JP2003533537A

JP2003533537A - タンパク質の誘導体化

Info

Publication number: JP2003533537A
Application number: JP2001585141A
Authority: JP
Inventors: グレゴリーグレゴリアディス
Original assignee: リポクセンテクノロジーズリミテッド
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2003-11-11
Also published as: AU2001258536A1; WO2001087922A3; US6962972B2; DE60116137D1; EP1335931A2; ATE313554T1; EP1335931B1; US20030129159A1; DE60116137T2; ES2256234T3; WO2001087922A2

Abstract

(57)【要約】タンパク質を、変性剤の存在下の水性反応におけるペンダント基（通常、該タンパク質の非末端アミノアシル単位における側鎖である基）の反応によって誘導体化する。変性剤は、好ましくは両親媒性化合物、最も好ましくはアニオン性両親媒性化合物（例えば、長鎖アルキルスルフェートモノエステル、好ましくはアルカリ金属塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム））である。誘導体化度は、該タンパク質が活性（例えば、酵素活性）を保持しながら、増加される。誘導体化度の増加は、インビボにおける循環時間ならびに保存およびインビボにおける安定性の増加を増強する。好ましくは、誘導体化試薬は、第１級アミン基、一般的にリシル単位のイプシロン−アミノ基と反応するアルデヒド化合物である。誘導体化は、還元条件下で行われて、第２級アミン誘導体が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、タンパク質を誘導体化（derivatising）して（ここで、変性剤が反
応混合物に含まれる）、高置換度を達成するための方法に関する。該方法は、特
に、タンパク質の非末端リシル単位のイプシロンアミノ基とのアルデヒド試薬の
反応を包含する誘導体化方法に好適である。新規の誘導体化タンパク質化合物は
、高置換度でポリシアル酸鎖を有する。

【０００２】我々の先の出願番号WO-A-92/22331において、我々は、基質の、循環時間（cir
culation time）を増加させるため、免疫原性を減少させるためおよび／または
インビボにおける安定性を増加させるために、ポリサッカリド（特に、ポリシア
ル酸）を使用して薬物送達システムまたはタンパク質を誘導体化する方法を記載
する。タンパク質との誘導体化反応の実施例は存在しない。Ｒｏｙらは、J. Che
m. Soc. Chem. Comm. 1993, 264-265において、タンパク質の第１級アミン基へ
のアクリリック官能性シアル酸のマイケル付加による誘導体化を記載する。反応
は、変性剤として一般的に記載されていない炭酸水素アンモニウムの存在下で行
われる。

【０００３】ドデシル硫酸ナトリウムが、０．０１Ｍの濃度で、水性組成物におけるタンパ
ク質の３次元立体配座に対して影響を有することが周知である。例えば、Prakas
hらは、Int. J. Peptide Protein Res. (1980) 15, 305-313において、円二色性
スペクトルを使用して、ＳＤＳがＳｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍＬ（ゴマ種
子）のα−グロブリンにおいてよりαヘリックスな構造を誘発することを示す。
Visserらは、Biochemistry (1971) 10 (5) 743-752において、種々の光学特徴の
エラスターゼ、および他の酵素を使用して、ＳＤＳの存在下における立体配座の
変化を測定する。溶液中のタンパク質濃度は０．０１〜０．１％まで変化し、一
方、ＳＤＳ濃度は０．２〜２重量％の範囲であった。ＳＤＳは、これらの条件下
でいくつかの酵素の活性を不可逆的に阻害することが示された。

【０００４】尿素の存在下でタンパク質の２つのシステイン単位間のジスルフィド架橋を還
元することが公知であり、これは、タンパク質のアンフォールディング（unfold
ing）を促進し、そしてメルカプトエタノール還元剤へのジスルフィド基の接近
可能性（accessibility）を増大させる。

【０００５】本発明者が知る限り、ＳＤＳのようなアニオン性両親媒性化合物は、水性誘導
体化手順の間、溶液中のタンパク質の立体配座に影響を与えるために使用されて
いない。

【０００６】本発明によれば、少なくとも２つの誘導体化可能なペンダント基（アミノアシ
ル単位の側鎖である）を有するタンパク質を水溶液中で誘導体化試薬と反応させ
て、タンパク質誘導体を得る方法であって、そして該誘導体化反応が有効変性化
濃度の変性剤の存在下で行われることを特徴とする、新規の方法が提供される。

【０００７】好ましくは、該ペンダント基での産物の置換度は、タンパク質１モル当たり少
なくとも２当量基である。

【０００８】該方法において、通常、タンパク質誘導体が、好ましくは透析工程を含む方法
によって、該変性剤から単離される、引き続いての工程が存在する。

【０００９】本発明において、変性剤は、カオトロピックイオン（例えば、Ｉ^-またはＳＣ
Ｎ^-）、強酸から誘導されるラージアニオン（large anion）（例えば、ＣｌＯ₄ ^- またはＣＣｌ₃ＣＯＯ^-）、有機溶媒、尿素、またはグアニジン化合物のような誘
導体であり得る。好ましくは、それは、両親媒性化合物、より好ましくはアニオ
ン性両親媒性物質である。アニオン性両親媒性物質は、好ましくは、８〜２４の
炭素原子を有するアルコールのスルフェートモノエステルである。好ましくは、
それは、アルカリ金属塩の形態で、反応混合物へ添加される。好ましくは、両親
媒性物質は、Ｃ_8-24アルキル硫酸ナトリウムまたはカリウム、最も好ましくはド
デシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulphate）である。

【００１０】本発明において、両親媒性物質は、一般的に、０．０００１〜０．０１Ｍの範
囲、最も好ましくは０．０００５〜０．００５Ｍの範囲、最も好ましくは約０．
００１Ｍの濃度で存在する。

【００１１】本発明において、出発タンパク質は、全て同一性質の、少なくとも２、より好
ましくは少なくとも５、例えば１０またはそれ以上の誘導体化可能な基を有する
。該基は、ヒドロキシル基、チオール基、カルボン酸基、または好ましくは第１
級アミン基であり得る。最も好ましくは、誘導体化可能な基は、リシル単位の側
鎖である。従って、好ましくは、タンパク質は、骨格において、少なくとも２、
より好ましくは少なくとも５、例えば１０またはそれ以上のリシン単位を有する
。好ましくは、少なくとも２つの反応性基が誘導体化され、より好ましくは少な
くとも５の反応性基が誘導体化され、すなわち、タンパク質の誘導体化度は少な
くとも５である。

【００１２】本発明において、誘導体化試薬は、必要に応じてカップリング化合物の存在下
で、水溶液中においてタンパク質と反応するに好適な反応性基を有する化合物で
ある。カップリング化合物および活性化化学種は、例えば、“Methods in Enzym
ology” 135B (Immobilised Enzymes and Cells), 1987, Mosbach ed, Academic Press Inc., New York および Nucci, M. L. et al. Adv. Drug Delivery Revi
ews 6, 133-151 (1991) に記載されている。

【００１３】試薬は、例えば、タンパク質の、安定性を与えるため、免疫原性を減少させる
ため、または溶解性もしくは循環時間を増加させるため、あるいは該タンパク質
を標的化するために使用される化合物である。それは、オリゴ−またはポリサッ
カリド、ポリ（ヒドロキシアルキル（アルク）アクリルアミドもしくは−（アル
ク）アクリレート）（poly(hydroxyalkyl(alk)acrylamide or -(alk)acrylates)
、ポリビニルアルコールまたはポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレ
ングリコール）のような、オリゴマー性またはポリマー性化合物であり得る。

【００１４】誘導体化試薬は、例えば、WO-A-9004606に記載のトレシル−ＰＥＧ（tresyl-P
EG）またはＰＥＧのスクシンイミジルスクシネートエステルのような、活性化ポ
リエチレングリコール（単官能性）であり得る。これらの化合物は、ヒドロキシ
ルおよびチオール基ならびにアミン基と反応し得る。

【００１５】本発明は、第１級アミンペンダント基と反応される誘導体化試薬がアルデヒド
化合物である場合、特に有用である。この場合、還元条件下での該タンパク質と
該試薬との縮合によって、第２級アミン結合化産物が生成される。

【００１６】最も好ましくは、アルデヒド化合物は、例えばアルコールの制御された酸化に
よって生成される、サッカリドまたはポリサッカリドの誘導体である。最も好ま
しくは、アルデヒドは、本発明の方法における第１工程であってもよい予備工程
において生成され、ここで、サッカリドまたはポリサッカリドは、水性反応にお
いて、例えば過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、制御された酸化条件下で反応さ
れる。最も好ましくは、サッカリドまたはポリサッカリドは、シアル酸、または
その誘導体、最も好ましくは末端シアル酸基を有するポリサッカリドであり、そ
して最も好ましくはポリシアル酸、即ち、２→８または２→９結合を介して互い
に結合された少なくとも５シアル酸単位を含むポリサッカリドである。好適なポ
リシアル酸は、２〜２０００ｋＤａの範囲、好ましくは５〜５０ｋＤａの範囲の
重量平均分子量を有する。最も好ましくは、ポリシアル酸は、細菌源から誘導さ
れ；例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、もしくはＥ
．ｃｏｌｉＫ１のポリサッカリドＢ、またはＥ．ｃｏｌｉＫ９２株のＫ９２
ポリサッカリドであるかまたはこれから誘導される。それは、最も好ましくは、
Ｅ．ｃｏｌｉＫ１由来のコロミン酸である。

【００１７】少なくとも５のペンダントポリシアル酸鎖を有するタンパク質は新規であると
思われる。本発明の更なる局面によれば、各々が互いに結合された少なくとも５
のシアル酸単位を有する、少なくとも５のペンダントポリシアル酸鎖を有する新
規のタンパク質が提供される。

【００１８】シアル酸試薬を、例えば、制御された酸化条件下で過ヨウ素酸ナトリウムと反
応させて、Ｃ₇原子に末端アルデヒドを形成する。酸化条件は、好ましくは、約
０．１Ｍの濃度の過ヨウ素酸ナトリウムを含み、ポリシアル酸の溶液を誘導体化
するために過剰に使用される。反応条件は、好ましくは、室温での５〜６０分間
の反応を含む。過剰の過ヨウ素酸塩を失活させるために、エチレングリコールと
の反応のような慣用的な手段が使用される。

【００１９】本発明の方法の誘導体化工程は、好ましくは、０〜６０℃、好ましくは１０〜
４５℃の範囲の温度で、例えば３０〜４０℃の範囲の高温で、水性反応混合物中
のタンパク質と共に行われる。タンパク質は、好ましくは、０．１〜１００ｇ／
ｌの範囲、好ましくは１〜２０ｇ／ｌの範囲の濃度で存在する。反応混合物は、
例えば好適なｐＨの溶液を緩衝化するために、溶解された無機塩のような他の成
分を含み得る。

【００２０】本発明において誘導体化されるタンパク質は、例えば、治療学的に活性な化合
物であり得る。誘導体化反応は、例えば、タンパク質の親水性または親油性を制
御するため、例えば、液体媒体中におけるその溶解性を調節するため、特に水性
媒体中におけるその親水性および溶解性を増大させるためであり得る。誘導体化
反応は、我々の先の公報WO-A-92/22331におけるように、治療学的化合物の、循
環時間を増加させるため、免疫原性を減少させるため、および／またはインビト
ロまたはインビボにおける保存安定性を増大させるためであり得る。ポリ（エチ
レングリコール）での誘導体化は、タンパク質の親水性を増大させ、このことは
、タンパク質の、水性溶解性またはアベイラビリティ（availability）を増大さ
せ、循環時間を増加させ、または免疫原性を減少させ得る。変性剤化合物の存在
は、誘導体化度（the degree of the derivatisation）を増加させ、それによっ
て、タンパク質の、溶解性、循環時間および／または免疫原性における改善また
は安定性の増大を促進する。誘導体化度のこの増加は、タンパク質の活性（例え
ば、その酵素活性）に悪影響を与えることなしに行われ得ることが見出された。
従って、Ｖｉｓｓｅｒら（前出）の知見とは対照的に、アニオン性両親媒性物質
の存在はタンパク質を不可逆的に非活性化せず、実際に、以下に示されるように
、それは非活性化を抑制する。あるいは、誘導体化は、ポリマーを付加すること
またはリガンドを結合させることによって、能動的（active）または受動的（pa
ssive）標的化を提供するためであり得る。

【００２１】循環におけるそのアベイラビリティ（availability）が本発明によって有利に
延長されるであろう薬学的に活性なタンパク質は、サイトカイン、例えばインタ
ーロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６またはＩＬ−１）、インターフェロン
、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、ペプチドホルモン（例えば、インシュリ
ン）、ならびに例えば酵素治療における使用のための酵素、ならびにイムノグロ
ブリン、およびアプロチニンである。

【００２２】あるいは、タンパク質は、担体またはアジュバントであり得、そして誘導体化
反応は、薬学的に活性なまたは診断学的に有用なリガンドを該タンパク質へ結合
させて、標的対象（target issue）への該有用なリガンドの送達を最適化する。

【００２３】以下の実施例において、カタラーゼをモデルタンパク質として使用する。

【００２４】一般的方法カタラーゼ測定カタラーゼは、酸素および水への過酸化水素の分解を触媒する、４量体ヘムプ
ロテイン（haemprotein）である。反応は、酵素活性を測定するために使用され
得る。反応は１次反応であり、これによって、分解された過酸化水素基質の量は
、基質および酵素の両方の濃度に正比例する。基質濃度が実験間で一定であるな
らば、分解速度の差異は、従って、存在する酵素活性の関数であろう。本実施例
において、３ｍｌの反応容積を有するキュベット中の３．４５μモルの過酸化水
素の分解に対応する、０．４５０から０．４００への２４０μｍでの過酸化水素
の吸光度の降下が、測定される。

【００２５】カタラーゼ（活性および不活性）の濃度は、該酵素が、４０５ｎｍで、特徴的
な吸光最大値、ソレー帯を示すという事実による。カタラーゼ濃度を、分光光度
法で測定する。

【００２６】カタラーゼ、インシュリン、アプロチニンおよびＩｇＧ標識およびクリアラン
ス測定カタラーゼ、インシュリン、ＩｇＧおよびアプロチニンを、¹²⁵Ｉを使用する
慣用方法、通常クロラミンＴ法を使用して、放射標識した。

【００２７】循環における放射標識化タンパク質を、Fernandes, A. I. et al, Biochem. B
iophys. Acta (1997) 1341, 26-34において記載される技術を使用して測定した
。

【００２８】コロミン酸（ポリシアル酸）の活性化コロミン酸は、約１０ｋＤａの平均分子量を有するＥ．ｃｏｌｉＫ１の誘導
体である。ポリサッカリドは、２−８の結合されたシアル酸単位のみから実質的
になる。

【００２９】コロミン酸の活性化（酸化）を以下のように行う。過ヨウ素酸ナトリウムの０
．１Ｍ水溶液を形成する。１ｍｌの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を、暗所で、１０
ｍｇのコロミン酸と混合し、そして反応混合物を室温および圧力（約２０℃、１
ｂａｒ）で１５分間攪拌する。反応を、２ｍｌのエチレングリコールの添加、続
いて同一条件下で３０分間攪拌することによって終結させる。引き続いて、混合
物を、０．０１重量％炭酸アンモニウム緩衝液に対して４０℃で広範に透析する
。透析物を一晩凍結乾燥させ、ついで次の使用まで冷蔵する。反応スキームを図
１に示す。

【００３０】シアル酸の測定シアル酸を、水溶液中の０．５ｍｌサンプル（４〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲のシ
アル酸の濃度を有する）（これへ０．５ｍｌレゾルシール試薬を添加した）を形
成することによって測定する。混合物を、密封チューブ中、３０分間、水浴中で
煮沸する。混合物を２０〜３０分間冷却し、そしてその吸光度を、好適な緩衝液
（即ち、オリジナルのサンプルが存在するタイプおよび濃度のもの）および試薬
のコントロール混合物に対して５７０ｎｍで読む。

【００３１】ポリ（エチレングリコール）の測定ペグ化（pegylation）のレベルを、アンモニウムフェリチオシアナート（ammo
nium ferrithiocyanate）を使用するＰＥＧのアッセイ（A. Nag, G. Micra and
C Ghost, Anal. Biochem. 237:224-231, 1996）によって評価した。

【００３２】タンパク質の測定誘導体化されたＩｇＧ、アプロチニンまたはインシュリンを含むサンプルを、
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用して、可溶性タンパク質含有量について評価した。１
００μｌタンパク質溶液（１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度を有
する）および１ｍｌ呈色試薬（colour reagent）（酸／色素溶液）を混合した。
吸光度を、好適なブランクに対して５９５ｍｍで読む。

【００３３】以下の実施例において使用されるＩｇＧを、この方法を使用してそのシアル酸
含有量について試験した。それは、２％シアル酸含有量を有するとわかった。こ
の数字は、実施例に従うコロミン酸誘導体化を使用してのポリシアリル化（poly
sialylation）のレベルを評価する場合に考慮される。

【００３４】試薬カタラーゼをＳｉｇｍａから得た。インシュリンをＳｉｇｍａから得た。Ｉｇ
Ｇは、Ｓｉｇｍａから得たウシ血清ＩｇＧである。アプロチニンをＢＤＨから得
た。モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート（分子
量約５ｋＤ）を、Ｓｉｇｍａから得た。コロミン酸をＳｉｇｍａから得た。ドデ
シル硫酸ナトリウムをＳｉｇｍａから得た。尿素をＢＤＨから得た。

【００３５】実施例１−カタラーゼとコロミン酸の反応本実施例は、活性化コロミン酸−カタラーゼ誘導体化反応における反応時間の
効果を、該誘導体化酵素の回収後のカタラーゼ活性を評価することによって、示
す。

【００３６】５ｍｌのリン酸水素カリウム緩衝液中、２０ｍｇのソディウムシアノボロヒド
リド（sodium cyanoborohydride）の存在下、５０ｍｇの活性化コロミン酸と共
に、２４ｍｇのカタラーゼを使用しての誘導体化を行った。反応物を、３５〜４
０℃で、４８時間までの時間の間、攪拌した。ＳＤＳ存在下で行われた誘導体化
反応については、固形ＳＤＳをホスフェート緩衝液に溶解させて、最終濃度１×
１０^-3ＭＳＤＳを得る。

【００３７】ゼロ時間（即ち、反応混合物が作製された後、可能な限り迅速に）、６時間、
１２時間、２４時間および４８時間の反応時間後、反応を、７０％の硫酸アンモ
ニウム溶液の添加によって停止させてタンパク質を析出させる。析出した混合物
を氷上で冷却し、そして１時間攪拌し、次いで４５分間３５００ｒｐｍで遠心分
離する。上澄みを捨て、そしてペレットを飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、
同一速度で１０分間再度回転し、そして上澄みを捨てる。ペレットを５ｍｌのリ
ン酸緩衝化生理食塩水に再溶解する。得られた溶液を、４交換（changes）のリ
ン酸緩衝化生理食塩水に対して−４℃で広範に透析する。次いで、溶液を、Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−１００カラムに通過させ、そしてピークを集め、カタ
ラーゼおよびコロミン酸含有量について評価する。

【００３８】図２は、ＳＤＳの存在下および非存在下でのカタラーゼとのコロミン酸の結合
比率（置換度）を示す。結果は、ＳＤＳの存在が約３倍だけ最大結合比率を増加
させることを示す。ＳＤＳの存在下における誘導体化の最大レベルは、カタラー
ゼ１モル当たり約８モルのコロミン酸であるようである。

【００３９】誘導体化カタラーゼ化合物をまた、それらの酵素活性について、天然カタラー
ゼに対して試験した。結果を図３に示す。図３におけるカタラーゼのみについて
の結果は、活性化コロミン酸の添加なしでの反応条件へカタラーゼを供する効果
を示す。これは、カタラーゼ活性がそれらの条件下で失われるが、活性の損失は
ポリシアリル化によって抑制されることを示す。インヒビターは、ポリシアリル
化がＳＤＳの存在下で行われる場合により大きい。

【００４０】実施例２−カタラーゼ活性に対するＳＤＳ濃度を変化させることの効果の測定実験１に使用される一般的なカップリング手順を、カタラーゼを誘導体化する
ために使用し、但し、ＳＤＳ濃度を０．０１重量％、０．０２重量％および０．
０２９重量％（１×１０^-3Ｍ）で使用し、誘導体化反応を４８時間の間続けた。

【００４１】誘導体化カタラーゼ産物を、上述の一般的な試験を使用して、それらのカタラ
ーゼ活性について評価した。酵素が吸光度を０．４５から０．４０へ減少させる
ためにかかる時間を、天然カタラーゼと比較して、表１に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】実施例３天然カタラーゼ、４８時間の反応時間の間１×１０^-3ＭＳＤＳを使用して誘
導体化されたカタラーゼ、および同一反応時間を使用してしかしＳＤＳの非存在
下で誘導体化されたカタラーゼを、種々の濃度の過酸化水素で比較し、Ｈａｎｅ
ｓＷｏｏｌｆプロットを形成した。天然カタラーゼについてのＫｍ（反応速度
がその最大値の半分となる基質濃度）は８３．９５ｍＭであり、ＳＤＳの非存在
下で生成されたコロミン酸−カタラーゼについてＫｍは１１４．４ｍＭであり、
そしてＳＤＳの存在下で修飾されたカタラーゼについてＫｍは１４０．８ｍＭで
ある。

【００４４】実施例４−ＳＤＳの存在および非存在下におけるタンパク質のポリシアリル化各タンパク質について、１ｍｇの¹²⁵Ｉ−標識化および非標識化タンパク質を
、５ｍｌのリン酸水素カリウム中、２０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムの存在下
で、８３．３ｍｇの活性化コロミン酸と反応させる。ＳＤＳの存在下での反応の
ために、ＳＤＳを溶解させて、１×１０^-3Ｍの最終濃度を得る。誘導体化反応を
、３５〜４０℃の範囲の温度で４８時間行う。

【００４５】反応後、誘導体化タンパク質を、実施例１におけるのと同一の一般的技術を使
用して、しかし９０００ｒｐｍでの遠心分離を使用して回収する。単離ために使
用されるカラムは、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０である。

【００４６】表２は、４つのタンパク質について、ＳＤＳ有りまたは無しでの、結合収率（
つまり、誘導体化度）を示す。

【００４７】アプロチニンは、アルデヒド試薬による誘導体化に利用可能な２末端アミノ基
および誘導体化可能なアミン基を有する４リシル単位を有する。

【００４８】

【表２】

【００４９】結果は、試験された各タンパク質について、ＳＤＳの存在が誘導体化度を増加
させることを示す。

【００５０】実施例５−インビボクリアランス率天然形態の、ならびにＳＤＳの存在下および非存在下でコロミン酸（ポリシア
ル酸ＰＳＡ）で誘導体化された、標識されたインシュリン、アプロチニンおよび
ＩｇＧを、循環からのクリアランス率を測定するために、マウスへ投与する。イ
ンビボ試験を、WO-A-92/22331の実施例１に記載の一般的技術を使用して、表３
に示される用量のタンパク質または誘導体化タンパク質の注射によって行う。動
物を、注射の直前および直後、注射後３０分、１時間、４時間、６時間、１２時
間、２４時間および４８時間で、尾静脈から採血して、循環中に残存する¹²⁵Iレ
ベルを測定した。注射に続く時間に対するパーセント初期放射活性の対数曲線か
ら、曲線下面積を測定する。種々のタンパク質についての結果を表３に示す。

【００５１】

【表３】

【００５２】表３の結果は、コロミン酸での各タンパク質の誘導体化が、循環時間の増加を
生じさせることを示し、それによってWO-A-92/22331に記載の結果が確認される
。循環時間の増加の程度は、誘導体化がＳＤＳの存在下で行われる場合に、有意
に増加される。

【００５３】実施例６−尿素の存在下での誘導体化実施例１に従う誘導体化方法を、カタラーゼの代わりにＩｇＧを使用して繰り
返した。５Ｍ尿素または１×１０^-3ＭＳＤＳを使用した。反応混合物の個々の
アリコートにおける反応を、６、１２、２４および４８時間後に停止させた。誘
導体化度を、上述のＢｒａｄｆｏｒｄ技術を使用してタンパク質レベルおよび上
述のレゾルシノール法を使用してシアル酸レベルを評価した後に、決定した。結
果を図４に示す。

【００５４】図４における結果は、尿素の存在が、タンパク質立体配座の変化を提供するた
めに通常予想される濃度で、ＳＤＳよりも少ない量だけではあるが、誘導体化の
レベルを増加させることを示す。

【００５５】実施例７−ＳＤＳの存在下におけるＩｇＧのペグ化（Pegylation）およびポリ
シアリル化上記実施例において使用されるようなＩｇＧを、実施例４において使用される
ような一般的条件下で、１０^-3ＭＳＤＳの非存在下および存在下における、酸
化コロミン酸（ＣＡ）での誘導体化へ供した。

【００５６】同一タンパク質をまた、ＳＤＳの非存在下および１０^-3ＭＳＤＳの存在下に
おいて、モノメトキシポリ（エチレングリコール）スクシンイミジルスクシネー
ト（ｓｓＰＥＧ）によって誘導した。反応は、Tsutsumi et al (1995) Brit. J.
Cancer 71:963-968に基づく。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中のＩｇＧ
を、１０分間、室温で、５０倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールスク
シンイミジルスクシネート（ｓｓ−ＰＥＧ）と反応させた。反応を、ｓｓ−ＰＥ
Ｇに対して５倍モル過剰のε−アミノカプロン酸の添加によって停止させた。得
られたＰＥＧ−ＩｇＧを精製し、そしてゲル浸透クロマトグラフィー（ＳＧ−１
００；０．２Ｍリン酸緩衝液）によって分離した。ＳＤＳの存在下における反応
について、ＩｇＧを、先ず、１２時間、高温で、０．２Ｍリン酸緩衝液中、１０^-3 ＭＳＤＳと接触させた。その他の点では、反応および回収は同一であった。

【００５７】ペグ化（pegylated）およびポリシアリル化ＩｇＧの誘導体化度を、上述の方
法を使用して測定した。結果を表４に示す。

【００５８】

【表４】

【００５９】ＳＤＳの存在は、ＰＥＧ試薬ならびにポリシアル酸試薬についての誘導体化レ
ベルを増加させる。ＰＥＧ試薬は、コロミン酸試薬よりも高い置換度を与える。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ポリシアル酸の誘導体化についての反応スキームである。

【図２】図２は、実施例１の結果を示す。

【図３】図３は、実施例１の結果を示す。

【図４】図４は、実施例６の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B050 CC02 GG03 LL01 LL03 4C084 AA01 AA07 NA14 ZB011 4H045 AA10 AA20 BA53 BA56 BA57 DA89 EA20 EA50 FA83 GA45

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも２つの誘導体化可能なペンダント基（アミノアシ
ル単位の側鎖である）を有するタンパク質を水溶液中で誘導体化試薬と反応させ
て、タンパク質誘導体を得る方法であって、そして該誘導体化反応が有効変性化
濃度の変性剤の存在下で行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】前記変性剤が両親媒性化合物である、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】前記両親媒性化合物がアニオン性である、請求項２に記載の
方法。
【請求項４】前記変性剤がＣ_8-24アルキルスルフェートモノエステル、好
ましくはアルカリ金属塩、より好ましくはドデシル硫酸ナトリウムである、請求
項３に記載の方法。
【請求項５】前記変性剤が０．０００１〜０．０１Ｍの範囲の濃度で存在
する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】前記タンパク質誘導体が、好ましくは透析を含む回収工程に
おいて、前記変性剤から単離される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記タンパク質が少なくとも５、好ましくは少なくとも１０
の誘導体化可能な基を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記誘導体化可能な基が、全て同一であり、そしてヒドロキ
シル、チオール、カルボン酸およびアミン基から選択され、そして好ましくは全
てのアミン基、特にリシル残基のイプシロンアミノ基である、前記請求項のいず
れかに記載の方法。
【請求項９】前記誘導体化試薬が、ポリビニルアルコール、ポリエチレン
グリコール、ポリ（ヒドロキシアルキル−（アルク）アクリルアミドおよび−ア
クリレート）およびポリサッカリド化合物から好ましくは選択される、ポリマー
性化合物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記誘導体化試薬が、サッカリド、好ましくはオリゴ−ま
たはポリ−サッカリド、より好ましくはポリシアル酸誘導体である、請求項９に
記載の方法。
【請求項１１】前記試薬がポリシアル酸のアルデヒド誘導体である、請求
項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記誘導体化試薬が、単官能性活性化（ポリエチレングリ
コール）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】前記タンパク質が治療学的に活性な化合物である、前記請
求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記産物の置換度が、少なくとも２、好ましくは少なくと
も５である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】各々が互いに結合された少なくとも５のシアル酸単位を有
する、少なくとも５のペンダントポリシアル酸鎖を有する、タンパク質化合物。
【請求項１６】前記ポリシアリック鎖が、第２級アミン結合を介して非末
端リシル単位の側鎖へ結合されている、請求項１５に記載のタンパク質化合物。
【請求項１７】前記ポリシアリック鎖が、各々、少なくとも１０、好まし
くは２０〜５０の互いに結合されたシアル酸単位を有する、請求項１５または請
求項１６に記載のタンパク質化合物。