, segundo y tercer sitios de inserción se pueden seleccionar del grupo de uno cualquiera de los sitios de inserción descritos en este documento. En algunas realizaciones, la proteína FVIII que comprende tres secuencias de XTEN puede además comprender una mutación o sustitución, p. ej., el aminoácido 1648 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., R1648A. Por ejemplo, los ejemplos no limitativos del primero, segundo y tercer sitios de inserción de XTEN se enumeran en la Tabla 12.
Tabla 12. Sitios de inserción ilustrativos para tres XTEN
Figure imgf000074_0001
En algunas realizaciones, una proteína FVIII comprende tres secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN insertada en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4 y una tercerea secuencia de XTEN insertada en dirección 3’ del aminoácido 1656, 1720 o 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una tercera secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1720 o 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 26 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una tercera secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una tercera secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1720 o 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 403 o 1656 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1720 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una tercera secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 1900 correspondiente a la SEQ ID NO: 4. En otras realizaciones, la primera secuencia de XTEN se inserta inmediatamente en dirección 3’ del aminoácido 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 o 1910 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, una segunda secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 745 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, y una tercera secuencia de XTEN se inserta en dirección 3’ del aminoácido 2332 correspondiente a la SEQ ID NO: 4.
En otras realizaciones, a proteína FVIII en la invención comprende cuatro secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción, una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción, una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción y una cuarta secuencia de XTEN insertada en un cuarto sitio de inserción. La primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de XTEN pueden ser idénticas, diferentes, o combinaciones de estas. En algunas realizaciones, la proteína FVIII que comprende cuatro secuencias de XTEN puede además comprender una mutación o sustitución, p. ej., el aminoácido 1648 correspondiente a la SEQ ID NO: 4, p. ej., R1648A. Los ejemplos no limitativos del primero, segundo, tercer y cuarto sitios de inserción de XTEN se enumeran en la Tabla 13.
Tabla 13. Sitios inserción ilustrativos para cuatro XTEN
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
En algunas realizaciones, una proteína FVIII comprende cinco secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción, una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción, una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción XTEN, una cuarta secuencia de XTEN insertada en un cuarto sitio de inserción de XTEN y una quinta secuencia de XTEN insertada en un quinto sitio de inserción de XTEN. La primera, segunda, tercera, cuarta o quinta secuencias de XTEN pueden ser idénticas, diferentes, o una combinación de estas. Los ejemplos no limitativos del primero, segundo, tercero, cuarto y quinto sitios de inserción se enumeran en la Tabla 14.
Tabla 14. Sitios de inserción ilustrativos para cinco XTEN
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000078_0001
En determinadas realizaciones, una proteína FVIII comprende seis secuencias de XTEN, una primera secuencia de XTEN insertada en un primer sitio de inserción de XTEN, una segunda secuencia de XTEN insertada en un segundo sitio de inserción de XTEN, una tercera secuencia de XTEN insertada en un tercer sitio de inserción de XTEN, una cuarta secuencia de XTEN insertada en un cuarto sitio de inserción de XTEN, una quinta secuencia de XTEN insertada en un quinto sitio de inserción de XTEN y una sexta secuencia de XTEN insertada en un sexto sitio de inserción de XTEN. La primera, segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta secuencias de XTEN pueden ser idénticas, diferentes o una combinación de estas. Los ejemplos de los seis sitios de inserción de XTEN incluyen, aunque sin limitarse a ello, los sitios de inserción enumerados en la Tabla 15.
Tabla 15. Sitios de inserción de XTEN ilustrativos para seis XTEN
Figure imgf000078_0002
En un ejemplo particular, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4 (FVIII maduro de longitud total). En otro ejemplo, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. En algunos ejemplos, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. En otros ejemplos, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN entre los aminoácidos 1720 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. Incluso en otras realizaciones, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 403 y 404 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un tercer XTEN entre los aminoácidos 1900 y 1901 correspondientes a la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, se inserta un primer XTEN entre los aminoácidos 26 y 27 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un segundo XTEN entre los aminoácidos 1656 y 1657 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, se inserta un tercer XTEN entre los aminoácidos 1720 y 1721 correspondientes a la SEQ ID NO: 4, y se inserta un cuarto XTEN entre 1900 y 1901 correspondientes a la SEQ ID NO: 4.
En una realización particular, se inserta una secuencia de XTEN entre los aminoácidos 745 y 746 de un Factor VIII de longitud total o el correspondiente sitio de inserción del Factor VIII con eliminación del dominio B.
En algunas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende dos secuencias de polipéptidos, una primera secuencia de polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada entre FVIII-161 (SEQ ID NO: 101), FVIII-169 (SEQ ID NO: 103), FVIII-170 (SEQ ID NO: 102), FVIII-173 (SEQ ID NO: 104); FVIII-195 (SEQ ID NO: 105); FVIII-196 (SEQ ID NO: 106), FVIII-199 (SEQ ID NO: 107), FVIII-201 (SEQ ID NO: 108); FVIII-203 (SEQ ID NO: 109), FVIII-204 (SEQ ID NO: 110), FVIII-205 (SEQ ID NO: 111), FVIII-266 (SEQ ID NO: 112), FVIII-267 (SEQ ID NO: 113), FVIII-268 (SEQ ID NO: 114), FVIII-269 (SEQ ID NO: 115), FVIII-271 (SEQ ID NO: 116) o FVIII-272 (SEQ ID NO: 117) y una segunda secuencia de polipéptidos que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 100% idéntica a una secuencia seleccionada entre VWF031 (SEQ ID NO: 118), VWF034 (SEQ ID NO: 119) o VWF-036 (SEQ ID NO: 120).
D) Región constante de Ig o una porción de esta
El fragmento de VWF o la proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN en la presente invención puede además comprender una región constante de Ig o una porción de esta. La región constante de Ig o una porción de esta puede mejorar la farmacocinética o las propiedades de farmacodinámica del fragmento de VWF o la proteína FVIII en combinación con la secuencia de XTEN. En determinadas realizaciones, la región constante de Ig o una porción de esta extiende la semivida de una molécula condensada a la región constante de Ig o una porción de esta. Una región constante de Ig está comprendida por dominios indicados como dominios CH (pesados constantes) (CH1, CH2, etc.). Dependiendo del isotipo, (es decir, IgG, IgM, IgA, IgD o IgE), la región constante puede estar comprendida por tres o cuatro dominios CH. Algunas regiones constantes de isotipos (p. ej., IgG) también contienen una región bisagra. Ver Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
Una región constante de Ig o una porción de esta para producir la proteína quimérica de la presente invención se puede obtener a partir de una serie de fuentes diferentes. En algunas realizaciones, una región constante de Ig o una porción de esta deriva de Ig humana. Se entiende, no obstante, que la región constante de Ig o una porción de esta puede derivar de una Ig de otra especie mamífera, incluidas, por ejemplo, especies de roedor (p. ej., un ratón, rata, conejo, cobaya) o un primate no humano (p. ej., chimpancé, macaco). Asimismo, la región constante de Ig o una porción de esta puede derivar de cualquier clase de Ig, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluidos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa el isotipo humano IgG 1.
Una variedad de las secuencias de genes de la región constante de Ig (p. ej., secuencias de genes de la región constante humana) están disponibles en la forma de depósitos públicamente accesibles. La secuencia de los dominios de la región constante se puede seleccionar para que tengan una función efectora particular (o carezcan de una función efectora particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad. Se han publicado muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos, y las secuencias de regiones constantes de Ig adecuadas (p. ej., bisagra, CH2, y/o secuencias CH3, o porciones de estas) pueden derivar de estas secuencias usando técnicas reconocidas en el campo. El material genético obtenido usando cualquiera de los métodos antes mencionados puede luego alterarse o sintetizarse para obtener los polipéptidos de la presente invención. Se ha de apreciar que el alcance de la presente invención abarca alelos, variantes y mutaciones de secuencias de ADN de región constante.
Las secuencias de la región constante de Ig o una porción de esta se pueden clonar, p. ej., usando una reacción en cadena de la polimerasa y cebadores que se seleccionan para ampliar el dominio de interés. Para clonar una secuencia de la región constante de Ig o una porción de esta de un anticuerpo, se puede aislar ARNm de hibridoma, bazo o células linfáticas, transcribirse inversamente en ADN, y ampliación de genes de anticuerpos por PCR. Los métodos de ampliación por PCR se describen en detalle en las patentes de EE. UU. núm. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; y en, p. ej., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). La PCR se puede iniciar con cebadores de regiones constantes de consenso o con cebadores más específicos basados en las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera y las secuencias de aminoácidos publicadas. Como se analizó anteriormente, la PCR puede también usarse para aislar clones de ADN que codifican cadenas de anticuerpos pesadas y ligeras. En este caso, las bibliotecas pueden cribarse por cebadores de consenso o sondas homólogas más grandes, como sondas de regiones constantes de ratón. Se conocen en la técnica numerosos conjuntos de cebadores adecuados para ampliación de genes de anticuerpos (p. ej., cebadores 5' basados en la secuencia N-terminal de anticuerpos modificados (Benhar y Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); extremos de ampliación rápida de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); secuencias líderes de anticuerpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). La clonación de secuencias de anticuerpos se describe además en Newman et al., patente de EE. UU. núm. 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995.
Una región constante de Ig utilizada en la presente invención puede incluir todos los dominios en la región bisagra o sus porciones. En una realización, la región constante de Ig o una porción de esta comprende un dominio CH2, dominio CH3 y una región bisagra, es decir, una región Fc o un elemento ligante de FcRn.
Tal como se emplea en este documento, la expresión "región Fc" se define como la porción de un polipéptido que corresponde a la región Fc de Ig nativa, es decir, según lo formado por la asociación dimérica de los respectivos dominios Fc de sus dos cadenas pesadas. Una región Fc nativa forma un homodímero con otra región Fc. En contraste, la expresión "región Fc genéticamente condensada" o "región Fc de cadena sencilla" (región scFc), como se utiliza en este documento, se refiere a una región Fc dimérica sintética de los dominios Fc genéticamente enlazados con una sola cadena de polipéptidos (es decir, en una secuencia genética contigua sencilla).
En una realización, "región Fc" se refiere a la porción de una cadena pesada de Ig sencilla que comienza en la región bisagra justo en dirección 5’ del sitio de escisión de papaína (es decir, el residuo 216 en IgG, tomando el primer residuo de la región constante de cadena pesada como 114) y finalizando en el término C del anticuerpo. Por consiguiente, un dominio Fc completo comprende por lo menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
La región Fc de una región constante de Ig, dependiendo del isotipo de Ig puede incluir los dominios CH2, CH3 y CH4, además de la región bisagra. Las proteínas quiméricas que comprenden una región Fc de una Ig confieren varias propiedades deseables a una proteína quimérica, incluidos mayor estabilidad, mayor semivida en suero (ver Capon et al., 1989, Nature 337:525) además de la unión a los receptores de Fc tales como el receptor de Fc neonatal (FcRn) (patentes de EE. UU. núm. 6.086.875, 6,485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
Una región constante de Ig o una de sus porciones puede ser un elemento de unión de FcRn. FcRn está activo en tejidos epiteliales de adultos y se expresa en el lumen de los intestinos, vías aéreas pulmonares, superficies nasales, superficies vaginales, superficies del colon y el recto (patente de EE. UU. núm. 6.485.726). Un elemento ligante de FcRn es una porción de una Ig que se une a FcRn.
El receptor de FcRn se ha aislado de varias especies mamíferas, incluidos seres humanos. Se conocen las secuencias de FcRn humano, FcRn de mono, FcRn de rata y FcRn de ratón (Story et al. 1994, J. Exp. Med.
180:2377). El receptor de FcRn que se une a IgG (pero no a otras clases de Ig como IgA, IgM, IgD e IgE) a pH relativamente bajo, transporta activamente la IgG en forma transcelular en una dirección luminal a serosa, y luego libera la IgG a pH relativamente superior hallado en los fluidos intersticiales. Se expresa en tejido epitelial adulto (patentes de EE. UU. núm. 6.485.726, 6.030.613, 6.086.875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) incluidos epitelios pulmonares e intestinales (Israel et al. 1997, Immunology 92:69) epitelio tubular proximal (Kobayashi et al.
2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) además de epitelio nasal, superficies vaginales y superficies del árbol biliar.
Los elementos ligantes de FcRn útiles en la presente invención abarcan moléculas que se unen específicamente mediante el receptor de FcRn, incluida IgG entera, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos que incluyen la región de unión completa del receptor de FcRn. La región de la porción Fc de IgG que se une al receptor de FcRn se ha descrito basada en cristalografía de rayos X (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). El área de contacto principal del Fc con el FcRn está cerca de la unión de los dominios CH2 y CH3. Los contactos de Fc-FcRn están todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los elementos ligantes de FcRn incluyen IgG completa, el fragmento Fc de IgG, y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa de FcRn. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos de aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Las referencias a la numeración de los aminoácidos de las Ig o los fragmentos de Ig, o las regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud Pública de EE. UU., Bethesda, Md.
Las regiones Fc o los elementos ligantes de FcRn unidos a FcRn pueden ser transportados por las barreras epiteliales por FcRn, proporcionando así medios no invasivos de administrar en forma sistémica una molécula terapéutica deseada. Además, las proteínas de fusión que comprenden una región Fc o un elemento ligante de FcRn son endocitosadas por células que expresan el FcRn. Pero en lugar de ser marcadas para degradación, estas proteínas de fusión se reciclan en la circulación nuevamente, incrementando de este modo la semivida in vivo de estas proteínas. En determinadas realizaciones, las porciones de regiones constantes de Ig son una región Fc o un elemento ligante de FcRn que típicamente se asocia, mediante enlaces disulfuro y otras interacciones no específicas, con otra región Fc u otro elemento ligante de FcRn para formar dímeros y multímeros de orden superior.
Dos receptores de FcRn pueden unirse a una sola molécula de Fc. Los datos cristalográficos sugieren que cada molécula de FcRn se una a un solo polipéptido del homodímero de Fc. En una realización, el enlazamiento del elemento ligante de FcRn, p. ej., un fragmento Fc de una IgG, a una molécula biológicamente activa proporciona un medio para administrar la molécula biológicamente activa por vía oral, bucal, sublingual, rectal, vaginal, como un aerosol administrado por ruta nasal o pulmonar, o a través de una ruta ocular. En otra realización, la proteína quimérica se puede administrar invasivamente, p. ej., por vía subcutánea, intravenosa.
Una región de un elemento ligante de FcRn es una molécula o su porción que puede unirse específicamente mediante el receptor de FcRn con el consecuente transporte activo por el receptor de FcRn de la región Fc. Específicamente unido se refiere a dos moléculas que forman un complejo relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una gran afinidad y una capacidad baja a moderada según se distingue de la unión no específica que usualmente tiene una baja afinidad con una capacidad moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad KA es mayor que 106 M-1, o mayor que 108 M-1. Si es necesario, la unión no específica se puede reducir sin afectar sustancialmente la unión específica, variando las condiciones de unión. El experto en la técnica puede optimizar las condiciones de unión adecuadas tales como la concentración de las moléculas, fuerza iónica de la disolución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración de un agente bloqueante (p. ej., albúmina en suero, caseína de la leche), etc., usando técnicas habituales.
En determinadas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una o más regiones truncadas Fc que sin embargo son suficientes para conferir al receptor de Fc (FcR) propiedades de unión a la región Fc. Por ejemplo, la porción de una región Fc que se une a FcRn (es decir, la porción ligante de FcRn) comprende aproximadamente los aminoácidos 282-438 de IgG 1, numeración de la UE (en donde los sitios de contacto primarios son los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 del dominio CH3. Por lo tanto, una región Fc de la invención puede comprender o consistir en una porción ligante de FcRn. Las porciones ligantes de FcRn pueden derivar de cadenas pesadas de cualquier isotipo, incluidas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, se usa una porción ligante de FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG1. En otra realización, se usa una porción ligante de FcRn de un anticuerpo del isotipo humano IgG4.
En otra realización, la "región Fc" incluye una secuencia de aminoácidos de un dominio Fc o derivada de un dominio Fc. En determinadas realizaciones, una región Fc comprende por lo menos uno de: un dominio bisagra (p. ej., región bisagra superior, media y/o inferior) (aproximadamente aminoácidos 216-230 de una región Fc de anticuerpos de acuerdo con la numeración de la UE), un dominio CH2 (aproximadamente aminoácidos 231-340 de una región Fc de anticuerpos de acuerdo con la numeración de la UE), un dominio CH3 (aproximadamente aminoácidos 341-438 de una región Fc de anticuerpos de acuerdo con la numeración de la UE), un dominio CH4, o una variante, porción o fragmento de estos. En otras realizaciones, una región Fc comprende un dominio Fc completo (es decir, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3). En algunas realizaciones, una región Fc comprende, consiste esencialmente en o consiste en un dominio bisagra (o una porción de este) condensado a un dominio CH3 (o una porción de este), un dominio bisagra (o una porción de este) condensado a un dominio CH2 (o una porción de este), un dominio CH2 (o una porción de este) condensado a un dominio CH3 (o una porción de este), un dominio CH2 (o una porción de este) condensado tanto a un dominio bisagra (o una porción de este) como a un dominio CH3 (o una porción de este). Incluso en otras realizaciones, una región Fc carece de por lo menos una porción de un dominio a CH2 (p. ej., todo o parte de un dominio CH2). En una realización particular, una región Fc comprende o consiste en los aminoácidos correspondientes a los números de la UE 221 a 447.
Las regiones Fc ilustradas como F, F1 o F2 en este documento se pueden obtener de una serie de fuentes diferentes. En una realización, una región Fc del polipéptido deriva de una Ig humana. Se entiende, no obstante, que una región Fc puede derivar de una Ig de otras especies mamíferas, como por ejemplo un roedor (p. ej., un ratón, rata, conejo o cobaya) o de un primate no humano (p. ej., chimpancé, macaco). A su vez, el polipéptido de los dominios Fc o sus porciones puede derivar de cualquier clase de Ig, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de Ig, incluidos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, se utiliza el isotipo humano IgG1.
En determinadas realizaciones, la variante de Fc confiere un cambio en por lo menos una función efectora impartida por una región Fc que comprende dicho dominio Fc de tipo salvaje (p. ej., una mejora o reducción en la capacidad de la región Fc de unirse a los receptores de Fc (p, ej., FcyRI, FcyRII o FcyRIII) o proteínas complementarias (p. ej., C1q), o para desencadenar citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC), fagocitosis o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC)). En otras realizaciones, la variante de Fc proporciona un residuo cisteína modificado.
Las regiones Fc de la invención pueden emplear variantes de Fc reconocidas en la técnica que se sabe que imparten un cambio (p. ej., una mejora o reducción) en una función efectora y/o unión de FcR o FcRn. Concretamente, una molécula de unión de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (p. ej., una sustitución) en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 y WO06/085967A2; publicaciones de patentes estadounidenses núm. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; o patentes estadounidenses 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956 y 7.317.091. En una realización, el cambio específico (p. ej., la sustitución específica de uno o más aminoácidos descritos en la técnica) se puede realizar en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas. En otra realización, se puede efectuar un cambio diferente en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas (p. ej., la sustitución diferente de una o más posiciones de aminoácidos descritas en la técnica).
La región Fc o el elemento ligante de FcRn de IgG se puede modificar de acuerdo con procedimientos bien conocidos como mutagénesis dirigida al sitio y similares para producir IgG modificada o fragmentos de Fc o sus porciones que se unirán mediante FcRn. Dichas modificaciones incluyen modificaciones remotas de los sitios de contacto de FcRn además de modificaciones dentro de los sitios de contacto que preservan o incluso mejoran la unión al FcRn. Por ejemplo, los siguientes residuos de aminoácidos sencillos en IgG 1 Fc (Fc y1) humano se pueden sustituir sin pérdida importante de la afinidad de unión de Fc hacia FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, y K447A, en donde, por ejemplo, P238A representa prolina de tipo salvaje sustituida por alanina en el número de posición 238. Como un ejemplo, una realización específica incorpora la mutación N297A, eliminando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. Además de alanina, se pueden sustituir los aminoácidos de tipo salvaje por otros aminoácidos en las posiciones especificadas anteriormente. Se pueden introducir mutaciones individualmente en Fc dando origen a más de cien regiones Fc distintas del Fc nativo. Adicionalmente, las combinaciones de dos, tres o más de estas mutaciones individuales se pueden introducir juntas, dando origen a cientos de regiones Fc. Asimismo, una de la región Fc de un constructo de la invención se puede mutar y la otra región Fc del constructo no mutarse en absoluto, o ambas pueden mutarse pero con diferentes mutaciones.
Ciertas de las mutaciones anteriores pueden conferir nueva funcionalidad a la región Fc o al elemento ligante de FcRn. Por ejemplo, una realización incorpora N297A, eliminando un sitio de N-glucosilación altamente conservado. El efecto de esta mutación es reducir la inmunogenicidad potenciando de esta forma la semivida circulante de la región Fc, y tornar la región Fc incapaz de unirse a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIIA, sin comprometer la afinidad hacia FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al.
1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como otro ejemplo de la nueva funcionalidad que surge de las mutaciones anteriormente descritas, la afinidad hacia FcRn se puede aumentar más allá de aquella de tipo salvaje en algunos casos. Este aumento de la afinidad puede reflejar un aumento de la constante de asociación, una reducción de la constante de disociación o tanto un aumento de la constante de asociación como una reducción de la disociación. Los ejemplos de mutaciones que se cree que imparten una mayor afinidad hacia FcRn incluyen, aunque sin limitarse a ello, T256A, T307A, E380A y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
Además, por lo menos tres receptores de Fc gamma humanos parecen reconocer un sitio de unión en IgG dentro de la región bisagra inferior, en general los aminoácidos 234-237. En consecuencia, otro ejemplo de una nueva funcionalidad y potencial de menor inmunogenicidad podría surgir de las mutaciones de esta región, como por ejemplo los aminoácidos 233-236 de IgG1 humana "ELLG" a la correspondiente secuencia de IgG2 "PVA" (con una eliminación de aminoácido). Se ha demostrado que FcyRI, FcyRII y FcyRIII, que median diversas funciones efectoras, no se unen a IgG1 cuando se han introducido dichas mutaciones. Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
En una realización, la región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una región Fc, es un polipéptido que incluye la secuencia PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 52) y opcionalmente además que incluye una secuencia seleccionada entre HQSLGTQ (SEQ ID NO: 53), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 54), HQNISDGK (SEQ ID NO: 55) o VISSHLGQ (SEQ ID NO: 56) (patente estadounidense núm. 5.739.277).
En otra realización, la región constante de inmunoglobulina o una porción de esta comprende una secuencia de aminoácidos en la región bisagra o una porción de esta que forma uno o más enlaces disulfuro con otra región constante de inmunoglobulina o una porción de esta. El enlace disulfuro por la región constante de inmunoglobulina o una porción de esta dispone al primer polipéptido que comprende FVIII y al segundo polipéptido que comprende el fragmento de VWF juntos para que el VWF endógeno no reemplace al fragmento de VWF y no se una al FVIII. Por consiguiente, el enlace disulfuro entre la primera región constante de inmunoglobulina o su porción y una segunda región constante de inmunoglobulina o su porción evita la interacción entre VWF endógeno y la proteína FVIII. Esta inhibición de la interacción entre VWF y la proteína FVIII permite que la semivida de la proteína FVIII vaya más allá del doble del límite. La región bisagra o su porción pueden además enlazarse a uno o más dominios de CH1, CH2, CH3, sus fragmentos, y cualquiera de sus combinaciones. En una realización particular, la región constante de inmunoglobulina o una porción de esta es una región bisagra y CH2.
En determinadas realizaciones, la región constante de Ig o una porción de esta está hemi-glucosilada. Por ejemplo, la proteína quimérica que comprende dos regiones Fc o elementos ligantes de FcRn puede contener una primera región Fc glucosilada (p. ej., una región CH2 glucosilada) o un elemento ligante de FcRn y una segunda región Fc aglucosilada (p. ej., una región CH2 aglucosildada) o un elemento ligante de FcRn. En una realización, se puede interponer un enlazador entre las regiones Fc glucosilada y aglucosilada. En otra realización, la región Fc o el elemento ligante de FcRn están totalmente glucosilados, es decir, todas las regiones Fc están glucosiladas. En otras realizaciones, la región Fc puede estar aglucosilada, es decir, ninguno de los restos Fc está glucosilado.
En determinadas realizaciones, una proteína quimérica de la invención comprende una sustitución de aminoácidos a una región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., variantes Fc), que altera las funciones efectoras independientes de los antígenos de la región constante de Ig, en particular la semivida circulante de la proteína.
Dichas proteínas exhiben o bien mayor o menor unión a FcRn en comparación con las proteínas que carecen de estas sustituciones y, por lo tanto, tienen mayor o menor semivida en suero, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fc con mejor afinidad hacia FcRn tienen semividas en suero más largas, y dichas moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos para tratar a mamíferos en los que se desea una larga semivida del polipéptido administrado, p. ej., para tratar una enfermedad o trastorno crónico (ver, p. ej., las patentes de EE. UU. 7.348.004, 7.404.956 y 7.862.820). En contraste, se espera que las variantes de Fc con menor afinidad de unión hacia FcRn tengan semividas más cortas, y dichas moléculas son también útiles, por ejemplo, para administrar a un mamífero para el que puede ser ventajoso un tiempo de circulación acortado, p. ej., para toma de imágenes diagnósticas in vivo o en situaciones en las que el polipéptido de partida exhibe efectos colaterales tóxicos cuando está presente en la circulación por periodos prolongados. Las variantes de Fc con menor afinidad de unión hacia FcRn son menos propensas a atravesar la placenta y, por lo tanto, son también útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que se puede desear afinidad de unión hacia FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización en cerebro, riñón y/o hígado. En una realización ilustrativa, la proteína quimérica de la invención exhibe transporte reducido por el epitelio de los glomérulos del riñón de la vasculatura. En otra realización, la proteína quimérica de la invención exhibe transporte reducido por la barrera hematoencefálica (BBB) del cerebro hacia el espacio vascular. En una realización, una proteína con unión a FcRn alterada comprende por lo menos una región Fc o un elemento ligante de FcRn (p. ej., una o dos regiones Fc o elementos ligantes de FcRn) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión FcRn" de una región constante de Ig. El bucle de unión FcRn está comprendido por los residuos de aminoácidos 280-299 (de acuerdo con la numeración de la UE) de una región Fc de tipo salvaje de longitud total. En otras realizaciones, una región constante de Ig o una porción de esta en una proteína quimérica de la invención que tiene afinidad de unión hacia FcRn alterada comprende por lo menos una región Fc o elemento ligante de FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro de la “zona de contacto” 15 Á FcRn. Tal como se emplea en este documento, la expresión “zona de contacto” 15 Á FcRn incluye residuos en las siguientes posiciones de un resto Fc de tipo salvaje de longitud total: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (numeración UE). En otras realizaciones, una región constante de Ig o una porción de esta de la invención que tiene afinidad de unión hacia FcRn alterada comprende por lo menos una región Fc o un elemento ligante de FcRn que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en una posición del aminoácido correspondiente a una cualquiera de las posiciones UE: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (p. ej, N434A o N434K) y 438. Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas que alteran la actividad de unión a FcRn se describe en la publicación PCT internacional núm. WO05/047327.
Una región Fc o elemento ligante de FcRn utilizado en la invención puede además comprender una sustitución de aminoácidos reconocida en la técnica que altera la glucosilación de la proteína quimérica. Por ejemplo, la región Fc o el elemento ligante de FcRn de la proteína quimérica enlazada a un fragmento de VWF o una proteína FVIII puede comprender una región Fc que tiene una mutación que lleva a una menor glucosilación (p. ej., glucosilación enlazada a N u O) o puede comprender una glucoforma alterada del resto Fc de tipo salvaje (p. ej., un glucano libre de fucosa o de baja fucosa).
En una realización, una proteína quimérica no procesada de la invención puede comprender una región Fc genéticamente condensada (es decir, una región scFc) que tenga dos o más de su región constante de Ig constituyente o una porción de esta independientemente seleccionada entre la región constante de Ig o una porción de esta descrita en este documento. En una realización, las regiones Fc de una región Fc dimérica son iguales. En otra realización, por lo menos dos de las regiones Fc son diferentes. Por ejemplo, las regiones Fc o los elementos ligantes de FcRn de las proteínas de la invención comprenden el mismo número de residuos de aminoácidos o pueden diferir en longitud por uno o más residuos de aminoácidos (p. ej., por aproximadamente 5 residuos de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4 o residuos de 5 aminoácidos), aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos, aproximadamente 20 residuos, aproximadamente 30 residuos, aproximadamente 40 residuos o aproximadamente 50 residuos). Incluso en otras realizaciones, las regiones Fc o el elemento ligante de FcRn de la proteína de la invención pueden diferir en secuencia en una o más posiciones de los aminoácidos. Por ejemplo, por lo menos dos de las regiones Fc o los elementos ligantes de FcRn pueden diferir en aproximadamente 5 posiciones de aminoácidos (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones o aproximadamente 50 posiciones).
E) Enlazadores
La proteína quimérica de la presente invención comprende además uno o más enlazadores. Un tipo de los enlazadores es un enlazador escindible, que se puede escindir por varias proteasas cuando se administra a un sujeto in vivo, p. ej., en un sitio de coagulación. En una realización, el enlazador escindible permite la escisión de un resto, p. ej., un fragmento de VWF, de la proteína quimérica en el sitio de la cascada de coagulación, permitiendo así que el FVIII activado (FVIIIa) tenga su actividad de FVIIIa. Otro tipo de enlazadores consiste en un enlazador procesable, que contiene un sitio de escisión intracelular y por lo tanto puede ser escindido por una enzima de procesamiento intracelular en una célula hospedante, permitiendo la expresión conveniente de un polipéptido y la formación de una proteína quimérica.
Uno o más enlazadores pueden estar presentes entre cualquiera de dos proteínas en la proteína quimérica. En un caso, una proteína quimérica comprende (i) un fragmento de VWF, (ii) una secuencia de XTEN y (iii) una proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN por un enlazador, p. ej., un enlazador escindible, y la secuencia XTEN está además enlazada a la proteína FVIII (es decir, V-L-X-FVIII). En otro caso, una proteína quimérica comprende (i) un fragmento de VWF, (ii) una secuencia de XTEN y (iii) una proteína FVIII, en donde el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN y la secuencia de XTEN está enlazada a la proteína FVIII por un enlazador, p. ej., un enlazador escindible (es decir, V-X-L-FVIII).
En determinadas realizaciones, una proteína quimérica comprende (i) un fragmento de VWF, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región Fc), (iv) una proteína FVIII y (v) una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc), en donde el fragmento de VWF está enlazado a la secuencia de XTEN por un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible. La secuencia de XTEN puede además estar enlazada a la primera región constante de Ig o su porción por un enlazador, p. ej., un enlazador escindible. La proteína FVIII (con o sin una secuencia de XTEN) puede además estar enlazada a la segunda región constante de Ig o su porción por un enlazador opcional, p. ej., un enlazador escindible. En determinadas realizaciones, la proteína quimérica comprende además uno o más enlazadores, p. ej., enlazadores procesables, entre la primera región constante de Ig o su porción (p. ej., la primera región Fc) y la segunda región constante de Ig o su porción (p. ej., la segunda región Fc), entre el fragmento de VWF y la segunda región constante de Ig o su porción, o entre la proteína FVIII y la primera región constante de Ig o su porción (p. ej., la primera región Fc).
En algunos casos, la presente invención incluye una proteína quimérica que comprende (i) una proteína FVIII, (ii) una secuencia de XTEN, (iii) una primera región constante de Ig o una porción de esta, y (iv) una segunda región constante de Ig o una porción de esta, en donde la primera región constante de Ig o una porción de esta y la segunda región constante de Ig o una porción de esta están enlazadas por un enlazador procesable.
El enlazador útil en la presente invención puede comprender cualquier molécula orgánica. En una realización, el enlazador comprende un polímero, p. ej., polietilenglicol (PEG) o hidroxietil almidón (HES). En otra realización, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos. El enlazador puede comprender por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 aminoácidos. El enlazador puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos o 900-1000 aminoácidos. En una realización, el enlazador comprende una secuencia de XTEN. Se pueden usar ejemplos adicionales de XTEN de acuerdo con la presente invención y se describen en las publicaciones de patentes estadounidenses núm. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 o 2011/0172146 A1, o las publicaciones de patentes internacionales núm. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 o WO 2011028344 A2. En otra realización, el enlazador es una secuencia de PAS.
El enlazador útil en la presente invención puede comprender cualquier molécula orgánica. En una realización, el enlazador es un polímero, p. ej., polietilenglicol (PEG) o hidroxietil almidón (HES). En otra realización, el enlazador es una secuencia de aminoácidos. El enlazador puede comprender por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 aminoácidos. El enlazador puede comprender 1-5 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-20 aminoácidos, 10-50 aminoácidos, 50-100 aminoácidos, 100-200 aminoácidos, 200-300 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 400-500 aminoácidos, 500-600 aminoácidos, 600-700 aminoácidos, 700-800 aminoácidos, 800-900 aminoácidos o 900-1000 aminoácidos.
Los ejemplos de enlazadores se conocen en la técnica. En una realización, el enlazador comprende la secuencia Gn. El enlazador puede comprender la secuencia (GA)n. El enlazador puede comprender la secuencia (GGS)n. En otras realizaciones, el enlazador comprende (GGGS)n (SEQ ID NO: 57). Incluso en otras realizaciones, el enlazador comprende la secuencia (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO: 58). En estos casos, n puede ser un número entero entre 1-100. En otros casos, n puede ser un número entero entre 1 -20, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Los ejemplos de enlazadores incluyen, aunque sin limitarse a ello, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 59), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 60), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 62) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63). El enlazador no elimina ni disminuye la actividad del fragmento de VWF ni la actividad de coagulación del Factor VIII. Opcionalmente, el enlazador potencia la actividad del fragmento de VWF o la actividad de coagulación de la proteína del Factor VIII, p. ej., disminuyendo más los efectos de impedimento estérico y haciendo que el fragmento de VWF o la porción del Factor VIII sea más accesible a su sitio de unión diana.
En una realización, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 15-25 aminoácidos de longitud. En otra realización, el enlazador útil para la proteína quimérica tiene 15-20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador para la proteína quimérica tiene 10-25 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el enlazador para la proteína quimérica tiene 15 aminoácidos de longitud. Incluso en otras realizaciones, el enlazador para la proteína quimérica tiene (GGGGS)n (SEQ ID NO: 64) en donde G representa glicina, S representa serina y n es un número entero entre 1-20.
F) Sitios de escisión
El enlazador puede además incorporar un resto capaz de escindirse o bien químicamente (p. ej., hidrólisis de una unión éster), enzimáticamente (es decir, incorporación de una secuencia de escisión de proteasa) o fotolíticamente (p. ej., un cromóforo tal como ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil) propiónico (ANP)) con el fin de liberar una molécula de otra.
En una realización, el enlazador es un enlazador escindible. Los enlazadores escindibles pueden comprender uno o más sitios escindibles en el término N o en el término C, o en ambos. En otra realización, el enlazador escindible consiste esencialmente en o consiste en uno o más sitios escindibles. En otras realizaciones, el enlazador escindible comprende secuencias de enlazadores de aminoácidos heterólogos descritas en este documento o polímeros y uno o más sitios escindibles.
En determinadas realizaciones, un enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión que se pueden escindir en una célula hospedante (es decir, sitios de procesamiento intracelular). Los ejemplos no limitativos del sitio de escisión incluyen RRRR (SEQ ID NO: 9), RKRRKR (SEQ ID NO: 10) y RRRRS (SEQ ID NO: 11).
En otras realizaciones, un enlazador escindible comprende uno o más sitios de escisión que se escinden por una proteasa después de que una proteína quimérica que comprende el enlazador escindible se administra a un sujeto. En una realización, el sitio escindible es escindido por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en factor XIa, factor XIIa, calicreína, factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor IIa (trombina), Elastasa-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 y MMP-20. En otra realización, el sitio de escisión se selecciona del grupo que consiste en un sitio de escisión de FXIa (p. ej., KLTR|AET (SeQ ID NO: 65)), un sitio de escisión de FXIa (p. ej., DFTR|VVG (SEQ ID NO: 66)), un sitio de escisión de FXIIa (p. ej., TMTR|IVGG (SEQ ID NO: 67)), un sitio de escisión de calicreína (p. ej., Sp Fr^STGG (SEQ ID NO: 68)), un sitio de escisión de FVIIa (p. ej., lQv R|IVGG (SEQ ID NO: 69)), un sitio de escisión de FIXa (p. ej., PLGR|IVGG (SEQ ID NO: 70)), un sitio de escisión de FXa (p. ej., IEGR^tVGg (SEQ ID NO: 71)), un sitio de escisión de FIIa (trombina) (p. ej., LTPR|SLLV (SEQ ID NO: 72)), un sitio de escisión de Elastasa-2 (p. ej., LGPV|SGVP (SEQ ID NO: 73)), un sitio de escisión de Granzima-B (p. ej., VAGD|SLEE (SEQ ID NO: 74)), un sitio de escisión de MMP-12 (p. ej., GpAG|LGGA (SEQ ID NO: 75)), un sitio de escisión de MMP-13 (p. ej., GpAg ^LRGA (SEQ ID NO: 76)), un sitio de escisión de MMP-17 (p. ej., ApLg ^LRLR (SEQ ID NO: 77)), un sitio de escisión de MMP-20 (p. ej., Pa LP|LVAQ (SEQ ID NO: 78)), un sitio de escisión de TEV (p. ej., ENLYfQ|G (SEQ ID NO: 79)), un sitio de escisión de Enterocinasa (p. ej., d DdK|IVGG (SEQ ID NO: 80)), un sitio de escisión de Proteasa 3C (PRESCISSION™) (p. ej., LEVLFQ^g P (SEQ ID NO: 81)) y un sitio de escisión de Sortasa A (p. ej., LPKT|GSES) (SEQ ID NO: 82). En determinadas realizaciones, los sitios de escisión de FXIa incluyen, aunque sin limitarse a ello, p. ej., TQSFn DfTR (SEQ ID NO: 83) y SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 84). Los sitios de escisión de trombina ilustrativos, no limitativos incluyen, p. ej., d FlAEGGGVR (SEQ ID NO: 85), TTKIKPR (SEQ ID NO: 86) o LVPRG (SEQ ID NO: 87), y una secuencia que comprende, consiste esencialmente en o consiste en ALRPR (SEQ ID NO: 17) (p. ej., ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 88)).
En una realización específica, el sitio de escisión es TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 8).
Polinucleótidos, vectores y células hospedantes
También se da a conocer en la descripción un polinucleótido que codifica (a) un fragmento de VWF enlazado a una secuencia de XTEN y una proteína FVIII, (b) una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN y Fc, o (c) una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN y un fragmento de VWF descrito en este documento. Cuando una proteína quimérica es una cadena de polipéptidos sencilla (p. ej., F2-L2-X-V-L1-F1-FVIII, en donde FVIII comprende una proteína FVIII, F1 comprende una primera región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una primera región Fc, L1 comprende un primer enlazador, V comprende un fragmento de VWF, X comprende una secuencia de XTEN, L2 comprende un segundo enlazador y F2 comprende una segunda región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una segunda región Fc), la invención se refiere a una cadena de polinucleótidos sencilla que codifica la cadena de polipéptidos sencilla. Cuando la proteína quimérica comprende una primera y una segunda cadena de polipéptidos (F2-L2-X-V:FVIII-F1), la primera cadena de polipéptidos comprende un fragmento de VWF enlazado a una secuencia de XTEN, que además se enlaza a una primera región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una primera región Fc) por un enlazador escindible (p. ej., F2-L2-X-V) y la segunda cadena de polipéptidos comprende una proteína FVIII y una segunda región constante de Ig o una porción de esta (p. ej., una segunda región Fc) (p. ej., FVIII-F1), en donde la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos se asocian entre sí, un polinucleótido puede comprender la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos. En una realización, la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos pueden estar codificadas por una cadena de polinucleótidos sencilla. En otra realización, la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos están codificadas por dos polinucleótidos diferentes, es decir, una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos. En otra realización, la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están en dos polinucleótidos diferentes (p. ej., diferentes vectores). En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a un conjunto de polinucleótidos que comprende una primera cadena de nucleótidos y una segunda cadena de nucleótidos, en donde la primera cadena de nucleótidos codifica el fragmento de VWF de la proteína quimérica y la segunda cadena de nucleótidos codifica la proteína FVIII. En algunas realizaciones, una proteína quimérica que comprende dos cadenas de polipéptidos o tres cadenas de polipéptidos puede estar codificada por una cadena de polinucleótidos sencilla y luego procesarse en dos o tres cadenas de polipéptidos (o más). Incluso en otras realizaciones, una proteína quimérica que comprende estas cadenas de polipéptidos puede estar codificada por dos o tres cadenas de polinucleótidos.
En otras realizaciones, el conjunto de los polinucleótidos comprende además una cadena de nucleótidos adicional (p. ej., una segunda cadena de nucleótidos cuando el polipéptido quimérico es codificado por una sola cadena de polinucleótidos, o una tercera cadena de nucleótidos cuando la proteína quimérica es codificada por dos cadenas de polinucleótidos) que codifica una proteína convertasa. La proteína convertasa se puede seleccionar del grupo que consiste en proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 5 (PCSK5 o PC5), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 7 (PCSK7 o PC5), una levadura Kex 2, proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 3 (PACE o PCSK3), y dos o más de sus combinaciones. En algunas realizaciones, la proteína convertasa es PACE, PC5 o PC7. En una realización específica, la proteína convertasa es PC5 o PC7. Ver la solicitud de patente internacional núm. PCT/US2011/043568.
Tal como se emplea en este documento, un vector de expresión se refiere a cualquier constructo de ácido nucleico que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de una secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector vírico de ARN, los elementos necesarios para replicación y traducción, cuando se introducen en una célula hospedante apropiada. Los vectores de expresión pueden incluir plásmidos, fagémidos, virus y sus derivados.
Los vectores de expresión de la invención incluirán polinucleótidos que codifican la proteína quimérica descrita en este documento. En una realización, una o más de las secuencias codificantes para el fragmento de VWF y XTEN, la proteína FVIII y XTEN, o ambos están operativamente enlazados a una secuencia de control de expresión. Tal como se emplea en este documento, dos secuencias de ácido nucleico están operativamente enlazadas cuando están enlazadas de manera covalente en un modo tal de permitir que cada componente de la secuencia de ácido nucleico retenga su funcionalidad. Se dice que una secuencia codificante y una secuencia de control de expresión de genes están operativamente enlazadas cuando están enlazadas en forma covalente de manera tal de disponer la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de la secuencia de control de expresión de genes. Se dice que dos secuencias de ADN están operativamente enlazadas si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión génica en 5' resulta en la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) resulta en la introducción de una mutación de marco-desplazamiento, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora de dirigir la transcripción de la secuencia codificante, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente de traducirse en una proteína. Por lo tanto, una secuencia de expresión génica estaría operativamente enlazada a una secuencia de ácido nucleico codificante si la secuencia de expresión génica fuese capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ácido nucleico codificante de manera tal que el transcrito resultante se tradujera en la proteína o el polipéptido deseado.
Una secuencia de control de expresión génica, tal como se emplea en este documento, es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, como una secuencia promotora una combinación de promotor-potenciador que facilita la transcripción y traducción eficientes del ácido nucleico codificante al cual está operativamente enlazada. La secuencia de control de expresión de genes puede, por ejemplo, ser un promotor mamífero o vírico, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores mamíferos constitutivos incluyen, entre otros, los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato cinasa, promotor de beta-actina y otros promotores constitutivos. Los promotores víricos ilustrativos que funcionan constitutivamente en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores de citomegalovirus (CMV), virus simio (p. ej., SV40), papiloma virus, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de sarcoma de Rous, citomegalovirus, las repeticiones terminales largas (LTR) de virus de leucemia Moloney y otros retrovirus, y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Los expertos en la técnica conocen otros promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión génica de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente de inducción. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína se induce para promover la transcripción y traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Los expertos en la técnica conocen otros promotores inducibles.
En general, la secuencia de control de expresión génica incluirá, como necesarias, las secuencias de no transcripción en 5' y de no traducción en 5' implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, como secuencia caja TATA, secuencia CAAT y similares. Especialmente, dichas secuencias de no transcripción en 5' suelen incluir una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del ácido nucleico codificante operativamente asociado. Las secuencias de expresión de genes opcionalmente incluyen secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección 5’, según se desee.
Los vectores víricos, incluyen, aunque sin limitarse a ello, secuencias de ácido nucleico de los siguiente virus: retrovirus, como el virus de leucemia murino Moloney, virus del sarcoma murino Harvey, virus de tumores mamarios murinos y virus de sarcoma de Rous; adenovirus, virus adeno-asociado; virus de tipo SV40; poliomavirus; virus de Epstein-Barr; papiloma virus; herpes virus; virus de la viruela; polio virus; y virus del ARN tales como un retrovirus. Se pueden emplear fácilmente vectores conocidos en la técnica. Ciertos vectores víricos se basan en virus eucariotas no citopáticos en donde los genes no esenciales han sido reemplazados con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, el ciclo de la vida que implica la transcripción inversa de ARN vírico genómico en ADN con posterior integración provírica en el ADN celular hospedante. Los retrovirus han sido aprobados para ensayos de terapia génica en seres humanos. Los más útiles son aquellos retrovirus que son deficientes de replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de elaborar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retrovírica genéticamente alterados presentan utilidad general para la transducción de genes de gran eficiencia in vivo. Los protocolos estándar para producir retrovirus deficientes de replicación (incluidas las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea de células empaquetadas con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea de células empaquetadas, colección de partículas víricas del medio de cultivo de tejido e infección de las células diana con partículas víricas) se dan a conocer en Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., Nueva York (1990) y Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
En una realización, el virus es un virus adeno-asociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adeno-asociado se puede modificar para ser deficiente de replicación, y es capaz de infectar a una amplia gama de tipos y especies de células. También tiene ventajas tales como estabilidad de disolvente de lípidos y calor; altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, incluidas células hematopoyéticas; y ausencia de inhibición de superinfección permitiendo así múltiples series de transducciones. Según se informa, el virus adeno-asociado puede integrarse en el ADN celular humano en un modo específico del sitio, minimizando de esta forma la posibilidad de mutagénesis de inserción y variabilidad de expresión del gen insertado característico de infección retrovírica. A su vez, se han seguido infecciones por virus adeno-asociados de tipo salvaje en cultivo celular por más de 100 pasajes en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adeno-asociado es un evento relativamente estable. El virus adeno-asociado puede también funcionar en un modo extracromosómico.
Otros vectores, incluidos vectores plasmídicos. Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y los expertos los conocen bien. Ver, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se ha descubierto que los vectores plasmídicos son particularmente ventajosos para proporcionar genes a las células in vivo debido a su incapacidad de replicarse dentro e integrarse en un genoma hospedante. Estos plásmidos, no obstante, ya que tienen un promotor compatible con la célula hospedante, pueden expresar un péptido de un gen operativamente codificado dentro del plásmido. Algunos plásmidos comúnmente utilizados disponibles de proveedores comerciales incluyen pBR322, pUC18, pUC19, diversos plásmidos de pcDNA, pRC/CMV, diversos plásmidos de pCMV, pSV40 y pBlueScript. Otros ejemplos de plásmidos específicos incluyen pcDNA3.1, número de catálogo V79020; pcDNA3.1/hygro, número de catálogo V87020; pcDNA4/myc-His, número de catálogo V86320; y pBudCE4.1, número de catálogo V53220, todos de Invitrogen (Carlsbad, CA.). El experto en la técnica conoce otros plásmidos. Además, los plásmidos se pueden diseñar a medida usando técnicas estándar de biología molecular y/o se pueden añadir fragmentos específicos de ADN.
En un sistema de expresión de insectos que se puede usar para producir las proteínas de la invención, se utiliza el virus de polihidrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes ajenos. El virus se desarrolla en células de Spodoptera frugiperda. Se puede clonar una secuencia codificante en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen poliédrico) del virus y disponerse bajo el control de un promotor de ACNPV (por ejemplo, el promotor poliédrico). La inserción exitosa de una secuencia codificante producirá la inactivación del gen de poliedro y la producción del virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece del recubrimiento proteináceo codificado para el gen poliédrico). Estos virus recombinantes se utilizan luego para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (ver, p. ej., Smith et al. (1983) J Virol 46:584; patente de EE. UU. núm. 4.215.051). Otros ejemplos de este sistema de expresión se pueden hallar en Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
Otro sistema que se puede utilizar para expresar las proteínas de la invención es el sistema de expresión de genes de glutamina sintetasa, también denominado "sistema de expresión de GS" (Lonza Biologics PLC, Berkshire Reino Unido). Este sistema de expresión se describe en detalle en la patente de EE. UU. núm. 5.981.216.
En células hospedantes mamíferas, se puede utilizar un número de sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, se puede ligar una secuencia codificante a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede luego insertarse en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (p. ej., región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el péptido en hospedantes infectados. Ver, p. ej., Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativamente, se puede usar el promotor de viruela 7.5 K. Ver, p. ej., Mackett et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett et al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.
Para aumentar la eficiencia de producción, los polinucleótidos se pueden diseñar para codificar múltiples unidades de la proteína de la invención separadas por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante se puede escindir (p. ej., por tratamiento con la enzima apropiada) con el fin de recuperar las unidades de polipéptidos. Esto puede aumentar la producción de polipéptidos promovida por un solo promotor. Cuando se usa en sistemas de expresión vírica apropiados, la traducción de cada polipéptido codificada por el ARNm es dirigida internamente en el transcrito; p. ej., por un sitio interno de entrada al ribosoma, IRES. Por consiguiente, el constructo policistrónico dirige la transcripción de un solo ARNm policistrónico grande que, a su vez, dirige la traducción de múltiples polipéptidos individuales. Este planteamiento elimina la producción y el procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente la producción de polipéptidos promovida por un solo promotor.
Los vectores utilizados en la transformación usualmente contendrán un marcador seleccionable utilizado para identificar transformantes. En sistemas bacterianos, esto puede incluir un gen de resistencia a antibióticos tal como ampicilina o kanamicina. Los marcadores seleccionables para uso en células mamíferas cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos, como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable ampliable. Un marcador seleccionable ampliable es el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR). Simonsen C et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Los marcadores seleccionables son revisados por Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., y la opción de marcadores seleccionables está dentro del nivel de la experiencia en la técnica.
Los marcadores seleccionables se pueden introducir en la célula en un plásmido separado al mismo tiempo que el gen de interés, o se pueden introducir en el mismo plásmido. Si están en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el gen de interés pueden estar bajo el control de diferentes promotores o del mismo promotor, en donde la última disposición produce un mensaje dicistrónico. Los constructos de este tipo se conocen en la técnica (por ejemplo, patente de EE. UU. núm. 4.713.339).
Los vectores de expresión pueden codificar etiquetas que permiten la fácil purificación de la proteína producida en forma recombinante. Los ejemplos incluyen, entre otros, el vector pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), en donde las secuencias codificantes para la proteína que se ha de expresar se pueden ligar en el vector en marco con la región codificante lac z de manera que se produzca la proteína de fusión etiquetada; se pueden usar vectores pGEX para expresar proteínas de la invención con una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST). Estas proteínas son usualmente solubles y pueden purificarse fácilmente de las células por adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (trombina o Factor Xa proteasa o PRESCISSION PROTEASE™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) para fácil eliminación de la etiqueta después de la purificación.
El vector o los vectores de expresión luego se transfectan o co-transfectan en una célula diana adecuada, que expresará los polipéptidos. Las técnicas de transfección conocidas en el campo incluyen, aunque sin limitarse a ello, precipitación de fosfato de calcio (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), electroporación (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) y reactivos basados en liposomas. Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vectores de expresión de hospedantes para expresar las proteínas descritas en este documento, incluidas células procariotas y eucariotas. Estos incluyen, entre otros, microorganismos tales como bacterias (p. ej., E coli) transformados con ADN bacteriófago recombinante o vectores de expresión de ADN plasmídico que contienen una secuencia codificante apropiada; levadura u hongos filamentosos transformados con levadura recombinante o vectores de expresión de hongos que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insectos con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus mosaico de la coliflor o virus mosaico del tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células animales, que incluyen células mamíferas (p. ej., HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 y células BHK).
En una realización, la célula hospedante es una célula eucariota. Tal como se emplea en este documento, una célula eucariota se refiere a cualquier célula animal o vegetal que tiene un núcleo definitivo. Las células eucariotas de animales incluyen células de vertebrados, p. ej., mamíferos, y células de invertebrados, p. ej., insectos. Las células eucariotas de plantas específicamente pueden incluir, sin limitación, células de levadura. Una célula eucariota es distinta de una célula procariota, p. ej., una bacteria.
En determinadas realizaciones, la célula eucariota es una célula mamífera. Una célula mamífera es cualquier célula derivada de un mamífero. Las células mamíferas específicamente incluyen, aunque sin limitarse a ello, líneas de células mamíferas. En una realización, la célula mamífera es una célula humana. En otra realización, la célula mamífera es una célula HEK 293, que es una línea celular de riñón embrionario humano. Las células HEK 293 están disponibles como CRL-1533 de American Type Culture Collection, Manassas, VA, y como células 293-H, Catálogo núm. 11631-017 o células 293-F, Catálogo núm. 11625-019 de Invitrogen (Carlsbad, Calif.). En algunas realizaciones, la célula mamífera es una célula PER.C6®, que es una línea celular humana derivada de retina. Las células PER.C6® están disponibles de Crucell (Leiden, Países Bajos). En otras realizaciones, la célula mamífera es una célula de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO están disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, VA. (p. ej., CHO-K1; CCL-61). Incluso en otras realizaciones, la célula mamífera es una célula de riñón de hámster bebé (BHK). Las células BHK están disponibles de American Type Culture Collection, Manassas, Va. (p. ej., CRL-1632). En algunas realizaciones, la célula mamífera es una célula HKB11, que es una línea celular híbrida de una célula HEK293 y una línea de células B humanas. Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165­ 78 (2006).
En un caso, un plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión FVIII(X)-Fc, una secuencia codificante de fusión de un fragmento de VWF-L-Fc, o ambas y un marcador seleccionable, p. ej., resistencia a zeocina, se transfectan en células HEK 293, para producción de una proteína quimérica.
En otra realización, un plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión FVIII-Fc, una secuencia codificante de fusión de un fragmento de fusión VWF-XTEN-L-Fc, o ambas y un marcador seleccionable, p. ej., resistencia a zeocina, se transfectan en células HEK 293, para producción de una proteína quimérica.
En otros casos, una secuencia codificante de fusión FVIII(X)-Fc, una secuencia codificante de Fc, o ambas y un marcador seleccionable, p. ej., resistencia a zeocina, se transfectan en células HEK 293, para producción de una proteína quimérica.
En algunos casos, un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión FVIII(X)-Fc y un primer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de Fc o una secuencia codificante de un fragmento de VWF-L-Fc y un segundo marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de una proteína convertasa y un tercer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a higromicina, se co-transfectan en células HEK 293, para producción de la proteína quimérica. El primero y segundo plásmidos se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1), o se pueden introducir en cantidades desiguales.
Incluso en otras realizaciones, un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión FVIII-Fc y un primer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de un fragmento de VWF-XTEN-L-Fc y un segundo marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un tercer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a higromicina, se co-transfectan en células HEK 293, para producir la proteína quimérica. El primero y segundo plásmidos se pueden introducir en cantidades iguales (es decir., relación molar 1:1), o se pueden introducir en cantidades desiguales.
Incluso en otras realizaciones, un primer plásmido que incluye una secuencia codificante de fusión FVI11 (X)-Fc y un primer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de un fragmento de VWF-XTEN-L-Fc y un segundo marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a neomicina, y un tercer plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un tercer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a higromicina, se co-transfectan en células HEK 293, para producción de la proteína quimérica. El primero y segundo plásmidos se pueden introducir en cantidades iguales (es decir, relación molar 1:1), o se pueden introducir en cantidades desiguales.
En determinadas realizaciones, un primer plásmido, que incluye una proteína quimérica que codifica una secuencia codificante de FVIII (con o sin XTEN)-F1-L1-V-XTEN-L2-F2 y un primer marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a zeocina, y un segundo plásmido que incluye una secuencia codificante de proteína convertasa y un segundo marcador seleccionable, p. ej., un gen de resistencia a higromicina, se co-transfectan en células HEK 293, para producir la proteína quimérica. Los promotores para la secuencia codificante de FVIII(X)-Fc y la secuencia codificante de VWF-XTEN-Fc pueden ser diferentes o pueden ser iguales.
Incluso en otras realizaciones, las células transfectadas se transfectan establemente. Estas células se pueden seleccionar y mantener como una línea celular estable, usando técnicas convencionales conocidas por el experto en el campo.
Las células hospedantes que contienen constructos de ADN de la proteína se desarrollan en un medio de crecimiento adecuado. Tal como se emplea en este documento, la expresión "medio de crecimiento adecuado" significa un medio que contiene nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento de las células incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. Opcionalmente, el medio puede contener uno o más factores de selección. Opcionalmente, el medio puede contener suero de ternero bovino o suero de ternero fetal (FCS). En una realización, el medio prácticamente no contiene IgG. El medio de crecimiento en general selecciona células que contienen constructo de ADN, por ejemplo mediante la selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que se complementa con el marcador seleccionable en el constructo de ADN o se co-transfecta con el constructo de ADN. Las células mamíferas cultivadas en general se desarrollan en un medio que contiene suero comercial o en un medio libre de suero (p. ej., MEM, DMEM, DMEM/F12). En una realización, el medio es CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). En otra realización, el medio es CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). La selección de un medio adecuado para la línea celular particular está dentro del nivel de experiencia en la técnica.
Con el fin de co-expresar las dos cadenas de polipéptidos de la proteína quimérica, las células hospedantes se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de ambas cadenas. Tal como se emplea en este documento, cultivar se refiere a mantener las células vivas in vitro durante por lo menos un tiempo definido. Mantener puede, pero no necesariamente incluye, un incremento en la población de células vivas. Por ejemplo, las células mantenidas en cultivo pueden ser estáticas en población, pero aun así ser viables y capaces de producir un producto deseado, p. ej., una proteína recombinante o una proteína de fusión recombinante. Las condiciones adecuadas para cultivar células eucariotas se conocen en la técnica e incluyen la selección apropiada del medio de cultivo, suplementos del medio, temperatura, pH, saturación de oxígeno y similares. Para propósitos comerciales, cultivar puede incluir el uso de cualquiera de varios tipos de sistemas a escala, incluidos matraces agitadores, frascos de cultivo rotatorios, biorreactores de fibras huecas, biorreactores de tanque agitado, biorreactores elevadores de aire, biorreactores Wave y otros.
Las condiciones de cultivo también se seleccionan para permitir la asociación del fragmento de VWF con la proteína FVIII. Las condiciones que permiten la expresión del fragmento de VWF y/o la proteína FVIII pueden incluir la presencia de una fuente de vitamina K. Por ejemplo, en una realización, las células HEK 293 establemente transfectadas se cultivan en medio CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) o en medio OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) enriquecido con glutamina 4 mM.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para expresar, elaborar o producir la proteína quimérica de la invención que comprende a) transfectar una célula hospedante que comprende un polinucleótido que codifica la proteína quimérica de la invención y b) cultivar la célula hospedante en un medio de cultivo bajo condiciones adecuadas para expresar la proteína quimérica, en donde se expresa la proteína quimérica.
En otras realizaciones, el producto de proteína que contiene el fragmento de VWF enlazado a una secuencia de XTEN o la proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN se segrega en el medio. El medio se separa de las células, se concentra, se filtra y luego se pasar por dos o tres columnas de afinidad, p. ej., una columna de proteína A y una o dos columnas de intercambio aniónico.
En ciertos casos, la presente invención se refiere a la proteína quimérica producida por los métodos descritos en este documento.
La producción in vitro permite producir a escala grandes cantidades de los polipéptidos modificados deseados de la invención. Las técnicas para cultivo celular mamífero bajo condiciones de cultivo de tejido se conocen en el campo e incluyen cultivo de suspensión homogénea, p. ej., en un reactor aéreo o en un reactor agitador continuo, o cultivo celular atrapado o inmovilizado, p. ej., en fibras huecas, microcápsulas, en microperlas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si se necesita y/o desea, las disoluciones de polipéptidos se pueden purificar por métodos de cromatografía convencionales, por ejemplo filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, cromatografía sobre DEAE-celulosa o cromatografía de afinidad.
Composición farmacéutica
Las composiciones que contienen la proteína quimérica de la presente invención pueden contener un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Por ejemplo, pueden contener excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones diseñadas para administrar al sitio de acción.
La composición farmacéutica se puede formular para administración parenteral (es decir, intravenosa, subcutánea o intramuscular) por inyección en bolo. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contener agentes formuladores como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede tener la forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua libre de pirógenos.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral también incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos según sea apropiado como suspensiones oleosas. Los disolventes lipófilos o vehículos incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintético, por ejemplo, etil oleato o triglicéridos. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes. Los liposomas también se pueden utilizar para encapsular las moléculas de la invención para administrar a las células o los espacios intersticiales. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos son disolventes fisiológicamente compatibles, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de demora de la absorción, agua, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares. En algunas realizaciones, la composición comprende agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. En otras realizaciones, las composiciones comprenden sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la semivida o efectividad de los ingredientes activos.
Las composiciones de la invención pueden adoptar una diversidad de formas, como por ejemplo, líquido (p. ej., disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones, suspensiones, semi-sólidos y presentaciones sólidas. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.
La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración del fármaco. Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes anteriormente enumerados, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos anteriormente enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución previamente filtrada estéril. La fluidez correcta de una disolución se puede mantener, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento tal como lecitina, con el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y con el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede generar incluyendo en la composición el agente que demora la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
El ingrediente activo se puede formular con una formulación o dispositivo de liberación controlada. Los ejemplos de dichas formulaciones y dispositivos incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden emplear polímeros biodegradables, biocompatibles, por ejemplo, etilnvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones y dispositivos se conocen en la técnica. Ver, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las formulaciones de depósito inyectables se pueden elaborar formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la relación del fármaco al polímero, y de la naturaleza del polímero empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Otros polímeros biodegradables ilustrativos son los poliortoésteres y polianhídridos. Las formulaciones de depósito inyectables también se pueden preparar atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones.
Se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. En una realización, la proteína quimérica de la invención se formula con otro factor de coagulación, o su variante, fragmento, análogo o derivado. Por ejemplo, el factor de coagulación incluye, aunque sin limitarse a ello, el factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, protrombina, fibrinógeno, factor de von Willebrand o factor de tejido soluble recombinante (rsTF) o formas activadas de cualquiera de los anteriores. El factor de coagulación del agente hemostático puede también incluir fármacos anti-fibrinóticos, p. ej., épsilon-pacido aminocaproico, ácido tranexámico. Los esquemas de administración se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar en forma proporcional según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para una fácil administración y uniformidad de la dosis. Ver, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).
Además del compuesto activo, la forma de dosis líquida puede contener ingredientes inertes como agua, alcohol etílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, bencil benzoato, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán. Los ejemplos no limitativos de vehículos farmacéuticos adecuados también se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Algunos ejemplos de excipientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche desnatada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición puede también contener reactivos de tampón de pH y agentes humectantes o emulsionantes.
Para administración oral, la composición farmacéutica puede adoptar la forma de comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales. La composición puede además prepararse como un líquido, por ejemplo un jarabe o una suspensión. El líquido puede incluir agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (lecitina o goma arábiga), vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados), y conservantes (p. ej., metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden además incluir saporíferos, colorantes y edulcorantes. Alternativamente, la composición se puede presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado.
Para administración bucal, la composición puede adoptar la forma de comprimidos o pastillas de acuerdo con protocolos convencionales.
Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención convenientemente se administran en la forma de un aerosol nebulizado con o sin excipientes o en la forma de un spray en aerosol desde un envase presurizado o nebulizador, opcionalmente con un propulsor, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada como lactosa o almidón.
La composición farmacéutica puede además formularse para administración rectal como supositorio o enema de retención, p. ej., que contenga bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
En una realización, una composición farmacéutica comprende una proteína quimérica, en donde el polinucleótido codifica la proteína quimérica, el vector comprende el polinucleótido o la célula hospedante comprende el vector, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína FVIII en una proteína quimérica presenta semivida extendida en comparación con la proteína FVIII de tipo salvaje o la correspondiente proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En una realización, la semivida de la proteína FVIII se extiende por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces o por lo menos aproximadamente 12 veces más que FVIII de tipo salvaje. En otra realización, la semivida del Factor VIII es de por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 26 horas, por lo menos aproximadamente 27 horas, por lo menos aproximadamente 28 horas, por lo menos aproximadamente 29 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 31 horas, por lo menos aproximadamente 32 horas, por lo menos aproximadamente 33 horas, por lo menos aproximadamente 34 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas o por lo menos aproximadamente 108 horas.
En algunos casos, la composición se administra por una ruta seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración oral. La administración parenteral puede ser intravenosa o subcutánea.
En otros casos, la composición se utiliza para tratar una enfermedad o afección de la sangre en un sujeto que lo necesita. La enfermedad o afección de la sangre se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra-craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del psoas ilíaco y cualquiera de sus combinaciones. Incluso en otros casos, el sujeto tiene programada una cirugía. Incluso en otros casos, el tratamiento es profiláctico o a demanda.
Terapia génica
Una proteína quimérica de la invención se puede producir in vivo en un mamífero, p. ej., un paciente humano, que usa un planteamiento de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la sangre seleccionado del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra-craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del psoas ilíaco sería terapéuticamente beneficiosa. En un caso, la enfermedad o trastorno de sangrado es hemofilia. En otro caso, la enfermedad o trastorno de sangrado es hemofilia A. Esto implica la administración de un ácido nucleico que codifica una proteína quimérica adecuada operativamente enlazada a secuencias de control de expresión adecuadas. En ciertos casos, estas secuencias se incorporan a un vector vírico. Los vectores víricos adecuados para dicha terapia génica incluyen vectores adenovíricos, vectores lentivíricos, vectores baculovíricos, vectores del virus de Epstein Barr, vectores papovavíricos, vectores del virus de la viruela, vectores víricos de herpes simple y vectores de virus adenoasociados (AAV). El vector vírico puede ser un vector vírico defectuoso de replicación. En otros casos, un vector adenovírico presenta una eliminación en su gen E1 o en su gen E3. Cuando se usa un vector adenovírico, el mamífero puede no estar expuesto a un ácido nucleico que codifica un gen marcador seleccionable. En otros casos, las secuencias se incorporan en un vector no vírico conocido por el experto en la técnica.
Métodos de uso de la proteína quimérica
La presente invención se refiere a un método para usar una proteína quimérica descrita en este documento para prevenir o inhibir la unión de VWF endógeno a una proteína FVIII. La presente invención también se refiere a un método para usar una proteína quimérica que tiene una proteína FVIII enlazada a XTEN y una región constante de Ig o una porción de esta.
Un aspecto de la presente invención se refiere a prevenir o inhibir la interacción de FVIII con VWF endógeno, bloqueando o protegiendo el sitio de unión de VWF en el FVIII contra VWF endógeno y al mismo tiempo extendiendo la semivida de la proteína FVIII usando una secuencia de XTEN en combinación con una región constante de Ig o una porción de esta, que puede además ser un extensor de la semivida. En un caso, la invención se refiere a un método para construir una proteína FVIII que tiene una semivida más larga que FVIII de tipo salvaje. En un caso, una secuencia de XTEN inhibe o previene la interacción de una proteína FVIII en una proteína quimérica con VWF endógeno. En otro caso, una región constante de Ig o una porción de esta inhibe o previene la interacción de la proteína FVIII con VWF endógeno. La proteína quimérica útil en el método incluye una cualquiera o más de las proteínas quiméricas descritas en este documento.
Otro aspecto de la invención incluye un método para administrar a un sujeto que lo necesita una proteína quimérica que comprende una proteína FVIII que tiene semivida más larga que FVIII de tipo salvaje, en donde el método comprende administrar al sujeto la proteína quimérica descrita en este documento.
En un caso, la invención se refiere a un método que usa una secuencia de XTEN y una región constante de Ig o una porción de esta para extender la semivida de una proteína FVIII y un fragmento de VWF para prevenir o inhibir la interacción del VWF endógeno con una proteína FVIII. Una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN (p. ej., FVIII(X)) y luego unida o asociada a un fragmento de VWF se protege contra la vía de aclaramiento de VWF y por lo tanto presenta aclaramiento reducido en comparación con la proteína FVIII no unida al fragmento de VWF. La proteína FVIII protegida posee entonces una extensión máxima de la semivida en comparación con una proteína FVIII no unida o asociada a la secuencia de XTEN y al fragmento de VWF. En ciertos casos, la proteína FVIII asociada con o protegida por un fragmento de VWF y enlazada a una secuencia de XTEN no es aclarada por un receptor de aclaramiento de VWF. En otros casos, la proteína FVIII asociada con o protegida por un fragmento de VWF y enlazada a una secuencia de XTEN se aclara del sistema más lentamente que la proteína FVIII no asociada ni protegida por el fragmento de VWF y enlazada a la secuencia de XTEN.
En un aspecto, la proteína quimérica que comprende la proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN o a la proteína FVIII unida o asociada con un fragmento de VWF enlazada a XTEN presenta menos aclaramiento de la circulación ya que el fragmento de VWF no contiene un sitio de unión al receptor de aclaramiento de VWF. El fragmento de VWF previene o inhibe el aclaramiento de FVIII unido o asociado al fragmento de VWF del sistema a través de la vía de aclaramiento del VWF. Los fragmentos de VWF útiles para la presente invención pueden también proporcionar por lo menos una o más propiedades de protección de FVIII de tipo VWF otorgadas por el VWF endógeno. En determinadas realizaciones, el fragmento de VWF o la secuencia de XTEN pueden también enmascarar uno o más de los sitios de unión al receptor de aclaramiento de FVIII, previniendo de este modo el aclaramiento de FVIII por su propia vía de aclaramiento.
En algunos casos, la prevención o inhibición de la unión de una proteína FVIII a VWF endógeno por el fragmento de VWF o la secuencia de XTEN se puede producir in vitro o in vivo.
También se da a conocer un método para aumentar la semivida de una proteína FVIII que comprende administrar la proteína quimérica descrita en este documento a un sujeto que lo necesita. La semivida de FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud total es de aproximadamente 12 a 14 horas en el plasma. En VWD de tipo 3, en donde prácticamente no hay VWF en la circulación, la semivida de FVIII es solo de aproximadamente es horas, lo que provoca síntomas de hemofilia A leves a moderados en dichos pacientes debido a las concentraciones reducidas de FVIII. La semivida de la proteína FVIII enlazada o asociada con el fragmento de VWF o la secuencia de XTEN de la presente invención puede aumentar por lo menos aproximadamente 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,6 veces, 2,7, veces, 2,8 veces, 2,9 veces, 3,0 veces, 3,1 veces, 3,2 veces, 3,3 veces, 3,4 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces o 4,0 veces más que la semivida del FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud total.
En una realización, la semivida de la proteína FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF o enlazada a una región constante de Ig o una porción de esta in la proteína quimérica que comprende una secuencia de XTEN se incrementa por lo menos aproximadamente 2 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces más que la semivida de FVIII no activado unido o asociado a VWF de longitud total. En otra realización, la semivida de la proteína FVIII enlazada o asociada con el fragmento de VWF o una región constante de Ig o una porción de esta en la proteína quimérica que comprende una secuencia de XTEN se incrementa aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 5 a aproximadamente 15 veces, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 15 a aproximadamente 25 veces, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 veces, aproximadamente 25 a aproximadamente 35 veces, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 veces, aproximadamente 35 a aproximadamente 45 veces más que la semivida de FVIII no activado unido o asociado con VWF de longitud total o FVIII de tipo salvaje. En una realización específica, la semivida de la proteína FVIII enlazada o asociada al fragmento de VWF o enlazada a una región constante de Ig en la proteína quimérica que comprende una secuencia de XTEN aumenta por lo menos aproximadamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 veces más que la semivida de FVIII de tipo salvaje en ratones con genes doblemente inactivados de FVIII y VWF.
En algunas realizaciones, la semivida de la proteína quimérica que comprende el fragmento de VWF condensado a una primera región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una primera región Fc y una secuencia de XTEN, y una proteína FVIII enlazada a una secuencia de XTEN y una segunda región constante de Ig o una porción de esta, p. ej., una segunda región Fc, es mayor que la semivida de un FVIII asociado con VWF endógeno. En otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica es por lo menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3,5 veces, 3,6 veces, 3,7 veces, 3,8 veces, 3,9 veces, 4,0 veces, 4,5 veces o 5,0 veces la semivida de FVIII de tipo salvaje o una proteína FVIII asociada con VWF endógeno.
En algunas realizaciones, como resultado de la invención, la semivida de la proteína FVIII se extiende en comparación con una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo salvaje. La semivida de la proteína quimérica de la invención es por lo menos aproximadamente 1,5 veces, por lo menos aproximadamente 2 veces, por lo menos aproximadamente 2,5 veces, por lo menos aproximadamente 3 veces, por lo menos aproximadamente 4 veces, por lo menos aproximadamente 5 veces, por lo menos aproximadamente 6 veces, por lo menos aproximadamente 7 veces, por lo menos aproximadamente 8 veces, por lo menos aproximadamente 9 veces, por lo menos aproximadamente 10 veces, por lo menos aproximadamente 11 veces o por lo menos aproximadamente 12 veces más larga que la semivida de una proteína FVIII sin el fragmento de VWF o FVIII de tipo salvaje. En una realización, la semivida de FVIII es aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 20 veces, aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 15 veces, o aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10 veces más larga que la semivida de FVIII de tipo salvaje. En otra realización, la semivida de FVIII se extiende aproximadamente 2 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4 veces, aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 10 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 9 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 8 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 7 veces, aproximadamente 3 aproximadamente 6 veces, aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 3 aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4 veces a aproximadamente 6 veces, aproximadamente 5 aproximadamente 7 veces o aproximadamente 6 veces a aproximadamente 8 veces en comparación con FVIII de tipo salvaje o una proteína FVIII sin el fragmento de VWF. En otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica de la invención es de por lo menos aproximadamente 17 horas, por lo menos aproximadamente 18 horas, por lo menos aproximadamente 19 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 21 horas, por lo menos aproximadamente 22 horas, por lo menos aproximadamente 23 horas, por lo menos aproximadamente 24 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 26 horas, por lo menos aproximadamente 27 horas, por lo menos aproximadamente 28 horas, por lo menos aproximadamente 29 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 31 horas, por lo menos aproximadamente 32 horas, por lo menos aproximadamente 33 horas, por lo menos aproximadamente 34 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 36 horas, por lo menos aproximadamente 48 horas, por lo menos aproximadamente 60 horas, por lo menos aproximadamente 72 horas, por lo menos aproximadamente 84 horas, por lo menos aproximadamente 96 horas, o por lo menos aproximadamente 108 horas.
Incluso en otras realizaciones, la semivida de la proteína quimérica de la invención es de aproximadamente 15 horas a aproximadamente dos semanas, aproximadamente 16 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 17 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 18 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 19 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 20 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 21 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 22 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 23 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 36 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 48 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 60 horas a aproximadamente una semana, aproximadamente 24 horas a aproximadamente seis días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cinco días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuatro días, aproximadamente 24 horas a aproximadamente tres días o aproximadamente 24 horas a aproximadamente dos días.
En algunos casos la semivida promedio de la proteína quimérica de la invención por sujeto es de aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas (1 día), aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 48 horas (2 días), aproximadamente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas (3 días), aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas (4 días), aproximadamente 108 horas, aproximadamente 120 horas (5 días), aproximadamente seis días, aproximadamente siete días (una semana), aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días o aproximadamente 14 días.
Además, la invención da a conocer un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno de sangrado que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína quimérica. En un caso, la enfermedad o el trastorno de sangrado se selecciona del grupo que consiste en un trastorno de coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra-craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal y sangrado en la vaina del psoas ilíaco. En un caso específico, la enfermedad o el trastorno de sangrado es hemofilia A.
La proteína quimérica que comprende una secuencia de XTEN y una región constante de Ig o una porción de esta en combinación con un fragmento de VWF descrito en este documento, que previene o inhibe la interacción con la proteína FVIII con VWF endógeno preparada por la invención tiene muchos usos que reconocerá el experto en la técnica, como por ejemplo métodos para tratar a un sujeto que presenta un trastorno hemostático y métodos para tratar a un sujeto que necesita un agente hemostático general. En un caso, la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno hemostático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica.
La porción FVIII de la proteína en la proteína quimérica trata o previene un trastorno hemostático, actuando como cofactor para el Factor IX en una superficie de fosfolípidos negativamente cargada, formando de este modo un complejo Xase. La unión de factores de coagulación activados a una superficie de fosfolípidos localiza este proceso en sitios de daño vascular. En una superficie de fosfolípidos, el Factor VIIIa incrementa la velocidad máxima de activación del Factor X por el Factor IXa, en aproximadamente 200.000 veces, lo que provoca un segundo gran estallido de generación de trombina.
La proteína quimérica de la invención se puede usar para tratar cualquier trastorno hemostático. Los trastornos hemostáticos que se pueden tratar por administración de la proteína quimérica de la invención incluyen, entre otros, hemofilia A, además de deficiencias o anomalías estructurales relacionadas con el Factor VIII. En un caso, el trastorno hemostático es hemofilia A.
La proteína quimérica de la invención se puede usar profilácticamente para tratar a un sujeto con un trastorno hemostático. La proteína quimérica de la invención se puede usar para tratar un episodio de sangrado agudo en un sujeto con un trastorno hemostático. En otro caso, el trastorno hemostático puede ser el resultado de un factor de coagulación defectuoso, p. ej., factor de von Willebrand. En un caso, el trastorno hemostático es un trastorno hereditario. En otro caso, el trastorno hemostático es un trastorno adquirido. El trastorno adquirido puede ser resultado de una enfermedad o afección secundaria subyacente. La afección no relacionada puede ser, por ejemplo, aunque sin limitarse a ello, cáncer, una enfermedad autoinmune o embarazo. El trastorno adquirido puede resultar de edad avanzada o de medicamentos para tratar un trastorno secundario subyacente (p. ej., quimioterapia para el cáncer).
La invención también se refiere a métodos para tratar a un sujeto que no padece un trastorno hemostático congénito, sino que padece una enfermedad o afección secundaria que provoca la adquisición de un trastorno hemostático, p. ej., debido al desarrollo de un anticuerpo anti-FVIII o a una cirugía. La invención se refiere por lo tanto a un método para tratar a un sujeto que necesita un agente hemostático general, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína quimérica preparada por los presentes métodos.
La presente invención se refiere además a métodos para reducir la inmunogenicidad de FVIII o inducir menos inmunogenicidad contra FVIII, que comprende administrar una cantidad eficaz de las proteínas quiméricas descritas en este documento, o los polinucleótidos que las codifican.
En un caso, el sujeto que necesita un agente hemostático general se está sometiendo o está por someterse a una cirugía. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes, durante o después de la cirugía como esquema profiláctico. La proteína quimérica de la invención se puede administrar antes, durante o después de la cirugía para controlar un episodio de sangrado agudo.
La proteína quimérica de la invención se puede usar para tratar a un sujeto que tiene un episodio de sangrado agudo que no padece un trastorno hemostático. El episodio de sangrado agudo puede resultar de traumatismo severo, p. ej., cirugía, un accidente automovilístico, herida, laceración, disparo de pistola, o cualquier evento traumático que resulte en sangrado descontrolado. Los ejemplos no limitativos de episodios de sangrado incluyen trastorno de coagulación de la sangre, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra­ craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, sangrado del sistema nervioso central, sangrado en el espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, sangrado en la vaina del psoas ilíaco, y cualquiera de sus combinaciones.
En aplicaciones profilácticas, una o más composiciones que contienen la proteína quimérica de la invención o un cóctel de estas se administran a un paciente que todavía no padece el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente o para reducir los síntomas asociados con una enfermedad o trastorno. Dicha cantidad se define como "dosis profiláctica eficaz". En aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente alta (p. ej., de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de polipéptido por dosis, en donde se utilizan comúnmente dosis de 5 a 25 mg para radioinmunoconjugados y dosis superiores para polipéptidos modificados por el fármaco citotoxina) en intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta reducir o terminar la progresión de la enfermedad, y hasta que el paciente demuestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después, el paciente puede recibir un esquema profiláctico.
En algún caso, una proteína quimérica o una composición de la invención se usa para el tratamiento a demanda, que incluye el tratamiento de un episodio de sangrado, hemartrosis, sangrado muscular, sangrado oral, hemorragia, hemorragia hacia los músculos, hemorragia oral, traumatismo, traumatismo craneal, sangrado gastrointestinal, hemorragia intra-craneal, hemorragia intra-abdominal, hemorragia intra-torácica, fractura ósea, central sangrado del sistema nervioso central, sangrado del espacio retrofaríngeo, sangrado en el espacio retroperitoneal, o sangrado en la vaina del psoas ilíaco. El sujeto puede necesitar profilaxis quirúrgica, manejo peri-operatorio o tratamiento para una cirugía. Dichas cirugías incluyen, p. ej., cirugía menor, cirugía mayor, extracción de dientes, amigdalectomía, herniotomía inguinal, sinovectomía, reemplazo total de rodilla, craneotomía, osteosíntesis, cirugía por traumatismo, cirugía intra-craneal, cirugía intra-abdominal, cirugía intra-torácica o cirugía para reemplazo de una articulación.
En un caso, la proteína quimérica de la presente invención se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, o por cualquier superficie mucosa, p. ej., por ruta oral, sublingual, bucal, nasal, rectal, vaginal o pulmonar. La proteína quimérica que comprende un fragmento de VWF y una proteína FVIII de la presente invención se puede implantar dentro o enlazarse a un soporte sólido de biopolímero que permite la liberación lenta de la proteína quimérica al sito de sangrado o se puede implantar en una venda/apósito. La dosis de la proteína quimérica variará dependiendo del sujeto y de la ruta de administración particular utilizada. Las dosis pueden oscilar entre 0,1 y 100.000 gg/kg de peso corporal. En un caso, el intervalo de dosis es 0,1-1,000 gg/kg. En otro caso, el intervalo de dosis es 0,1-500 gg/kg. La proteína se puede administrar continuamente o en intervalos de tiempo específicos. Se pueden emplear ensayos in vitro para determinar los intervalos de dosis óptimos y/o los esquemas de administración óptimos. Los ensayos in vitro que miden la actividad del factor de coagulación se conocen en la técnica, p. ej., el ensayo de coagulación de VIIa-rTF STA-CLOT o el ensayo de coagulación ROTEM. Adicionalmente, se pueden extrapolar las dosis eficaces de las curvas de dosis y respuesta de modelos animales, p. ej., un perro hemofílico (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670).
Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá claramente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen aquí para fines ilustrativos solamente y no tienen como fin limitar la invención.
Ejemplos
En todos los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos a menos que se indique lo contrario.
Materiales y métodos
En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biofísica, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, p. ej., tecnología de anticuerpos), y técnicas estándar en electroforesis. Ver, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Ejemplo 1: Clonación de diferentes dominios de VWF (Figura 1)
(a) Clonación de pSYN-VWF-002
pSYN-VWF-002 contiene secuencias de nucleótidos que codifican un fragmento de VWF, que son los aminoácidos 1-477 de SEQ ID NO: 100. [secuencia de proteína VWF-D'D3] La numeración de aminoácidos representa la secuencia de VWF maduro sin propéptido y corresponde a los aminoácidos 764-1240 de la SEQ ID NO: 2. El constructo pSYN-VWF-002 tiene el péptido de señalización FVIII en el término N, lo que permite la segregación correcta de la proteína sintetizada y seguida por una etiqueta 6xHis en el término C, que se usa para la purificación de proteínas. Se sintetizó usando las siguientes combinaciones de cebadores:
ESC48- Fwd - VWF-D'D3 con la señal VIII y el sitio BsiW1
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGT
GCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQIDNO:
90)
ESC51- Rev- VWF D'D3 (aminoácido 1-477) con 6His y el sitio Not 1
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTT
CACAGGTGAGGTTGACAAC (SEQIDNO:91)
Se llevó a cabo una reacción PCR de 50 gl PCR con combinaciones del cebador ESC 48/ESC 51 y el plásmido de VWF de longitud total como molde, usando el ciclo de ampliación de PCR de dos etapas: 94 °C 2 minutos; 21 ciclos de (96 °C 30 segundos, 68 °C 2 minutos). La banda de 1460bp se purificó en gel con un kit de extracción de gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción BsiWI y Not1 de pcDNA 4 para generar pSYN-VWF 002.
(b) Clonación de pSYN-VWF- 010 y 013
Se construyó pSYN-VWF-010 usando pSYN-VWF-008 y pSYN-VWF-002. pSYN-VWF-008 contiene la secuencia de VWF de longitud total en pcDNA 3.1 (aminoácidos 1-2813 de SEQ ID NO: 2), incluye el propéptido de 763 aminoácidos (es decir, los dominios D1D2) seguido por la secuencia restante de 2050 aminoácidos del VWF maduro. El péptido de señalización FVIII en pSYN-VWF-002 se reemplazó con los dominios D1D2 de pSYN-VWF-008, el constructo resultante es pSYN-VWF-010. pSYN-VWF- 008 tiene un sitio BamH1 en Arg907 y un sitio Not1 al final de la región codificante (después del codón de finalización). pSYN- VWF- 008 y 002 se digirieron con las enzimas de restricción BamH1 y Not1. Las inserciones de pSYN- vWf-002 (1026 bp) se ligaron a pSYN-VWF- 008 digerido con bamH1/Not1 (8242bp) para obtener pSYN-VWF -010 (D1D2D'D3: aminoácidos 1-1240 de SEQ ID NO: 2), también se añadió una etiqueta 6xHis al término C. En células transformadas, pSYN-VWF-010 se sintetiza con propéptido pero debido al procesamiento intracelular los productos segregados no contienen ningún propéptido (D1D2). La proteína de VWF-010 existe como dímero.
Se usó pSYN-VWF-010 para generar pSYN-VWF-013 que tiene dos mutaciones puntuales en C336A y C379A correspondientes a la SeQ ID NO: 100 (la numeración de aminoácidos representa la secuencia de VWF maduro sin el dominio D1 D2-secuenciaVWF 2). Se pronostica que estas mutaciones previenen la dimerización del dominio VWF D'D3.
(c) Clonación de pSYN-VWF-025 y pSYN-VWF-029
pSYN-VWF-025 contiene las secuencias D1D2D'D3 de tipo salvaje de VWF de longitud total en el vector pLIVE, y pSYN-VWF-029 contiene la secuencia D1D2D'D3 con la mutación C336A y C379A. Para clonación de pSYN-VWF-025, se usó la siguiente combinación de cebadores:
ESC 89-fwd con el sito Nhel= CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (SEQ ID NO: 92)
ESC 91-rev con Sal1= CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (SEQ ID NO: 93) Se llevó a cabo una reacción PCR de 50 pl con las combinaciones del cebador ESC 89/ESC91 y, o bien el plásmido pSYN-VWF 010 (para pSYN-VWF-025) o bien el pSYN-VWF 013 (para pSYN-VWF-029) como molde, usando un ciclo de ampliación por PCR de 3 etapas: 94 °C 2 minutos; 21 ciclos de (96 °C -30 segundos, 55 °C -30 segundos, 68 °C -4 minutos). La banda del tamaño esperado (~3800bp) se purificó en gel con un kit de Extracción de Gel (Qiagen, Valencia, Calif.) y se clonó en los sitios de restricción Nheland Sal1 del vector pLIVE-Mirus (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) para generar pSYN-VWF 025 y 029.
(d) Clonación de pSYN-VWF-031
pSYN-VWF-031 es un constructo D1 D2D'D3(C336A/C379A) -Fc que tiene un enlazador escindible de trombina de 48 aminoácidos de longitud (8x GGGGS (SeQ ID NO 94) sitio de trombina) entre las secuencias de VWF D1D2D'D3(C336A/C379A) y Fc. Para preparar este constructo, se amplió la región VWF-Fc del constructo pSYN-FVIII-064 (referencia al constructo FVIII-vWf que sigue). Se digirió pSYN-FVIII-VWF con Xba1 y Nhe1. La región de inserción resultante de 4165bp, que contenía el fragmento de VWF y la región Fc se usó como molde para ampliar el VWF y la región Fc por combinaciones de cebadores LW 22/LW23.
LW 22-FWD-VWF-D'D3 con secuencia de señalización de FVIII y sitio BsiW1 GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTT GCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO: 95)
LW 23-Rev- Fc con codón finalizador y sitio Not1 TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC (SEQ ID NO: 96)
El producto de PCR obtenido de la ampliación LW22/LW23 (~2300bp) se clonó en pSYN-VWF-002 digerido con BsiW1/Not1 para obtener el intermedio pSYN-VWF-014. pSYN-VWF-014 contiene el péptido de señalización de FVIII-enlazador escindible de trombina D'D3- de 20 aminoácidos seguido por la región Fc.
Para generar el constructo D1 D2D'D3-Fc, la región D1 D2D'D3 se amplió de pSYN-VWF-013 usando la combinación de cebadores LW24/LW27 por el método de PCR estándar.
Clonación de LW24- Fwd- VWF D1D2D'D3 oligo con el sitio BsiW1 GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG (SEQ ID NO: 97)
LW27-Rev-VWF D'D3 oligo con EcoRV CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID NO: 98)
El producto de PCR obtenido de la ampliación LW22/LW23 (~3750bp) se clonó en pSYN-VWF-014 digerido con BsiW1/EcoRV para obtener el intermedio pSYN-VWF-015. La longitud del enlazador entre el fragmento de VWF y la región Fc se cambió para obtener pSYN-VWF-031.
Secuencia de proteínas VWF-D1 D2D'D31 (SEQ ID NO: 99)
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE
KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD
SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS
CESIGDCACF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY
ECEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC
VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP'
VWF-D'D3 protein sequence 2 (SEQ ID NO: 100)
1 SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG
CVSGCLCPPG
51 MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD
RKWNCTDHVC
101 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG
TFRILVGNKG
151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF
EVVESGRYII
201 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ
NNDLTSSNLQ
251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ
TMVDSSCRIL
301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCACFCDT
IAAYAHVCAQ
351 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYECE WRYNSCAPAC
QVTCQHPEPL
401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG
RRFASGKKVT
451 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEP
Ejemplo 2: Efectos de la fusión de D'D3 y XTEN en la extensión de la semivida de FVIII
Para evaluar la extensión de la semivida de D'D3 FVIII potencial en la proteína de fusión rFVIII-XTEN, se introdujo un dímero de VWF D'D3 en ratones FVIII-VWF DKO por inyección hidrodinámica de su correspondiente constructo de ADN VWF-025 (Ejemplo 1). Después de que D'D3 alcanzó una expresión de estado estable (día 5 post inyección), se administró una sola dosis de rFVIII-XTEN por inyección IV en una dosis de 200 IU/kg. Se obtuvieron muestras de sangre hasta 120 horas post administración de rFVIII-XTEN. La actividad del FVIII en el plasma se analizó con un ensayo cromogénico de FVIII. El nivel de expresión de D'D3 se midió por VWF ELISA y se analizó el perfil de PK rFVIIIFc usando el programa WinNonlin.
Los resultados del estudio se exponen en la Figura 2, y el parámetro de PK de rFVIII-XTEN con/sin D'D3 en la circulación se enumera en la Tabla 16. El dímero D'D3 también extiende rFIII-XTEN t1/2 de 3,4h a 17,8h, un incremento de 5 veces. Además de la semivida, también se observó un incremento de 5 veces en MRT, un incremento de 3,6 veces en AUC y una reducción de 3,8 veces en el aclaramiento.
Observamos un efecto sinérgico del fragmento D'D3 y la tecnología de XTEN, y se evaluará una serie de constructos FVIII/VWF/XTEN por su potencial de extensión de la semivida de FVIII en animales hemofílicos.
Tabla 16: Parámetro de PK de rFVIII-XTEN con/sin D'D3 en la circulación sanguínea
Figure imgf000100_0001
Purificación de proteínas de FVIII-XTEN
Se insertó AE288 XTEN en el término C de BDD-FVIII para este estudio. Para purificar esta proteína, se usó una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF) primero para intercambiar tampones en el medio acondicionado. Los productos del filtrado luego se capturaron usando cromatografía de intercambio aniónico fuerte, y además luego se purificaron usando cromatografía de afinidad. La pureza de la molécula fue aceptable por HPLC-SEC y se confirmó además por inmunotransferencia western. La actividad específica de la molécula fue comparable a FVIII con eliminación del dominio B, según lo medido por ensayo aPTT y ELISA.
Ensayo cromogénico de FVIII
La actividad de FVIII se midió usando el kit de FVIII COATEST SP de DiaPharma (lote# N089019), y todas las incubaciones se llevaron a cabo en un calentador de placas a 37°C con agitación.
El intervalo del estándar de rFVIII fue de 100 mIU/ml a 0,78 mIU/ml. Se añadieron una mezcla de control de ensayo de plasma humano normal y muestras de plasma (diluidas con tampón Coatest IX) a placas de 96 pocillos Immulon 2HB por duplicado (25 gl/pocillo). Se añadieron en secuencia mezcla recién preparada de IXa/FX/Fosfolípido (50 gl), 25 gl de CaCl2 25mM y 50 gl de sustrato FXa a cada pocillo con 5 minutos de incubación entre cada adición. Después de incubar con el sustrato, se añadieron 25 gl de ácido acético al 20% para terminar la reacción de color, y se midió la absorbancia de OD405 con un instrumento SpectraMAX plus (Molecular Devices). Los datos se analizaron con el software SoftMax Pro (versión 5.2). El nivel más bajo de cuantificación (LLOQ) es 7,8 mIU/ml. VWF ELISA:
Se utilizó anticuerpo de VWF antihumano de cabra (Affinity purified, affinity biological, GAVWF-AP) como el anticuerpo de captura a 0,5 ug/pocillo y VWF-EIA-D (Affinity Biologicals, VWF-EIA-D, dilución 1:100) como el anticuerpo de detección para el ELISA de VWF. Se efectuó el ensayo ELISA siguiendo el procedimiento ELISA estándar, se usó TMB como sustrato de HRP, PBST/1,5% BSA/tampón NaCl 0,5M como tampón de bloqueo y unión. El intervalo estándar del ensayo es 100 ng a 0,78 ng, y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) del ensayo es 7,8 ng/ml.
Ejemplo 3: Construcción de plásmidos de XTEN que contiene constructos de FVIII/VWF
(a) Clonación de pSYN-FVII I-161 (Figura 3)
El plásmido de FVIII-161 comprende un andamio de Fc de cadena sencilla (scFc) con sitios de escisión enzimática que se procesan durante la síntesis en una célula. El constructo tiene un dominio de unión FVIII de VWF de longitud total (D'D3).
Se diseñó plásmido (pSYN-FVIII-161) para el heterodímero de FVIII-Fc y VWF-Fc de expresión, en donde los dominios D'D3 se unen a FVIII y previenen la interacción de FVIII con fosfolípidos y proteína C activada. La proteína de pSYN-FVII I-161 se expresa en la célula como un solo polipéptido en donde el término C de la subunidad FVIII-Fc se enlaza al término N de la subunidad VWF D'D3-Fc mediante un enlazador de polipéptidos 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 64). Además, se insertaron secuencias de RRRRS (SEQ ID NO: 11) y RKRRKR (SEQ ID NO: 10) en el extremo 5' y 3' del enlazador de polipéptidos, respectivamente, para escisión intracelular por proteína convertasas siguiendo el último Arg en cada secuencia. En consecuencia, las células pueden expresar un heterodímero FVIII-Fc/D'D3-Fc de doble cadena en donde la cadena de FVIII-Fc posee una secuencia RRRRS (SEQ ID NO: 11) en el término C, pero el resto de la secuencia del enlazador se ha eliminado. Un fragmento de AE288 XTEN inmediatamente seguido por el polipéptido IS{5X(GGGGS)}LVPRGSGG (SEQ ID NO: 122) (contiene el sitio de escisión de trombina) se introduce entre los dominios de VWF y la región Fc para facilitar la liberación del fragmento de VWF de FVIII una vez que la proteína heterodimérica FVIII-VWF es activada por trombina, permitiendo la interacción de FVIII con otros factores de coagulación.
Secuencia de proteínas pSYN-FVIII-161 (SEQ ID NO: 101). (Secuencia de FVIII, posición de aminoácidos 1-1457; la región subrayada representa la región Fc; el subrayado curvo representa el enlazador escindible entre la primera región Fc y el fragmento de VWF; la región de subrayado doble representa el fragmento de VWF; la región en negrita representa el enlazador escindible entre el fragmento de VWF y Fc.
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL
GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR
EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG
LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD
AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL
EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME
AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI
RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR
KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR
PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP
TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR
NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV
FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF
PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED
SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD
DTISVEMKKE
801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP
HVLRNRAQSG
851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA
EVEDNIMVTF
901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY
FWKVQHHMAP
951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFREN YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
.01 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
.51 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
.01 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
.51 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG
01 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC
51 TKTGONYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRCVALERCP CFHOGKEYAP
01 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE
51 COYVLVODYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD
>01 GEVNVKRPMK DETHFEVVES GRYIILLLGK ALSVVWDRHL SISVVLKOTY
>51 OEKVCGLCGN FDGIONNDLT SSNLOVEEDP VDFGNSWKVS SOCADTRKVP
01 LDSSPATCHN NIMKOTMVDS SCRILTSDVF ODCNKLVDPE PYLDVCIYDT
51 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAOHGKVV TWRTATLCPO SCEERNLREN
01 GYEAEWRYNS CAPACOVTCO HPEPLACPVO CVEGCHAHCP PGKILDELLO
51 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCOICHCD VVNLTCEACO
2201 EPISGTSESA TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP
GSEPATSGSE
2251 TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT
SESATPESGP
2301 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA
GSPTSTEEGT
2351 STEPSEGSAP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGTSESA
TPESGPGSEP
2401 ATSGSETPGS EPATSGSETP GSPAGSPTST EEGTSTEPSE
GSAPGTSTEP
2451 SEGSAPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GTSTEPSEGS
APDSGGGGSG
2501 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSL VPRGSGGDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF
2551 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE
VHNAKTKPRE
2601 EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE
KTISKAKGQP
2651 REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES
NGQPENNYKT
2701 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH
NHYTQKSLSL
2751 SPGK
(b) Clonación de _pSYN-FVIII-168, 175, 172 y 174 (Figura 4A-4D)
pSYN-FVIII-168, 172, 174 y 175 son derivados de pSYN-FVIII-161. Se introdujeron mutaciones de R1645A/R1648A en pSYN-FVIII-161 para formar pSYN-FVIII-168, lo que produce una isoforma SC-FVIII, y se condensó directamente un AE288 XTEN al término C de FVIII-HC para mayor extensión de la semivida. Para el constructo pSYN-FVIII-175, se eliminó la secuencia del codón D'D3 de pSYN-FVIII-168 para evaluación del efecto de Fc y tecnología de XTEN sobre la extensión de la semivida del FVIII.
Para el constructo pSYN-FVIII-172, el fragmento de AE288 XTEN se condensó directamente al término C de FVIII-HC para mayor extensión de la semivida, y la secuencia del codón D'D3 se eliminó de pSYN-FVIII-172 para formar pSYN-FVIII-174 para evaluación del efecto de Fc y tecnología de XTEN sobre la extensión de la semivida del FVIII.
(c) Clonación de pSYN-FVIII-170 (Figura 4E)
Se construyó pSYN-FVIII-170 para evaluar el efecto de XTEN y del fragmento de D'D3 sobre la extensión de la semivida del FVIII. El fragmento de VWF-D1D2D'D3 de la secuencia codificante y BDD-FVIII se introdujeron en el extremo 5' y 3' del cassette de expresión, una secuencia del codón AE288 XTEN que se usó seguida de un enlazador escindible de trombina de 35 aa para conectar la molécula de FVIII y VWF. Después del procesamiento intracelular, la proteína segregada comprende un polipéptido que contiene el fragmento de D'D3 de la molécula de VWF madura que está enlazada al término N de BDD-FVIII maduro por un enlazador escindible de trombina AE288 XTEN/35 aa.
Secuencia de la proteína pSYN-FVIII-170 (SEQ ID NO: 102)
1 SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG
1 MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC
1 DATCSTIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG
1 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EVVESGRYII
1 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ
1 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL
1 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCAAFCDT IAAYAHVCAQ
1 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYEAE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL
1 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT
1 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEPISG TSESATPESG PGSEPATSGS
1 ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA
1 PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
1 SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS
1 ESATPESGPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG
1 SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT
1 PESGPGTSTE PSEGSAPDSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSLVPRGS
1 GGASATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV DARFPPRVPK SFPFNTSVVY
1 KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI QAEVYDTVVI TLKNMASHPV
1 SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD KVFPGGSHTY VWQVLKENGP
1 MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL LVCREGSLAK EKTQTLHKFI
1001 LLFAVFDEGK SWHSETKNSL MQDRDAASAR AWPKMHTVNG
YVNRSLPGLI
1051 GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF LVRNHRQASL
EISPITFLTA
1101 QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV DSCPEEPQLR
MKNNEEAEDY
1151 DDDLTDSEMD VVRFDDDNSP SFIQIRSVAK KHPKTWVHYI
AAEEEDWDYA
1201 PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV RFMAYTDETF
KTREAIQHES
1251 GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY PHGITDVRPL
YSRRLPKGVK
1301 HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP RCLTRYYSSF
VNMERDLASG
1351 LIGPLLICYK ESVDQRGNQI MSDKRNVILF SVFDENRSWY
LTENIQRFLP
1401 NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ LSVCLHEVAY
WYILSIGAQT
1451 DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE TVFMSMENPG
LWILGCHNSD
1501 FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI SAYLLSKNNA
IEPRSFSQNP
15 51 PVLKRHQREI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY
DEDENQSPRS
1601 FQKKTRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF
KKVVFQEFTD
1651 GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS
RPYSFYSSLI
1701 SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF
DCKAWAYFSD
1751 VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF
TIFDETKSWY
1801 FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP
GLVMAQDQRI
1851 RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP
GVFETVEMLP
1901 SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG
HIRDFQITAS
1951 GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI
IHGIKTQGAR
2001 QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV
DSSGIKHNIF
2051 NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM
ESKAISDAQI
2101 TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL
QVDFQKTMKV
2151 TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV
KVFQGNQDSF
2201 TPVVNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LY
Ejemplo 4: Inyección hidrodinámica de XTEN que contiene los constructos FVIIIF/VWF en ratones deficientes de FVIII y VWF
Los constructos de ADN que contienen XTEN en las Figuras 3 y 4 combinaron entre sí 2-3 elementos de extensión de la semivida. Para evaluar su potencial de extensión de la semivida del FVIII, se introdujo un grupo selectivo de constructos de ADN en la figura 3 y en la figura 4 en ratones con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF por inyección hidrodinámica (HDI) en una dosis de 100 ug/ratón. Se obtuvieron luego muestras de sangre por extracción retro orbital 24 horas post HDI. La actividad del FVIII en el plasma post HDI se analizó con un ensayo cromogénico de FVIII, y los resultados se exponen en la Tabla 17 y en la Figura 5. En comparación con BDD-FVIII de tipo salvaje, todos los constructos de ADN que contienen XTEN producen una actividad en el plasma de FVIII significativamente mayor 24 horas post HDI, lo que indica que las correspondientes moléculas tuvieron una semivida de la proteína circulante significativamente más prolongada que BDD-FVIII. La aplicación de la combinación de aquellos elementos que extienden la semivida se evaluó adicionalmente en animales hemofílicos.
Tabla 17: Actividad en plasma del FVIII 24 horas post HDI en ratones FVIII/VWF DKO
Figure imgf000106_0001
Inyección hidrodinámica:
La inyección hidrodinámica es un método de administración de genes no víricos eficiente y seguro para el hígado en pequeños animales, como en ratones y ratas. Se describió originalmente como una inyección rápida de un ADN plasmídico desnudo/disolución salina libre de endotoxina en una décima del volumen del peso corporal del animal en aproximadamente 5-7 segundos. El ADN plasmídico desnudo contiene el gen de interés y el hígado producido en una décima del volumen del peso corporal del animal. La proteína dirigida se produce en el hígado a partir del ADN inyectado y se puede detectar dentro de las 24 horas de la inyección. Se obtienen luego muestras de plasma para estudiar la propiedad terapéutica de la proteína expresada.
Para todas las inyecciones hidrodinámicas que se aplicaron en el presente documento, se administraron 2 ml de ADN plasmídico en disolución salina estéril al 0,9% mediante inyección intravenosa en la vena del rabo dentro de aproximadamente 4-7 segundos a ratones que pesaban 20-35 gramos. Los ratones fueron vigilados de cerca durante las primeras dos horas hasta retomar la actividad normal. Después de obtener las muestras de sangre por recolección de sangre retro orbital, las muestras se conservaron a -80 °C para posterior análisis.
Ejemplo 5: Construcción de plásmidos del sistema de co-transfección para el heterodímero de FVIIIFc-VWF que contiene inserciones de XTEN (Figura 6)
Para aumentar el rendimiento de la producción de proteínas, se generaron dos sistemas de co-transfección para la producción de proteínas, que contienen tres constructos de ADN. El primer constructo de ADN codificó una proteína de fusión FVIII-Fc en donde el fragmento AE288 XTEN se condensó directamente al término C de la cadena pesada de FVIII y le siguió un fragmento de cadena ligera de FVIII de tipo salvaje (pSYN-FVIII-173, Figura 6B) o un fragmento de cadena ligera de FVIII con mutaciones R1645A/R1648A (pSYN-FVIII-169, Figura 6A), la cadena ligera de FVIII se condensó luego directamente a un solo fragmento de Fc. El segundo constructo de ADN es pSYN-VWF-031 que codifica una proteína de fusión D'D3-Fc (Ejemplo 1). Se transfectaron células HEK293F con los dos plásmidos junto con un tercer plásmido (PC5) en una relación 80:15:5. Las proteínas sintetizadas se secregaron como el heterodímero FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc y el dímero D'D3Fc, y el heterodímero FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc se separó del dímero D'D3Fc por purificación de la proteína.
Secuencia de la proteína madura pSYN-FVIII-169 (SEQ ID NO: 103):
1 ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL
1 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA
1 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD
1 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA
1 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR
1 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL
1 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL
1 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL
1 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG
1 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD
501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP
551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG
601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS
651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR
701 GMTALLKVS S CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT
751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE
801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT
851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE
901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE
951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP
1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQAEI
1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI
1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD GSFTQPLYRG
1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA
1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG
1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR
1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI RWYLLSMGSN
1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC
1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL
1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR QKFSSLYISQ
1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR
1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF
1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS
1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPVVNSLDPP
1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP
1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
1951 KSLSLSPGK
Secuenciación de la proteína madura pSYN-FVIII-173 (SEQ ID NO: 104):
1 ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL
51 FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA
101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD
151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA
201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR
251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL
301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL
351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL
401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG
451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD
501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP
551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG
601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS
651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR
701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT
751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE
801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT
851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE
901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE
951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP
1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP
PVLKRHQREI
1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS
FQKKTRHYFI
1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD
GSFTQPLYRG
1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI
SYEEDQRQGA
1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD
VDLEKDVHSG
1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY
FTENMERNCR
1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRI
RWYLLSMGSN
1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP
SKAGIWRVEC
1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS
GQYGQWAPKL
1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMI IHGIKTQGAR
QKFSSLYISQ
1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF
NPPIIARYIR
1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI
TASSYFTNMF
1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV
TGVTTQGVKS
1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF
TPVVNSLDPP
1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP
CPAPELLGGP
1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY
VDGVEVHNAK
1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL
PAPIEKTISK
1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
VEWESNGQPE
1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
HEALHNHYTQ
1951 KSLSLSPGK
Ejemplo 6. Purificación de proteínas para FVIII-169/VWF-031 y FVIII-173/VWF-031
Se empleó una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF) para intercambio de tampones del medio acondicionado aclarado. El heterodímero FVIII-169/vWf-031 o FVIII-173/VWF-031 se purificó luego usando un procedimiento cromatográfico de dos etapas. Se utilizó una resina de intercambio aniónico débil, seguida de cromatografía de afinidad. El producto purificado final tuvo pureza aceptable según SEC-HPLC. La actividad específica fue compatible con el FVIII de dominio B eliminado, según lo medido por el ensayo cromatográfico del fViII y concentración de A280. La pureza y la presencia de cada resto de esta molécula se confirmaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia western.
Ejemplo 7. Evaluación de la capacidad de unión a VWF de FVIII-169/VWF-031 por el ensayo Octet
La capacidad de unión a VWF de FVIII-169/VWF-031 se obtuvo por mediciones basadas en interferometría de biocapas (BLI) (ensayo Octet) a 25 °C con un instrumento ForteBio Octet 384 que usa tampón de unión Tris (Tris 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, CaCl25 mM). El ensayo Octet para determinar la unión de FVIII se basó en la inmovilización hidrófoba del factor de von Willebrand humano (Haematologic Technologies Catálogo núm. HCVWF-0191) en el APS Biosensor, luego le siguió la unión de albúmina de suero bovino 1,0% (Jackson ImmunoResearch Catálogo núm. 001-000-161). En síntesis, se diluyó hvWF (20 pg/ml) en tampón Tris y se cargó a APS Biosensors durante 600 seg, produciendo aproximadamente 3,0 - 3,5 nm de unión en las sondas de reacción. Se cargaron sondas APS control con BSA al 1,0% en ausencia de hvWF para sustracción de referencia. Después de cargar, todas las sondas se incubaron en tampón Tris durante 300 seg para establecer una nueva situación inicial. Posteriormente, las sondas del biosensor se incubaron en disoluciones de FVIII-XTEN 169 o la sustancia del fármaco FVIIIFc (0, 0,6, 2, 6, 20, 60, 200, 600 IU/ml) durante 5 min a temperatura ambiente, seguida de una etapa de disociación de 5 min. Usando el software de análisis de datos Octet, se derivó la respuesta de la unión (nm) de los datos sustraídos (sonda de reacción menos sonda de referencia). No se detectó unión al VWF inmovilizado para FVIII-169/VWF-031 (Figura 7), lo que indica una protección completa del FVIII de la molécula de VWF de longitud total por el fragmento de D'D3.
Ejemplo 8. FVIII-169/VWF-031 PK en ratones HemA y FVIII/VWF DKO
El perfil de PK de FVIII-169/VWF-031 se ensayó en ratones HemA y FVIII/VWF DKO para evaluar la capacidad del fragmento de D’D3 de proteger el resto FVIII del VWF endógeno. Se trataron ratones HemA o FVIII/VWF DKO con una sola dosis intravenosa de FVIII-169/VWF-031 a 200 IU/kg, luego se obtuvieron muestras de plasma 5 min, 8 h, 24 h, 48 h y 72 horas post administración. La actividad del FVIII en la muestra de plasma se ensayó con un ensayo cromogénico de FVIII, y se calculó la semivida de FVIII-169/VWF-031 usando el programa WinNonlin.
La inhibición completa de la unión de los constructos a VWF inmovilizado se demostró por interferometría de biocapas (Figura 7) para FVIII-169/VWF-031. Esto indica que el fragmento de D’D3 en la molécula había bloqueado exitosamente la unión de FVIII a moléculas de VWF nativas, por lo tanto se pronosticó una semivida similar de FVIII-169/VWF-031 en las dos cepas de ratón diferentes. Como se muestra en la Figura 8A y en la Tabla 18, según lo esperado, FVIII-169/VWF-031 tuvo un perfil de PK similar tanto en ratones HemA como DKO FVIII/VWF, lo que ha demostrado que la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF es independiente de la semivida del VWF endógeno. La separación de la semivida del heterodímero FVIIIFc/VWF de la semivida del VWF endógeno, eliminó el techo de extensión del FVIII y abrió la posibilidad de una mayor extensión de la semivida de FVIII más allá del doble del límite de la semivida impuesto por el VWF endógeno.
Tabla 18: FVIII-169/VWF-031 PK en ratones HemA y FVIII/VWF DKO
Figure imgf000111_0001
La capacidad protectora del FVIII por inserción de XTEN y el fragmento de D'D3 se evaluó comparando la semivida de FVIII-169/VWF-031 con FVIII-169/Fc y FVIIIFc en ratones FVIII/VWF DKO. Después de una sola administración de IV, se tomaron muestras de sangre a 5 min, 8 h, 24 h, 48 h y 72 h para FVIII-169/VWF-031, a 5 min, 8 h, 24 h, 32 h, 48 h para FVIII-169/Fc y a 5 min, 1, 2, 4, 6 y 8 horas para FVIIIFc. La actividad del FVIII en la muestra de plasma se ensayó con el ensayo cromogénico de FVIII, y se calculó la semivida de FVIII-155/VWF-031 usando el programa WinNonlin.
Los resultados del estudio se resumieron en la Figura 8B y en la Tabla 19, rFVIIIFc tiene una semivida de 1,6 h en ratones DKO debido a la pérdida de protección de VWF. Cuando se introdujo una inserción de XTEN en la molécula de FVIIIFc, la molécula de FVIII-169/Fc resultante tuvo una semivida de 7 horas, una extensión de la semivida de 4 veces por la inserción de XTEN. Finalmente, cuando se incorporó el fragmento de D'D3 en la molécula para formar FVIII-169/VWF-031, se observó una semivida de 17 horas, otro incremento de 2,5 veces por el fragmento de D'D3. Además de la mejora en la semivida, también se observaron mejoras en el tiempo de residencia medio (MRT), aclaramiento (Cl) y AUC, como se expone en la Tabla 19.
FVIII-169/VWF-031 alcanzó 17-18 h t1/2 tanto en ratones HemA como FVIII/VWF DKO, que es el límite máximo de la extensión de t1/2 impuesto por el aclaramiento del VWF. Más elementos de extensión de t1/2 se pueden incorporar a esta molécula, tal como una segunda inserción de XTEN dentro del FVIII. El efecto sinérgico del fragmento de D'D3 y las inserciones de XTEN proporcionaron la posibilidad de protección completa para FVIII contra su vía de aclaramiento, un avance final del doble del límite de extensión de t1/2 del FVIII podría alcanzarse con las variantes FVIIIFc/XTEN/VWF.
Tabla 19. FVIII-169/VWF-031 PK en ratones FVIII/VWF DKO
Figure imgf000112_0001
Ejemplo 9: PK del concentrado del medio celular de las variantes FVIII-XTEN en ratones FVIII/VWF DKO que expresan D'D3
Se evaluó la capacidad del fragmento de D'D3 de extender la t 1/2 de FVII-XTEN en el modelo de ratón FVIII/VWF DKO que expresa D'D3 (descrito en el ejemplo 2). En este estudio, en lugar de usar VWF-025 para introducir el dímero de D'D3 en la circulación, se usó el constructo de VWF-029 para introducir el monómero de D'D3 en la circulación. Para preparar proteína de variantes FVIII-XTEN, se preparó un medio de cultivo de transfección transitoria a escala pequeña (50-100 ml), el día 4 post transfección, el cultivo celular se cosechó y se concentró hasta alcanzar 10-20 IU/ml de intervalo de actividad de FVIII, que es adecuado para el estudio de PK. El medio celular concentrado se usó luego para el estudio de PK estándar en ratones FVIII/VWF DKO con o sin D'D3 en la circulación.
Se ensayó un total de 6 variantes FVIII-XTEN que contiene 1-3 inserciones de XTEN en el sistema, sus t1/2 se resumen en la Tabla 20 y los datos de variantes representativas se grafican en la Figura 9A.
Se observó una semivida más prolongada para todas las variantes de FVIII-XTEN con el fragmento de D'D3 en la circulación (Tabla 20), lo que demostró la protección de D'D3 para FVIII-XTEN contra sus vías de aclaramiento. Asimismo, en comparación con su semivida de 14 horas en ratones HemA, el LSD0055.021 que tiene una t1/2 de 20,4 horas en ratones DKO que expresan D'D3 (Figura 9B, Tabla 20), indica un avance final del doble en el techo de extensión de la semivida para moléculas FVIII. Modificando incluso más la molécula de FVIII(XTEN)/VWF, podríamos potencialmente lograr una FVIII t1/2 incluso más larga y proporcionar a pacientes HemA una proteína FVIII que requiera solamente un esquema de dosis de una vez por semana o menos frecuente.
Tabla 20. FVIII-XTEN t1/2 en ratones FVIII/VWF DKO que expresan D'D3
Figure imgf000112_0002
*B indica que una secuencia de XTEN (p. ej., 144) se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo de aminoácidos 745 correspondiente a la secuencia de FVIII maduro.
Ejemplo 10: Estabilidad de variantes de FVIII que contienen VWF y XTEN en plasma de ratones con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF
Se ensayó la estabilidad en plasma de variantes de proteína rFVIIIFc en el plasma de ratones con doble inactivación (DKO) de FVIII/VWF. Para el ensayo de estabilidad, se co-transfectaron células HEK293 con plásmidos que dirigen la expresión de rFVIIIFc o FVIII-169 (rFVIIIFc con 288 AE XTEN insertados en la unión del dominio B) y plásmidos que dirigen la expresión o bien de IgG-Fc o VWF-031 (región VWF D'D3 condensada a IgG-Fc). El día cuatro posttransfección, se cosechó el medio de cultivo y se concentró hasta 30 IU/ml en base a la actividad cromogénica del FVIII. El medio de cultivo celular concentrado se añadió luego a plasma de ratones DKO para producir una actividad del FVIII de 5 IU/ml y se incubó a 37°C. Se recogieron alícuotas en diferentes puntos de tiempo para medición de la actividad con el ensayo cromogénico. Se midió la actividad en cada punto de tiempo por duplicado, y la actividad promedio se graficó en función del tiempo. La actividad de FVIIIFc, una molécula de FVIII de cadena dual (dc) en donde las cadenas pesada y ligera se mantienen juntas mediante interacción no covalente, disminuye con el tiempo en el plasma de ratones DKO (Figura 10). La actividad de FVIII-169:Fc, que contiene una inserción 288 AE XTEN en la unión del dominio B, decae a una velocidad reducida en relación con rFVIIIFc, lo que indica una mejor estabilidad conferida por la inserción de XTEN. Dado que VWF se ha propuesto para potenciar la estabilidad de FVIII in vivo, evaluamos la estabilidad en el plasma de FVIII-169:VWF-031. Esta molécula heterodimérica, en donde el elemento FVIII y el elemento VWF D'D3 se condensan a los respectivos hemi-dominios de Fc, exhibió estabilidad en el plasma adicional en relación a FVIII-169:Fc, lo que indica que el dominio VWF D'D3 y XTEN tienen un efecto sinérgico sobre la estabilidad en el plasma de rFVIIIFc.
Ejemplo 11: Efecto sobre la semivida de FVIII de la fusión de Fc, la inserción de XTEN y el fragmento D'D3 de VWF.
Para evaluar el efecto de la fusión de Fc, la inserción de XTEN y el fragmento D'D3 de VWF sobre la semivida de FVIII, se evaluaron las propiedades de farmacocinética de FVIII recombinante con eliminación del dominio B (rBDD-FVIII), rFVIIIFc, FVIII-169:Fc y FVIII-169:VWF-031 en ratones con doble inactivación )DKO) de FVIII/VWF.
Se trataron ratones DKO con una sola administración intravenosa de 200 IU/kg de proteína FVIII, y se recogieron muestras de plasma en puntos de tiempo designados como se indica en la Figura 11. Se analizó la actividad de FVIII en las muestras de plasma con un ensayo cromogénico de FVIII y se calculó la semivida usando el programa WinNonlin-Phoenix. Los parámetros de farmacocinética de las moléculas ensayadas se enumeran en la Tabla 21. La curva de regresión de tiempo de la actividad de FVIII en el plasma para cada variante de FVIII se ilustra en la Figura 11.
BDD-FVIII sin modificar tuvo una semivida de 0,23 h en ratones DKO, la proteína de fusión FVIIIFc tuvo una semivida extendida de 1,66 h en ratones DKO debido al reciclaje de la proteína FVIIIFc mediante la interacción Fc:FcRn. Cuando se incorporó un residuo 288 del polipéptido AEXTEN en la región del dominio B de FVIII dentro de la molécula FVIIIFc, la semivida de la proteína FVII1169/Fc resultante se extendió también a 7,41 h en ratones DKO. Finalmente, con la adición del dominio D'D3 de VWF, la semivida del heterodímero FVIII 169/VWF031 alcanzó 17,9 h en ratones DKO (Figura 11, Tabla 21). Además de la semivida, todos los demás parámetros de PK también mejoraron proporcionalmente con la adición de cada elemento (Tabla 21). FVIII puede tolerar múltiples elementos de extensión de la semivida, y este efecto sinérgico de los tres elementos sobre la extensión de la semivida del FVIII permitió una mayor mejora de la semivida de los heterodímeros FVIII-XTEN VWF.
Tabla 21: Parámetros de PK de las variantes de FVIII
Figure imgf000113_0001
*B indica que una secuencia de XTEN (p. ej., 144) se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo de aminoácidos 745 correspondiente a la secuencia de FVIII maduro.
Ejemplo 12: Propiedades de farmacocinética de diferentes heterodímeros de FVIII-XTEN_VWF
Para evaluar el efecto combinado del fragmento de VWF-D'D3 y las inserciones de XTEN sobre la semivida de FVIII, las propiedades de farmacocinética de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc se ensayaron en ratones HemA y se compararon con aquellas de la isoforma de cadena sencilla de BDD-FVIII (scBDD-FVIII) y FVIII-169:VWF-031 (ejemplo 10). Se generaron siete nuevos constructos de FVIII-XTEN-Fc (las secuencias de proteínas se enumeraron en la Tabla 24). Los diagramas esquemáticos de esos constructos se muestran en la Figura 14A-H. FVIII-195 y FVIII-199, respectivamente, son las isoformas de FVIII de cadena dual y cadena sencilla que cada una contiene dos inserciones de XTEN en las posiciones 1900 y 1656. FVIII-196 y FVIII-201, respectivamente, son las isoformas de FVIII de cadena dual y cadena sencilla que cada una contiene tres inserciones de XTEN en las posiciones 26, 1656 y 1900. FVIII-203, -204 y -205 son moléculas de sc-FVII I Fc con dos inserciones de XTEN en la unión del dominio B y en las posiciones 1900, 403 o 18, respectivamente. Cada constructo de FVIII-XTEN-Fc se co-expresó con VWF-031 en células HEK293 para producir proteínas heterodiméricas de FVIII-XTEN-Fc/VWF. El día cuatro posttransfección, se cosechó el medio de cultivo y o bien se concentró hasta 20 IU/ml en base a la actividad cromogénica de FVIII (FVIII-195:VWF-031, FVIII-196:VWF-031, FVIII-199:VWF-031, FVIII-203:VWF-031 y FVIII-204:VWF-031) o se purificó (scBDD-FVIII, FVIII-169:VWF-031, FVIII-201:VWF-031 y FVIII-205:VWF-031). Habiendo demostrado la protección completa intra-molecular de la molécula de FVIII del VWF endógeno por el fragmento D'D3 en el heterodímero FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc (FVIII-169:VWF-031, Ejemplo 5), se escogieron ratones HemA para las evaluaciones de PK. El medio de cultivo celular concentrado o con proteína purificada se administró a ratones HemA de 8-12 semanas de vida por administración intravenosa en una dosis de 200 IU/10 ml/kg. Se recogieron muestras de plasma 5 min, 8 h, 16 h, 24 h, 32 h, 48 h, 72 h y 96 h post-administración. Se analizó la actividad del FVIII en las muestras de plasma por ensayo cromogénico de FVIII y se calculó la semivida usando el programa WinNonlin-Phoenix. Los parámetros de farmacocinética de las moléculas ensayadas se enumeran en la Tabla 22. Las actividades de FVIII en el plasma en puntos de tiempo seleccionados para las variantes de FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc se ilustran en las Figuras 12A-C.
Cuando se insertó XTEN en las posiciones 1900 y 1656 (FVIII-195, FVIII-199), se observó una mejora moderada de la semivida para la isoforma scFVIII (FVIII-199:VWF-031) en comparación con FVIII-169:VWF-031. No obstante, la isoforma dcFVIII exhibió una semivida más corta que FVIII-169:VWF-031, lo que indica que la isoforma de cadena sencilla podría ser significativamente más estable que la correspondiente isoforma de doble cadena (Tabla 22 y Figura 12A). Cuando se incorporó una tercera inserción de XTEN en FVIII-199 en la posición 26, la mejora de la semivida de la molécula resultante FVIII-201 :VWF-031 había alcanzado 24,6 h, lo que representa una mejora de la semivida de más del triple en relación con scBDD-FVIII (Tabla 22 y Figura 12C). También se ensayó el efecto de extensión de la semivida de la segunda inserción de XTEN en la posición 403 (dominio A2), 1900 (dominio A3) y 18 (dominio A1) cada uno en combinación con la inserción de XTEN en el dominio B. Si bien la adición de la inserción de A2 o A3 XTEN no confirió un beneficio de semivida adicional (Tabla 22, Figura 12b), la adición de la inserción A1 extendió más la semivida del heterodímero FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc a 29,4 h (Tabla 22, Figura 12C), que es más de tres veces más prolongada que aquella de scBDD-FVIII.
Cuando se incorporaron XTEN en el constructo del heterodímero FVIIIFc/VWF, el grado de mejora de la semivida de las moléculas resultantes fue variable, y no hubo correlación obvia entre las semividas y o bien el sitio o número de inserción de XTEN, lo que sugiere que la semivida del heterodímero FVIII-XTEN-Fc/VWF es determinada por la integridad de toda la molécula en lugar del número o reemplazo de inserciones de XTEN.
Las semividas de 24,6 h y 29,4 h observadas para los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc claramente excedieron la limitación de 1,6 a 2 veces en la extensión de la semivida de FVIII. Si este hallazgo se traduce a pacientes HemA, permitirá una administración de una vez por semana o menos frecuente para profilaxis de FVIII.
Tabla 22: parámetros de PK de heterodímeros FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc
Figure imgf000114_0001
*B indica que una secuencia de XTEN (p. ej., 144) se inserta inmediatamente en dirección 3’ del residuo de aminoácidos 745 correspondiente a la secuencia de FVIII maduro.
Además de incorporar XTEN en la molécula de FVIII, también evaluamos el beneficio de extensión potencial de la semivida por incorporar XTEN como un enlazador entre el fragmento D'D3 y Fc. FVIII-155 (scFVIIIFc) se co-expresó con VWF-034 (VWF-Fc con AE 288 XTEN más un enlazador escindible de trombina de 35 residuos) en células HEK293. El día 4 post-transfección, el medio de cultivo celular se cosechó y concentró hasta 20 IU/ml en base al ensayo de actividad de FVIII. Se administró a ratones FVIII/VWF DKO el medio de cultivo celular concentrado en una dosis de 200 IU/10 ml/kg con una sola inyección intravenosa. Se recogieron muestras de plasma 5 min, 8 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h post-administración. Se analizó la actividad del FVIII en las muestras de plasma con un ensayo cromogénico de FVIII, y se trazó la curva de regresión de la actividad de FVIII en plasma en función del tiempo (Figura 13). FVIII-155/VWF-034 exhibió cierta mejora en la semivida, al igual que FVIII-169/VWF-031, que tiene Ae 288 XTEN insertado en la unión del dominio B de FVIII, como se ilustra por las curvas de regresión superpuestas para las dos moléculas (Figura 13). La demostración de que la inserción de XTEN en el polipéptido VWF-Fc confiere una mejora de la semivida de una magnitud similar a aquella conferida por la inserción de XTEN en la unión del dominio B del polipéptido de FVIII sugiere que podría ser posible una mayor mejora de la semivida en una molécula heterodimérica en la que la inserción de XTEN intramolecular en el polipéptido de FVIII se combina con una inserción de XTEN inter-dominio entre los elementos VWF y Fc del polipéptido de VWF-Fc.
Ejemplo 13A: Propiedades de farmacocinética de heterodímeros FVIII-XTEN_VWF adicionales
Además de los heterodímeros FVIII-XTEN VWF que se enumeraron en la Tabla 22, los heterodímeros FVIII-XTEN VWF que contienen diferente composición de inserciones de XTEN, versión de FVIII de cadena sencilla y de cadena dual (Tabla 23A) o bien se ensayan o se ensayarán en HemA para sus propiedades de farmacocinética. Varios constructos de FVIII (Tabla 23B) y constructos de VWF (Tabla 23C) se describen también a continuación. Los ratones HemA se tratarán con una sola dosis de administración intravenosa de las proteínas de heterodímero a 200 IU/10 ml/kg. Las muestras de plasma se recogerán 5 min, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-administración. La actividad del FVIII en las muestras de plasma se analizará con un ensayo cromogénico de FVIII y la semivida se calculará usando el programa WinNonlin-Phoenix. Las secuencias de proteínas de los heterodímeros enumerados se expusieron en la Tabla 25.
Tabla 23A. Combinaciones de heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc plausibles para mejora de actividad y PK.
Figure imgf000115_0001
Tabla 23B. Constructos de FVIII:
Figure imgf000115_0002
Figure imgf000116_0001
Tabla 23C. Constructos de VWF:
Figure imgf000116_0002
Ejemplo 13B: Propiedades de farmacocinética de heterodímeros FVIII-XTEN_VWF adicionales.
Se ensayaron las propiedades de farmacocinética de heterodímeros FVIII-XTEN_VWF en ratones HemA. Los heterodímeros ensayados son FVNM69/VWF034, FVIII205/VWF034, FVIII205/VWF036 y FVIII266/VWF031. Los ratones HemA recibieron una sola dosis intravenosa de distintas proteínas de heterodímero a 200 IU/10 ml/kg. Se recogieron muestras de plasma 5 min, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-administración. La actividad del FVIII en las muestras de plasma se analizaron por ensayo cromogénico de FVIII, y se calcularon las semividas usando el programa WinNonlin-Phoenix. Los resultados de PK se exponen en la Tabla 24.
Tabla 24. FVIII-XTEN VWF adicional - PK en ratones HemA
Figure imgf000117_0001
Secuencia de nucleótidos pSYNFVIII 010 -( FVIIIFc de cadena dual) (SEQ ID NO: 125) 1 ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG
51 CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG
101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT
151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA
201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA
251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT
301 GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTCAGTCT
351 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG
401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT
451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC
501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG
551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA
601 GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAAT TTATACTACT
651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT
701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG
751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG
801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG
851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT
901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC
951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC
1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG
1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG ACTATGATGA
1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT
1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT
1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT
1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG
1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC
1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT
1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT
1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACA TCTACCCTCA CGGAATCACT
1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT
1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG
1601 TGACTGTAGA AGATGGGCCA ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC
1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT
1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC
1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG
1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC
1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC
1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG
1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT
2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG
2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG
2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG
2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA
2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG
2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACCCACCAGT
2301 CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATAACTCG TACTACTCTT CAGTCAGATC
2351 AAGAGGAAAT TGACTATGAT GATACCATAT CAGTTGAAAT GAAGAAGGAA
2401 GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA
2451 AAAGAAAACA CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATT
2501 ATGGGATGAG TAGCTCCCCA CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC
2551 AGTGTCCCTC AGTTCAAGAA AGTTGTTTTC CAGGAATTTA CTGATGGCTC
2601 CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT TTGGGACTCC
2651 TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAG ATAATATCAT GGTAACTTTC
2701 AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA
2751 TGAGGAAGAT CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGC
2801 CTAATGAAAC CAAAACTTAC TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC
2851 ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GCTTATTTCT CTGATGTTGA
2901 CCTGGAAAAA GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT CTGGTCTGCC
2951 ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA GACAAGTGAC AGTACAGGAA
3001 TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT GGTACTTCAC
3051 TGAAAATATG GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG
3101 ATCCCACTTT TAAAGAGAAT TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA
3151 ATGGATACAC TACCTGGCTT AGTAATGGCT CAGGATCAAA GGATTCGATG
3201 GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT ATTCATTTCA
3251 GTGGACATGT GTTCACTGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG
3301 TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA
3351 AGCTGGAATT TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG
3401 GGATGAGCAC ACTTTTTCTG GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG
3451 GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CAGATTACAG CTTCAGGACA
3501 ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCCGGATCAA
3551 TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG
3601 TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA
3651 GTTCTCCAGC CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG
3701 GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC
3751 TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA AAACACAATA TTTTTAACCC
3801 TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT TATAGCATTC
3851 GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCT GTGATTTAAA TAGTTGCAGC
3901 ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC
3951 TTCATCCTAC TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC
4001 GACTTCACCT CCAAGGGAGG AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT
4051 CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT GGACTTCCAG AAGACAATGA AAGTCACAGG
4101 AGTAACTACT CAGGGAGTAA AATCTCTGCT TACCAGCATG TATGTGAAGG
4151 AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC ATCAGTGGAC TCTCTTTTTT
4201 CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACT CCTTCACACC
4251 TGTGGTGAAC TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC
4301 ACCCCCAGAG TTGGGTGCAC CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC
4351 TGCGAGGCAC AGGACCTCTA CGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC
4401 AGCTCCAGAA CTCCTGGGCG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC
4451 CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG
4501 GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA
4551 CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA
4601 ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG
4651 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC
4701 CCCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC
4751 AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC
4801 AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA
4851 GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG
4901 TGTTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC
4951 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA
5001 GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA
5051 AATGA
a de p ro te ín a s pS Y N F V III 010 -(F V IIIF c de c a d e n a du a l) (S E Q ID NO : 126) 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFREN YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV
RKKEEYKMAL
1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL
VYSNKCQTPL
1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK
EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY
RGNSTGTLMV
1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME
LMGCDLNSCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR
SNAWRPQVNN
1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS
QDGHQWTLFF
1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH
QIALRMEVLG
1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
SRTPEVTCVV
1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW
1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
Ejemplo 14: Una nueva clase de moléculas del factor VIII de coagulación con más del triple de extensión de la semivida en ratones con hemofilia A
La nueva clase de moléculas de FVIII se diseñó para contener dos polipéptidos; uno que consiste en un FVIII con eliminación del dominio B (BDD) de cadena sencilla con XTEN insertado en una o más localizaciones dentro de la secuencia de FVIII, y uno compuesto por la región D'D3 de VWF. Cada polipéptido también se condensó en forma recombinante a la región Fc de IgG1 para permitir que la región D'D3 sea correctamente alineada para unir el resto FVIII. Las variantes de FVIII resultantes se expresaron en células HEK 293 por transfección transitoria, y se purificaron del medio acondicionado. Se evaluó la actividad del FVIII por ensayo cromogénico de FVIII y las propiedades de farmacocinética se evaluaron en ambos ratones con inactivación de FVIII (HemA) y doble inactivación FVIII/VWF (DKO).
La incorporación de XTEN y la región D'D3 de VWF a rFVIII generó el desacoplamiento del aclaramiento de las proteínas de fusión de VWF endógeno a la vez que extendió su semivida circulante. El FVIII en esta configuración de fusión está completamente protegido de la interacción con VWF, según lo medido por análisis de interferometría de biocapas (Octet). De conformidad con esto, se halló que sus perfiles de farmacocinética en ratones HemA y DKO eran idénticos, lo que indica que su tasa de aclaramiento en ratones estuvo efectivamente desconectada del VWF. La optimización de la longitud de XTEN y las localizaciones para insertar XTEN identificaron un subconjunto de las proteínas que han excedido la limitación de VWF (16 horas), alcanzando una semivida circulante de hasta 30 horas en ratones HemA, lo que representa una mejora de 4 veces frente a BDD-FVIII. Cabe destacar que estas proteínas mantuvieron su funcionalidad, según lo juzgado por el ensayo cromogénico de FVIII.
La dependencia del VWF ha impuesto una limitación fundamental para la semivida del FVIII terapéutico. El desacoplamiento del FVIII de las vías de aclaramiento del VWF y a la vez la extensión de la semivida por la fusión de la región D'D3 de VWF y XTEN ha generado una nueva molécula de FVIII con una extensión de la semivida de 4 veces. Esta es la primera descripción de un FVIII modificado que ha excedido la limitación de la semivida que se observa en toda la industria del desarrollo de FVIII duradero, lo que representa un importante avance en el tratamiento profiláctico de la hemofilia A.
Tabla 25: Secuencias de proteínas de constructos FVIII-XTEN-Fc y VWF-Fc
S e cu e n c ia s de p ro te ín a s FVIII 195 (F V IIIF c de c a d e n a du a l con dos 144 A E X T E N en los a m in o á c id o s 1656 y 1900) (S E Q ID NO : 105)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
1 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
1 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR
EKEDDKVFPG
1 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG
LIGALLVCRE
1 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD
AASARAWPKM
1 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL
EGHTFLVRNH
1 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME
AYVKVDSCPE
1 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI
RSVAKKHPKT
1 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR
KYKKVRFMAY
1 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR
PYNIYPHGIT
1 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP
TKSDPRCLTR
1 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR
NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV
FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF
PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED
SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG
TASSSPGASP
801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST
GTGPGTPGSG
851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG
SPGSSTPSGA
901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD
DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP
HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA
EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY
FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP
AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG
SEPATSGSET
1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS
TEPSEGSAPG
1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG
SPTSTEEGTS
1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGAS SAPCNI QMEDPTFREN
YRFHAINGYI
1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV
RKKEEYKMAL
1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL
VYSNKCQTPL
1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK
EPFSWIKVDL
1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY
RGNSTGTLMV
1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME
LMGCDLNSCS
1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR
SNAWRPQVNN
1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS
QDGHQWTLFF
1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH
QIALRMEVLG
1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
SRTPEVTCVV
1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW
1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
S e c u e n c ia de p ro te ín a s FVIII 196 (F V IIIF c de c a d e n a du a l con tre s 144 A E X T E N en los a m in o á c id o s 26, 1656 y 1900) (S E Q ID N O : 106)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS
51 SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST
101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG
SPGSSTPSGA
1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD
DTISVEMKKE
1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP
HVLRNRAQSG
1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA
EVEDNIMVTF
1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY
FWKVQHHMAP
1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP
AHGRQVTVQE
1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG
SEPATSGSET
1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS
TEPSEGSAPG
1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG
SPTSTEEGTS
1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFREN
YRFHAINGYI
1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV
RKKEEYKMAL
1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL
VYSNKCQTPL
1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK
EPFSWIKVDL
1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY
RGNSTGTLMV
1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME
LMGCDLNSCS
1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR
SNAWRPQVNN
1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS
QDGHQWTLFF
1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH
QIALRMEVLG
1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
SRTPEVTCVV
1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW
2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
Secuencia de proteínas FVIII 199 (FVIIIFc de cadena sencilla con tres 144 AE XTEN en los aminoácidos 1656 y 1900) (SEQ ID NO: 107)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL
GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEIS PI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFREN YRFHAINGYI
1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV
RKKEEYKMAL
1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL
VYSNKCQTPL
1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK
EPFSWIKVDL
1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY
RGNSTGTLMV
1551 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME
LMGCDLNSCS
1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR
SNAWRPQVNN
1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS
QDGHQWTLFF
1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH
QIALRMEVLG
1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
SRTPEVTCVV
1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW
1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
Secuencia de proteínas FVIII 201 (FVIIIFc de cadena sencilla con tres 144 AE XTEN en los aminoácidos 26, 1656 y 1900) (SEQ ID NO: 108)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL
GELPVGAPGS
51 SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT
SSTGSPGSST
101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST
GTGPGTPGSG
151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG
SPASSDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR
EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG
LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD
AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL
EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME
AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI
RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP
951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG
1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA
1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE
1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET
1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
1401 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS
1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGAS SAPCNI QMEDPTFREN YRFHAINGYI
1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1701 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS
QDGHQWTLFF
1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH
QIALRMEVLG
1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI
SRTPEVTCVV
1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW
2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
Secuencia de proteínas FVIII 203 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos AE XTEN; un 288AE XTEN en el dominio B y un 144 AE XTEN en el aminoácido 1900) (SEQ ID NO: 109)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL
GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR
EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG
LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD
AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL
EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME
AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI
RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR
KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR
PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP
TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR
NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV
FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF
PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED
SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET
PGTSESATPE
801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
SPAGSPTSTE
851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP
AGSPTSTEEG
901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES
ATPESGPGTS
951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP
TSTEEGTSTE
1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE
SGPGTSTEPS
1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE
MKKEDFDIYD
1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR
AQSGSVPQFK
1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI
MVTFRNQASR
1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH
HMAPTKDEFD
1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV
TVQEFALFFT
1301 IFDETKSWYF TENMERNCRG APTSESATPE SGPGSEPATS
GSETPGTSES
1351 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG
SAPGTSESAT
1401 PESGPGSPAG SPTSTEEGS P AGSPTSTEEG SPAGSPTSTE
EGTSESATPE
1451 SGPGTSTEPS EGSAPGASSA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI
NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY
KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC
QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI
KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG
TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL
NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP
QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW
TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM
EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV
TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL
HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT
KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
Secuencia de proteínas FVIII 204 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos AE XTEN; un 288AE XTEN en el dominio B y un 144 AE Xt En en el aminoácido 403) (SEQ ID NO: 110)
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDGAPTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT
451 STEPSEGSAP GTSTEPSEGS APGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGTSE
501 SATPESGPGS EPATSGSETP GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGTSESA
551 TPESGPGTSE SATPESGPGA SSDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE
SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE
MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR
AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI
MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH
HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV
TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI
NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY
KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC
QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI
KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG
TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL
NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP
QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW
TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM
EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV
TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL
HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT
KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
Secuencia de proteínas FVIII 205 (FVIIIFc de cadena sencilla con dos AE XTEN; un 288AE XTEN en el dominio B y un 144 AE XTEN en el aminoácido 18) (SEQ ID NO: 111)
_ 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP
TSESATPESG
51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA
TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS
1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV
TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI
NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY
KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC
QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI
KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG
TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL
NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP
QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW
TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM
EVLGCEAQDL
1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV
TCVVVDVSHE
1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL
HQDWLNGKEY
2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT
KNQVSLTCLV
2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQ
2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN FVIII 266 (FVIII Fc con 42 AE-XTEN en el aminoácido 18 y 288 AE XTEN en el dominio B) SEQ ID NO: 112
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP
GSPAGSPTST
51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR
FPPRVPKSFP
101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE
VYDTVVITLK
151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF
PGGSHTYVWQ
201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC
REGSLAKEKT
251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP
KMHTVNGYVN
301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR
NHRQASLEIS
351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC
PEEPQLRMKN
401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP
KTWVHYIAAE
451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR
501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR
551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM
601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE
651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI
701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI
751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP
801 RSFSQNGAPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA
851 TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT
901 PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS
951 TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS ESATPESGPG TSESATPESG
1001 PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG
1051 TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGTSTE PSEGSAPASS
1101 PPVLKRHQAE ITRTTLQSDQ EEIDYDDTIS VEMKKEDFDI YDEDENQSPR
1151 SFQKKTRHYF IAAVERLWDY GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKVVFQEFT
1201 DGSFTQPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFRNQA SRPYSFYSSL
1251 ISYEEDQRQG AEPRKNFVKP NETKTYFWKV QHHMAPTKDE FDCKAWAYFS
1301 DVDLEKDVHS GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QVTVQEFALF FTIFDETKSW
1351 YFTENMERNC RAPCNIQMED PTFKENYRFH AINGYIMDTL PGLVMAQDQR
1401 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMALYNLY PGVFETVEML
1451 PSKAGIWRVE CLIGEHLHAG MSTLFLVYSN KCQTPLGMAS GHIRDFQITA
1501 SGQYGQWAPK LARLHYSGSI NAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA
1551 RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDS SGIKHNI
1601 FNPPIIARYI RLHPTHYSIR STLRMELMGC DLNSCSMPLG MESKAISDAQ
1651 ITASSYFTNM FATWSPSKAR LHLQGRSNAW RPQVNNPKEW LQVDFQKTMK
1701 VTGVTTQGVK SLLTSMYVKE FLISSSQDGH QWTLFFQNGK
VKVFQGNQDS
1751 FTPVVNSLDP PLLTRYLRIH PQSWVHQIAL RMEVLGCEAQ
DLYDKTHTCP
1801 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
HEDPEVKFNW
1851 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA
1901 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
LVKGFYPSDI
1951 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV
2001 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK *
Secuencia de proteínas pSYN FVIII 267 (FVIII Fc con 72 AE-XTEN en el aminoácido 18 y 288 AE XTEN en el dominio B) SEQ ID NO: 113
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP
TSESATPESG
51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS
VVYKKTLFVE
151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS
HPVSLHAVGV
201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE
NGPMASDPLC
251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH
KFILLFAVFD
301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP
GLIGCHRKSV
351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF
LTAQTLLMDL
401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA
EDYDDDLTDS
451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW
DYAPLVLAPD
501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ
HESGILGPLL
551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK
GVKHLKDFPI
601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL
ASGLIGPLLI
651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR
FLPNPAGVQL
701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG
AQTDFLSVFF
751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH
NSDFRNRGMT
801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS
QNGAPGTSES
851 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS
ETPGTSESAT
901 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG
PGSEPATSGS
951 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG
TSTEPSEGSA
1001 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE
PATSGSETPG
1051 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE
PSEGSAPGSE
1101 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSPPVL
KRHQAEITRT
1151 TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK
KTRHYFIAAV
1201 ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF
TQPLYRGELN
1251 EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE
EDQRQGAEPR
1301 KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL
EKDVHSGLIG
1351 PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE
NMERNCRAPC
1401 NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRWY
LLSMGSNENI
1451 HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA
GIWRVECLIG
1501 EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY
GQWAPKLARL
1551 HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG IKTQGARQKF
SSLYISQFII
1601 MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP
IIARYIRLHP
1651 THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS
SYFTNMFATW
1701 SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV
TTQGVKSLLT
1751 SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV
VNSLDPPLLT
1801 RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA
PELLGGPSVF
1851 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG
VEVHNAKTKP
1901 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP
IEKTISKAKG
1951 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW
ESNGQPENNY
2001 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA
LHNHYTQKSL
2051 SLSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN FVIII 268 (FVIII Fc con 144 AE-XTEN en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 114 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFREN YRFHAINGYI
1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1401 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN
1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV
1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW
1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV
1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK*
Secuencia de proteínas pSYN FVIII 269 (FVIII Fc con 72 AE-XTEN en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 115
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG
51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE
151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV
201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC
251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD
301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV
351 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL
401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS
451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD
501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ
HESGILGPLL
551 YGEVGDTLLI IFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK
GVKHLKDFPI
601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL
ASGLIGPLLI
651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR
FLPNPAGVQL
701 EDPEFQASNI MHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG
AQTDFLSVFF
751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH
NSDFRNRGMT
801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS
QNPPVLKRHQ
851 AEITRTTLQS DQEEIDYDDT ISVEMKKEDF DIYDEDENQS
PRSFQKKTRH
901 YFIAAVERLW DYGMSSSPHV LRNRAQSGSV PQFKKVVFQE
FTDGSFTQPL
951 YRGELNEHLG LLGPYIRAEV EDNIMVTFRN QASRPYSFYS
SLISYEEDQR
1001 QGAEPRKNFV KPNETKTYFW KVQHHMAPTK DEFDCKAWAY
FSDVDLEKDV
1051 HSGLIGPLLV CHTNTLNPAH GRQVTVQEFA LFFTIFDETK
SWYFTENMER
1101 NCRAPCNIQM EDPTFKENYR FHAINGYIMD TLPGLVMAQD
QRIRWYLLSM
1151 GSNENIHSIH FSGHVFTVRK KEEYKMALYN LYPGVFETVE
MLPSKAGIWR
1201 VECLIGEHLH AGMSTLFLVY SNKCQTPLGM ASGHIRDFQI
TASGQYGQWA
1251 PKLARLHYSG SINAWSTKEP FSWIKVDLLA PMIIHGIKTQ
GARQKFSSLY
1301 ISQFIIMYSL DGKKWQTYRG NSTGTLMVFF GNVDSSGIKH
NIFNPPIIAR
1351 YIRLHPTHYS IRSTLRMELM GCDLNSCSMP LGMESKAISD
AQITASSYFT
1401 NMFATWSPSK ARLHLQGRSN AWRPQVNNPK EWLQVDFQKT
MKVTGVTTQG
1451 VKSLLTSMYV KEFLISSSQD GHQWTLFFQN GKVKVFQGNQ
DSFTPVVNSL
1501 DPPLLTRYLR IHPQSWVHQI ALRMEVLGCE AQDLYDKTHT
CPPCPAPELL
1551 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF
NWYVDGVEVH
1601 NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN
KALPAPIEKT
1651 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS
DIAVEWESNG
1701 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH
1751 YTQKSLSLSP GK*
Secuencia de proteínas pSYNFVIII 271 (FVIII Fc con 42 AE-XTEN en el aminoácido 18) SEQ ID NO: 116 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST
51 EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP
101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK
151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ
201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT
251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN
301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS
351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN
401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE
451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR
501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR
551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYSSFVNM
601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE
651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI
701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI
751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP
801 RSFSQNPPVL KRHQAEITRT TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED
851 ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV
901 VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYI RAEVEDNIMV TFRNQASRPY
951 SFYSSLISYE EDQRQGAEPR KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK
1001 AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF
1051 DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV
1101 MAQDQRIRWY LLSMGSNENI HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF
1151 ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR
1201 DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS TKEPFSWIKV
DLLAPMIIHG
1251 IKTQGARQKF SSLYISQFII MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL
MVFFGNVDSS
1301 GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR MELMGCDLNS
CSMPLGMESK
1351 AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV
NNPKEWLQVD
1401 FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL
FFQNGKVKVF
1451 QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV
LGCEAQDLYD
1501 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC
VVVDVSHEDP
1551 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKC
1601 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN
QVSLTCLVKG
1651 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT
VDKSRWQQGN
1701 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN FVIII 272 (FVIII con 144 AE XTEN en los aminoácidos 18 y 244 AE XTEN en el dominio B- no Fc) SeQ ID NO: 117
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP
TSESATPESG
51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS
ESATPESGPG
101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA
TSGSETPGTS
151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL
GELPVDARFP
201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL
LGPTIQAEVY
251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR
EKEDDKVFPG
301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG
LIGALLVCRE
351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD
AASARAWPKM
401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL
EGHTFLVRNH
451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME
AYVKVDSCPE
501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI
RSVAKKHPKT
551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR
KYKKVRFMAY
601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR
PYNIYPHGIT
651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP
TKSDPRCLTR
701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR
NVILFSVFDE
751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV
FDSLQLSVCL
801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF
PFSGETVFMS
851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED
SYEDISAYLL
901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET
PGTSESATPE
951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG
SPAGSPTSTE
1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP
AGSPTSTEEG
1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES
ATPESGPGTS
1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP
TSTEEGTSTE
1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE
SGPGTSTEPS
1201 EGSAPAS SPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE
MKKEDFDIYD
1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR
AQSGSVPQFK
1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI
MVTFRNQASR
1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH
HMAPTKDEFD
1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV
TVQEFALFFT
1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI
NGYIMDTLPG
1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY
KMALYNLYPG
1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC
QTPLGMASGH
1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI
KVDLLAPMII
1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG
TLMVFFGNVD
1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL
NSCSMPLGME
1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP
QVNNPKEWLQ
1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW
TLFFQNGKVK
1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM
EVLGCEAQDL
1901 Y*
Secuencia de proteínas pSYN VWF 031 (enlazador GS escindible de trombina VWF D1 D2D'D3- 48aa de longitud-Fc) SEQ ID NO: 118
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC
VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP
ISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK
THTCPPCPAP
1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
VKFNWYVDGV
1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
VSNKALPAPI
1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF
YPSDIAVEWE
1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
FSCSVMHEAL
1501 HNHYTQKSLS LSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN VWF 034 (VWF D1 D2D'D3- 288AE XTEN- enlazador GS escindible de trombina con 35aa de longitud-Fc) SeQ ID NO: 119
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS
DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE
FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI
DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS
WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL
VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA
CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG
LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV
TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC
TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV
RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG
LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP
TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV
AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP
PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM
SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK
TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE
TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ
YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE
VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE
KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD
SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS
CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY
EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC
VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP
ISGTSESATP
1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP
GTSESATPES
1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS
EPATSGSETP
1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST
EPSEGSAPGT
1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT
SGSETPGSEP
1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE
GSAPGSEPAT
1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DIGGGGGSGG
GGSLVPRGSG
1551 GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV
TCVVVDVSHE
1601 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL
HQDWLNGKEY
1651 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT
KNQVSLTCLV
1701 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQ
1751 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN VWF 036 (enlazador GS escindible de trombina VWF DID2D'D-98aa de longitud-Fc) SEQ ID NO: 120
1 MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS
DFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE
FFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI
DGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS
WALSSGEQWC
201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC
251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME
301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC
351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD
701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM
801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE
951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD
1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI
1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE
1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGGGGSGGG
1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG
1301 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP
1351 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV
1401 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI
1451 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE
1501 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
1551 HNHYTQKSLS LSPGK*
Secuencia de proteínas pSYN Fc-015 (dominio IgG-Fc) SEQ ID NO: 121
1 METDTLLLWV LLLWVPGSTG DKTHTCPPCP APELLGGPSV
FLFPPKPKDT
51 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY
101 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT
151 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
YKTTPPVLDS
201 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS
LSLSPGK*
Ejemplo 15: Los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc han mantenido la actividad específica de FVIII normal en comparación con BDD-FVIII de tipo salvaje.
Se determinó la actividad específica de FVIII de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc. Los heterodímeros se purificaron usando un procedimiento de cromatografía de dos etapas. Se usó una resina de intercambio aniónico débil, seguida de cromatografía de afinidad. El producto purificado final tuvo pureza aceptable según SEC-HPLC. La actividad específica se comparó con el FVIII que tiene eliminación del dominio B (BDD-FVIII), según lo medido por el ensayo cromogénico de FVIII y concentración de A280. Los datos se presentan en la Tabla 26. Todas las moléculas ensayadas habían demostrado actividades específicas del FVIII comparables a BDD-FVIII. Se confirmaron la pureza y la presencia de cada resto de las moléculas por SDS-PAGE e inmunotransferencia western.
Tabla 26: Actividad específica de FVIII de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc
Figure imgf000150_0001
Las semividas de rFVIII-XTEN/D'D3 y BDD-FVIII se compararon en ratones HemA (Figura 15; Tabla 27). Como muestra la Figura 15, rFVIII-XTEN/D'D3 alcanzó una semivida que fue cuatro veces más larga que la semivida alcanzada por BDD-FVIII.
Tabla 27: rFVIII-XTEN/D'D3 y BDD-FVIII en ratones HemA
Figure imgf000150_0002
Ejemplo 16: Potencia de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc (actividad de FVIII) en hemostasia según lo medido por el ensayo de aPTT de una etapa
Se evaluó la potencia de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc en hemostasia por su actividad de aPTT específica de FVIII según se resume en la Tabla 28. Como lo demuestra la Tabla 28, si bien la adición del fragmento de VWF D'D3 y la inserción de XTEN en los intra-dominios de FVIII reduce la actividad aPTT específica de FVIII de los heterodímeros (según lo indicado por los datos de FVIII155/VWF031 y los datos de FVIII205/VWF031), las inserciones de XTEN en la región del dominio B de FVIII o el término C del fragmento D'D3 de VWF no tienen efecto negativo sobre la actividad aPTT específica de FVIII (como lo indican los datos de FVIII169/VWF031 y los datos de FVIII169/VWF034). En comparación con BDD-FVIII de cadena dual (dcBDD-FVIII), FVIII155/VWF031, FVIII169/VWF031, FVIII169/VWF034 y VWF205/VWF031 demostraron reducción de la actividad aPTT específica por 2,5 veces, 2,8 veces, 2,6 veces y 5,5 veces, respectivamente.
Tabla 28: Actividad aPTT específica de FVIII de los heterodímeros FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc
Figure imgf000151_0001
Ensayo de actividad aPTT específica del FVIII
Se diluyeron variantes de FVIII con tampón de aPTT (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,05 M, 1% BSA, pH 7,4) al intervalo del ensayo lineal (200- 1,6 mU/ml). Se mezclaron secuencialmente 50 pl de muestras diluidas o estándares con 50 pl de plasma combinado de HemA humano virgen a 37°C, 50 pl de reactivo de aPTT a 37°C (reactivo de cefaloplastina activado ACTIN® FSL - Dade Behring, referencia # B4219-2) y se incubó a 37 °C durante 4 minutos. Se añadieron luego 50 pl de CaCl220 mM (Dade Behring [referencia # ORFO37]) a la mezcla de reacción para comenzar las reacciones de coagulación. Usando el tiempo de coagulación de cada muestra (la longitud de tiempo desde la adición de CaCl2 hasta el inicio de la formación del coágulo), se calculó la actividad aPTT contra el estándar que se generó con el 8o concentrado de FVIII estándar internacional. La actividad de aPTT específica se calculó contra la concentración de proteína de cada molécula que se midió por OD280.
Ejemplo 17: Eficacia in v iv o del heterodímero FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc en el modelo de sangrado por corte en el rabo de ratones HemA
Para acceder más a la potencia de la hemostasia de los heterodímeros, se evaluó la eficacia aguda de FVIII 169/VWF034 y FVIII205/VWF031 en comparación con BDD-FVIII en el modelo de sangrado por corte en el rabo de ratones HemA. Se trataron ratones HemA con una sola inyección IV de BDD-FVIII a 200, 65 y 20 IU/kg para generar el nivel de control de pérdida de sangre post lesión cortante en el rabo. La pérdida de sangre de los ratones tratados con 200 IU/kg de FVIII 169/VWF034 o FVIII205/VWF031 se comparó con aquella de los ratones del grupo control tratados con BDD-FVIII para estimar su potencia en hemostasia. Los animales tratados con vehículo se usaron para generar la situación inicial de pérdida de sangre para el modelo. Como se muestra en la Figura 16, se observó una reducción significativa en pérdida de sangre de todos los grupos de tratamiento con FVIII comparados con aquella de los animales tratados con vehículo (p<0,05). Tanto FVIII169/VWF034 como FVIII205/VWF031 son eficaces en el modelo de corte en el rabo de ratones HemA. En comparación con BDD-FVIII, se observó una potencia aproximadamente 3 veces inferior para FVIII169/VWF034, según lo demostrado por una reducción de pérdida de sangre similar alcanzada por 65 IU/kg BDD-FVIII y 200 IU/kg FVIII169/VWF034. En cuanto a FVIII205/VWF034, se observó una reducción de la potencia de 10 veces, según lo demostrado por la reducción de pérdida de sangre similar de 20 IU/kg BDD-FVIII y 200 IU/kg FVIII205/VWF031.
Si bien FVIII69/VWF034 y FVIII205/VWF031 tuvieron actividad cromogénica de FVIII específica similar comparada con rBDD-FVIII, su actividad aPTT del FVIII y potencia in vivo se redujeron ambas debido a las modificaciones de las moléculas. Esos datos indican que la actividad de aPTT de una molécula de FVIII es una medición más precisa para pronosticar su potencia in vivo en hemostasia que la actividad cromogénica del FVIII.
Modelo de sangrado por corte en el rabo de ratones HemA
Se utilizaron ratones HemA macho de 8-10 semanas de vida en este estudio. Antes de lesionar por corte en el rabo, los ratones fueron anestesiados con un cóctel de 50 mg/kg Ketamina/0,5 mg/kg Dexmedetomidina y dispuestos en una almohadilla térmica a 37°C para ayudar a mantener la temperatura corporal. Los rabos de los ratones se sumergieron luego en agua a 37°C durante 10 minutos para dilatar la vena lateral. Después de dilatar la vena, se inyectó rFVIII o solución de vehículo mediante la vena del rabo y 5 min después, se efectuó un corte distal de 1 cm en el rabo usando un bisturí #11 con canto recto. La sangre derramada se recogió en 13 ml de disolución salina calentada a 37°C durante 30 minutos, y los ratones luego fueron sacrificados aún bajo los efectos de la anestesia por toracotomía bilateral. Se cuantificó la pérdida de sangre en forma gravimétrica por cambio de peso de los tubos de recolección de sangre antes y después de recoger la sangre en gramos, que se convirtieron a mililitros (ml) de volumen de pérdida de sangre (1g cambio de peso = 1 ml pérdida de sangre).
La descripción precedente de las realizaciones específicas revela la naturaleza general de la invención que otros podrán, aplicando el conocimiento de la técnica, modificar y/o adaptar fácilmente para distintas aplicaciones tales como realizaciones específicas, sin experimentación indebida, sin desviarse del concepto general de la presente invención. Por consiguiente, dichas adaptaciones y modificaciones están destinadas a estar dentro del significado y alcance de los equivalentes de las realizaciones descritas, en base a las descripciones y lineamientos presentados en este documento. Se ha de entender que las frases y la terminología de este documento tienen fines descriptivos y no limitativos, de forma tal que el experto en la materia debe interpretar la terminología o las frases de la presente invención en vista de las descripciones y lineamientos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína quimérica que comprende (i) un fragmento del factor de von Willebrand Factor (VWF) que comprende el dominio D' y el dominio D3 de VWF, (ii) una secuencia de polipéptidos de longitud extendida (XTEN), (iii) una proteína del factor VIII (FVIII), (iv) una primera región constante de Ig o una porción de esta, y (v) una segunda región constante de Ig o una porción de esta,
en donde el fragmento de VWF y la secuencia de XTEN están enlazados por un enlazador opcional, en donde la secuencia de XTEN o el fragmento de VWF están enlazados a la primera región constante de Ig o una porción de esta,
en donde la proteína FVIII está enlazada a la segunda región constante de Ig o una porción de esta,
y en donde la primera región constante de Ig o una porción de esta se asocia o enlaza a la segunda región constante de Ig o una porción de esta mediante un enlace covalente.
2. La proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende (i) una cadena de polipéptidos sencilla que comprende el fragmento de VWF, la secuencia de XTEN, la primera región constante de Ig o una porción de esta, la segunda región constante de Ig o una porción de esta y la proteína FVIII, o (ii) una primera cadena de polipéptidos y una segunda cadena de polipéptidos, en donde la primera cadena de polipéptidos comprende el fragmento de VWF, la secuencia de XTEN y la primera región constante de Ig o una porción de esta, y la segunda cadena de polipéptidos comprende la proteína FVIII y la segunda región constante de Ig o una porción de esta.
3. La proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende una fórmula:
(a) V-L2-X-L1-F1 :FVI II-L3-F2;
(b) V-L2-X-L1-F1 :F2-L3-FVIII;
(c) F1-L1-X-L2-V: FVIII-L3-F2;
(d) F1-L1 -X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(e) V-L2-X-LI-FI-L4-FVIII-L3-F2;
(f) F2-L3-FVIII-L4-F1 -L1-X-L2-V;
(g) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1;
o
(h) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII;
en donde V es el fragmento de VWF;
cada uno de L1, L2 y L3 es un enlazador opcional;
L4 es un enlazador opcional;
FVIII es la proteína FVIII;
X es la secuencia de XTEN;
F1 es la primera región constante de inmunoglobulina (Ig) o una porción de esta;
F2 es la segunda región constante de Ig o una porción de esta;
(-) es un enlace peptídico; y
(:) es un enlace covalente.
4. La proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende una fórmula:
(a) FVIII(X1 )-L1 -F1 :V-L2-X2-L3-F2;
(b) FVIII(X1 )-L1 -F1 :F2-L3-X2-L2-V;
(c) F1 -L1 -FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(d) F1 -L1 -FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(e) FVIII(X1 )-L1 -F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(f) FVIII(X1 )-L1 -F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(g) F1 -L1 -FVIII(X1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2;
o
(h) F1 -L1 -FVIII(X1 )-L4-F2-L3-X2-L2-V;
en donde FVIII(X1) comprende la proteína FVIII y la secuencia de XTEN, en donde la secuencia de XTEN está enlazada al término N o al término C de la proteína FVIII o insertada inmediatamente en dirección 3’ de uno o más de los aminoácidos ("uno o más sitios de inserción") en la proteína FVIII;
cada uno de L1, L2 o L3 es un enlazador opcional;
L4 es un enlazador;
X2 es una secuencia de XTEN;
F1 es la primea región constante de Ig o una porción de esta;
F2 es la segunda región constante de Ig o una porción de esta;
V es el fragmento de VWF;
(-) es un enlace peptídico; y
(:) es un enlace covalente.
5. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde
(a) la primera región constante de Ig o una porción de esta es una primera región de Fc;
(b) la segunda región constante de Ig o una porción de esta es una segunda región constante de Fc; o
(c) tanto (a) como (b).
6. La proteína quimérica según la reivindicación 4 o 5, en donde uno o más de los sitios de inserción en la proteína FVIII se seleccionan del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos de la Tabla 7, la Tabla 8, la Tabla 9 y la Tabla 10.
7. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína FVIII comprende el dominio B o una porción de este, o no comprende el dominio B.
8. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína quimérica comprende por lo menos dos XTEN, por lo menos tres XTEN, por lo menos cuatro XTEN, por lo menos cinco XTEN o por lo menos seis XTEN.
9. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la proteína FVIII es FVIII de cadena sencilla.
10. Un polinucleótido o un conjunto de polinucleótidos que codifican la proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un vector que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos según la reivindicación 10 y uno o más promotores operativamente enlazados al polinucleótido o al conjunto de polinucleótidos.
12. Una célula hospedante que comprende el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos según la reivindicación 10 o el vector según la reivindicación 11.
13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos según la reivindicación 10, el vector según la reivindicación 11 o la célula hospedante según la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el polinucleótido según la reivindicación 10, el vector según la reivindicación 11, la célula hospedante según la reivindicación 12 o la composición según la reivindicación 13 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la sangre en un sujeto que lo necesita.
15. Un método para elaborar una proteína quimérica, que comprende transfectar una o más células hospedantes con el polinucleótido o el conjunto de polinucleótidos según la reivindicación 10 o el vector según la reivindicación 11 y expresar la proteína quimérica en la célula hospedante.
ES13816031T 2012-07-11 2013-07-10 Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos Active ES2770501T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261670401P 2012-07-11 2012-07-11
US201361759819P 2013-02-01 2013-02-01
US201361801504P 2013-03-15 2013-03-15
US201361801544P 2013-03-15 2013-03-15
US201361827158P 2013-05-24 2013-05-24
US201361840811P 2013-06-28 2013-06-28
PCT/US2013/049989 WO2014011819A2 (en) 2012-07-11 2013-07-10 Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2770501T3 true ES2770501T3 (es) 2020-07-01

Family

ID=49916682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13816031T Active ES2770501T3 (es) 2012-07-11 2013-07-10 Complejo del factor VIII con XTEN y proteína del factor de Von Willebrand y sus usos

Country Status (31)

Country Link
US (3) US10138291B2 (es)
EP (3) EP3674410A1 (es)
JP (5) JP6603128B2 (es)
KR (2) KR102403545B1 (es)
CN (2) CN110054699A (es)
AR (1) AR091735A1 (es)
AU (4) AU2013290173B2 (es)
BR (1) BR112015000267B1 (es)
CA (1) CA2878679A1 (es)
CL (1) CL2015000060A1 (es)
CO (1) CO7170123A2 (es)
CY (1) CY1122729T1 (es)
DK (1) DK2882450T3 (es)
EA (2) EA029685B1 (es)
ES (1) ES2770501T3 (es)
HK (1) HK1211228A1 (es)
HR (1) HRP20200007T1 (es)
HU (1) HUE047088T2 (es)
IL (1) IL236412B (es)
LT (1) LT2882450T (es)
MX (1) MX2015000397A (es)
NZ (1) NZ703366A (es)
PH (1) PH12015500039A1 (es)
PL (1) PL2882450T3 (es)
PT (1) PT2882450T (es)
RS (1) RS59876B1 (es)
SG (3) SG10201913893XA (es)
SI (1) SI2882450T1 (es)
TW (1) TWI667258B (es)
UA (1) UA116632C2 (es)
WO (1) WO2014011819A2 (es)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX362028B (es) * 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2870250B2 (en) 2012-07-06 2022-06-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
CN110054699A (zh) 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
ES2959747T3 (es) 2013-02-15 2024-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc Gen del factor VIII optimizado
AU2014228938B2 (en) 2013-03-15 2019-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX polypeptide formulations
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
CN105392495A (zh) * 2013-06-28 2016-03-09 比奥根Ma公司 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN106456718A (zh) * 2014-01-10 2017-02-22 比奥根Ma公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
AU2016231328B2 (en) * 2015-03-06 2018-07-05 CSL Behring Lengnau AG Compounds for improving the half-life of von Willebrand factor
JP6573989B2 (ja) * 2015-05-22 2019-09-11 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
WO2017027545A1 (en) 2015-08-12 2017-02-16 Cell Machines, Inc. Methods and compositions related to long half-life coagulation complexes
AU2016315656A1 (en) 2015-08-28 2018-02-01 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
SG11201805497QA (en) 2016-01-07 2018-07-30 Csl Behring Recombinant Facility Ag Mutated truncated von willebrand factor
LT3411478T (lt) 2016-02-01 2022-09-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizuoti viii faktoriaus genai
CA3024349A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Octapharma Ag Glycosylated vwf fusion proteins with improved pharmacokinetics
CN109790529A (zh) * 2016-06-24 2019-05-21 财团法人牧岩生命科学研究所 包含FVIII和vWF因子的嵌合蛋白及其用途
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN107759694B (zh) 2016-08-19 2023-01-13 安源医药科技（上海）有限公司 双特异性抗体及其制备方法与用途
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
JP2020504082A (ja) 2016-11-11 2020-02-06 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 血液凝固障害の処置又は予防における血管外投与のための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
DK3538133T3 (da) 2016-11-11 2021-04-19 CSL Behring Lengnau AG Trunkeret von willebrand faktor polypeptider til behandling af hæmofili
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
BR112019011115A2 (pt) 2016-12-02 2019-10-01 Bioverativ Therapeutics Inc métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos
AU2018215092A1 (en) 2017-01-31 2019-08-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
GB201707139D0 (en) * 2017-05-04 2017-06-21 Imp Innovations Ltd Polypeptides
TW201920255A (zh) 2017-08-09 2019-06-01 美商生物化學醫療公司 核酸分子及其用途
BR112020012220A2 (pt) * 2017-12-21 2021-01-26 Amunix Pharmaceuticals, Inc. segmentos de liberação e composições de ligação que compreende os mesmos
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
BR112021002017A2 (pt) 2018-08-09 2021-05-11 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácido nucleico e usos das mesmas para terapia genética não viral
KR20210091243A (ko) 2018-11-15 2021-07-21 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 단백질 시퀀싱을 위한 방법 및 조성물
CN113396223A (zh) 2018-12-06 2021-09-14 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 表达因子ix的慢病毒载体的用途
US10654911B1 (en) * 2019-04-02 2020-05-19 Beijing Neoletix Biological Technology Co., Ltd. Vector co-expressing truncated von Willebrand factor and factor VIII
TW202115127A (zh) * 2019-06-19 2021-04-16 美商百歐維拉提夫治療公司 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物
CN112175088B (zh) * 2019-07-02 2023-03-28 江苏晟斯生物制药有限公司 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用
CN114364796B (zh) * 2019-09-02 2023-07-11 甘李药业股份有限公司 嵌合蛋白
US20230287040A1 (en) 2019-11-13 2023-09-14 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same
CN113597434B (zh) 2019-12-31 2022-07-01 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和gdf15的融合蛋白以及其缀合物
CN113728013B (zh) 2020-01-11 2022-06-14 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
JP2023527764A (ja) * 2020-05-20 2023-06-30 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド タンパク質シーケンスのための方法及び組成物
CN115925995A (zh) 2020-09-30 2023-04-07 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物和使用方法
JP2024522855A (ja) 2021-06-23 2024-06-21 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質の製剤およびその使用
CN113862301A (zh) * 2021-08-25 2021-12-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种vwf前肽表达载体及其制备方法和应用

Family Cites Families (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4868112A (en) 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
WO1987004187A1 (en) 1986-01-03 1987-07-16 Genetics Institute, Inc. METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5610278A (en) 1986-06-24 1997-03-11 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5563045A (en) 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
EP0918872B1 (en) 1996-08-02 2008-02-20 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US7829085B2 (en) 1999-07-14 2010-11-09 Life Sciences Research Partners Vzw Methods of treating hemostasis disorders using antibodies binding the C1 domain of factor VIII
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003533537A (ja) 2000-05-16 2003-11-11 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
DK1355919T3 (da) 2000-12-12 2011-03-14 Medimmune Llc Molekyler med længere halveringstider, sammensætninger og anvendelser deraf
JP4336771B2 (ja) 2001-03-09 2009-09-30 モルフォシス アーゲー 血清アルブミン結合部分
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
EP1463751B1 (en) 2001-12-21 2013-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
CN100343393C (zh) 2002-03-15 2007-10-17 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
ATE536188T1 (de) 2002-08-14 2011-12-15 Macrogenics Inc Fcgammariib-spezifische antikörper und verfahren zur verwendung davon
WO2004027901A2 (en) 2002-09-17 2004-04-01 Diffusion Science, Inc. Electrochemical generation, storage and reaction of hydrogen and oxygen using gas permeable catalyst-coated hollow microspheres
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
CN1767857A (zh) 2003-02-26 2006-05-03 尼克塔治疗亚拉巴马公司 聚合物－因子ⅷ部分共轭物
CA2515989C (en) 2003-02-28 2009-09-15 Kuraray Co., Ltd. Curable resin composition
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP2298347B1 (en) 2003-05-06 2015-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Clotting factor chimeric proteins for treatment of a hemostatic disorder
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005016949A2 (en) 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
BRPI0506771A (pt) 2004-01-12 2007-05-22 Applied Molecular Evolution anticorpo, e, composição farmacêutica
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
CN101987870B (zh) 2004-07-15 2013-07-03 赞科股份有限公司 优化的Fc变体
US7566701B2 (en) 2004-09-07 2009-07-28 Archemix Corp. Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
ES2434035T3 (es) * 2004-12-27 2013-12-13 Baxter International Inc. Conjugados de polímero-factor von Willebrand
JP2009504157A (ja) 2005-08-12 2009-02-05 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US7846445B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007103455A2 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Amunix, Inc. Genetic packages and uses thereof
PL3896090T3 (pl) 2006-06-14 2022-05-02 Csl Behring Gmbh Rozszczepialne proteolitycznie białko fuzyjne zawierające czynnik krzepnięcia krwi
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008033413A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2054521A4 (en) * 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
CN101600448B (zh) 2006-10-04 2015-11-25 诺和诺德公司 甘油连接的peg化的糖和糖肽
EP1935430A1 (en) 2006-12-22 2008-06-25 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
WO2008077616A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
MX2010001684A (es) 2007-08-15 2010-04-21 Amunix Inc Composiciones y metodos para modificar propiedades de polipeptidos biologicamente activos.
BRPI0818913A2 (pt) 2007-11-01 2015-05-12 Univ Rochester Fator viii recombinante tendo elevada estabilidade
KR20100095441A (ko) 2007-11-09 2010-08-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법
CN105816858A (zh) 2007-12-28 2016-08-03 巴克斯特国际公司 重组vwf配方
KR101648734B1 (ko) * 2008-06-24 2016-08-18 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
JP2012510060A (ja) 2008-11-24 2012-04-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおけるｐｅｇ化血液凝固因子の活性の測定方法
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
MX362028B (es) * 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
AU2010233089B2 (en) 2009-04-10 2016-05-26 Tufts Medical Center, Inc. Par-1 activation by metalloproteinase-1 (MMP-1)
MX354555B (es) 2009-06-08 2018-03-09 Amunix Operating Inc Polipeptidos de la hormona de crecimiento y metodos de preparacion y su uso.
ES2705249T3 (es) 2009-06-08 2019-03-22 Amunix Operating Inc Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso
US20120148557A1 (en) 2009-08-20 2012-06-14 Ulrich Kronthaler Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
JP5876416B2 (ja) * 2009-11-13 2016-03-02 グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドＧｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）含有調製品並びにこれに関連する方法、キット及び使用
ES2880038T3 (es) * 2009-12-06 2021-11-23 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos
US9493543B2 (en) 2010-02-16 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Factor VIII fusion protein
CN102770449B (zh) * 2010-02-16 2016-02-24 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有降低的vwf结合的因子viii分子
DK3106170T3 (da) 2010-05-20 2020-07-13 Allergan Inc Nedbrydelige clostridiumtoksiner
WO2012006623A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
MX2013000301A (es) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Factores quimericos de coagulacion.
US20130017997A1 (en) 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
BR112014017165B1 (pt) * 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
CN110054699A (zh) 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
CN105392495A (zh) 2013-06-28 2016-03-09 比奥根Ma公司 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途
EP3013359A4 (en) 2013-06-28 2017-01-25 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker
CN106456718A (zh) 2014-01-10 2017-02-22 比奥根Ma公司 因子viii嵌合蛋白及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022252703A1 (en) 2022-11-10
HRP20200007T1 (hr) 2020-03-20
CN104661674A (zh) 2015-05-27
JP6603128B2 (ja) 2019-11-06
EA201792485A2 (ru) 2018-08-31
CN110054699A (zh) 2019-07-26
PH12015500039A1 (en) 2015-03-16
SG10201701037WA (en) 2017-03-30
JP2018102323A (ja) 2018-07-05
AU2018203206A1 (en) 2018-05-24
EP4269431A1 (en) 2023-11-01
JP2022000471A (ja) 2022-01-04
BR112015000267A2 (pt) 2018-03-06
JP7022165B2 (ja) 2022-02-17
SI2882450T1 (sl) 2020-02-28
AU2013290173A1 (en) 2015-01-22
EA201792485A3 (ru) 2019-03-29
IL236412B (en) 2020-10-29
WO2014011819A2 (en) 2014-01-16
CL2015000060A1 (es) 2015-08-28
RS59876B1 (sr) 2020-03-31
KR20150036510A (ko) 2015-04-07
KR102403545B1 (ko) 2022-05-30
MX2015000397A (es) 2015-11-23
EP3674410A1 (en) 2020-07-01
EP2882450A4 (en) 2016-06-22
LT2882450T (lt) 2020-03-25
CY1122729T1 (el) 2021-03-12
AR091735A1 (es) 2015-02-25
KR20210143931A (ko) 2021-11-29
PL2882450T3 (pl) 2020-06-29
CA2878679A1 (en) 2014-01-16
JP2020078352A (ja) 2020-05-28
SG11201500045RA (en) 2015-02-27
DK2882450T3 (da) 2020-02-24
US10138291B2 (en) 2018-11-27
HUE047088T2 (hu) 2020-04-28
AU2013290173B2 (en) 2018-02-15
IL236412A0 (en) 2015-02-26
TW201414749A (zh) 2014-04-16
US20190169267A1 (en) 2019-06-06
BR112015000267B1 (pt) 2023-01-24
CO7170123A2 (es) 2015-01-28
JP2023166024A (ja) 2023-11-17
AU2020264355A1 (en) 2020-12-03
NZ703366A (en) 2018-03-23
EA029685B1 (ru) 2018-04-30
WO2014011819A3 (en) 2014-03-06
EP2882450A2 (en) 2015-06-17
HK1211228A1 (en) 2016-05-20
US20220056108A1 (en) 2022-02-24
UA116632C2 (uk) 2018-04-25
US11091534B2 (en) 2021-08-17
KR102329315B1 (ko) 2021-11-19
JP2015527882A (ja) 2015-09-24
AU2018203206B2 (en) 2020-08-06
PT2882450T (pt) 2020-02-19
US20150266943A1 (en) 2015-09-24
SG10201913893XA (en) 2020-03-30
EP2882450B1 (en) 2019-11-27
TWI667258B (zh) 2019-08-01
EA201590198A1 (ru) 2015-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220056108A1 (en) Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
JP6906882B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用
US10548953B2 (en) Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
AU2016202875B2 (en) Chimeric Factor VIII Polypeptides and Uses Thereof
AU2016204986B2 (en) Factor VIII Chimeric And Hybrid Polypeptides, And Methods Of Use Thereof
US20190010212A1 (en) Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
JP2022089920A (ja) 最適化第ｖｉｉｉ因子遺伝子
CA2913078A1 (en) Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
EA042955B1 (ru) Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, с использованием комплекса фактора viii с xten и белком фактора фон виллебранда и его применение