JP2008531764A - タンパク質の誘導体化及び結合のための活性化シアル酸誘導体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)は、末端のシアル酸の非還元性末端においてタンパク質反応性アルデヒドを形成するための、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたCA(E.coli由来のアルファ−2,8結合したPSA)の酸化後の、アルデヒドとタンパク質の第1級アミン基との反応を示し、
b)は、タンパク質のアミノ基との安定で不可逆性の共有結合を形成するための、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を用いた、シッフ塩基の選択的還元を示す。
R2は連結基であり、
Aは、NR5、NR5NR6、O又はSRであり(式中、R5及びR6は独立して、H、C1〜4アルキル及びアリールから選択される)、
SylOはシアリル基であり、
nは1〜100であり、mは0〜100であり、
R3は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、
R4は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである)
を有する。
a)ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
b)アルデヒド基を形成するための、工程a)で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
c)例えばシアノ水素化ホウ素(cyano borohydrate)を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程b)のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
d)工程c)による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性NHS試薬と反応させる工程と
を含み得る。
e)非還元性末端シアル酸ユニットをC−7及びC−8のビシナルジオール基において酸化し、C−7にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、
f)C−7のアルデヒド基を対応するアルコールへと還元するための還元工程と
に供される。この工程はまた同時に、還元性末端のシアル酸環を還元的に開環する、すなわち、工程a)と同時に行われる。本発明のこの態様は、「不動態化された」シアル酸非還元性末端を有するシアル酸誘導体を提供し、過ヨウ素酸塩による酸化(工程b)及び還元アミノ化(工程c)を介して還元性末端を活性化させる。
ビス[2−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)及びそのスルホ類似体、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート)(BS3)、
ジスクシンイミジルグルタレート(DSG)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ジスクシンイミジルタートレート(DST)又はそのスルホ類似体、
3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、並びに
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)及びそのスルホ類似体である。
R7は連結基であり、
A1はNR12(式中、R12はH、C1〜4アルキル又はアリールである)であり、
GlyOはグリコシル基であり、kは0〜100であり、
Gly1Oは、ペンダント型カルボン酸基上で必要に応じて誘導体化されるグリコシル基であり、R8は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分であり、
R8及びR9はそれぞれ、水素、又はモノ−、ジ−、オリゴサッカライド基、アルキル基、アシル基、薬物、脂質又はドラッグデリバリーシステムであり、
R10は、モノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリサッカライド基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、ドラッグデリバリーシステム、又は細胞膜若しくは細胞壁の成分、
又は基
で表され得る。
N−(α−マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル(AMAS)、
N−(β−マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル(BMPS)、
N−(ξ−マレイミドカプリルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)、又はそのスルホ類似体、
N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート)(LC−SMCC)、
m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート)(SHCC)又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(SMPB)又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−6−(β−マレイミド−プロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、
N−(k−マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル(スルホ−KMUS)、
スクシンイミジル−6−[3−2(2−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド]ヘキサノエート(LC−SPDP)又はそのスルホ類似体、
4−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)又はそのスルホ−LC類似体、
N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、
N−スクシンイミジル[4−ビニルスルホニル)ベンゾエート(SVSB)、
スクシンイミジル−3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)、及び
N−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)及び
N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)又はそのスルホ類似体である。
実施例
材料
メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Sigma Chemical Laboratory(英国)から入手した。使用されるCA、鎖状アルファ−(2,8)結合したE.coli K1 PSA(平均22.7kDa、多分散性(p.d.)1.34;39kDa、p.d. 1.4;11kDa、p.d. 1.27)はCamida(アイルランド)から入手した。他の物質は、2,4ジニトロフェニルヒドラジン(Aldrich Chemical Company、英国);透析チューブ(3.5kDa及び10kDaのカットオフ限界(Medicell International Limited、英国));Sepharose SP HiTrap、PD−10カラム(Pharmacia、英国);XK50カラム及びSepharose Q FF(Amersham Biosciences、英国);トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル(4〜20%及び16%)、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー(Novex、英国)を含む。脱イオン水は、Elgastat Option 4水精製ユニット(Elga Limited、英国)から得た。使用される全ての試薬は、分析用グレードである。プレートリーダー(Dynex Technologies、英国)を、タンパク質又はCAアッセイにおける分光学的測定のために用いた。
方法
タンパク質及びCA測定
シアル酸であるCAの定量評価は、別記されるように(Gregoriadis他、1993;Fernandes及びGregoriadis、1996及び1997)、レゾルシノール法(Svennerholm、1957)によって行った。GHはビシンコニン酸(BCA)比色法によって測定した。
XK50カラムに900mlのSepharose Q FFを充填し、3カラム体積の洗浄バッファー(20mMトリエタノールアミン;pH7.4)を用いて、50ml/分の流量で平衡とした。CA(200mlの洗浄バッファー中に25グラム)をシリンジポートを介して50ml/分でカラムに供給した。その後、1.5カラム体積(1350ml)の洗浄バッファーでカラムを洗浄した。
新たに調製した0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4;CAに対して6倍過剰モル)溶液を20℃でCAと混合し、この反応混合物を暗所で15分間、磁気攪拌させた。酸化させたCAを、70%(最終濃度)エタノールを用いて、混合物を3000gで20分間遠心分離することによって沈殿させた。上清を除去し、ペレットを最小量の脱イオン水に溶解した。CAを再度70%エタノールで沈殿させた後、12,000gで遠心分離した。ペレットを最小量(quantitiy)の水に溶解し、凍結乾燥して、次に使用するまで−20℃で保存した。
CAの酸化度の定量評価は、カルボニル化合物との相互作用において、難溶性の2,4ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる2,4ジニトロフェニルヒドラジン(2,4−DNPH)を用いて行った。非酸化CA及び酸化CA(CAO)(各5mg)を、2,4−DNPH試薬(1.0ml)に添加し、この溶液を振盪し、その後、結晶性沈殿が観察されるまで37℃で放置した(Shriner他、1980)。CAの酸化度(定量的)は、アルカリ性溶液中のフェリシアニドイオンのフェロシアン化第二鉄(ペルシアンブルー)への還元に基づく方法(Park及びJohnson、1949)を用いて測定した(後で630nmで測定する)。この例では、グルコースを標準液(standard)として用いた。
10〜100mg/mlのCAOを、50mlのチューブ内で300倍過剰モルのNH4Clを含む2mlの脱イオン水に溶解した後、NaCNBH4(1N NaOH水溶液中に5Mのストック)を最終濃度が5mg/mlとなるように添加した。この混合物を室温で5日間インキュベートした。CAOの代わりにコロミン酸を用いて対照反応物も準備した。生成物であるコロミン酸アミン誘導体を、5mlの氷冷エタノールを添加することにより沈殿させた。沈殿物を4000rpmで30分間、室温で、卓上遠心機で遠心分離することにより回収した。ペレットはそのままにしておき、2mlの脱イオン水で再懸濁した後、10mlの超遠心チューブ内で5mlの氷冷エタノールを用いて再度沈殿させた。沈殿物を30,000rpmで30分間、室温で遠心分離することにより回収した。ペレットを2mlの脱イオン水で再懸濁し、凍結乾燥させた。
TNBS(ピクリルスルホン酸、すなわち2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸) 分析を用いて、生成物中に存在するアミノ基の量を測定した(Satake他、1960)。
NH4Clの代わりに100倍過剰モルのシスタミンを用いること以外は、実施例4aに記載したのと同様に、酸化させたCAを還元アミノ化によってシスタミンで誘導体化した。この生成物を精製する前に、これを37℃で1時間、50mM DTTで処理した。還元された生成物を、エタノール二重沈殿及びsepharose G25によるサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
上記の参照例4aで合成したCA−NH2(35kDa)(15〜20mg)を0.15M PBS(350μL、pH7.2)に溶解し、次に、PBS(150μL、PH7.2)に溶解した50又は75モル当量のBS3を添加した。この混合物を5秒間ボルテックスにかけた後、30分間20℃で反応させた。CA−NHS生成物を、溶離液としてPBS(pH7.2)を用いてPD−10カラムにより精製し、直ちにタンパク質及びペプチドのNH2基との部位特異的結合に用いた。PD10画分からのCA濃度の測定を、レゾルシノール分析を用いてシアル酸含有量を分析することによって行った。CAとNHSとの反応溶液を260nmで分析することによる紫外分光法によって、また254nmでの可視化を伴う薄層クロマトグラフィによって、CAポリマーにおけるNHS含有量を測定した。
CA(35kDa)試料をNaNO3(0.2M)及びCH3CN(10%;5mg/ml)に溶解し、2×GMPWXLカラム上で、屈折率を検出しながらクロマトグラフィを行った(GPCシステム:VE1121 GPC溶媒ポンプ、VE3580 RI検出器及びTrisec3ソフトウェア(Viscotek Europe Ltd)による照合)。試料(5mg/ml)を、0.45μmナイロン膜で濾過し、移動相として0.2M NaNO3及びCH3CN(10%)を用いて0.7cm/分で流した(図11)。
炭酸水素ナトリウムに溶解したGH(23mg/ml、pH7.4)を、過剰量のBS3を用いて実施例4bからのCA−NHS(35kDa)と共有結合させた。25:1又は50:1のCA−NHS:GHのモル比を用いて0.15M PBS(pH7.2、1.5ml)中で30分間、20℃で反応を行った。ポリシアリル化させたGHを、SDS−PAGE及びHPLC−サイズ排除クロマトグラフィにより測定された結合収量を用いて特徴付けた。対照は、天然のタンパク質を、CA−NHSの非存在下でBS3を用いた結合手順にかけることを含むものであった。CA−NH2をまた、天然のGHの非存在下でBS3を用いた結合手順にかけた。
CA−GH複合体を炭酸水素アンモニウムバッファー(0.2M、pH7)に溶解し、superose 6カラム上で、紫外線指数により検出しながら(Agilent、10/50システム(英国))クロマトグラフィを行った。試料(1mg/ml)を0.45μmナイロン膜で濾過し、175μlを注入し、移動相として炭酸水素アンモニウムバッファーを用いて0.25cm/分で流した(図12)。
SDS−PAGE(MiniGel、Vertical Gel Unit、型式 VGT 1、電源型式 Consort E132(VWR、英国))を、ポリシアリル化におけるGHの分子サイズの変化を検出するために使用した。反応混合物からの0分(対照)及び30分の試料におけるGH及びその(CA−NHSとの)複合体、並びにプロセスの対照(非酸化CA)のSDS−PAGEを、4〜20%ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。この試料を幅広い分子量マーカーに対して較正した(図13及び図14)。
結果
CA(22.7kDa)及びその誘導体を、1.1未満の多分散性、46kDaまでの平均分子量、及び種々の%割合を有する様々な狭い種(narrow species)に、首尾よく分画した。表2は22.7kDaの物質を分離した結果を示す。
400μlの20mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)中で2時間、25℃で、50mgの酸化されたコロミン酸(19kDa)を2.6mgのヒドラジン(液体)と反応させた。次に、このコロミン酸を70%エタノールで沈殿させた。この沈殿物を350μlのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)に再溶解し、NaCNBH3を5mg/mlまで添加した。この混合物を4時間、25℃で反応させた後、一晩凍結させた。移動相として0.15M NH4HCO3を用いて、Sephadex G25を充填したPD10カラム上のゲル浸透クロマトグラフィによって、NaCNBH3及び反応副生成物を除去した。画分(各0.5ml)を(アミノ基に対して特異的であり、既述の)TNBS分析によって分析した。画分6、7、8及び9(ボイドボリューム画分)は、バックグラウンドよりもかなり強いシグナル(singal)を有し、バックグラウンドはNH4 +イオンの存在により高い値を示した。また、画分6、7、8及び9はコロミン酸を含有していた。これらの4つの画分を凍結乾燥し、CA−ヒドラジド(CAH)を回収した。
10mgの19kDaであるCA−ヒドラジドを9mgのBS3と、400μlのPBS(pH7.4)中で30分間、室温で反応させた。この反応混合物をSephadex G25を充填したPD10カラムに入れて、0.5ml画分を回収した。0.1mgのBSAを5〜9の各画分に加えた。室温で2時間後、画分をBSAと反応させた。これらの試料をSDS−PAGE及びSEC HPLCで分析した。
参考文献
Claims (14)
- シアル酸ユニット由来の少なくとも1つの末端ユニットを有するポリシアル酸(PSA)基質分子を含む化合物であって、必要に応じてリンカーを介して、シアル酸ユニットの2位又は7位炭素のいずれかで該ユニットと結合するN−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む、化合物。
- 各末端ユニットが、N−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含むシアル酸ユニットに由来する、請求項1に記載の化合物。
- 一般式I、II又はIII
R2は連結基であり、
Aは、NR5、NR5NR6、O又はSであり(式中、R5及びR6は独立して、H、C1〜4アルキル及びアリールから選択される)、
SylOはシアリル基であり、
nは1〜100であり、mは0〜100であり、
R3は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、タンパク質、ペプチド、脂質、薬物、細胞膜若しくは細胞壁成分、又はドラッグデリバリーシステムであり、および
R4は、水素又はモノ−、ジ−、オリゴ−若しくはポリシアル酸基、アルキル基、アシル基、薬物、又はドラッグデリバリーシステムである)
を有する、請求項1又は2に記載の化合物。 - R2が、チオエステル結合、エステル結合、アミン結合又はアミド結合とみなされ得る任意のアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、へテロアリーレン、アルキルヘテロアリーレンから選択され、Aが、NR5、すなわちNR5基を介して前記分子の残りの部分と結合する連結基である、請求項3に記載の化合物。
- 必要に応じて予備末端シアル酸誘導体化工程(複数可)の後で、官能基の一方がNHSエステルであり、且つ官能基の他方が末端シアル酸ユニット(複数可)又はその誘導体(複数可)の2位又は7位炭素原子において反応性である、二官能性試薬と、場合によっては、該試薬と該シアル酸基(複数可)とを共有結合させると共に、該NHS基が変化しないような条件下で、PSA基質を反応させる方法。
- 前記基質中の前記シアル酸ユニットが、アミン基を生成する予備工程に供される、請求項5に記載の方法。
- 前記シアル酸ユニットが還元性末端ユニットであり、前記予備工程が、一連の:
a)ビシナルジオール基を形成するために、前記還元性末端シアル酸ユニットを開環する還元工程と、
b)アルデヒド基を形成するための、工程a)で形成された前記ビシナルジオール基の選択的酸化工程と、
c)例えばシアノ水素化ホウ素(cyano borohydrate)を用いたアンモニウム化合物との還元アミノ化による工程b)のアルデヒドのアミノ基への変換工程と、
d)工程c)による前記アミノ基を、過剰量のホモ二官能性NHS試薬と反応させる工程と
を含む、請求項6に記載の方法。 - 前記非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発物質が、工程e)該非還元性末端のシアル酸ユニットをC−7及びC−8のビシナルジオール基において酸化し、7位炭素原子上にアルデヒドを形成するための選択的酸化工程と、工程c)アンモニウム化合物との還元アミノ化による、工程e)のアルデヒド基のアミノ基への変換工程と、工程d)得られるアミノ基の修飾工程とに供される、請求項6に記載の方法。
- 前記NHS試薬が、ビス[2−スクシンイミジルオキシカルボニル−オキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート)(BS3)、
ジスクシンイミジルグルタレート(DSG)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ジスクシンイミジルタートレート(DST)又はそのスルホ類似体、
3,3’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、並びに
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)及びそのスルホ類似体から選択される、請求項8又は9に記載の方法。 - 前記NHS試薬との前記反応が、非プロトン性溶媒中で行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記基質中の前記シアル酸ユニットが、チオール基を生成する予備工程に供される、請求項5に記載の方法。
- 前記NHS試薬が、
N−(α−マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル(AMAS)、
N−(β−マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル(BMPS)、
N−(ξ−マレイミドカプリルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)、又はそのスルホ類似体、
N−(γ−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート)m(LC−SMCC)、
m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート)又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチラート(SMBP)又はそのスルホ類似体、
スクシンイミジル−6−(β−マレイミド−プロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、
N−(k−マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル(スルホ−KMUS)、
スクシンイミジル6−[3−2(2−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド]ヘキサノエート(LC−SPDP)又はそのスルホ類似体、
4−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)、
N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、
N−スクシンイミジル[4−ビニルスルホニル)ベンゾエート(SVSB)、
スクシンイミジル3−(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)、及び
N−スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)及び
N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(SIAB)又はそのスルホ類似体から選択される、請求項11に記載の方法。 - 第1級アミン基を有する生物学的に有用な化合物を、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物と、又は請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法の生成物と、前記N−スクシンイミジルオキシ基が置換された後に残るアシル基で前記アミンの活性水素を置換する条件下で反応させる、誘導体化方法。
- 前記生物学的に有用な分子が、第1級アミン基がN末端であるか又はリジンユニットのγ−アミノ基である、タンパク質又はペプチドである、請求項13に記載の誘導体化方法。
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