CN116507369A - 唾液酸配体修饰疗法 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了用于调节自相关分子模式识别受体的活性的方法及组合物，这些自相关分子模式识别受体是例如Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素)及补体因子H(CFH)。调节感染性生物如甲型、乙型、丙型流感病毒，以及SARS‑CoV1、2以及癌症/肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌和皮肤癌的活性。这些组合物包含颗粒，该颗粒包含由以下结构式表示的分子：P——L——G，其中P是包含至少一种本文所定义的生物相容性聚合物的生物相容性聚合物支架，G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)；并且L是共价接头或其药学上可接受的盐。

Description

唾液酸配体修饰疗法
技术领域
本披露提供用于调节自相关模式识别受体的活性的方法及组合物，这些自相关模式识别受体是例如Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素)及补体因子H(CFH)。所提供的组合物包含例如纳米颗粒、微粒、修饰有聚糖结构的其他聚合物结构，这些聚糖结构具有可结合、激动或拮抗自相关分子模式识别受体和感染相关唾液酸结合部分(其允许(感染原)在宿主体内的进入、繁殖和免疫监视的逃避)的末端唾液酸。
与此类自相关模式识别受体的结合，和/或对此类受体活性的激动或拮抗可解决先天性、适应性、多模式、炎性或补体介导的免疫应答，从而提供以下疾病的治疗：(1)急性炎症，如病毒性、细菌性、过敏原性、移植排斥或自身免疫性炎症；(2)慢性炎症，如慢性阻塞性肺疾病或风湿性障碍；和(3)先天性和适应性形式的慢性非消退炎症，如渗出性或非渗出性黄斑变性或阿尔茨海默病。
所提供的组合物还可用于阻断或拮抗自相关分子模式识别受体，这些受体可使癌细胞、感染原如病毒性、细菌性、蠕虫性、寄生性或损伤相关分子模式(DAMP)逃避先天或适应性免疫系统的免疫监视、检测和清除。
所提供的组合物还可用于通过结合唾液酸受体和/或唾液酸酶来防止感染原如流感嗜血杆菌、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和链球菌进入宿主细胞，该唾液酸受体和/或唾液酸酶附着于宿主的唾液酸并促进感染原进入宿主细胞并在其中繁殖。
背景技术
识别自我的能力即下调人体的免疫系统，使其不会破坏自身健康的宿主细胞。特定细胞的糖组(覆盖所有细胞的碳水化合物部分)的组成决定细胞是被识别为自相关细胞、非自体细胞还是受损细胞。在免疫监视和炎症过程中，免疫系统会检查遇到的细胞的糖组特征，从而确定该细胞是否需要通过免疫激活消除，或者该细胞是否是未受损的宿主细胞，从而发出免疫激活抑制或炎症消退的信号。在炎性细胞上发现的负责识别这种糖组特征的受体或结合区域被认为是自相关模式识别受体。
最大的自相关分子模式识别受体家族称为Siglec(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素)。目前有16种已有描述的Siglec。研究发现，Siglec位于炎性细胞的表面，其中在不同的炎性细胞上有不同的Siglec表达模式。当在健康宿主细胞表面存在特异性唾液酸配体模式时，激动的抑制性Siglec受体将激活免疫球蛋白酪氨酸激酶抑制基序(ITIM)，其募集含src同源性2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1和2(SHP-1和2)，两种磷酸酶都可将使炎性细胞处于激活状态的激酶去磷酸化。这种抑制性Siglec控制机制可深度关闭激活的炎性细胞，促使炎症消退。不同的Siglec具有不同的唾液酸特征，结合并激动受体，使炎性细胞严重失活。
激动Siglec 3、5、7、9、10、11或15将使给定细胞内所有激活(磷酸化)的酪氨酸激酶去磷酸化，促使细胞内关闭该特定细胞的激活。唾液酸配体以及这些配体对于特定Siglec受体的密度和呈现决定了其激动、拮抗或阻断受体结合位点的能力。
拮抗通过免疫球蛋白酪氨酸激酶激活基序(ITAM)激活炎症的Siglec 14或16是另一种抑制炎症的机制。当Siglec 14或16被激动时，ITAM被激活，并且ITAM内的酪氨酸残基被SRC激酶家族磷酸化，从而产生构象改变，使基序成为含有SH2结构域的蛋白质的停泊位点。激动Siglec 14和16也可用于激活炎症以治疗传染病，或用于肿瘤学领域。
补体因子H(CFH)代表另一种唾液酸结合自相关模式识别受体。CFH负责消减补体级联的激活，尤其是补体旁路途径。CFH通过结合和降解补体因子3Bb(C3Bb)下调补体级联。C3Bb代表传播补体级联的放大因子。CFH是补体旁路途径的中心调节因子。因为补体旁路途径是组成性激活的，故CFH充当“制动器”，防止补体级联加速并通过膜攻击复合物引起细胞溶解。当CFH被激活并与适当的自相关分子模式(适当地呈递给CFH的唾液酸配体)结合时，CFH会与C3Bb结合，从而阻止Bb结合C3Bb，进而阻止C3BbBb的形成。C3BbBb是传播和加速补体级联的限速中间体。如果CFH不与适当的自相关分子模式(以正确的构型呈递的唾液酸配体)结合，则CFH不与C3Bb结合，导致C3BbBb加速形成、膜攻击复合物形成放大，进而导致致病细胞和天然细胞均发生不受限制的细胞溶解。
CFH由20个补体控制蛋白(CCP)模块组成。CFH上有两个唾液酸结合区，即CFH的4-6CCP区和19-20 CCP区。唾液酸与这些区域的结合被认为可打开C3Bb的结合区域，这将使补体级联失活。据信，需要同时结合这2个位点才能在CFH中形成构象变化，从而增强其与C3Bb的结合。
拮抗或阻断Siglec 3、5、7、9、10、11或15的结合位点是一种病症治疗方法，该病症通过自相关分子模式(SAMP)模拟表面唾液酸配体激动Siglec以逃避免疫监视或免疫激活。可使用此方法的病症包括癌症和感染。已证明癌症在其表面表达唾液酸结构，以逃避巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞和单核细胞的免疫激活。B型链球菌也在其表面表达唾液酸配体，该配体与Siglec 7结合以逃避免疫攻击。
唾液酸也被用作几种病毒家族的进入点，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、SARS-CoV-1或SARS-CoV-2。这些病毒的结合受体可以是血凝素酯酶(病毒HE)、神经氨酸酶(病毒N)或病毒衣壳部分(例如与宿主细胞表面的唾液酸配体结合并促进病毒进入宿主细胞的刺突蛋白(病毒SP))，或CD147，这是一种唾液酸结合凝集素，用于SARS-CoV-2和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的感染性进入。将这些唾液酸受体与诱饵唾液酸配体结合可以防止病毒感染宿主细胞，并防止病毒颗粒从受感染细胞中逸出。
需要用于激动唾液酸结合自相关模式识别受体的改进的组合物和方法，以治疗由急性、慢性或异常免疫系统激活引起的疾病。还需要阻止这些SAMP受体被癌症和感染占据用于逃避免疫监视和躲避攻击。本发明提供了能够以一定密度呈递唾液酸配体的纳米颗粒，从而特异性且深度地激动、阻断或拮抗特定Siglec受体。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了颗粒，该颗粒包含由以下结构式表示的分子：
P-L-G，
其中：P是生物相容性聚合物支架，其包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)；并且L是共价接头或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗患有眼科疾病的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒，其中癌症是急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、非霍奇金或霍奇金淋巴瘤。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒，其中传染病是由B组链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、空肠弯曲杆菌、克氏锥虫(Tyrpanosoma cruzi)、HIV、甲型流感、乙型流感、或丙型流感、Sars CoV1、Sars Co V2或疱疹病毒科(Herpes viridae)引起的。
在另一个实施例中，本发明提供了调节免疫细胞中细胞介导的炎症反应的方法，该方法包括：使免疫细胞与根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒接触。
在另一个实施例中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述实施例中任一项所述的颗粒和药学上可接受的载剂。
在另一个实施例中，本发明提供了抑制受试者中补体激活的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗患有补体过度激活疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本文所述实施例中任一项所述的颗粒。
在另一个实施例中，本发明提供了制造颗粒的方法，该方法包括：使生物相容性聚合物支架P和聚糖G反应，该生物相容性聚合物支架P包含第一不稳定部分，该聚糖G包含第二不稳定部分，反应条件足以产生该第一不稳定部分和第二不稳定部分的加合物L，从而产生由以下结构式表示的分子：
P-L-G，
其中：P包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；并且G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)。
附图说明
为了更好地理解本文披露的主题并例示其在实践中可能的进行方式，现在将通过非限制性实例的方式，参考附图对实施例进行描述。对于附图的特别参考，需要强调的是，所示的细节通过举例进行说明并用于对本文披露的实施例进行说明性讨论。
图1.用于无铜(CU)点击化学的具有二苯并环辛炔(DBCO)官能团的模块化纳米颗粒。
图2.用于催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)点击化学的具有炔烃官能团的模块化纳米颗粒。无铜点击化学基于炔烃(例如二苄基环辛炔(DBCO)部分)与叠氮化物标记部分的反应。这种反应称为应变促进的炔烃叠氮化物环加成(SPAAC)。
图3.聚唾液酸叠氮化物配体合成。
图4.使用DBCO用于唾液乳糖-聚唾液酸叠氮化物-叠氮化物配体的缀合的模块化纳米颗粒。
图5.2-3唾液乳糖或2-6唾液乳糖配体与模块化PLGA-PEG-DBCO纳米颗粒缀合。
图6.使用CuAAC点击化学的炔烃-PEG-PLGA纳米颗粒与聚唾液酸-叠氮化物的反应形成聚唾液酸官能化纳米颗粒。
图7.使用CuAAC点击化学的炔烃-PEG-PLGA纳米颗粒与NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-叠氮化物的反应形成聚唾液酸官能化纳米颗粒。
图8.使用CuAAC点击化学用炔烃-PEG-PLGA和四嗪-PEG-PLGA分别与聚唾液酸-叠氮化物和NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-反式-环辛烯形成纳米颗粒的反应，以形成聚唾液酸和NeuAcα2-3Galβ1-4Glc官能化的纳米颗粒。
图9.用于调节Siglec活性的细胞机制。
图10.显示不同配体密度的纳米颗粒。
图11.唾液酸纳米颗粒以高亲和力和剂量依赖性方式与(a)siglec 11(b)siglec9(c)siglec 7(d)siglec 5结合。
图12.唾液酸纳米颗粒对(a)外周血单核细胞和(b)THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞无毒，如MTT测定所证明的。
图13.显示示例性纳米颗粒使活化巨噬细胞中的IL-10增加。
图14A和图14B总体地是显示示例性纳米颗粒使CFH生成增加的柱状图。
图15显示示例性纳米颗粒抑制LPS活化巨噬细胞中的TNF-α。
图16显示示例性纳米颗粒使LPS活化巨噬细胞中的VEGF显著降低。
图17是PSA与叠氮化物官能团的非还原端缀合的合成方案。
图18是PSA热水解工作流程的示意图。
图19是用于确定水解PSA聚合度(DP)的1H-NMR谱。
图20是显示与本文所述的纳米颗粒孵育后LPS激发的THP-1细胞中的TNF-α生成受到抑制的柱状图。
图21是显示用AT-007-NP04处理后LPS激发的M1巨噬细胞中的抗炎症介质IL-10呈剂量依赖性增加的柱状图。
图22A和图22B显示用AT-007-NP06处理后LPS激发的M1巨噬细胞中促炎介质IL-6(B)和TNF-a(A)的下调。
图23是显示注射空白-NP、AT-007和AT-007-NP02的动物的外核层厚度(μM)的柱状图。
图24是用于测量AT-007-NP04对纤维细胞分化的影响的实验设置的示意图。
图25是显示用指示的药剂处理后纤维细胞分化％的柱状图。
图26是用于测量AT-007-NP06在延迟NET形成和延迟细胞死亡(使用Sytox橙色染料测量)中的影响的实验设置的示意图。
图27显示SyTOX阳性％与时间函数的动力学曲线。
图28是补体途径的示意图。
图29是本文所述的纳米颗粒与C3b结合取代Bb以关闭补体放大的示意图。
图30A是说明通过表面等离子体共振(SPR-Biacore)确定的AT-007-NP04在补体因子H上的强结合增强了与C3b的结合的传感图。
图30B是说明通过表面等离子体共振(SPR-Biacore)确定的AT-007-NP04在补体因子H上的强结合增强了与C3b的结合的传感图。
图31A是说明实验(其结果在图31B中示出并在本文中描述)设置的示意图。
图31B是说明AT-007-NP06纳米颗粒直接阻止通过旁路途径或经典途径的补体激活的能力的柱状图。
图32A、图32B和图32C是显示ELISA测量的AT-007-NP04和AT-007-NP06与CFH蛋白结合亲和力的图。
图33是表明批次AT-007-NP04对Siglec 7、9和11表现出结合亲和力(如通过490nm处的吸光度所测量的)的图。
图34A至图34D是PSA对Siglec 7、9和13的传感图(BIACoreTMPSR测量结果)。
具体实施方式
如本文所用，“唾液酸配体”是指与至少一种唾液酸受体同源的唾液酸的任何单糖或多糖衍生物。唾液酸是指神经氨酸或神经氨酸的任何化学修饰(自然产生的或合成衍生的)。神经氨酸的结构式如下：
唾液酸衍生物的实例包括：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，由以下结构式表示：
和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，由以下结构式表示：
如本文所用，碳水化合物残基是其中一个或多个位置被修饰用于共价连接的单糖。
如本文所用，“感染原”是病毒、细菌或寄生虫原；受体可以是衣壳/囊膜、膜或核聚糖结合分子/蛋白质/酶(凝集素)，例如血凝素酯酶、冠状病毒刺突蛋白、病毒神经氨酸酶/唾液酸酶。
如本文所用，“平均横截面宽度”是非球形纳米颗粒中最宽的部分，以颗粒整体取平均值。
如本文所用，术语“颗粒”包括如本文定义的微粒和纳米颗粒。
本披露提供了包含唾液酸配体的治疗剂，用作免疫系统调节剂，即免疫系统的抑制剂或激活剂，病毒/细菌/寄生虫感染的抑制剂，揭示癌细胞或损伤相关分子模式(DAMP)以增强免疫监视。靶细胞群包括表达Siglec受体、CFH CCP 4-6、19-20、病毒HE、病毒N、病毒SP和CD147的细胞群。在特定的实施例中，递送媒介物包含配制成纳米颗粒或微粒的聚合物，将纳米颗粒或微粒束缚(缀合或连接)至包含唾液酸、唾液酸衍生物、唾液酸类似物、唾液酸单体和/或唾液酸聚合物的配体(本文统称为“唾液酸配体”)，以呈现于纳米颗粒表面上。束缚的唾液酸用作将纳米颗粒与靶细胞表面表达的受体(例如Siglec受体)靶向结合的配体。
在一方面，本披露提供包含聚合物的纳米颗粒，该聚合物通过唾液酸配体的共价化学缀合实现束缚以呈现于纳米颗粒表面上。纳米颗粒可用于接触表达唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)的免疫细胞，以调节炎症过程。已经确定提供能够靶向和结合表达唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)的免疫细胞的唾液酸配体，可用于调节靶细胞和相关环境中的炎症反应。Siglec是自相关模式识别受体家族的成员，包括在不同细胞群中选择性表达的Siglec同种型。因此，设计选择性结合特定Siglec受体的纳米颗粒的能力允许靶向结合期望的目的细胞群。纳米颗粒与Siglec受体的这种结合可用作调节目的细胞内Siglec受体的信号转导活性的手段，从而使治疗的受试者的炎症反应减少或抗炎反应增强。
唾液酸配体在纳米颗粒表面上的呈现意味着将唾液酸配体修饰到纳米颗粒上，使得它们可以与靶细胞或生物体上的Siglec受体结合。适当地提供这些配体以结合、激活或阻断受体。在不希望受理论约束的情况下，唾液酸在纳米颗粒上的呈现需要唾液酸配体以特定浓度密度呈现，以调节炎症反应、增强免疫监视或阻断感染。
单个纳米颗粒可以修饰有唾液酸配体的多价复合物，这将允许该单个纳米颗粒对不同Siglec受体的多价结合，从而调节炎症反应。修饰有独特配体的纳米颗粒也可以与可能靶向不同Siglec受体的其他配体修饰的纳米颗粒混合，再次实现对炎症反应的期望调节。在一些实施例中，唾液酸配体在纳米颗粒或微粒表面上的呈现可以使细胞对颗粒的摄取增加至少约两倍、至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍或至少约十倍。在一些实施例中，唾液酸配体在纳米颗粒或微粒表面上的呈现可以减少炎症反应。在非限制性实施例中，炎症反应的减少超过约两倍、超过约三倍、超过约四倍、超过约五倍、超过约10倍、超过约20倍、超过约50倍、超过约100倍、超过约500倍或超过约1000倍。
纳米颗粒或微粒可用于全身递送或局部递送至需要治疗的受试者中的靶患病组织，从而调节所述受试者中的炎症反应以使先天性和适应性炎症消退、在期望增强免疫监视时激活先天性和/或适应性免疫，或降低感染性生物体的感染性。靶向的免疫细胞或病毒应分别具有Siglec受体或病毒唾液酸配体结合区。先天性免疫系统的活动包括，例如，先天性免疫系统的细胞应答；先天性免疫系统、补体系统、补体旁路、补体旁路途径的放大环和/或由补体因子H激活的补体旁路途径的放大环的非细胞/体液应答。适应性免疫系统的活动涉及树突细胞成熟和呈递至T细胞、T细胞活化、T细胞调节、T细胞检查点抑制或激活、中性粒细胞NETosis和B细胞活化。感染性降低包括病毒进入宿主细胞减少、病毒颗粒复制减少或对病毒感染的炎症反应减少。
如本文所用，“受试者”是指根据所提供的治疗方法接受治疗的受试者。受试者可以是人、灵长类动物、犬、猫、牛、马、鼠等。受试者还指用于实验室试验的那些动物。
如本文所用，“纳米颗粒”是指由一个或多个聚合物组成的颗粒，其大小为纳米(nm)级，包括10纳米至2000纳米之间的线性维度范围。如本文所用，“线性维度”是指以直线测量的纳米颗粒表面上任意两点之间的距离。本披露的纳米颗粒可以是不规则的、椭圆形的、纺锤形的、棒状的、圆柱形的、薄饼状的、盘状的、球形的、双凹面的或红细胞形状的。可以使用多种方法测量线性维度，包括但不限于透射电子显微术或可调电阻脉冲传感，它们是确定纳米颗粒大小的一些标准方法。广泛使用的测量纳米颗粒大小的技术之一是动态光散射(DLS)，该技术可以提供纳米颗粒的直径和多分散性。DLS假设纳米颗粒在本质上是球形的，纳米颗粒的大小是这种假定球体的平均直径(或半径)。在这样的测量中，纳米颗粒可以被描述为具有10nm至1000nm或1nm至500nm的大小范围。
如本文所用，“微粒”是指由一个或多个聚合物组成的微观颗粒，其大小为微米(μm)级，包括小于1000μm且大于或等于1μm的最大横截面宽度。
本披露涵盖了几种类型和构型的纳米颗粒。例如，纳米颗粒可由多种材料组成，包括但不限于可生物降解聚合物、生物相容性聚合物、可生物吸收聚合物或其组合。生物相容性是指聚合物不会不利地干扰组织的生物学功能。术语可生物降解、可生物吸收和可生物蚀解以及降解、蚀解和吸收可互换使用(除非上下文另有说明)，这些术语是指聚合物和金属暴露于体液，例如血液及其组分(如酶)时能够被降解或吸收且可以被身体逐渐再吸收、吸收和/或消除。
连接唾液酸配体的纳米颗粒的聚合物主链可以由天然存在的聚合物如碳水化合物或蛋白质组成，或者可以由合成聚合物组成。聚合物主链将具有独特的末端官能团，以实现将唾液酸配体束缚到纳米颗粒表面。聚合物主链可以首先通过化学缀合方法与多个唾液酸配体结合，然后形成纳米颗粒，或者聚合物主链可以首先形成纳米颗粒，然后显露在纳米颗粒表面上的官能团可以通过化学缀合方法与唾液酸配体结合。
合适的纳米颗粒包括聚合物颗粒和水凝胶颗粒。如本文所用，“聚合物”是指由通过共价键连接的多个重复结构单元组成的一个或多个分子。如本文所用，“聚合物颗粒”是指固体或多孔颗粒，与脂质体和聚合物囊泡的壳状结构以及水凝胶颗粒的相对开放结构形成对比。如本文所用，“水凝胶颗粒”是指具有吸水性但在水性环境中稳定的聚合物链的交联网络。
可用于制备纳米颗粒的聚合物包括但不限于聚(N-乙酰基葡糖胺)(甲壳质)、壳聚糖、聚(3-羟基戊酸酯)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(1-丙交酯-共-乙交酯)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)、聚原酸酯、聚酐、聚(羟基乙酸)、聚(乙交酯)、聚(L-乳酸)、聚(L-丙交酯)、聚(D,L-乳酸)、聚((D,L)丙交酯)-b-聚(乙二醇)-叠氮化物、聚(DL-丙交酯)-b-聚(乙二醇)-甲基四嗪、聚(D,L-丙交酯)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯)-b-聚(乙二醇)-羧酸、聚(乙二醇)甲基醚-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-叠氮化物、聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-炔烃、聚((D,L)乳酸)-b-聚(乙二醇)-叠氮化物、聚((D,L)乳酸)-b-聚(乙二醇)-炔烃、聚(己内酯)、聚(己内酯)-b-聚(乙二醇)、聚己内酯-b-聚(乙二醇)、聚(丙交酯-共-己内酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(乙交酯-共-己内酯)、聚(DL-丙交酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(DL-丙交酯)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚酯酰胺、聚(羟基乙酸-共-三亚甲基碳酸酯)、丙烯酸酯-聚(己内酯)-b-聚(乙二醇)-炔烃、共-聚(醚酯)(例如PEO/PLA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酸)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-甲氧基聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯)、聚磷腈、生物分子(例如纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、胶原和透明质酸、弹性蛋白和透明质酸)、聚氨酯、硅酮、聚酯、聚烯烃、聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物、丙烯酸类聚合物和除聚丙烯酸酯之外的共聚物、乙烯基卤化物聚合物和共聚物(例如聚氯乙烯)、聚乙烯醚(例如聚乙烯基甲基醚)、聚偏二卤乙烯(例如聚偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(偏二氟乙烯-共-六氟丙烯)、聚丙烯腈、聚乙烯酮、聚乙烯芳香族化合物(例如聚苯乙烯)、聚乙烯酯(例如聚乙酸乙烯酯)、丙烯腈-苯乙烯聚物、ABS树脂、聚酰胺(例如尼龙66和聚己内酰胺)、聚碳酸酯(包括酪氨酸基聚碳酸酯)、聚氧化亚甲基、聚酰亚胺、聚醚、聚氨酯、人造丝、三乙酸酯人造丝、纤维素、乙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、玻璃纸、硝酸纤维素、丙酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素和富勒烯。
在一方面，纳米颗粒由可生物降解聚合物聚己内酯形成，在其他实施例中，由包含聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)的聚合物形成。在实施例中，纳米颗粒可以是聚合颗粒，特别是颗粒可以由生物可降解聚酯例如聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PGA)、聚乳酸-10-羟基乙酸(PLGA)、聚(氰基丙烯酸丁酯)(PBCA)或N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物形成。在另一方面，纳米颗粒由不可生物降解的聚合物例如聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇和聚(乙烯吡咯烷酮)形成。
在一些实施例中，纳米颗粒由可生物降解和不可生物降解聚合物的混合物形成，作为嵌段共聚物(BCP)，包括PLGA-嵌段-PEG的优选实施例。嵌段共聚物包含具有通过共价键连接的两个或更多个不同聚合物亚基的聚合物。在一些实施例中，纳米颗粒由可生物降解和不可生物降解聚合物的混合物形成，作为嵌段共聚物，包括PLGA-嵌段-PEG的优选实施例。在又一方面，纳米颗粒由天然衍生的聚合物以水凝胶纳米颗粒的形式形成，包括由胶原、透明质酸、肝素、硫酸肝素、壳聚糖和藻酸盐形成。
纳米颗粒的合成方法是本领域技术人员众所周知的。(例如，参见Spence等人,Science Translational Medicine[科学转化医学],2015,7:303 303ra140和其中引用的参考文献)，例如，具有已知降解速率的纳米颗粒的合成方法是本领域技术人员已知的，如授予Gregoriadis等人的美国专利号6,451,338、授予Samuel等人的美国专利号6,168,804和授予Schneider等人的美国专利号6,258,378所述，这些专利通过引用以其全文特此并入。
提供了束缚有用于选择性结合目的靶细胞上表达的受体的唾液酸配体的配制纳米颗粒或微粒。术语唾液酸是指任何单唾液酸、低聚唾液酸或聚合唾液酸或聚唾液酸，包括可与Siglec受体结合的二唾液酸，特别是与抑制性Siglec受体(例如Siglec 7)具有结合特异性的唾液酸。在实施例中，用于在当前披露的组合物或方法中使用的唾液酸可以是动物组织和血细胞中作为粘蛋白和糖蛋白组分的氨基碳水化合物的任何组。在实施例中，唾液酸(也称为壬酮糖酸(nonulosonic acid))是含有九个或更多碳原子的含氨基糖家族的成员，例如，N-乙酰神经氨酸(也称为5-(乙酰氨基)-3,5-双脱氧-D-甘油-D-D-半乳糖-壬酮糖酸、乙酰神经氨酸(lactaminic acid)和O-唾液酸)。
在实施例中，设想唾液酸可以是单唾液酸或聚唾液酸，包括二唾液酸。聚唾液酸能以2→8和/或2→9、和/或2→6、和/或2→3连接，通常以α-构型连接。在实施例中，其中唾液酸或聚唾液酸束缚于纳米颗粒或微粒表面。聚唾液酸是包含多个唾液酸单元的均聚物。聚唾液酸可以为少于五个唾液酸单元，优选地少于四个唾液酸单元、少于三个唾液酸单元长度，最优选地两个唾液酸单元长度。在实施例中，聚合度(DP)可以在DP2至DP100以上的范围内。DP可以介于DP2与DP100之间、DP2与DP90之间、DP2与DP80之间、DP2与DP70之间、DP2与DP60之间、DP2与DP50之间、DP2与DP40之间、DP2与DP30之间、DP2与DP30之间、DP2与DP20之间、DP2与DP10之间。在特定的非限制性实施例中，聚合度为DP3至DP100。在可替代的实施例中，聚唾液酸可以包含五个或更多个唾液酸单元。例如，聚唾液酸可以包含至少六个唾液酸单元、至少七个唾液酸单元或至少八个唾液酸。在实施例中，聚合度(DP)可以在DP5至DP1000的范围内。例如，聚合度可以为DP5至DP500、DP5至DP100、DP5至DP90、DP5至DP80、DP5至DP70、DP5至DP60、DP5至DP50、DP5至DP40、DP5至DP30、DP5至DP20、DP5至DP10。在特定的非限制性实施例中，聚合度为DP10至DP400、DP20至DP300或DP30至DP200。在某些实施例中，DP为DP5至DP30，例如DP5、DP10、DP15、DP20、DP25、DP30、DP35、DP40、DP45或DP50。在某些实施例中，DP为DP5至DP500。在示例实施例中，DP为DP10至DP30。
在其中使用唾液酸的类似物的实施例中，类似物可以与本文披露的唾液酸具有结构相似性并且对某些Siglec具有结合亲和力。合适的类似物是本领域已知的。据信，影响唾液酸配体与Siglec受体结合的特征是唾液酸的羧酸官能度之间的电荷-距离-配位关系。
在特定的实施例中，唾液酸选自NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc和NeuAcα2-8NeuAc或这样的唾液酸的唾液酸苷(sialoside)衍生物，例如BPCNeuAc唾液酸苷。
可获得许多其他合成/非天然存在的唾液酸苷/唾液酸衍生物。唾液酸可以从高通量筛选或基于细胞的微阵列获得，以获得对相应Siglec受体具有最高结合亲和力的唾液酸类似物/衍生物。
在实施例中，可以根据被靶向的Siglec受体来选择本披露中使用的唾液酸，其中对特定Siglec的结合偏好可选自表1。
表1
在一些实施例中，可以根据期望的受体特异性将合适的唾液酸配体或类似物缀合至纳米颗粒。在一些实施例中，唾液酸是2-8二唾液酸或2-6或2-3变体(其中至少一个位置填充有唾液酸)中的至少一种。在一些实施例中，唾液酸可以选自α2-8二乙酰神经氨酸、α-NeuNAc-(2→6)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc和α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc中的至少一种。在特定的实施例中，纳米颗粒可以具有α2-8乙酰神经氨酸。
唾液酸通过Siglec受体相互作用与免疫系统的细胞自然地结合，并且可以通过结合调节所述细胞的活性。因此，基于它们对免疫细胞表面上表达的特定Siglec的结合亲和力，可以将本文披露的纳米颗粒设计为结合免疫系统的特定细胞。例如，巨噬细胞的活性可以通过带有唾液酸配体的纳米颗粒进行调节，这些纳米颗粒结合并激动Siglec3、Siglec5、Siglec 7、Siglec 9、Siglec 11、Siglec 12、Siglec 15，或结合并拮抗Siglec 16，在每种情况下，这样的Siglec均在巨噬细胞表面表达。潜在的治疗性生物反应是巨噬细胞极化成M2c(巨噬细胞的消退抗炎状态)或M0(巨噬细胞的衰老状态)。在另一个实例中，单核细胞的活性可以通过带有唾液酸配体的纳米颗粒进行调节，这些纳米颗粒结合并激动Siglec3、Siglec 5、Siglec 7、Siglec 9、Siglec 10、Siglec 13，或结合并拮抗Siglec 14，在每种情况下，这样的Siglec均在单核细胞表面表达。生物反应是抑制单核细胞的细胞因子产生，如白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23、IL-23p40、CCL17、CXCL10、MCP-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β1)、干扰素γ(IFNγ)生成的抑制。在另一个实例中，NK细胞的活性可以通过结合唾液酸的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合NK细胞表面表达的Siglec 7。生物反应是细胞焦亡的抑制。细胞焦亡的标志是含NOD、LRR和pyrin结构域的蛋白3(NLRP3)下调、IL-1β下调且颗粒酶B减少。在另一个实例中，嗜酸性粒细胞的活性可以通过结合唾液酸的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒结合并激动在嗜酸性粒细胞表面表达的Siglec 7、Siglec8(包括其鼠同系物SiglecF)或Siglec 10。生物反应是诱导嗜酸性粒细胞死亡、肥大细胞脱颗粒减少和组胺生成减少。在另一个实例中，中性粒细胞的活性可以通过结合唾液酸的纳米颗粒进行调节，这些纳米颗粒设计用于结合和激动Siglec 3、Siglec 5、Siglec 9，或结合和拮抗Siglec 14，在每种情况下，这样的Siglec均在中性粒细胞表面表达。生物反应是NETosis的抑制。NETosis抑制的标志是中性白细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、乳铁蛋白和明胶酶的下调。在另一个实例中，中枢神经系统的小胶质细胞或其他组织中的树突细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合和激动Siglec 3、Siglec 7或Siglec 9，在每种情况下，这样的Siglec均在中枢神经系统的小胶质细胞或树突细胞的表面表达。生物反应是CD80、CD83和/或CD86成熟和抗原呈递标志物的上调。在另一个实例中，B细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合和激动Siglec2、Siglec 5或Siglec 10，在每种情况下，这样的Siglec均在B细胞的表面表达。生物细胞因子反应是淋巴毒素、Il-6、干扰素-γ和TNF的抑制。生物细胞标志反应是IGM形成的下调、类别转换DNA重组的减少和/或类别转换浆细胞的减少。在另一个实例中，CD8+T细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合和激动Siglec 7或Siglec9，在每种情况下，这样的Siglec均在T细胞的表面表达。生物细胞因子反应是淋巴毒素、Il-6、干扰素-γ和/或TNF的抑制。生物反应是干扰素-γ、TNF、LAG-3或CD160的抑制。生物细胞标志反应是2b4和PD-1的下调。在另一个实例中，CD34+T细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合和激动Siglec 3、Siglec 5、Siglec 9或Siglec 10，在每种情况下，这样的Siglec均在T细胞的表面表达。生物细胞因子反应是淋巴毒素、Il-6、干扰素-γ和TNF的抑制。生物反应是干扰素-γ、TNF、LAG-3或CD160的抑制。生物细胞标志反应是2b4和PD-1的下调。在另一个实例中，肥大细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒结合并激动Siglec 3、Siglec 5、Siglec 6或Siglec 8(包括其鼠同系物Siglec F)，在每种情况下，这样的Siglec均在嗜酸性粒细胞的表面表达。生物反应是诱导肥大细胞死亡、肥大细胞脱颗粒减少和组胺生成减少。在另一个实例中，嗜碱性粒细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒结合并激动Siglec 3、Siglec 5、Siglec 6或Siglec 8(包括其鼠同系物SiglecF)，在每种情况下，这样的Siglec均在嗜碱性粒细胞的表面表达。生物反应是诱导嗜碱性粒细胞死亡、肥大细胞脱颗粒减少和组胺生成减少。在另一个实例中，旁路补体级联的激活可以通过含有唾液酸配体的纳米颗粒进行调节，该配体在CCP区域4-6和/或19-20与CFH结合并过度激活CFH和具有Y402H多态性的CFH的功能。生物反应是膜攻击复合物和其他补体因子(如C3bBb或C5)的形成减少和/或野生型和Y402H多态性CFH中的裂解C3bBb分解产物的增加。CFH激活的其他下游指标包括减少绵羊RBC补体激活模型中溶解的能力。在另一个实例中，病毒的感染性可以通过含有唾液酸配体的纳米颗粒来调节，该纳米颗粒可结合神经氨酸酶或唾液酸酶并且能够抑制病毒表达的神经氨酸酶/唾液酸酶对神经氨酸/唾液酸的裂解。这应该可以减少甲型流感、乙型流感和丙型流感感染中病毒颗粒的释放。在另一个实例中，病毒的感染性可以通过含有唾液酸配体的纳米颗粒来调节，该纳米颗粒可结合在病毒(如甲型流感、乙型流感、丙型流感、SARS-CoV1或SARS-CoV2的相应刺突蛋白)衣壳上发现的唾液酸结合位点。这应该通过阻断、干扰或调节病毒附着或对接分子并阻断它们结合和感染此类宿主细胞的能力来降低这些病毒结合和感染呼吸道细胞或其他宿主细胞的能力。在另一个实例中，肺部炎症的减少可以通过含有唾液酸配体的纳米颗粒来调节，该纳米颗粒可结合神经氨酸酶或唾液酸酶并且能够抑制支气管、肺泡和/或呼吸道的上皮细胞表达的神经氨酸酶/唾液酸酶对神经氨酸/唾液酸的裂解。这应该减少由与天然肺Siglec结合的组成型顺式结合唾液酸降解引起的炎症，其中Siglec被唾液酸酶裂解并引发组成型抗炎。在另一个实例中，肿瘤相关巨噬细胞的活性可以通过带有唾液酸配体的纳米颗粒进行调节，这些纳米颗粒结合并拮抗Siglec 3、Siglec 5、Siglec 7、Siglec 9、Siglec 11、Siglec12、Siglec 15，或结合并激动Siglec 16，在每种情况下，这样的Siglec均在巨噬细胞表面表达。潜在的治疗性生物反应是巨噬细胞极化成M1和M2a、b或d，以揭示癌细胞使用肿瘤Siglec激动作用来逃避免疫监视。巨噬细胞的细胞反应是吞噬作用和细胞因子杀伤以及肿瘤细胞破坏的增加。在另一个实例中，肿瘤相关单核细胞的活性可以通过带有唾液酸配体的纳米颗粒进行调节，这些纳米颗粒结合并拮抗Siglec 3、Siglec 5、Siglec 7、Siglec 9、Siglec 10、Siglec 13，或结合并激动Siglec 14，在每种情况下，这样的Siglec在单核细胞表面表达。生物反应是单核细胞的细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-23、IL-23p40、CCL17、CXCL10、MCP-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β1)、干扰素γ(IFNγ)的生成增强，这表明免疫监视恢复，因为它涉及攻击利用Siglec激动作用逃避肿瘤监视的癌细胞。单核细胞的细胞反应将是吞噬作用和细胞因子杀伤以及肿瘤细胞破坏的增加。在另一个实例中，肿瘤相关NK细胞的活性可以通过结合唾液酸的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合并拮抗这样的NK细胞表面表达的Siglec7。生物反应是细胞焦亡增强。细胞焦亡的标志是NLRP3上调、IL-1β上调、颗粒酶B上调、Toll样受体1-4激活。NK细胞反应是焦亡细胞因子杀伤以及肿瘤细胞破坏的增加。在另一个实例中，肿瘤相关CD8+T细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合并拮抗Siglec 7或Siglec 9，在每种情况下，这样的Siglec均在肿瘤相关T细胞的表面表达。生物细胞因子反应是在存在癌细胞的情况下淋巴毒素、Il-6、干扰素-γ和TNF的上调。生物细胞标志反应是2b4、LAG-3、CD160和PD-1的上调。T细胞生物反应将是适应性免疫系统激活增加以攻击和杀伤肿瘤细胞。在另一个实例中，CD34+T细胞的活性可以通过结合唾液酸的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒设计用于结合并拮抗Siglec 3、Siglec 5、Siglec 9或Siglec 10，在每种情况下，这样的Siglec均在T细胞的表面表达。生物细胞因子反应是在存在癌细胞的情况下淋巴毒素、IL-6、干扰素-γ和TNF的上调。生物细胞标志反应是2b4、LAG-3、CD160和PD-1的上调。T细胞生物反应是适应性免疫系统激活增加以攻击和杀伤肿瘤细胞。在另一个实例中，破骨细胞的活性可以通过结合唾液酸配体的纳米颗粒来调节，这些纳米颗粒可结合破骨细胞表面表达的Siglec 15。
表2列出了Siglec及其最常表达的细胞类型，以及每种Siglec的有效唾液酸连接类型。
表2
束缚在纳米颗粒表面的唾液酸配体可以是单体、低聚物或聚合物的形式。在某些实施例中，唾液酸配体可首先通过化学缀合技术连接到聚合物主链上，随后可在纳米颗粒表面形成聚合物缀合唾液酸配体构建体。在其他实施例中，聚合物形成纳米颗粒，在纳米颗粒表面上具有暴露的官能团，使得这些官能团可以与唾液酸配体缀合。
在另一个实施例中，可以采用筛选方法来鉴定特异性结合一个或多个Siglec受体的纳米颗粒。然后可以测试这种已鉴定的纳米颗粒，以确定所述与Siglec受体的结合是否诱导可检测的细胞反应
在另一个实施例中，基于多种纳米颗粒(其中纳米颗粒所连接的唾液酸配体是变化的)的使用提供了筛选文库和高通量筛选方法。此类文库可用于鉴定特异性结合Siglec受体的纳米颗粒的方法中，该方法包括使纳米颗粒文库与表达所述Siglec受体的细胞或包含Siglec受体的载体接触。一旦鉴别出纳米颗粒文库的成员与Siglec受体结合，就可以测试纳米颗粒以确定所述与Siglec受体的结合是否诱导可检测的细胞反应。在某些实施例中，聚合物形成纳米颗粒，在纳米颗粒表面上具有暴露的官能团，使得这些官能团可用于将唾液酸配体束缚到纳米颗粒表面上。如本文所用，“模块化”纳米颗粒是指具有特定官能团的纳米颗粒，该官能团可用作通用平台，用于以期望方式将一个或多个唾液酸配体连接至纳米颗粒。
包含低聚物和聚合物的唾液酸配体可以通过α2-3、α2-6、α2-8或α2-9糖苷键的任意组合连接在一起。可以控制将唾液酸或唾液酸类似物连接到纳米颗粒表面的糖苷键的类型，以最大化对靶Siglec受体的结合亲和力并增强对特定Siglec的特异性。由于已知不同的Siglec由不同的细胞类型差异表达，因此可以使用特定类型的唾液酸连接的选择来确定具有唾液酸配体的纳米颗粒要接触或靶向的细胞类型。低聚物和聚合物形式的唾液酸配体可具有直链或支链结构。可以通过引入不同于相邻糖苷键的糖苷键来产生低聚物或聚合物形式的支链结构。低聚物和聚合物形式可以是组成均一的，由一种唾液酸组成，或者它们可以是组成不均一的，由多种唾液酸组成。除唾液酸和/或唾液酸类似物外，低聚物和聚合物形式还可包含其他碳水化合物单体，例如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、甘露糖、N-乙酰甘露糖胺、岩藻糖或其他糖/碳水化合物。
唾液酸可以是天然衍生的(例如，Neu5Ac、Neu5Gc、Neu5Ac9Ac等)或可以包括任何合成制备的唾液酸类似物。唾液酸类似物是本领域已知的。在实施例中，这样的类似物可以在位置C9处有取代。类似物还可以在C1、C4、C5、C7和C8处有取代。类似物可以包括神经氨酸衍生物、唾液酸苷和包含至少一种神经氨酸分子的任何糖。
唾液酸类似物可以通过化学合成、化学酶促合成(例如，一锅多酶；OPME)或通过哺乳动物或细菌细胞合成，例如通过细胞补充前体碳水化合物(例如，甘露糖衍生物)、重组方法或基因工程方法制备。制备用作纳米颗粒配体的唾液酸类似物可以使用一锅合成法或微阵列平台制备。可以使用HTS方法原位制备唾液酸类似物配体阵列。
唾液酸配体与纳米颗粒表面的化学连接可以通过使用点击化学反应来实现。在此类反应中，纳米颗粒聚合物的末端官能团与唾液酸配体的末端官能团(本文称为“末端官能团共轭对”)之间发生化学反应，使得聚合物与唾液酸-酸性配体连接。在聚合物表面发现的末端官能团类型及其结合伴侣配体将决定用于将唾液酸配体化学连接到纳米颗粒表面的点击化学反应的类型。此外，具有特定末端官能团的聚合物的选择可用于控制将在纳米颗粒表面上呈现的唾液酸配体缀合物伴侣的类型、密度和空间排列。在实施例中，聚合物具有在形成的纳米颗粒表面上提供化学缀合位点的特定官能团，包括叠氮化物、炔烃、芳基酯、酰胺、胺、芳基酰胺、醛、乙酰基、取代的芳基酯、烷基酯、烷基酮、芳基酮、取代的芳基酮、酮、烷基卤化物、氨基氧基(amnioxy)、醇、氮杂-内鎓盐、羧酸、酯、酰胺、双环壬炔、二酰肼、卤代羰基、卤磺酰基、酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺酯、单氟和二氟环辛炔、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、甲基环丙烯、肼、腈、硝基、膦、叠氮膦、四嗪、甲基四嗪、反式-环辛烯、应变炔烃、二苯并环辛炔、二芳基氮杂环辛酮、氮杂二苄基环辛炔、乙烯基、磺酰酯、硫酯、硫代羧酸酯、硫酯、磺酰卤化物、硫醇和硫醇烯。
这样的缀合位点通过进行点击化学反应为唾液酸配体与纳米颗粒表面的连接提供了位置。在一个实例中，纳米颗粒由具有叠氮化物或炔烃末端官能团的PLGA-PEG聚合物形成。在非限制性实施例中，可以使用具有不同末端官能团的不同聚合物的共混物。这样的聚合物包括例如PLGA-PEG-炔烃、PLGA-PEG-酯和PLGA-PEG-DBCO。在特定方面，PLGA-PEG-炔烃和PLGA-PEG-羧酸的共混物可以制备成纳米颗粒。在另一个特定方面，PLGA-PEG-炔烃和PLGA-PEG-酯的共混物可以制备成纳米颗粒。在另一个特定的实施例中，PLGA-PEG-DBCO和PLGA-PEG-羧酸的共混物可以制备成纳米颗粒。在另一个特定方面，PLGA-PEG-DBCO和PLGA-PEG-酯的共混物可以制备成纳米颗粒。
尽管PLGA聚合物可以具有游离末端炔烃基团，但其中许多会被埋在颗粒基质中，无法在颗粒表面供结合。在一些实施例中，除了颗粒的第一PGLA聚合物或共聚物之外，可通过提供第二聚合物或共聚物表面活性剂或涂层来将更多炔烃基团引入颗粒。适当地，第二聚合物或共聚物可以是支链的或直链的并且可以具有多个末端烷基基团，其中烷基基团仅包含碳和氢并且形成具有通式CnH2n+1的同源系列。在其他实施例中，唾液酸配体或类似物可以通过共价键连接到颗粒，例如聚合纳米颗粒。
在其他实施例中，唾液酸配体包含末端官能团(即，缀合位点)，以供在纳米颗粒表面的束缚。这样的末端官能团包括叠氮化物、炔烃、芳基酯、酰胺、胺、芳基酰胺、醛、乙酰基、取代的芳基酯、烷基酯、烷基酮、芳基酮、取代的芳基酮、酮、烷基卤化物、氨基氧基、醇、氮杂-内鎓盐、羧酸、酯、酰胺、双环壬炔、二酰肼、卤代羰基、卤磺酰基、酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺、降冰片烯、氧杂降冰片二烯、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、单氟和二氟环辛炔、马来酰亚胺、甲基环丙烯、异氰基丙酸酯、肼、腈、硝基、膦、叠氮膦、四嗪、甲基四嗪、反式-环辛烯、应变炔烃、二苯并环辛炔、二芳基氮杂环辛酮、炔丙基、异腈、氮杂二苄基环辛炔、乙烯基、磺酰酯、硫酯、硫代羧酸酯、硫酯、磺酰卤化物、硫醇和硫醇烯。这样的缀合位点通过进行点击化学反应为唾液酸配体与纳米颗粒表面的连接提供了位置。纳米颗粒上的官能团(例如炔烃)的连接典型地经由缀合点击化学反应通过缀合点击化学官能团(例如叠氮化物)C2碳连接实现。
唾液酸配体的官能团可见于唾液酸核心分子结构的不同位置(位于C1、C2、C4、C5、C7、C8或C9位置)。因此，唾液酸配体与纳米颗粒表面的连接可通过在C1、C2、C4、C5、C7、C8或C9位置的缀合发生，在纳米颗粒表面上的3维空间中产生不同的配体取向，它可以影响配体在目的免疫细胞上的呈现。因此，可以以这种方式控制配体呈现，以在通过受体结合接触免疫细胞后引发期望的细胞反应。
具有已知配体间距和/或密度的唾液酸低聚物和唾液酸聚合物及其唾液酸类似物将作为Siglec受体的配体呈现于纳米颗粒的表面上。通过将特定的唾液酸类似物配体束缚在纳米颗粒表面上，纳米颗粒可接触表达Siglec受体的已知免疫细胞集，以诱导特异性生物反应，从而调节炎症。纳米颗粒表面呈现的唾液酸组成、结构、密度和架构的多样性为调控免疫细胞反应的调节程度和方向提供了手段。
多种唾液酸和/或唾液酸类似物呈单体、聚合物或低聚物的形式并且具有毗邻的聚糖，可以通过化学缀合的方式束缚在纳米颗粒的表面上。这样的化学缀合可包括例如点击化学、碳二亚胺化学、还原胺化或化学吸附。
在优选的实施例中，采用点击化学反应将唾液酸配体连接到纳米颗粒表面。这样的点击化学反应以通常用于生物缀合的一类生物相容性小分子反应为特征，生物缀合用于化学连接以修饰其他分子、生物分子、纳米颗粒和其他表面。一般而言，点击化学反应具有以下特性：模块化、对溶剂参数不敏感、高化学产率、对氧气和水不敏感、区域特异性和立体特异性以及大热力学驱动力(>20kcal/mol)，有利于与单一反应产物发生反应。点击化学反应提供了高反应特异性，可以控制区域特异性和立体特异性。反应特异性对于实现唾液酸配体在纳米颗粒表面的期望呈现特别有用，从而允许纳米颗粒与免疫细胞Siglec受体的最佳结合。缀合过程中点击反应形成的键提供了唾液酸配体和纳米颗粒之间高度稳定的共价键的可及性，这些共价键不会发生重排或反应，也不会导致生物条件下的降解或水解。
可以使用多种不同的点击化学反应将唾液酸配体连接至纳米颗粒表面。这样的点击化学反应的使用提供了受控的反应介质，用于生成具有期望的唾液酸配体密度和空间排列的纳米颗粒。可以控制唾液酸配体在纳米颗粒表面上的密度和空间排列，例如，通过控制用于形成纳米颗粒的具有官能团的聚合物的量、聚合物分子量、聚合物密度、每个聚合物的官能团数量、溶剂、官能团类型、配体浓度、采用的点击化学类型和点击化学共轭对的类型。配体的空间排列也可以通过唾液酸和配体上其他碳水化合物的连接来控制。低聚物和/或聚合物配体的长度也可以控制密度和空间排列。
在多种实施例中，聚合物(例如PEG、PLGA、PEG-PLGA嵌段共聚物或聚唾液酸)的平均分子量可以通过本领域已知的任何方法测定，例如阴离子交换层析、凝胶渗透层析、粘度测量等。
用于将唾液酸配体束缚到聚合物上的点击化学反应是本领域的技术人员众所周知的，包括例如Huisgen 1,3–偶极环加成、产生1,3-取代产物的铜(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、产生1,5-取代三唑的钌催化的炔烃-叠氮化物环加成(RuAAC)、产生1,4-取代产物的应变促进的炔烃叠氮化物环加成(SPAAC)、应变促进的炔烃-硝酮环加成、烯烃和四嗪逆需求的狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder)、四嗪反式-环辛烯连接、硫醇-烯反应、硫醇-炔反应、施陶丁格(Staudinger)反应、[4+1]环加成、四环庚烷连接[2+2+2]环加成、降冰片烯环加成和烯烃四唑光点击反应。
将唾液酸或唾液酸类似物(以单体、聚合物或低聚物的形式)束缚到纳米颗粒表面是以这样的方式进行的，所提供的唾液酸配体的呈现可使纳米颗粒与免疫细胞表面表达的Siglec受体或病毒颗粒表面表达的唾液酸配体受体具有最大的结合亲和力。可以控制配体密度，从而在接触免疫细胞时提供期望的多价(multivalent/polyvalent)配体与Siglec受体相互作用，因为这样的相互作用与期望的细胞免疫应答相关。多价唾液酸-受体相互作用可以根据纳米颗粒表面提供的配体密度来控制，并且此密度可以影响在接触时免疫细胞引起的应答。
适当地，唾液酸或其类似物可以固定在纳米颗粒的表面上。唾液酸可以直接结合到纳米颗粒上或通过接头(如聚乙二醇)结合。纳米颗粒可以被衍生化或活化以允许与唾液酸或类似物的结合。可替代地，纳米颗粒可以被衍生化或活化以允许接头与纳米颗粒结合并且接头可以连接到唾液酸。通过将唾液酸或其类似物连接到纳米颗粒，纳米颗粒可以适用于靶向包含Siglec受体的细胞以诱导Siglec受体的结合，从而抑制细胞内促炎细胞因子的产生或增加抗炎细胞因子的产生，由此抑制促炎免疫应答。
如所披露的，点击化学反应的使用要求纳米颗粒和唾液酸配体的聚合物都被官能化以允许配体与纳米颗粒表面的期望缀合。在一个实施例中，末端炔烃呈现于纳米颗粒表面上，用于通过进行以下反应与呈现叠氮化物的唾液酸配体共价化学缀合：铜(I)催化的叠氮化物-炔烃(CuAAC)反应；无铜反应；应变促进的叠氮化物-炔烃(SPAAC)反应；四嗪-烯烃连接反应，或反式-环辛烯(TCO)-四嗪反应。可以使用例如唾液酸转移酶ST8SIA4将叠氮化物官能团添加到唾液酸配体。
一方面，配体/纳米颗粒共轭对可以通过具有叠氮化物的唾液酸配体与具有炔烃官能团的纳米颗粒或具有炔烃的唾液酸配体与具有叠氮化物官能团的纳米颗粒的铜(I)叠氮化物-炔烃环加成制备。具有二苄基环辛炔、二氟辛炔或二芳基氮杂环辛酮的唾液酸配体可以通过SPACC与叠氮化物反应。具有反式-环辛烯的配体可以与具有四嗪官能团的纳米颗粒反应。
在特定的非限制性实施例中，形成PLGA-PEG-炔烃或PLGA-PEG-羧酸纳米颗粒，然后通过使用点击化学将α2-8聚合物唾液酸-叠氮化物配体共价束缚到纳米颗粒表面进行修饰。根据Greene等人(Chem Sci[化学科学]2018)使用的方案，通过乳液法制备炔烃官能化PLGA纳米颗粒，产生核心纳米颗粒构建体。形成的纳米颗粒在表面提供炔烃官能团，以供通过点击化学方法(包括CuAAC点击化学反应)进行共价化学缀合。
在特定的非限制性实施例中，形成PLGA-PEG-DBCO或PLGA-PEG-羧酸纳米颗粒，然后通过使用SPACC点击化学反应将α2-8聚合物唾液酸-叠氮化物配体共价束缚到纳米颗粒表面进行修饰。根据Greene等人(Chem Sci[化学科学]2018)使用的方案，通过乳液法制备DBCO官能化PLGA纳米颗粒，产生核心纳米颗粒构建体。形成的纳米颗粒在表面提供DBCO官能团，以供通过点击化学方法(包括SPAAC点击化学反应)进行共价化学缀合。
在特定的非限制性实施例中，形成PLGA-PEG-DBCO或PLGA-PEG-羧酸纳米颗粒，然后通过使用SPACC点击化学反应将NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-叠氮化物配体共价束缚到纳米颗粒表面进行修饰。根据Greene等人(Chem Sci[化学科学]2018)使用的方案，通过乳液法制备DBCO官能化PLGA纳米颗粒，产生核心纳米颗粒构建体。形成的纳米颗粒在表面提供DBCO官能团，以供通过点击化学方法(包括SPAAC点击化学反应)进行共价化学缀合。
在特定的非限制性实施例中，形成PLGA-PEG-DBCO或PLGA-PEG-羧酸纳米颗粒，然后通过使用应变促进的叠氮化物-炔烃环加成点击化学将NeuAcα2-6Galβ1-4Glc-叠氮化物配体共价束缚到纳米颗粒表面进行修饰。根据Greene等人(Chem Sci[化学科学]2018)使用的方案，通过乳液法制备DBCO官能化PLGA纳米颗粒，产生核心纳米颗粒构建体。形成的纳米颗粒在表面提供DBCO官能团，以供通过点击化学方法(包括SPAAC点击化学反应)进行共价化学缀合。
通过以75:25(w/w)比率的PLGA-COOH:PLGA-炔烃(DBCO)混合聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯-COOH)-PEG-COOH(PLGA 10,000Da-PEG-COOH 5000Da)和聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-叠氮化物(PLGA-PEG-炔烃；10,000Da PLGA:1,000PEG Da)制备纳米颗粒。此75:25比率是纳米颗粒表面上叠氮化物官能团密度的一个实施例。用于制备纳米颗粒的PLGA-PEG-COOH与PLGA-PEG-炔烃(DBCO)的其他比率为95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50。PLGA-PEG-COOH与PLGA-PEG-炔烃(DBCO)的比率设计用于在官能团之间提供足够的空间，以允许聚合物配体的有效缀合，并允许达到期望的配体密度。
可制备包含一种或多种具有不同点击化学官能团以与其唾液酸配体缀合伴侣配对的聚合物的纳米颗粒，从而允许一种或多种类型的唾液酸配体在纳米颗粒表面上以不同密度和/或空间排列呈现。通过采用一种或多种纳米颗粒聚合物/配体对，可以将不同共轭对的使用设计到纳米颗粒中。
在特定的非限制性实施例中，形成PLGA-PEG-DBCO//PLGA-PEG-羧酸纳米颗粒。然后使用后续的两步过程反应，使用异质点击化学将两种不同的配体缀合到纳米颗粒的表面。然后在第一步中，通过使用应变促进的叠氮化物-炔烃环加成点击化学将NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc-叠氮化物配体共价束缚到纳米颗粒表面进行修饰。在第二步反应步骤中，在洗涤纳米颗粒以去除杂质后，可以使用CuAAC点击化学将α2-8低聚唾液酸-叠氮化物缀合到表面。根据Greene等人(Chem Sci[化学科学]2018)使用的方案，通过乳液法制备DBCO/炔烃官能化PLGA纳米颗粒，产生核心纳米颗粒构建体。形成的纳米颗粒在表面提供DBCO和炔烃官能团，以供通过点击化学方法以逐步方式(SPAAC后接CuAAC)进行共价化学缀合。
通过在纳米颗粒表面提供不同的点击化学官能团，可以将不同类型的唾液酸配体缀合到纳米颗粒表面。不同官能团的密度可以通过不同聚合物相互之间的比率、聚合物的浓度、点击化学共轭对的类型、点击化学反应的类型以及唾液酸配体的大小和形状来控制。可以在表面上呈现的不同配体的数量可以由本领域技术人员确定。在非限制性实施例中，纳米颗粒表面上存在的不同配体的数量在1至20范围内。不同配体的数量包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在另一个实施例中，纳米颗粒表面上存在的不同配体的数量在2至20范围内。不同配体的数量包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在另一个实施例中，纳米颗粒将包含至少两种不同的唾液酸配体。在另一个实施例中，纳米颗粒将包含至少三种不同的唾液酸配体。在另一个实施例中，纳米颗粒将包含至少四种不同的唾液酸配体。在另一个实施例中，纳米颗粒将包含至少五种不同的唾液酸配体。
一般而言，纳米颗粒表面上的官能团密度决定了可以通过点击化学共价化学缀合束缚在纳米颗粒表面的最大配体密度。可以根据每平方纳米表面积的官能团数量来控制和定量配体密度。达到的密度允许聚合物唾液酸配体从蘑菇构象(mushroom confirmation)转化为刷构象(brush confirmation)。刷构象提供了聚合物聚唾液酸的最高密度填充。调整纳米颗粒表面上的配体密度提供了可以调节由纳米颗粒接触的靶免疫细胞的生物反应的方法。纳米颗粒表面上存在的配体密度可定量为nmol配体/mg总纳米颗粒固体。密度范围可为0.05nmol/mg至50nmol/mg纳米颗粒。纳米颗粒的直径范围可为25nm至200nm。
纳米颗粒表面的配体密度可以通过多种方法来控制，包括化学缀合技术、聚合物上的配体密度、配体类型、溶剂、pH和离子强度。可以调整纳米颗粒表面上的配体密度，使得免疫细胞与这样的纳米颗粒接触会产生免疫调节反应，包括抗炎生物反应。配体密度的控制也可用于调节期望抗炎反应的强度。
在一些实施例中，唾液酸或其类似物可以以至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或至少25个、至少50个、至少100个、至少200个或至少400个的组存在于纳米颗粒上。在一些实施例中，唾液酸或其类似物可以在纳米颗粒表面上间隔开，使得它们或纳米颗粒可以结合一个以上的Siglec受体。在一些实施例中，唾液酸或其类似物可以在纳米颗粒表面上间隔开，使得它们或纳米颗粒可以结合单个细胞类型上存在的多个Siglec受体，细胞质膜上存在的Siglec受体数量可能有所变化。
在一些实施例中，纳米颗粒可以包含聚合物，该聚合物包括浓度在以下范围中的唾液酸：0.05nmol/mg(唾液酸比纳米颗粒)至250nmol/mg(唾液酸比纳米颗粒)，优选地0.5nmol/mg至25nmol/mg，以及最优选地0.5至15nmol唾液酸/mg纳米颗粒。在实施例中，装置可涂有这样的纳米颗粒。在可替代的实施例中，装置可以由聚合物形成，例如其中装置是微粒或纳米颗粒，其中唾液酸在聚合物中以如下范围浓度提供：0.05nmol/mg(唾液酸比纳米颗粒)至250nmol/mg(唾液酸比纳米颗粒)，优选地1nmol/mg至25μg/mg，以及最优选地2至15nmol唾液酸/mg纳米颗粒。
在一些实施例中，纳米颗粒可具有小于约1000nm、小于约500nm、小于约250nm或小于约200nm的最大横截面宽度或直径。在实施例中，纳米颗粒可具有大于约1nm、大于约10nm、大于约50nm或大于约100nm的宽度。在实施例中，涂有唾液酸或唾液酸类似物的纳米颗粒可具有约130nm至约170nm范围的最大横截面宽度或直径，更优选地约150nm的宽度。在实施例中，这些大小范围可以是纳米颗粒的平均宽度。在实施例中，至少80％的纳米颗粒处于披露的范围内。
适当地，在一些实施例中，约至少80％、更优选地至少90％的颗粒的最大横截面宽度在130nm至170nm之间。在实施例中，颗粒的平均最大横截面宽度可以是150nm，并且颗粒的宽度不大于或小于不在150nm的一个标准差内的值。在一些实施例中，纳米颗粒的体积可以等于直径在10nm至500nm之间、适当地50nm至250nm之间、或100nm至200nm之间、或130nm至170nm之间的球体的体积。
在优选的非限制性实施例中，纳米颗粒的体积可以等于直径约100nm的球体的体积。
在本发明的另一方面，纳米颗粒与唾液酸配体的连接为纳米颗粒提供了逃避免疫系统的手段，即通过网状内皮系统(RES)的调理作用和吞噬作用。已知纳米颗粒的聚乙二醇化(PEGylation)(即用聚乙二醇涂覆纳米颗粒)可提供免受免疫细胞检测的屏障。然而，PEG具有毒性、免疫原性、细胞摄取减少、结合减少和不可生物降解或可生物吸收特性的缺点。纳米颗粒的唾液酸涂层克服了PEG的缺点，并提供了一种可以逃避RES和免疫检测的天然的、非免疫原性的纳米颗粒涂层。因此，本文披露的纳米颗粒具有逃避免疫检测和减轻免疫原性应答的能力。
本文披露的纳米颗粒或微粒可进一步包含封装在所述纳米颗粒内、粘附到其表面或整合到其结构中的生物活性剂。例如，纳米颗粒可以进一步包含抗生素、抗病毒剂、抗炎剂、细胞因子、细胞因子抑制剂、免疫调节剂、免疫毒素、抗血管生成剂、抗高血压剂、抗水肿剂、放射增敏剂、包含DNA或RNA的寡核苷酸、肽、抗癌剂或其任何组合的中的至少一种。制备包含封装在纳米颗粒内、粘附到其表面或整合到其结构中的生物活性剂的纳米颗粒的方法是本领域技术人员已知的。
本披露进一步提供包含本文披露的唾液酸配体连接的纳米颗粒的药物或兽药组合物。这样的药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例同时包括肠胃外和非肠胃外施用方法，包括例如静脉内、玻璃体内、口服、眼内、视网膜下、眼球筋膜下(subtenons)、巩膜内、眼周、静脉内、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗、肝内、皮下和直肠施用。
适当地，在一些实施例中，纳米颗粒可肠胃外施用。肠胃外施用后，纳米颗粒可以选择性地在特定的组织或身体部位蓄积。在一些实施例中，纳米颗粒可以将治疗有效载荷递送至细胞或组织。在一些实施例中，纳米颗粒可以通过增强的渗透性和保留作用进入患病组织。
一般而言，提供的药物组合物包含有效量的纳米颗粒以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂。这样的组合物包含：具有多种缓冲液内容物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂例如洗涤剂和增溶剂(例如，tween 80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞(thimersol)、苯甲醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。这样的组合物可能影响纳米颗粒的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],第18版(1990,Mack Publishing Co.[马克出版公司],Easton,Pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿]18042)1435-1712页，其通过引用并入本文。组合物可以以液体形式制备，或者可以配制成干粉，例如冻干形式。
本披露提供了治疗免疫和炎症相关疾病的方法，疾病包括但不限于干性和湿性黄斑变性、视网膜血管病、糖尿病视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、囊样黄斑水肿、增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变、干眼症、变应性结膜炎、类风湿性关节炎、炎症性关节炎、狼疮、肾炎、免疫复合物肾病、过敏性食管炎、过敏性胃炎、肝炎、肝纤维化疾病、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、细菌和病毒感染、流感、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2、HIV/AIDS、B组链球菌感染、奈瑟氏球菌感染、涉及实质器官的癌症或血液癌症，在每种情况下都通过在患病受试者中施用这样的药物组合物进行治疗。本披露提供了调节细胞中炎症反应的方法，该方法包括：向细胞提供唾液酸或其类似物，其中该唾液酸或类似物存在于纳米颗粒上，从而使细胞中的促炎反应受到抑制或细胞中的抗炎反应增加。在实施例中，该方法使促炎反应受到抑制。在可替代的实施例中，该方法使抗炎反应增加。在一些实施例中，该方法在诸如感染或癌症的情况下使促炎反应增强。
本文使用的术语“治疗”(treatment或treating)描述目的如下的方法或过程：(1)延缓或预防疾病、障碍或病症的发作；(2)减缓或停止疾病、障碍或病症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)改善疾病、障碍或病症的症状；(4)降低疾病、障碍或病症的严重程度或发生率；或(5)治愈疾病、障碍或病症。可以在疾病、障碍或病症发作之前施用治疗以起到预防或防止作用。可替代地或另外地，可以在疾病、障碍或病症开始之后施用治疗以起到治疗作用。
取决于施用途径和疾病，可根据待治疗受试者的体重、体表面积、主要器官/肿瘤大小和/或转移数量、大小和/或类型计算有效剂量。考虑到在人体临床试验中观察到的药代动力学数据，本领域技术人员可以容易地优化合适的剂量。最终剂量方案将通过考虑可改变药物作用的多种因素来确定，例如药物的比活性，损伤的严重程度和患者的反应性，患者的年龄、病况、体重、性别和饮食，任何现有感染的严重程度，施用时间，其他疗法的使用(或不使用)以及其他临床因素。
在一方面，促炎反应可被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少99％。在可替代的实施例中，抗炎反应可以增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％和至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％。在其他实施例中，本文披露的组合物可使促炎反应受到抑制、抗炎反应增加。
适当地可以测量促炎细胞因子以确定纳米颗粒药物治疗的疗效。这样的测量可以在受试者的实际治疗期间进行，或者可替代地，在本文披露的纳米颗粒的动物试验期间进行。在实施例中，促炎细胞因子可以包括例如TNF-α和IL-6。适当地也可以测量抗炎细胞因子，例如IL-10。技术人员会知道测量这样的细胞因子的合适测定方法。例如，可以使用Bio-PlexTMCytokine Assay(伯乐公司(Bio-Rad))。为了确定细胞产生更多还是更少的促炎细胞因子，可以使用的合适的方法是将细胞重新悬浮并以2×105个细胞/ml和200μl/孔接种到96孔板中。然后可以放置过夜让细胞贴在平板上，并用一系列浓度的LPS和配体处理24小时。然后可以去除上清液并于-70℃储存。然后可通过ELISA(安迪公司(R&D systems))评估细胞因子水平。应理解，可以应用类似的方法来确定抗炎细胞因子。
在实施例中，可以通过用在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的TNF-α捕获抗体过夜包被96孔板来适当地测定TNF-α水平。所有步骤都可以在室温下进行。可以用1×PBS/0.1％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)洗涤孔三次，然后用溶于1×PBS中的1％BSA(BDH)封闭一小时。可以重复洗涤步骤，并且可以向孔中添加50μl经处理的细胞上清液或范围为2000pg/ml至0pg/ml的标准品，并放置2小时。随后吸出上清液，将孔洗涤3次，添加50μl在1％BSA/1×PBS中稀释的TNF-α检测抗体2小时。同样，可以将孔洗涤3次，并且可以添加以1/200的稀释度在1％ BSA/1×PBS中稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体20分钟。在此阶段，板可以用铝箔覆盖。洗涤孔后，可以添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)20分钟，然后再次避光。可添加1M盐酸以使反应停止，并在酶标仪上读取450nM处的吸光度。然后可以根据标准曲线外推TNF-α浓度。应理解，可以应用类似的方法来确定其他细胞因子水平，用TNF-α检测抗体替代检测抗体或对适用的细胞因子特异的其他药剂。
在实施例中，可以通过用在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的IL-10捕获抗体过夜包被96孔板来适当地测定IL-10水平。所有步骤都可以在室温下进行。可以用1×PBS/0.1％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)洗涤孔三次，然后用溶于1×PBS中的1％BSA(BDH)封闭一小时。可以重复洗涤步骤，并且可以向孔中添加50μl经处理的细胞上清液或范围为2000pg/ml至0pg/ml的标准品，并放置2小时。随后吸出上清液，将孔洗涤3次，添加50μl在1％BSA/1×PBS中稀释的IL-10检测抗体2小时。同样，可以将孔洗涤3次，并且可以添加以1/200的稀释度在1％ BSA/1×PBS中稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体20分钟。在此阶段，板可以用铝箔覆盖。洗涤孔后，可以添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)20分钟，然后再次避光。可添加1M盐酸以使反应停止，并在酶标仪上读取450nM处的吸光度。然后可以根据标准曲线外推IL-10浓度。应理解，可以应用类似的方法来确定其他细胞因子水平，用IL-10检测抗体替代检测抗体或对适用的细胞因子特异的其他药剂。
为确定治疗的受试者或试验动物产生更大还是更小的促炎反应，可使用的方法是分析血清细胞因子水平。例如，这可以通过使用毛细管从治疗的受试者中采集50μl血液来实现。在以1300rpm离心以沉淀红细胞之前，让此血液在室温下凝结30分钟。将血清倒入干净的微量离心管中，并通过ELISA进行分析。对于更全面的分析，可以通过直接穿刺心脏采集更大体积的血液(约600μl-1ml)，从而允许采集更大体积的血清并通过ELISA或其他此类技术分析。确定治疗的受试者或试验动物产生更大还是更小的促炎反应的其他合适的技术将是本领域已知的，特别是检测和测量细胞因子的技术。
在该方法的一些实施例中，其中提供了纳米颗粒，已经确定其与细胞上的Siglec受体结合可以抑制细胞产生促炎细胞因子并诱导抗炎细胞因子。在实施例中，纳米颗粒与细胞上的Siglec受体的结合可以激活受体并可诱导受体和纳米颗粒内化到细胞中。纳米颗粒内化后，可以抑制细胞产生促炎细胞因子和/或增加抗炎细胞因子的产生。
因此，提供了在有需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用唾液酸或其类似物，其中该唾液酸或类似物存在于纳米颗粒上，使得在受试者中抑制促炎免疫应答或增加抗炎免疫应答。
所述方法可包括：识别具有促炎免疫应答和/或患有与促炎免疫应答相关或由其引起的障碍或有风险发生促炎免疫应答或与促炎免疫应答相关或由其引起的障碍的受试者；向受试者施用唾液酸或其类似物，其中该唾液酸或类似物存在于纳米颗粒上。
在特定的实施例中，该方法可用于治疗患有肺病的受试者，包括肺炎性和非炎性病症，但不限于结核病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管扩张、肺纤维化、间质性肺疾病、肺血管疾病、流感、病毒性肺炎、细菌性肺炎、过敏性支气管炎、非过敏性支气管炎、鼻炎和纤维化肺泡炎。
在一些实施例中，该方法可用于治疗风湿性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、系统性硬化病(硬皮病)、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、干燥综合征(sjogrens syndrome)、风湿性多肌痛、痛风、骨关节炎、感染性关节炎和幼年型特发性关节炎。
在一些实施例中，该方法可用于治疗胃肠道炎症，包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、乳糜泻、憩室炎、胃食管反流、乳糖不耐受、消化性溃疡、胆囊炎、胃炎、结肠炎、胰腺炎、自身免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎和胰腺炎。
在一些实施例中，该方法可用于治疗心血管疾病，包括但不限于脓毒症休克、动脉粥样硬化、舒张功能障碍、心力衰竭、心脏纤维化、柯萨奇病毒性心肌炎(coxsackiemyocarditis)、先天性心脏传导阻滞、自身免疫性心肌炎、巨细胞性心肌炎和炎症。
在一些实施例中，该方法可用于治疗肾炎症，包括但不限于肾移植排斥、肾小球肾炎、急性肾炎、膀胱炎、前列腺炎、糖尿病性肾炎、糖尿病肾病和尿路感染。
在一些实施例中，该方法可用于治疗皮肤炎症，包括但不限于皮炎、湿疹、炎性皮疹、硬皮病、瘢痕疙瘩、痤疮、结节病、股癣、体癣、足癣、头癣、甲癣、酒渣鼻、白癜风、硬化性苔藓、自身免疫性荨麻疹、皮肌炎和化脓性汗腺炎。
在一些实施例中，该方法可用于治疗神经系统炎症，包括但不限于神经脊髓炎、多发性硬化、脑炎、神经系统结节病(neuro sarcoid)、阿尔茨海默病(Alzheimers)、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿舞蹈症(huntingtons chorea)
在一些实施例中，该方法可用于治疗自身免疫性炎症，包括但不限于糖尿病、SLE、多发性硬化、干燥综合征、艾迪生病(Addison’sdisease)、格雷夫斯病(Graves Disease)、桥本甲状腺炎(Hashimotos thyroiditis)、重症肌无力、自身免疫性血管炎、乳糜泻、恶性贫血、斑秃、自身免疫性肝炎、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性内耳疾病、吉兰-巴雷综合征(Guillain barre)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、福格特-小柳-原田综合征(Vogt-Koyanagi-HaradaSyndrome)、系统性血管炎、巨细胞性动脉炎、结节病和结节性多动脉炎。
在一些实施例中，该方法可用于治疗病毒性炎症，包括但不限于甲型流感、乙型流感、丙型流感、SARS-CoV1、SARS-CoV2、新城疫、仙台病毒、多瘤病毒、HIV、黄病毒、杯状病毒(Caclivirus)、疱疹病毒、微小核糖核酸病毒(Picoronovirus)和冠状病毒。
在一些实施例中，该方法可用于治疗真菌炎症，包括但不限于真菌血症、真菌脓肿、真菌性角膜炎、念珠菌病、足癣和股癣。
在一些实施例中，该方法可用于治疗寄生性炎症，包括但不限于阿米巴病、贾弟虫病、弓形体病和弓蛔虫病。
在一些实施例中，该方法可用于治疗纤维化疾病，包括但不限于特发性肺纤维化、骨髓纤维化、肝纤维化、心脏纤维化伴舒张功能障碍和CHF、肾纤维化、视网膜纤维化、皮肤纤维化和瘢痕形成。
在一些实施例中，该方法可用于治疗急性危及生命的炎症，包括但不限于脓毒症和细胞因子风暴。在特定实施例中，提供了治疗多种眼部炎性疾病的方法，例如黄斑变性，葡萄膜炎，视神经炎，神经脊髓炎和由眼睛感染、眼睛暴露于药物和毒素以及包括自身免疫性障碍在内的一般免疫障碍引起的炎症。在非限制性实施例中，提供了用于预防、治疗或改善患者中的黄斑变性的有用方法，例如干性黄斑变性、湿性黄斑变性、地图样萎缩、中间性黄斑变性和年龄相关性黄斑变性。治疗、预防或改善包括黄斑变性在内的眼部炎症的方法包括将唾液酸配体纳米颗粒的组合物施用于患有或有风险发生黄斑变性等眼部炎症的患者。
在一些实施例中，眼用制剂以滴眼液、眼药膏或眼用注射液的形式提供。对于眼用注射液，玻璃体内或结膜下注射可用于施用纳米颗粒。
在治疗、预防或改善黄斑变性的方法中应用的联合施用的另外化合物可以与用于治疗黄斑变性的包含纳米颗粒的药物组合物一起联合施用。例如，用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的抗血管生成药物，例如哌加他尼钠(pegaptanib sodium)、雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibrecept)和布洛赛珠单抗(brolucizumab)可以组合使用。虽然已经显示和描述了本披露的特定实施例，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不偏离本披露的更广泛方面的情况下进行改变和修改。因此，所附权利要求书将在其范围内涵盖属于本披露真实精神和范围内的所有此类改变和修改。
因此，在第一个示例实施例中，本发明提供了颗粒，该颗粒包含由以下结构式表示的分子：
P-L-G。
在第1个示例实施例的第1方面，P是生物相容性聚合物支架，其包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)；并且L是共价接头或其药学上可接受的盐。
在第1个示例实施例的第2方面，聚合物支架包含嵌段共聚物PLGA-PEG。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样
在第1个示例实施例的第3方面，P由以下结构式表示：
其中符号表示该聚合物至该接头L的附着点，并且进一步其中：x为0到20的整数，例如0到10，y为0到20的整数，例如0到10，m为1到1000的整数，例如1到500，n为5到450的整数，前提是x和y不同时为0。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第4方面，nG由以下结构式中的任一个表示：
或其药学上可接受的盐，其中符号------表示G至接头L的附着点，并且进一步其中p，也称为聚合度(DP)，是4至198的整数。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第5方面，p的值选自以下范围中的任一个：10至20、20至30、30至40、40至50和50至60。例如，p的值可以是5至25或10至20。例如，p的值可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47，48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第6方面，接头L由以下结构式中的任一个表示，其中符号------表示接头L至G的附着点，并且符号表示接头L至P的附着点：
其中：R11是–C(O)NH-或–CH2-NH-C(O)-CH2-O-；并且R12不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X11)-(CH2)1-10-、-N(X12)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X11是H或乙酰基，并且X12是H或甲基；
其中：R21是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；并且R22不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X21)-(CH2)1-10-、-N(X22)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X21是H或乙酰基，并且X22是H或甲基；
其中：R31是–(CH2)1-10-；并且R32不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X31)-(CH2)1-10-、-N(X32)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X31是H或乙酰基，并且X32是H或甲基；
其中：R41是–(CH2)1-10-；并且R42不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X41)-(CH2)1-10-、-N(X42)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X41是H或乙酰基，并且X42是H或甲基；
其中：R51是–(CH2)1-10-；并且R52不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X51)-(CH2)1-10-、-N(X52)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X51是H或乙酰基，并且X52是H或甲基；
其中：R61是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；R62不存在或是–(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-；
其中：R71是–NHC(O)-或–OCH2-C(O)NH-CH2-；并且R72是–(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-；
其中：R81和R82各自独立地是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；
其中：R91是–NHC(O)-或–OCH2-C(O)NH-CH2-；并且R92是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；
其中：R101是H或甲基；X10是O或NH；并且R102是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X101、X102和X103各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基A的附着点；
其中：R111和R111A各自独立地是H或C1-C3烷基；X11和X11A各自独立地是O或NH；并且R11和R11A独立地是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X111、X112和X113各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基B或羰基B’的附着点；
其中：X12是-(CH2)1-10-或–C(O)-(CH2)1-10-；并且R12是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分
其中X121、X122和X123各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基C的附着点；
其中：X13是–Ph-或–CH2-Ph-CH2-，其中Ph是苯基；并且R13是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X131、X132和X133各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-，并且其中符号表示至羰基D的附着点；
其中：X14和X15各自独立地是H或甲基，A14和A15各自独立地是NRA、NRANRB、O或S，其中RA和RB每次出现时独立地选自H、C1-4烷基和C6-C18芳基；并且R14和R15各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第8方面，接头L由以下结构式表示：
其中：a为2至6的整数；并且RA不存在或是–(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NH-。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第9方面，P是PLGA(10k)-PEG(5k)。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第1个示例实施例的第10方面，每单位重量P中G的重量(配体密度)是0.5μg/mg至100μg/mg。例如，配体密度可以是10至75μg/mg或10至75μg/mg。在其他实例中，配体密度可以是0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μg/mg。第1个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第2个示例实施例中，本发明提供了治疗患有眼科疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的第1个示例实施例的任何方面的颗粒。
在第2个示例实施例的第1方面，眼科疾病是干性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、非增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、葡萄膜炎、干眼症、结膜炎、甲状腺性眼病、眼内炎、视网膜变性、青光眼、视网膜静脉阻塞、睑缘炎、角膜炎、眼部感染或白内障。第2个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第2个示例实施例的第2方面，唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的拮抗剂。第2个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例中，本发明提供了治疗患有炎性疾病的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒。
在第3个示例实施例的第1方面，施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、眼内、视网膜下、眼球筋膜下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗以及肝内、皮下或直肠施用中的一种或多种。
在第3个示例实施例的第2方面，炎性疾病是结核病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管扩张、肺纤维化、间质性肺疾病、肺血管疾病、流感、病毒性肺炎、细菌性肺炎、过敏性支气管炎、非过敏性支气管炎、鼻炎或纤维化肺泡炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第3方面，炎性疾病是类风湿性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、系统性硬化病(硬皮病)、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、干燥综合征、风湿性多肌痛、痛风、骨关节炎、感染性关节炎或幼年型特发性关节炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第4方面，炎性疾病是克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、乳糜泻、憩室炎、胃食管反流、乳糖不耐受、消化性溃疡、胆囊炎、胃炎、结肠炎、胰腺炎、自身免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎或胰腺炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第5方面，炎性疾病是脓毒症休克、动脉粥样硬化、舒张功能障碍、心力衰竭、心脏纤维化、柯萨奇病毒性心肌炎、先天性心脏传导阻滞、自身免疫性心肌炎或巨细胞性心肌炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第6方面，炎性疾病是肾移植排斥、肾小球肾炎、急性肾炎、膀胱炎、前列腺炎、糖尿病性肾炎或糖尿病肾病。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第7方面，炎性疾病是皮炎、湿疹、炎性皮疹、硬皮病、瘢痕疙瘩、痤疮、结节病、股癣、体癣、足癣、头癣、甲癣、酒渣鼻、白癜风、硬化性苔藓、自身免疫性荨麻疹、皮肌炎或化脓性汗腺炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第8方面，炎性疾病是糖尿病、SLE、多发性硬化、干燥综合征、艾迪生病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、乳糜泻、恶性贫血、斑秃、自身免疫性肝炎、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性内耳疾病、吉兰-巴雷综合征、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、福格特-小柳-原田综合征、系统性血管炎、巨细胞性动脉炎、结节病或结节性多动脉炎。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第9方面，该炎性疾病是神经脊髓炎、多发性硬化、脑炎、神经系统结节病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化或亨廷顿舞蹈症、横贯性脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、帕金森病或良性特发性震颤。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第10方面，该炎性疾病是由甲型流感、乙型流感、丙型流感、SARS-CoV1、SARS-CoV2、新城疫病毒、仙台病毒、多瘤病毒、HIV、黄病毒、杯状病毒、疱疹病毒、微小核糖核酸病毒或冠状病毒引起的病毒性疾病。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第11方面，炎性疾病是由革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、需氧菌、厌氧菌或抗生素耐药菌引起的细菌性疾病。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第12方面，炎性疾病是真菌血症、真菌性角膜炎、念珠菌病、足癣或股癣。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第13方面，其中炎性疾病是阿米巴病、贾弟虫病、弓形体病或弓蛔虫病。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第14方面，炎性疾病是特发性肺纤维化、骨髓纤维化、肝纤维化、心脏纤维化伴舒张功能障碍和CHF、肾纤维化、视网膜纤维化、皮肤纤维化和瘢痕形成。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第15方面，炎性疾病是脓毒症、细胞因子风暴或镰状细胞病。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第3个示例实施例的第16方面，唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂。第3个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第4个示例实施例中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒。
在第4个示例实施例的第1方面，癌症是原发性肺癌、转移性肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、口腔癌、食管癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、肾细胞癌、脊髓癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、眼癌、鼻咽癌或皮肤癌。
在第4个示例实施例的第2方面，唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中一个或多个的拮抗剂，是Siglec 14或16中一个或多个的激动剂。第4个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第4个示例实施例的第3方面，该方法进一步包括向受试者施用治疗量的选自伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolimumab)、帕博利珠单抗(pebrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)或西米普利单抗(cemiplimab)的检查点抑制剂。第4个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第4个示例实施例的第4方面，颗粒的施用与放射疗法同时或顺序进行。第4个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第4个示例实施例的第5方面，该方法进一步包括向受试者施用治疗量的第二治疗剂，该第二治疗剂选自环磷酰胺、甲氨蝶呤(methothrexate)、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)、环磷酰胺、多西他赛(docetaxel)、博来霉素(bleomycin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、盐酸氮芥(mustine)、长春新碱(vincristine)、丙卡巴肼(procarbazine)、泼尼松龙、表柔比星(epirubicin)、顺铂、他莫昔芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、Her2 neu抑制剂、抗VEGF抑制剂、EGFR抑制剂、ALK抑制剂、索拉非尼(sorafenib)或mTOR抑制剂。第4个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第5个示例实施例中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒。在第5个示例实施例的第1方面，癌症是急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、非霍奇金或霍奇金淋巴瘤。
在第5个示例实施例的第1方面，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的柔红霉素、阿糖胞苷或伊马替尼。
在第5个示例实施例的第2方面，颗粒的施用与干细胞移植或骨髓移植同时或顺序进行。第5个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例中，本发明提供了治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒。在第6个示例实施例的第1方面，传染病是由B组链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、空肠弯曲杆菌、克氏锥虫、HIV、甲型流感、乙型流感、或丙型流感、Sars CoV1、Sars CoV2或疱疹病毒科引起的。
在第6个示例实施例的第2方面，唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂或拮抗剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂或拮抗剂。第6个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例的第3方面，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的扎那米韦、奥司他韦、伐昔洛韦、阿昔洛韦或齐多夫定中的一种或多种。第5个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例的第4方面，唾液酸配体与Siglec 11同源。第6个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例的第5方面，唾液酸配体与Siglec 9同源。第6个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例的第6方面，唾液酸配体与Siglec 7同源。第6个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第6个示例实施例的第7方面，唾液酸配体与Siglec 5同源。第6个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第7个示例实施例中，本发明提供了调节免疫细胞中细胞介导的炎症反应的方法，该方法包括使免疫细胞与根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒接触。
在第8个示例实施例中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒和药学上可接受的载剂。在第8个示例实施例的第1方面，药学上可接受的载剂包括PBS缓冲液或盐水溶液。
在第8个示例实施例的第2方面，载剂中颗粒的浓度为0.01mg/ml至100mg/ml。第8个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第9个示例实施例中，本发明提供了组合物，该组合物包含根据第1个示例实施例的任何方面的冻干或冷冻干燥颗粒。
在第10个示例实施例中，本发明提供了制造颗粒的方法，该方法包括：使生物相容性聚合物支架P和聚糖G反应，该生物相容性聚合物支架P包含第一不稳定部分，该聚糖G包含第二不稳定部分，反应条件足以产生该第一不稳定部分和第二不稳定部分的加合物L，从而产生由以下结构式表示的分子：
P-L-G，
其中P包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；并且G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)。
在第10个示例实施例的第1方面，第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自胺、羧酸、叠氮化物、炔烃、TCO、四嗪、DCBO和二酰肼。
在第10个示例实施例的第1方面，第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自叠氮化物、炔烃或四嗪，加合物L包括炔烃-叠氮化物加合物或炔烃-叠氮化物加合物，并且其中这些足以产生该加合物的条件是以下反应的条件：铜(I)催化的叠氮化物-炔烃反应(CuAAC)；无铜叠氮化物-炔烃反应；应变促进的叠氮化物-炔烃反应(SPAAC)；四嗪-烯烃连接反应；以及TCO-四嗪反应。第10个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第10个示例实施例的第2方面，P包含PLGA-PEG共聚物。第10个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第11个示例实施例中，本发明提供了抑制受试者中补体激活的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第一个示例实施例的任何方面的颗粒。
在第11个示例实施例的第1方面，受试者产生过量的补体成分C3、C3b。
在第11个示例实施例的第2方面，颗粒是Siglec 11的激动剂。第11个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第11个示例实施例的第3方面，颗粒与补体因子H结合。第11个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
在第12个示例实施例中，本发明提供了治疗患有补体过度激活疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据第1个示例实施例的任何方面的颗粒。
在第12个示例实施例的第1方面，施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、口腔冲洗、眼内、视网膜下、眼球筋膜下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗以及肝内、皮下、直肠、关节内施用中的一种或多种。
在第12个示例实施例的第2方面，补体过度激活疾病是干性和湿性黄斑变性、阵发性夜间血尿、系统性红斑狼疮、脓毒症、抗磷脂综合征、阿尔茨海默病、卒中、心肌梗死、休克、器官移植排斥、生物材料植入排斥、COPD加重、牙龈炎/牙周病、全身炎症反应综合征。第11个示例实施例的其余特征和示例特征如它们关于其各个方面所定义的那样。
合成方案
合成实例1
方案1
条件：i)化合物2(20当量)，乙酸钠缓冲液，室温1小时；ii)化合物4(2当量)，三乙胺(3当量)，DMF，室温1小时；iii)化合物6(20当量)，H2O，室温24小时
化合物3：向烧瓶中加入化合物1(1当量)、接头2(20当量)和乙酸钠缓冲液，并在室温下搅拌1小时。使用0.1M碳酸氢铵作为洗脱液，通过P2聚丙烯酰胺凝胶过滤纯化混合物，得到化合物3。
化合物5：将化合物3(1当量)、BCN-PNP 4(2当量)、三乙胺(3当量)和DMF加入烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌1小时。对产物进行C18柱层析纯化得到化合物5。
化合物7：将化合物5(1当量)、H2O、叠氮基聚合物6(20当量)加入烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌24小时。通过尺寸排阻色谱法纯化产物，得到化合物7。
合成实例2
方案2
条件：i)化合物2(20当量)，乙酸钠缓冲液，室温1小时；ii)化合物4(2当量)，三乙胺(3当量)，DMF，室温1小时；iii)化合物6(20当量)，H2O，室温24小时
化合物3：向烧瓶中加入化合物1(1当量)、接头2(20当量)和乙酸钠缓冲液，并在室温下搅拌1小时。使用0.1M碳酸氢铵作为洗脱液，通过P2聚丙烯酰胺凝胶过滤纯化混合物，得到化合物3。
化合物5：将化合物3(1当量)、BCN-PNP 4(2当量)、三乙胺(3当量)和DMF加入烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌1小时。对产物进行C18柱层析纯化得到化合物5。
化合物7：将化合物5(1当量)、H2O、叠氮基聚合物6(20当量)加入烧瓶中，并将混合物在室温下搅拌24小时。通过尺寸排阻色谱法纯化产物，得到化合物7。
合成实例3
可以通过化学方法制备用多种合适的接头(例如氨基烷基或氨基低聚乙二醇)修饰的乳糖，(Nat.Chem.[自然化学]1,611–622,2009)。所得化合物可通过使用微生物或哺乳动物唾液酸转移酶的聚唾液酸(PSA)进行延伸(Glycobiology[糖生物学],18,177–186,2008)。这样的经修饰乳糖的实例是由以下结构式表示的那些：
接头的胺提供了一个官能团，用于附接到具有活化酯如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的聚合物(Chem.Rev.[化学评论]2016,116,3,1434–1495)。胺可转化为各种官能团以附接到适当官能化的聚合物上。例如，胺可以通过叠氮基迁移反应转化为叠氮化物(ACSComb.Sci.[ACS组合科学]2013,15,7,331–334)，然后可以与通过环辛炔修饰的聚合物(如BCN或DBCO)缀合(Accounts Chemical Research[化学研究评述],9,805-815,2011)。可替代地，通过使用这些试剂的活化酯或氨基甲酸酯，可以使用胺安装BCN或DBCO部分。所得产物可与由叠氮基部分修饰的聚合物连接。可以通过胺与S-(2-溴-2-氧代乙基)硫代乙酸酯反应，然后用弱碱处理来安装硫醇。然后可使用标准条件使硫醇与马来酰亚胺改性的聚合物反应。
据描述，微生物可以生物合成与乳糖部分相连的PSA(Richard等人Glycobiology[糖生物学],2016,第26卷,第7期,723–731)。在这种情况下，需要连接适当的接头以与适当官能化的聚合物缀合。这可以通过还原胺化或用适当官能化的羟胺处理来实现(Glycobiology.[糖生物学]2006；16:21C–27C,和Chem.Commun.[化学通信],2014,50,7132-7135)。以这种方式，可安装氨基，其可用于与活性酯官能化聚合物的直接缀合或如上所述被衍生化。示例合成方案如下所示：
如美国专利2015/0150997中所述，亦可将氨基安装在非还原端，该美国历的全部教导通过引用并入本文。
如美国专利2015/0150997中所述，使用高碘酸钠处理PSA，在非还原端安装醛，可用于通过还原胺化(Bioconjug Chem.[生物缀合化学]2008；19(7):1485–1490)或者肟或腙连接(Chem.Rev.[化学评
论]2017,117,15,10358–10376,和Nat.Methods.[自然-方法学]2009；6(3):207–209)安装各种官能团(即胺，参见方案1)。PSA的非还原端修饰参见以下合成方案3：
方案3
还可以通过与苯二胺衍生物反应在异头中心用含氨基的接头修饰PSA(Glycobiology[糖生物学],2016,第26卷,第7期,723–731)，得到具有氨基末端的荧光喹喔啉酮，可通过上述化学方法进一步延伸。参见下文方案4：PSA化合物1可与用氨基末端官能化的苯二胺2衍生物反应，形成荧光3，其可被如NHS官能化的聚合物等多种官能团修饰。
方案4：PSA还原端的苯二胺修饰
合成实例4
可利用以下反应通过三唑连接使PSA和聚合物缀合。
方案5A
方案5B
方案5C
方案5A至5C中所示每个反应的条件为：CuSO4、THPTA、抗坏血酸
合成实例5
可利用以下反应通过DBCO连接使PSA和聚合物缀合。
方案6A
方案6B
方案6A和6B中所示每个反应的条件为：H2O，室温24小时。
合成实例6
可利用以下反应通过硫代马来酰亚胺连接使PSA和聚合物缀合。
方案7
另外的实施例
在某些实施例中，本发明由以下编号的示例实施例定义。
1.一种颗粒，其包含：
生物相容性聚合物支架；以及与该支架共价连接的聚糖，其中该聚糖包含至少一个唾液酸配体，其中该至少一个唾液酸配体包含五个或更多个碳水化合物残基。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中该聚糖的平均分子量为900Da至100,000Da。
3.根据权利要求1所述的颗粒，其中该颗粒为纳米颗粒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的颗粒，其包含至少第一唾液酸配体和与该第一唾液酸配体不同的至少第二唾液酸配体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体与选自Sigelc 1、Siglec 2、Siglec 3、Siglec 4、Siglec 5、Siglec 6、Siglec 7、Siglec 8、Siglec 9、Siglec 10、Siglec 11、Siglec 12、Siglec 13、Siglec 14、Siglec 15、Siglec16、Siglec 17、Siglec E、Siglec F或Siglec H的Siglec受体同源。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体与选自血小板免疫球蛋白样2型受体(PILR-α或PILR-β)、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)和basigin(CD147)的受体同源。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体与源自感染原的受体同源。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该支架的生物相容性聚合物包含可生物降解聚合物。
9.根据权利要求8所述的颗粒，其中该可生物降解聚合物选自由聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和聚(3-羟基丁酸)组成的组。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该支架包含不可生物降解聚合物。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该支架包含选自由以下组成的组的聚合物：聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该支架包含嵌段共聚物PLGA-PEG。
13.根据权利要求12所述的颗粒，其中该PEG嵌段的平均分子量为900Da至50,000Da。
14.根据权利要求13所述的颗粒，其中该PEG的平均分子量为1,000Da至5000Da。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的颗粒，其中该颗粒为非球形，并且具有至少50nm且不大于750nm的平均横截面宽度。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的颗粒，其中该颗粒为球形，并且具有20-2000nm的直径。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的颗粒，其中该颗粒为非球形，且其中该颗粒的平均最大横截面宽度为1微米至5微米
18.根据权利要求1-17中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体包含Neu5Ac和Neu5Gc中的一种或多种。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体是Neu5Ac和Neu5Gc中一种或两种的唾液酸聚合物。
20.根据权利要求11-17中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体通过糖苷α2-3、α2-6、α2-8或α2-9键共价连接至生物相容性聚合物。
21.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体是具有DP5至DP200的聚合度的多糖。
22.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体是直链或支链多糖。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体是GlcNAc、GluNAc、GalNAc、ManAc、岩藻糖中的两种或更多种的多糖，并且其中该多糖以唾液酸封端。
24.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其进一步包含至少一种第二治疗剂。
25.根据权利要求27所述的颗粒，其中该第二治疗剂选自抗体、多肽、脂质、小分子或唾液酸修饰的细胞。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体以每nm2颗粒0.0001-10个分子的密度存在。
27.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该唾液酸配体与Siglec 3-16同源。
28.根据权利要求27所述的颗粒，其中Siglec 3-16存在于选自由巨噬细胞、小胶质细胞、树突细胞、NK细胞、中性粒细胞、多形核细胞、T细胞CD8、T细胞CD34、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞组成的组的免疫细胞上。
29.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的巨噬细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、7、9、11、12、15或16同源。
30.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的单核细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、7、9、10、13或14同源。
31.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的树突细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、7或9同源。
32.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的中性粒细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、9或14同源。
33.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的自然杀伤细胞(NK)，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 7同源。
34.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的B细胞，且该至少一个唾液酸配体与Siglec 5或10同源。
35.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的CD8+T细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 7或9同源。
36.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的CD34+T细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、9或10同源。
37.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是嗜酸性粒细胞，并且该至少一种唾液酸配体与Siglec 7、8或10同源。
38.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的肥大细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、6或8同源。
39.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是活化的嗜碱性粒细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 3、5、6、8或14同源。
40.根据权利要求28所述的颗粒，其中该免疫细胞是小胶质细胞，并且该至少一个唾液酸配体与Siglec 11同源。
41.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体与补体控制蛋白(CCP)区域4-6和19-20处的补体因子H同源。
42.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体包括神经氨酸酶或唾液酸酶的抑制剂。
43.根据权利要求42所述的颗粒，其中该神经氨酸酶或该唾液酸酶是甲型、乙型或丙型流感病毒神经氨酸酶或唾液酸酶。
44.根据权利要求42所述的颗粒，其中该神经氨酸酶或该唾液酸酶是在呼吸道上皮细胞中表达的神经氨酸酶或唾液酸酶。
45.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中该至少一个唾液酸配体与病毒衣壳唾液酸结合位点同源。
46.根据权利要求45所述的颗粒，其中该病毒衣壳唾液酸结合位点是甲型、乙型或丙型流感病毒上的血凝素酯酶。
47.根据权利要求45所述的颗粒，其中该病毒衣壳唾液酸结合位点是SARS-CoV1或SARS-CoV2病毒刺突蛋白的宿主附着/感染位点。
48.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中：该生物相容性聚合物是PLGA-PEG共聚物；该唾液酸配体由以下结构式表示：
其中x为0到10的整数，y为0到10的整数，m为1到500的整数，n为5到450的整数，p为1到200的整数，前提是x和y不同时为0。
49.一种调节免疫细胞中细胞介导的炎症反应的方法，该方法包括：使该免疫细胞与根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒接触。
50.一种治疗患有炎性疾病的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中该施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、眼内、视网膜下、眼球筋膜下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗以及肝内、皮下或直肠施用中的一种或多种。
52.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是结核病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管扩张、肺纤维化、间质性肺疾病、肺血管疾病、流感、病毒性肺炎、细菌性肺炎、过敏性支气管炎、非过敏性支气管炎、鼻炎或纤维化肺泡炎。
53.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是类风湿性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、系统性硬化病(硬皮病)、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、干燥综合征、风湿性多肌痛、痛风、骨关节炎、感染性关节炎或幼年型特发性关节炎。
54.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、乳糜泻、憩室炎、胃食管反流、乳糖不耐受、消化性溃疡、胆囊炎、胃炎、结肠炎、胰腺炎、自身免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎或胰腺炎。
55.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是脓毒症休克、动脉粥样硬化、舒张功能障碍、心力衰竭、心脏纤维化、柯萨奇病毒性心肌炎、先天性心脏传导阻滞、自身免疫性心肌炎或巨细胞性心肌炎。
56.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是肾移植排斥、肾小球肾炎、急性肾炎、膀胱炎、前列腺炎、糖尿病性肾炎或糖尿病肾病。
57.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是皮炎、湿疹、炎性皮疹、硬皮病、瘢痕疙瘩、痤疮、结节病、股癣、体癣、足癣、头癣、甲癣、酒渣鼻、白癜风、硬化性苔藓、自身免疫性荨麻疹、皮肌炎或化脓性汗腺炎。
58.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是糖尿病、SLE、多发性硬化、干燥综合征、艾迪生病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、乳糜泻、恶性贫血、斑秃、自身免疫性肝炎、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性内耳疾病、吉兰-巴雷综合征、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、福格特-小柳-原田综合征、系统性血管炎、巨细胞性动脉炎、结节病或结节性多动脉炎。
59.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是神经脊髓炎、多发性硬化、脑炎、神经系统结节病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化或亨廷顿舞蹈症、横贯性脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、帕金森病或良性特发性震颤。
60.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是由甲型流感、乙型流感、丙型流感、SARS-CoV1、SARS-CoV2、新城疫病毒、仙台病毒、多瘤病毒、HIV、黄病毒、杯状病毒、疱疹病毒、微小核糖核酸病毒或冠状病毒引起的病毒性疾病。
61.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是由革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、需氧菌、厌氧菌或抗生素耐药菌引起的细菌性疾病。
62.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是真菌血症、真菌性角膜炎、念珠菌病、足癣或股癣。
63.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是阿米巴病、贾弟虫病、弓形体病或弓蛔虫病。
64.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是特发性肺纤维化、骨髓纤维化、肝纤维化、心脏纤维化伴舒张功能障碍和CHF、肾纤维化、视网膜纤维化、皮肤纤维化和瘢痕形成。
65.根据权利要求50所述的方法，其中该炎性疾病是脓毒症、细胞因子风暴或镰状细胞病。
66.根据权利要求50所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂。
67.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒，其中该癌症是原发性肺癌、转移性肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、口腔癌、食管癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、肾细胞癌、脊髓癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、眼癌、鼻咽癌或皮肤癌。
68.根据权利要求67所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的拮抗剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂。
69.根据权利要求67所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗量的选自伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗或西米普利单抗的检查点抑制剂。
70.根据权利要求67所述的方法，其中该颗粒的施用与放射疗法同时或顺序进行。
71.根据权利要求67所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗量的第二治疗剂，该第二治疗剂选自环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、多柔比星、环磷酰胺、多西他赛、博来霉素、达卡巴嗪、盐酸氮芥、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松龙、表柔比星、顺铂、他莫昔芬、泰索帝、Her2 neu抑制剂、抗VEGF抑制剂、EGFR抑制剂、ALK抑制剂、索拉非尼或mTOR抑制剂。
72.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒，其中该癌症是急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、非霍奇金或霍奇金淋巴瘤。
73.根据权利要求72所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的柔红霉素、阿糖胞苷或伊马替尼。
74.根据权利要求72所述的方法，其中该颗粒的施用与干细胞移植或骨髓移植同时或顺序进行。
75.一种治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒，其中该传染病是由B组链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、空肠弯曲杆菌、克氏锥虫、HIV、甲型流感、乙型流感、或丙型流感、Sars CoV1、Sars Co V2或疱疹病毒科引起的。
76.根据权利要求75所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂或拮抗剂，是Siglec14或16中的一种或多种的激动剂或拮抗剂。
77.根据权利要求76所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的扎那米韦、奥司他韦、伐昔洛韦、阿昔洛韦或齐多夫定中的一种或多种。
78.根据权利要求77所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec 11同源。
79.根据权利要求77所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec 9同源。
80.根据权利要求77所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec 7同源。
81.根据权利要求77所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec 5同源。
82.一种治疗患有眼科疾病的受试者的方法，该方法包括：向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒。
83.根据权利要求82所述的方法，其中该眼科疾病是干性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、非增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、葡萄膜炎、干眼症、结膜炎、甲状腺性眼病、眼内炎、视网膜变性、青光眼、视网膜静脉阻塞、睑缘炎、角膜炎、眼部感染或白内障。
84.根据权利要求82所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec 3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的拮抗剂。
85.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒以及药学上可接受的载剂。
86.根据权利要求85所述的药物组合物，其中该药学上可接受的载剂包括PBS缓冲液或盐水溶液。
87.根据权利要求85所述的药物组合物，其中该载剂中这些颗粒的浓度为0.01mg/ml至100mg/ml。
88.一种组合物，该组合物包含冻干的或冷冻干燥的根据权利要求1-48中任一项所述的颗粒。
89.一种制造颗粒的方法，该方法包括：
使生物相容性聚合物支架和聚糖反应，该生物相容性聚合物包含第一不稳定部分，并且
该聚糖包含至少一个唾液酸配体，其中该聚糖包含第二不稳定部分，
该反应在足以产生第一不稳定部分和第二不稳定部分的加合物的条件下进行，
其中该唾液酸配体包括至少三种唾液酸衍生物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中该第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自胺、羧酸、叠氮化物、炔烃、TCO、四嗪、DCBO和二酰肼。
91.根据权利要求89所述的方法，其中该第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自叠氮化物、炔烃或四嗪，该加合物选自炔烃-叠氮化物加合物或炔烃-叠氮化物加合物，并且其中这些足以产生该加合物的条件是以下反应的条件：
铜(I)催化的叠氮化物-炔烃反应(CuAAC)；
无铜叠氮化物-炔烃反应；
应变促进的叠氮化物-炔烃反应(SPAAC)；
四嗪-烯烃连接反应；以及
TCO-四嗪反应。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法，其中该支架包含PEG聚合物。
本文引用的所有文件、论文和已发表材料，包括书籍、期刊文章、手册、已发表的专利申请和专利，均通过引用以其全文明确并入本文。
实例
试剂表：
描述的测定中所用所有试剂的附录
使用的仪器
缩写
通用方法：
I.具有聚唾液酸配体的纳米颗粒的制造方法
1A.用于与纳米颗粒偶联的聚唾液酸叠氮化物配体的制备
可通过将末端CMP-叠氮基-唾液酸部分(CMP-叠氮基-唾液酸；安迪公司)缀合至聚唾液酸的C2异头物羟基基团(α2-8Neu5Ac；多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)DP约150)，制备聚唾液酸叠氮化物配体(Polysia-N3，本文也称为PSA-N3)。使用纯化的人重组唾液酸转移酶ST8SIA4(CMP-N-乙酰神经氨糖酸-聚α-2,8-唾液酸转移酶；安迪公司)进行该缀合。后续的polysia-N3可以为每个聚唾液酸聚合物分子提供单个点击化学活化的叠氮化物官能团，因此可实现与PLGA-炔烃纳米颗粒表面的高度特异性缀合。使用定向点击化学可以产生polysia配体的最佳3D取向，以呈递给Siglec表达细胞，并提供显著优于碳二亚胺化学(即，EDC-NHS)的合成途径。图3描绘了制备聚唾液酸叠氮化物配体(Polysia-N3)的合成方案。
1B.DBCO官能化PLGA纳米颗粒的制备
可以通过乳液法制备DBCO官能化PLGA纳米颗粒，形成聚唾液酸配体附着在其上的核心纳米颗粒。通过将聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-羧酸(PLGA-PEG-COOH；Nanosoft聚合物；MW约10,000:5,000Da)和聚(丙交酯-共-乙交酯)-b-聚(乙二醇)-叠氮化物(PLGA-PEG-二苯并双环辛炔)(DBCO)；Nanosoft聚合物；MW约10,000:5,000Da)以(PLGA-H):(PLGA-PEG-COOH+PLGA-PEG-DBCO)的75:25(w/w)比率共混来制备核心PLGA纳米颗粒。75:25比率也可以更改为50:50或25:75。可以改变PLGA-PEG-COOH:PLGA-PEG-DBCO的比率以增加或降低纳米颗粒表面上DBCO基团的浓度。所选择的比率在纳米颗粒表面上提供合理高密度的叠氮化物官能团，同时允许官能团之间有足够的空间以允许聚合物配体的有效缀合。
为了将荧光部分引入纳米颗粒中，使用聚合物、荧光素-PLA或荧光素-PLGA。用于制备纳米颗粒的总聚合物中荧光素聚合物的总分数为1％(按重量计)。在后续实验中使用空白纳米颗粒作为对照。这些空白纳米颗粒来自上述相同批次的纳米颗粒，但未进行任何PSA配体缀合。
1C.纳米颗粒表面游离DBCO基团的定量方法
可以采用荧光分光光度测定方法对纳米颗粒表面上的游离DBCO基团进行定量。该方法涉及将叠氮化物官能化荧光团(例如，Cy3-N3)缀合到制备的表面上具有DBCO基团的纳米颗粒上。缀合后，洗涤纳米颗粒溶液以除去未反应材料，并测定溶液的荧光。根据使用Cy-3生成的标准曲线确定纳米颗粒表面上可用的DBCO基团的浓度。
1D-1.PSA-N3配体与DBCO官能化纳米颗粒的缀合
可以通过SPAAC无铜点击化学方案将纯化的PSA-N3配体缀合至纯化的PLGA-DBCO纳米颗粒的表面。简言之，将具有DBCO的纳米颗粒与PSA-叠氮化物在4℃或室温或37℃下孵育过夜。完成缀合反应后，使用TFF洗涤纳米颗粒以除去未反应组分，并用PBS或适当的等渗溶液(如10％蔗糖)替换MES缓冲液。然后通过0.2μm过滤器对纳米颗粒溶液进行无菌过滤。通过动态光散射(DLS)测量最终PSA缀合的PLGA纳米颗粒(PSA-PLGA NP)的大小。由于唾液酸部分的高度负电荷和PEG-COOH链的存在(可以通过ζ电位测量证实)，PSA-PLGA纳米颗粒是稳定的。最终polysia-PLGA纳米颗粒产品可以在4℃下以1mg/ml的浓度储存在PBS中，或在-20℃下储存在10％蔗糖中以供后续使用。可以表征最终产品PSA-PLGA纳米颗粒的大小(DLS)和表面电荷(ζ电位测量)。
1D-2.PSA-N3配体与DBCO官能化纳米颗粒的缀合
用于制备纳米颗粒的DBCO-PEG-PLGA聚合物的分数用于确定每mg纳米颗粒总固体中存在的这种聚合物的量。通过SPAAC无铜点击化学方案将纯化的PSA-N3配体缀合至纯化的PLGA-DBCO纳米颗粒的表面。简言之，将具有DBCO的纳米颗粒与PSA-叠氮化物在4℃或室温或37℃下孵育过夜。PSA-叠氮化物与纳米颗粒中存在的DBCO-PEG-PLGA的比率范围为0.75:1.0至1:1(按重量计)。完成缀合反应后，使用TFF洗涤纳米颗粒以除去未反应组分，并用PBS或适当的等渗溶液(如10％蔗糖)替换MES缓冲液。然后通过0.2μm过滤器对纳米颗粒溶液进行无菌过滤。通过动态光散射(DLS)测量最终PSA缀合的PLGA纳米颗粒(PSA-PLGANP)的大小。由于唾液酸部分的高度负电荷和PEG-COOH链的存在(可以通过ζ电位测量证实)，PSA-PLGA纳米颗粒是稳定的。最终PSA-PLGA纳米颗粒产品可以在4℃下储存在PBS中，或在-20℃下储存在10％蔗糖中以供后续使用。表征最终产品PSA-PLGA纳米颗粒的大小(DLS)和表面电荷(ζ电位测量)。
1E.测定纳米颗粒上含聚唾液酸(PSA)的配体的缀合效率
测定与纳米颗粒表面缀合的PSA酸配体的密度和点击化学反应缀合效率是优化本文所述的纳米颗粒的关键。炔烃表面官能团的密度将往往决定可以与纳米颗粒表面缀合的聚合物配体的最大密度。缀合的polysia配体的实际密度也取决于聚唾液酸(polysia)的聚合度(DP；唾液酸单元数)。然而，带负电荷的唾液酸的空间效应和排斥力可能阻止表面官能团的完全缀合。需要测定缀合前纳米颗粒表面炔烃官能团的密度，这可以通过荧光团叠氮化物缀合并使用分光荧光计根据标准曲线定量实现。此外，可以通过X射线光电子能谱(XPS)图分析验证炔烃官能团密度，这可能更准确。通过对配体缀合前炔烃基团的密度进行定量，并随后对缀合步骤后未缀合配体的量进行定量，可以计算PLGA聚唾液酸系统的点击化学反应的缀合效率。
此外，需要测定纳米颗粒表面上配体缀合的密度。可通过氮解吸法以每mg为单位定量未缀合纳米颗粒的总表面来确定配体密度，以m2或nm2表示。将纳米颗粒与聚唾液酸配体缀合后，可通过差示扫描量热法(DSC)和/或热重分析(TGA)定量聚唾液酸的质量。将聚唾液酸的质量转换为分子数(使用缀合聚唾液酸的平均分子量)，然后将分子数除以给定质量纳米颗粒样品的总表面积，得到以分子/nm2为单位的聚唾液酸配体密度。在某些实施例中，颗粒上的聚唾液酸配体的密度为0.1个分子/nm2至5个分子/nm2。
1F.测定纳米颗粒上含聚唾液酸(PSA)的配体的浓度
通过提供的唾液酸测定试剂盒测定与纳米颗粒表面缀合的Polysia的浓度。唾液酸测定试剂盒可测量多种样品中的游离唾液酸(主要是N-乙酰神经氨酸或NANA)。检测基于酶偶联反应，在该反应中，游离唾液酸氧化生成中间体，该中间体与探针进行化学计量反应，生成可通过吸光度(OD＝570nm)或荧光(Ex/Em＝535/587nm)检测的产物。该试剂盒在0.1至10nmol的线性范围内测量唾液酸，检测灵敏度为约1μM浓度。(参考：https:// www.abcam.com/sialic-acid-nana-assaykit-ab83375.html)。将PSA浓度归一化为纳米颗粒的总重量或nmol PSA/mg纳米颗粒。
II.实例1：示例性纳米颗粒的生产。
制备了九批纳米颗粒。表2列出了各制备批次，并提供了各批次的生产详细信息。
除批次AT-007NP06外，通过乳液法制备纳米颗粒。纳米颗粒生产的代表性实例包括以下内容。以3:1的重量比称量PLGA(10k)-PEG(5k)-COOH和PLGA(10k)-PEG(5k)-DBCO并溶于有机溶剂混合物中。聚合物在有机溶剂(59.5％乙酸乙酯和40.5％苯甲醇)中的浓度为37mg/mL。将10mL聚合物溶液添加至40mL由0或0.1％ Tween 80水溶液组成的水相中，并使用旋转定子均质化，形成粗乳液。使用具有3个通道的微流化器将粗乳液进一步均质化成细纳米乳剂。然后通过添加450mL冷水淬灭纳米乳剂以硬化纳米颗粒。然后浓缩淬灭的纳米颗粒溶液，并通过切向流过滤洗涤以除去有机溶剂。通过从已知体积的纳米颗粒溶液中蒸发水来测定聚合的纳米颗粒的浓度。然后使用TFF或通过添加浓缩的MES缓冲液，用pH 5的50mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)水合物缓冲液更换纳米颗粒溶液中的水。然后制备纳米颗粒溶液以与唾液酸(PSA-N3)配体缀合。
纳米颗粒组成的详细描述见表3。对纳米颗粒进行了表征，结果显示于表4中。
表3：纳米颗粒制备步骤
表4：各纳米颗粒批次的组成
注意：
1-纳米颗粒中使用的PLGA的关键特性可以根据“Graner,J.等人,InternationalJournal of Pharmaceutics[国际药剂学杂志]；495(2015)87-92”中发现的程序测定。
2-除NP06外的所有配制剂均根据实例1(I)制备；AT-007NP06根据实例4(V)制备。
III.实例2：CMP-叠氮基-唾液酸对多聚乙酰神经氨酸(PSA-N3)的酶促加成
表5：制备PSA-N3的过程描述
IV.实例3：PSA-叠氮化物通过SPAAC化学与核心DBCO纳米颗粒表面缀合
通过SPAAC无铜点击化学方案将按照上述制备的纯化的PSA-N3配体缀合至纯化的PLGA-DBCO纳米颗粒的表面。简言之，将具有DBCO的纳米颗粒与PSA-叠氮化物在4℃或室温或37℃下孵育过夜。完成缀合反应后，使用TFF洗涤纳米颗粒以除去未反应组分，并用PBS或适当的等渗溶液(如10％蔗糖)替换MES缓冲液。然后通过0.2μm过滤器对纳米颗粒溶液进行无菌过滤。
表6：PSA-叠氮化物通过SPAAC化学与核心DBCO纳米颗粒缀合的详细信息
表7：纳米颗粒的缀合后处理
特别地，通过NANA测定(NANA测定试剂盒，艾博抗公司ab83375)确定PSA-NP中的唾液酸含量。NANA测定是测量游离唾液酸(N-乙酰神经氨酸或NANA)的简便方法。检测基于酶偶联反应，其中游离唾液酸氧化生成可通过吸光度(OD＝570nm)或荧光(Ex/Em＝535/587nm)检测的中间产物。选择荧光检测来定量纳米颗粒配制剂中的唾液酸含量，以确保更高的灵敏度。NANA测定的逐步描述见下表。
使用以下公式计算试验样品中的唾液酸浓度(nmol/μL)。
其中：
CSA＝唾液酸浓度(nmol/μL)
A＝样品孔中的唾液酸量(nmol)
v＝孔中的样品体积(μL)
D＝样品稀释系数
用于体外研究的PSA-PLGA批次
V.实例4：另外的示例性纳米颗粒的生产
采用乳液法制备纳米颗粒。纳米颗粒生产的代表性实例描述如下。用叠氮基团修饰PSA(卡博森斯公司(Carbosynth)的多聚乙酰神经氨酸)的非还原端(参见图17)。将非还原端含有叠氮基团的10mg PSA溶于0.6mL DMSO中。将PSA叠氮化物溶液添加至15mg PLGA(10k)-PEG(5k)-DBCO(溶于乙酸乙酯:苯甲醇的有机溶剂混合物)中。搅拌混合物并混合过夜，以允许PSA叠氮化物通过叠氮化物-DBCO点击化学偶联与PLGA-PEG-DBCO缀合。混合过夜后，将285PLGA(10k)-PEG(5k)-COOH添加至此反应混合物中，并混合/搅拌溶液直至其目视澄清。
有机溶剂的最终体积为3.03mL，其中含2.43mL体积比为60:40的乙酸乙酯:苯甲醇以及0.6mL DMSO。为了将荧光部分引入纳米颗粒中，使用了聚合物荧光素-PLGA。用于制备纳米颗粒的总聚合物中荧光素聚合物的总分数为1％(按重量计)，即，还将3mg PLGA-荧光素添加至聚合物溶液中。
将此聚合物溶液添加到27mL冷水(用乙酸乙酯饱和)中，并使用IKA T-18旋转定子进行均质化以形成粗乳液。使用具有3个通道的微流化器(Microfluidics LM10)将粗乳液进一步均质化成细纳米乳剂。然后通过添加270mL冷水淬灭纳米乳剂以硬化纳米颗粒。然后浓缩淬灭的纳米颗粒溶液，并通过切向流过滤(KR2i TFF，瑞普里根公司(Repligen))使用冷水洗涤以除去有机溶剂和未反应的PSA-叠氮化物。通过从已知体积的纳米颗粒溶液中蒸发水来测定聚合的纳米颗粒的浓度。将蔗糖以10％wt/wt添加至纳米颗粒溶液中，并使用0.2μm Millipore针头过滤器过滤。将纳米颗粒溶液在-20℃冷冻。
使用Malvern Zetasizer利用动态光散射测量纳米颗粒的大小。动态光散射技术使用称为布朗运动(Brownian motion)的颗粒和分子恒定随机热运动来测量大小。颗粒以与其大小相关的速度扩散，较小的颗粒比较大的颗粒扩散更快。通过用激光照射颗粒产生的散斑图测量扩散速度。使用灵敏的光电二极管检测器检测特定角度的散射强度波动。使用数字自相关器分析强度变化，以生成相关函数。对此曲线进行分析，得出颗粒的大小和大小分布。使用干净水将纳米颗粒稀释至约0.1-1.0mg/mL的浓度，并在Zetasizer中测量。生成的每个值是3个读数的平均值。使用NANA测定来确定PSA配体的浓度。使用酸水解或唾液酸酶将多聚乙酰神经氨酸或PSA链水解为唾液酸单体。使用这种处理将游离唾液酸从游离PSA或缀合至纳米颗粒的PSA中释放并水解。使用唾液酸测定试剂盒(ab83375)测量PSA中的游离唾液酸(主要为N-乙酰神经氨酸或NANA)。检测基于酶偶联反应，在该反应中，游离唾液酸氧化生成中间体，该中间体与唾液酸探针进行化学计量反应，生成可通过吸光度(OD＝570nm)或荧光(Ex/Em＝535/587nm)检测的产物。使用唾液酸标准品的校准曲线测定检测到的唾液酸的最终浓度。
纳米颗粒的总固体浓度测定方法如下：称取已知量的纳米颗粒溶液置于1.5mL微量离心管中。然后冷冻并冻干溶液。将冻干纳米颗粒粉末的重量归一化为溶液的重量，得到纳米颗粒在水中的wt/wt浓度。通过计算μg PSA/mg总固体来表征所生产的纳米颗粒配制剂。对于通过上述实例2中所述程序制备的纳米颗粒，按照如下所示测定缀合效率。计算了用于制备有机相的PSA与总固体(聚合物+PSA)的比率。使用NANA测定和冻干的纳米颗粒溶液(如上所述)测定PSA与总固体的最终比率。总缀合效率计算如下
VI.实例5：通过肟连接和热水解化学修饰聚唾液酸
1.与PSA肟连接
一般程序
在600MHz Agilent DD2上记录了1H谱。化学位移校准使用4.79ppm的水残留物峰作为参考。NMR数据表示如下：化学位移、多重性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，dd＝双二重峰，m＝多重峰和/或多重共振，br.＝宽信号)、J偶联、积分和峰特征。根据1H NMR、13C-NMR、gCOSY、gHSQC和HMBC实验指定3b的NMR信号。通过将乙酸钠溶于脱气的MilliQ水中来制备0.1M乙酸钠缓冲液(pH＝5)，用1M HCl水溶液调节pH。唾液酸低聚物购自Nacalai Tesque公司。
肟连接的一般程序
合成程序见方案1：
方案1
方案1.通过肟连接化学合成氨基接头官能化Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)低聚物3a-f。
将化合物1a-f(1当量)和化合物2(20当量)溶于0.2mL NaOAc缓冲液(0.1M，pH＝5)，并在室温下搅拌1h。使用0.1M NH4HCO3作为洗脱液，通过P2聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel)色谱法纯化反应混合物。通过ESI和TLC分析组分。组合纯组分，在40℃下减压浓缩并冻干，得到白色固体3a-f。
合成化合物的1H-NMR和13C-NMR谱(如可用)见下文：
使用化合物1a(1.00mg，3.24μmol)和化合物2(4.92mg，64.80μmol)根据一般程序合成化合物3a(1.10mg，3.00μmol，量化产率)。1H NMR(600MHz,d2o)δ4.45(ddd,J＝9.2,4.3,1.3Hz,1H,H4),4.43–4.34(m,2H,OCH2),3.98–3.88(m,2H,H5,H6),3.88–3.81(m,1H,H9),3.74(ddd,J＝10.8,6.2,2.7Hz,1H,H8),3.67–3.60(m,1H,H9),3.46(dd,J＝9.0,1.8Hz,1H,H7),3.36(td,J＝4.6,3.0Hz,2H,NH2CH2),2.92–2.81(m,1H,H3),2.79–2.65(m,1H,H3),2.08(s,3H,CH3 Ac)。
使用化合物1b(1.00mg，1.55μmol)和化合物2(2.36mg，31.00μmol)根据一般程序合成化合物3b(1.10mg，1.59μmol，量化产率)。1H NMR(600MHz,d2o)δ4.50–4.38(m,2H,H4,CH2CH2O),4.27(t,J＝5.0Hz,1H,CH2CH2O),4.04–3.76(m,8H),3.74–3.60(m,4H),3.60–3.52(m,1H),3.41–3.26(m,2H,NH2CH2),2.86(dd,J＝13.6,9.5Hz,0.6H,H3,A),2.78–2.65(m,1.60H,H3,A+B),2.50(d,J＝7.0Hz,0.80H,H3,A),2.09(s,3H,CH3 Ac),2.04(s,3H,CH3 Ac),1.79(td,J＝12.2,2.9Hz,1H,H3,B)。13C NMR(151MHz,d2o)δ174.93,174.43,174.35(C＝OAc),173.56(COOH B),170.29(COOH A),169.27(COOH A),158.59(C＝N A),156.72(C＝NA),101.79,101.76(C2 B),74.25,74.20,72.74,72.72,71.81,71.79,69.94,69.04,68.23,68.02,67.65,67.45,67.40,66.26,65.57,62.65,61.10,53.59,53.04,51.61,40.01(C3B),38.89(NH2CH2),38.76(NH2CH2),35.49(C3,A),30.79(C3 A),21.95,21.92,21.88(CH3 Ac,A&B)。
使用化合物1c(1.00mg，1.04μmol)和化合物2(1.58mg，20.80μmol)根据一般程序合成化合物3c(0.90mg，0.92μmol，88％产率)。1H NMR(600MHz,d2o)δ4.50–4.39(m,2H,H4,CH2CH2O),4.27(t,J＝4.9Hz,1H,CH2CH2O),4.08(d,J＝12.1Hz,1H),4.06–3.98(m,2H),3.97–3.77(m,9H),3.77–3.61(m,7H),3.57(d,J＝9.7Hz,1H),3.41–3.34(m,1H,NH2CH2),3.31(q,J＝3.5Hz,1H,NH2CH2),2.91–2.76(m,1.50H,H3),2.74–2.62(m,1.50H,H3),2.50(d,J＝7.1Hz,1H,H3),2.15–2.00(m,9H,CH3 Ac),1.87–1.71(m,2H,H3)。13C NMR(151MHz,d2o)δ174.88,174.40,174.33(C＝O Ac),172.85,170.28(COOH),158.54(C＝N),101.52,100.79(C2),77.20,74.00,73.95,73.33,72.70,71.60,70.11,69.02,68.23,68.05,67.87,67.80,67.67,67.55,67.50,66.11,65.50,62.58,61.26,60.69,53.62,53.08,52.13,51.63,40.27,39.34(C3),38.86,38.77(NH2CH2),35.54,30.85(C3),22.19,21.94,21.90(CH3 Ac)。
使用化合物1d(2.00mg，1.57μmol)和化合物2(2.39mg，31.40μmol)根据一般程序合成化合物3d(0.90mg，0.92μmol，59％产率)。
1H NMR(600MHz,d2o)δ4.55–4.34(m,2H,H4,CH2CH2O),4.28(t,J＝4.8Hz,1H,CH2CH2O),4.21–3.54(m,28H),3.43–3.27(m,2H,NH2CH2),2.95–2.59(m,4H,H3),2.51(d,J＝6.8Hz,1H,H3),2.19–2.00(m,12H,CH3 Ac),1.88–1.69(m,3H,H3)。
使用化合物1e(1.00mg，0.63μmol)和化合物2(0.96mg，12.60μmol)根据一般程序合成化合物3e(0.90mg，0.56μmol，89％产率)。1H NMR(600MHz,d2o)δ4.52–4.36(m,2H,H4,CH2CH2O),4.27(dd,J＝6.7,3.2Hz,1H,CH2CH2O),4.19–3.53(m,37H),3.43–3.27(m,2H,NH2CH2),2.90–2.59(m,5H,H3),2.49(d,J＝6.8Hz,1H,H3),2.15–1.97(m,15H,CH3 Ac),1.76(q,J＝11.7Hz,4H,H3)。
使用化合物1f(4.00mg，2.11μmol)和化合物2(3.21mg，42.20μmol)根据一般程序合成化合物3f(3.60mg，1.89μmol，90％产率)。1H NMR(600MHz,d2o)δ4.53–4.37(m,2H,H4,CH2CH2O),4.28(t,1H,CH2CH2O),4.20–3.54(m,41H),3.44–3.27(m,2H,NH2CH2),2.93–2.61(m,6H,H3),2.50(d,J＝6.9Hz,1H,H3),2.23–1.95(m,18H,CH3 Ac),1.90–1.65(m,5H,H3)。
2.PSA的热水解及其纯化
将多聚乙酰神经氨酸(20mg)溶于H2O(2mL)中，并在80℃下搅拌该溶液2.5h，然后使用10K自旋过滤器(Nanosep离心装置，4次)通过超滤进行纯化。采集上部残留物并标记为“PSA-2.5h-长”。(图18.)减压浓缩10K自旋过滤器的滤液以除去大部分溶剂，并使用3K自旋过滤器(Nanosep离心装置，4次)通过超滤进一步纯化。采集上部残留物并标记为“PSA-2.5h-中”。同样，减压浓缩3K自旋过滤器的滤液以除去大部分溶剂，并标记为“PSA-2.5h-短”。将三份组分冻干，并在D2O中通过1H-NMR分析以确定聚合度(DP)(图19)。
PSA-2.5h-长：8.7mg，43.5％产率(来自多聚乙酰神经氨酸)，平均DP＝20.1，平均Mw＝5884(根据DP值计算)；PSA-2.5h-中：3.7mg，18.5％产率(来自多聚乙酰神经氨酸)，平均DP＝12.8，平均Mw＝3757(根据DP值计算)；PSA-2.5h-短：7.6mg，38.0％产率(来自多聚乙酰神经氨酸)，平均DP＝6.8，平均Mw＝2011(通过DP值计算)。
3.用接头修饰PSA
参考图18，将PSA-2.5h-长/中/短(1当量)、化合物2(20当量)溶于0.2mL NaOAc缓冲液(0.1M，pH＝5)，并在室温下搅拌2小时。使用0.1M NH4HCO3作为洗脱液，通过P2/P4聚丙烯酰胺凝胶色谱法纯化反应混合物。通过ESI和TLC分析组分。组合含产物的组分，在40℃下减压浓缩并冻干，得到白色固体PSA-2.5h-长/中/短-接头。
对接头连接前后的化合物进行了1H-NMR研究。通过指定关键质子信号的化学位移，确认成功引入了接头，并通过接头“CH2”和唾液酸的乙酰基“CH3”的积分比率计算DP。
获得以下接头缀合的PSA化合物：使用PSA-2.5h-长(5mg)作为起始材料，通过P4聚丙烯酰胺凝胶色谱法纯化产物，得到PSA-2.5h-长-接头。(0.9mg，18.0％产率，平均DP＝16.61，平均Mw＝4910)；使用PSA-2.5h-中(3.7mg)作为起始材料，通过P4聚丙烯酰胺凝胶色谱法纯化产物，得到PSA-2.5h-中-接头。(1.6mg，43.2％产率，平均DP＝13.33，平均Mw＝3955)；使用2.0mg PSA-2.5h-短作为起始材料，通过P2聚丙烯酰胺凝胶色谱法纯化产物，得到PSA-2.5h-短-接头。(1.3mg，65％产率，平均DP＝5.17，平均Mw＝1580)
生物学实验和方法
基于表4中的标识在本文提及了微粒批次。
I.实例6：示例性纳米颗粒对选定靶标的亲和力。
Octet测定使用称为生物膜干涉技术(BLI)的技术。生物膜干涉技术是一种用于测量生物分子相互作用的无标记技术。它是一种光学分析技术，用于分析从两个表面反射的白光的干涉图样：生物传感器尖端上的固定化蛋白质层和内部参比层(图11A、11B和11C)。结合到生物传感器尖端的分子数量的任何改变都引起可以实时测量到的干涉图样的变化。仅结合至生物传感器或从生物传感器解离的分子可以使干涉图样发生改变并在系统中产生反应曲线。未结合分子、周围介质折射率的改变或者流速的改变不影响干涉图样。这是BLI的独特特征，并且扩展了其在针对蛋白质的应用：蛋白结合、定量、亲和力和动力学中使用的粗样品中执行的能力。
使用Octet测定测量示例性纳米颗粒和不同Siglec受体的亲和力，如下所示：探针传感器由PBS+1％ BSA阻断。使用抗人Fc捕获抗体包被(AHC)的浸入即读(dip and read)生物传感器，捕获了在PBS中浓度为25μg/mL的对Siglec 11、9、7和5具有特异性的不同SiglecFc融合蛋白。将探针浸入含有不同稀释度的分析物的孔中时，会生成关联曲线。分析物是示例性纳米颗粒或不含配体的纳米颗粒，其已在PBS中以1:10、1:20、1:40、1:80、1:160的比率稀释。当探针浸入PBS中时，测量解离速率(dissociation rate/off rate)。测量了测定缓冲液(1x PBS)中不同浓度的示例性纳米颗粒与浓度为25μg/mL的抗人Fc融合蛋白和Siglec11、9、7、5之间的结合反应。图显示了按照纳米位移的结合反应，其与BLI平台中结合的量对时间(秒)直接成比例。作为参考，使用单独装载缓冲液的传感器。图11a显示了示例性纳米颗粒与Siglec 11之间的结合亲和力，图11b显示了示例性纳米颗粒与Siglec 9之间的结合亲和力，图11c显示了示例性纳米颗粒与Siglec 7之间的结合亲和力，图11d显示了示例性纳米颗粒与Siglec 5之间的结合亲和力。还在下表描述了结合亲和力：
II.实例7：示例性纳米颗粒对外周血单核细胞(PBMC)的无毒性特征
通过MTT测定分析PBMC衍生的巨噬细胞的细胞存活百分比，以评估示例性纳米颗粒的无毒性特征。使用PBMC细胞评价了用FITC标记的示例性纳米颗粒的细胞毒性。从健康供体获得PBMC，并将其活化至M1表型(使用Hu IFN-y 50ng/ml，LPS 10ng/ml)和M2表型(使用hu IL-4-10ng/ml)，持续48小时。然后用50-750μg/mL示例性纳米颗粒处理细胞24小时。使用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物]测定确定细胞存活率。将巨噬细胞(M0、M1、M2)以100x103个细胞/200μl/孔培养基的密度接种在96孔板中。将细胞与50-750μg/mL示例性纳米颗粒和缺乏配体的对照纳米颗粒一起孵育24h。24小时后，洗涤细胞并在37℃下与1mg/mL MTT一起孵育3-4h。将得到的甲臜(formazan)晶体溶于100μl MTT增溶缓冲液中，并使用Spectra iMax酶标仪在570nm处测量吸光度，将值与对照细胞进行比较。图代表与对照未处理细胞相比的细胞活力百分比。图12(a)反映了示例性纳米颗粒对外周血单核细胞无毒性，如通过MTT测定所证实的。
III.实例8：示例性纳米颗粒对巨噬细胞的无毒性特征
为了确定示例性纳米颗粒的无毒性特征，对THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞进行了体外细胞毒性测定。将THP-1细胞以100x103个细胞/200μl/孔的密度接种在96孔板中。用50-750μg/mL示例性纳米颗粒处理THP-1单核细胞分化的巨噬细胞24小时。使用10ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)分化细胞，并使用1μg/mL脂多糖(LPS)活化细胞。将细胞与50-750μg/mL剂量的示例性纳米颗粒和缺乏配体的对照纳米颗粒一起孵育24小时。24小时后，洗涤细胞并在37℃下与1mg/mL MTT一起孵育3-4h。将得到的甲臜晶体溶于100μlMTT增溶缓冲液中，并使用Spectra iMax酶标仪在570nm处测量吸光度，将值与对照细胞进行比较。图代表与对照未处理细胞相比的细胞活力百分比。图12(b)显示了示例性纳米颗粒对THP-1衍生的巨噬细胞无毒性。
IV.实例9：示例性纳米颗粒对活化巨噬细胞中IL-10的影响
示例性纳米颗粒在人PBMC衍生的巨噬细胞中上调IL-10生成的能力如下所示：将来自健康供体的PBMC活化至M1表型(使用Hu IFN-y 50ng/mL，LPS 10ng/mL)和M2表型(使用hu IL-4-10ng/ml)48小时，然后用75μg/mL示例性纳米颗粒和对照纳米颗粒处理24小时。收集孔中的上清液，并通过ELISA(安迪公司)测定IL-10。图代表IL-10蛋白水平，显示与不含配体的对照纳米颗粒和无处理对照组相比，使用示例性纳米颗粒处理后24小时，IL-10上调。Sidak多重比较检验M1相比于M1-PSA-PLGA**p＝0.0002，M1-PSA-PLGA相比于M1-空白-PLGA***p＝0.0008。这些结果显示于图24中。
V.实例10：示例性纳米颗粒对CFH生成的影响
示例性纳米颗粒在人PBMC衍生的巨噬细胞中上调补体因子H(CFH)生成的能力如下所示：将来自健康供体的PBMC活化至M1表型(使用Hu IFN-y 50ng/mL，LPS 10ng/mL)和M2表型(hu IL-4-10ng/mL)48小时，然后用75μg/mL示例性纳米颗粒和缺乏配体的对照纳米颗粒处理24小时。通过ELISA(艾博抗公司)分析从孔中收集的上清液中的CFH。图14(a)中的图代表CFH蛋白水平，其显示与缺乏配体的对照纳米颗粒和无处理组相比，使用示例性纳米颗粒处理后24小时，CFH上调。Sidak多重比较检验M1相比于M1-PSA-PLGA****p<0.0001，M2相比于M2-PSA-PLGA**p＝0.0032，M1-PSA-PLGA相比于M1-空白-PLGA***p＝0.0001，M2-PSA-PLGA相比于M2-空白-PLGA**p＝0.004
VI.实例11：示例性纳米颗粒在人PBMC衍生的巨噬细胞中降低补体C3水平的能力
将来自健康供体的PBMC活化至M1表型(使用Hu IFN-y 50ng/mL，LPS 10ng/mL)和M2表型(使用hu IL-4 10ng/ml)48小时，然后用75μg/mL示例性纳米颗粒或缺乏配体的对照纳米颗粒处理24小时。通过ELISA(艾博抗公司)测定收集的上清液中的C3水平。图14(b)显示结果并反映补体C3蛋白质水平，其显示与缺乏配体的对照纳米颗粒和未处理组相比，示例性纳米颗粒对M0和M1巨噬细胞处理后24小时，对补体C3水平有明显抑制。Sidak多重比较检验M1-PSA-PLGA相比于M1-空白-PLGA，**p＝0.007。
VII.实例12：AT-007-NP04纳米颗粒介导的补体调节
补体途径是先天性免疫系统的重要组成部分，其通过效应子膜攻击复合物导致细胞膜的非特异性细胞溶解。可以通过3个不同的途径(经典途径、旁路途径和凝集素途径)进行级联。经典途径由抗体或抗体复合物触发。当遇到非宿主细胞或分子模式时，旁路途径被组成性激活并放大。当遇到非自相关糖残基(如病原体细胞壁中所见)时，凝集素途径被激活。
这些途径共用一个限速步骤，即C3转化酶(C3bBb)的形成。由于脱靶细胞可能发生溶解，因此C3转化酶的形成受到补体因子H(CFH)的严格调节。CFH反过来又受其结合自相关分子模式(SAMP、唾液酸)能力的调节，从而允许CFH结合C3b并降低其结合Bb的能力。当CFH未与SAMP结合时，C3b以高亲和力结合Bb，并导致传播和放大膜攻击复合物形成以及宿主和病原体细胞等的细胞溶解(图28)。本发明的本质是提供唾液酸配体以模拟自相关分子模式。下面我们展示了我们的AT-007-NP04纳米颗粒如何结合和激活CFH，进而以更高的亲和力结合C3b并减少C3b的形成(图29)。
1.AT-007-NP04增强CFH与C3B结合的能力
为了确定AT-007-NP04纳米颗粒是否能够结合CFH以增强CFH与C3b的结合，进行了Biacore测定。在本实例中，将C3b以1600RU固定在Fc2上，以1450RU、950RU固定在Fc3上。使用200nm(图30A)和100nM(图30B)的单独缓冲液人补体因子H以及1:20稀释的人补体因子H+AT-007-NP04(在室温下孵育10分钟)进行测定。当AT-007-NP04与CFH一起孵育时，CFH与C3B的结合会增加。在CFH发生构象变化时，CFH会与C3B结合。在体内，CFH必须结合宿主细胞呈现的自相关分子模式，以使CFH发生构象改变并增强与C3B的结合。本实例证明了AT-007-NP04在没有宿主细胞的情况下表现出自相关分子模式的能力。这提供了AT-007-NP04可以通过活化CFH下调补体级联的直接证据。如果没有AT-007-NP04，CFH不会与C3B结合，因为它未被活化。
下表提供了第一项实验的设置：
在本实验中，将C3b固定在Biacore板上，并让含或不含AT-007-NP04的补体因子H流过进入溶液中，并实时测量折射率的变化。图30A中的图绘制为共振单位(RU)对时间的响应(传感图)。
下表提供了第二项实验的设置：
在本实验中，将C3b固定在Biacore板上，并让含或不含AT-007-NP04的补体因子H流过进入溶液中，并实时测量折射率的变化。图30B中的图绘制为共振单位(RU)对时间的响应(传感图)。
2.AT-007-NP06纳米颗粒直接阻止通过旁路或经典途径的补体激活的能力
为了确定AT-007-NP06纳米颗粒是否可以抑制旁路和经典途径，在存在和不存在AT-007-NP06纳米颗粒的情况下，使用去纤维蛋白血清与IgM(经典补体激活因子)、酶原和LPS(两种旁路补体激活因子)一起孵育进行补体激活测定。为了进行这项测定，在与去纤维蛋白血清、酶原、LPS或IgM、+/-AT-007-NP06纳米颗粒或蔗糖一起孵育前，用1％ BSA封闭平板。孵育3小时后，加入抗C3b抗体，1小时后加入Strep HRP，然后在20分钟后用酶标仪读数。
这项测定的结果表明，当与AT-007-NP06纳米颗粒和酶原及IgM孵育时，添加酶原和LPS显示C3b形成出现统计学上显著的下降，LPS处理的血清显示出趋势，但在统计学上不显著，主要是因为LPS蔗糖组不能显著激活补体和C3b上调。
此特定实例显示AT-007-NP06纳米颗粒能够通过阻止形成C3b来抑制经典途径和旁路途径的补体放大。C3b形成是CFH的直接结合靶点。
实验的设置显示于图31A(C3b沉积在包被板上的去纤维蛋白血清)中，结果显示于图31B中。
根据先前实例，具有CFH的AT-007-NP06纳米颗粒增加了CFH与C3b的结合。这2个实例的组合证明了AT-007-NP06纳米颗粒增加CFH与C3b结合的能力，该结合使得由旁路或经典补体途径触发的c3b减少。
3.AT-007-NP04纳米颗粒与CFH直接结合的证明。
为了确定AT-007-NP04纳米颗粒是否可以直接与CFH结合，我们用His预包被平板，并与人CFH his标签蛋白一起孵育，将CFH固定在平板上。然后将平板与含有不同浓度聚乙二醇(PEG)接头的AT-007-NP04纳米颗粒一起孵育，以确定我们是否可以计算出IC50和剂量动力学结合关系。然后将平板与抗PEG生物素一起孵育，并在ELISA酶标仪上读取490nm处的吸光度。
该测定证明了具有S结合曲线，其中IC50约为2mg/ml。这些结果证实了本发明的AT-007-NP04纳米颗粒以剂量依赖性方式与人CFH结合的能力，提供了潜在的药物和治疗特性。
基于ELISA的AT-007-NP04和AT-007-NP06与CFH蛋白的结合亲和力。
在RT下将His标签人CFH蛋白(1ug/ml浓度)(抗体克隆-目录号-ABIN1079269)预包被在ELISA镍包被板(赛默飞世尔科技公司目录号15142Pierce镍包被透明平板)上过夜。这些对于通过基于ELISA的方法分析多组氨酸标签的融合蛋白(His标签)是理想的。在氨基或羧基端含有一系列组氨酸残基的蛋白质对金属具有强结合亲和力。可直接将含有多组氨酸标签融合蛋白的蛋白质添加至平板中。
按照标准制造商的ELISA方案和安迪公司的试剂，洗涤His标签CFH平板，并在室温下添加AT-007-NP04(浓度范围为10mg/ml-0.001mg/ml)和AT-004-NP06(0.1mg/ml-0.001mg/ml)纳米颗粒(NP)总固体3h。使用在室温下孵育1h的抗PEG生物素(重组生物素抗聚乙二醇抗体-艾博抗公司ab53449)检测纳米颗粒中的PEG。使用链霉亲和素HRP(1:40)与生物素结合，并使用颜色试剂(安迪公司)显色。在490nm处测量吸光度。图表明，AT-007-NP04对CFH蛋白表现出的结合亲和力高于空白纳米颗粒对照
这项实验的结果显示于图32A、32B和32C中。可以看出，最大浓度为100ug/ml(A)的AT-007-NP06和AT-007-NP04对CFH蛋白表现出的结合亲和力与空白纳米颗粒不存在差异。与高浓度空白纳米颗粒相比，最大浓度为1mg/ml(B)时，对CFH蛋白表现出的结合亲和力存在显著差异。最大浓度为10mg/ml(C)的AT-007-NP06表现出S型S结合曲线，其中与空白纳米颗粒相比对CFH蛋白的结合亲和力存在显著差异。
VIII.实例13：示例性纳米颗粒对LPS活化巨噬细胞中TNF-α的影响
示例性纳米颗粒对LPS活化巨噬细胞中TNF-α的影响评估如下：将THP-1细胞以500,000个细胞/500ul培养基/孔的密度接种在24孔板中。使用10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)分化细胞，并使用1μg/mL脂多糖(LPS)活化细胞。将细胞与75μg/mL示例性纳米颗粒、缺乏配体的对照纳米颗粒孵育24小时。24小时后，收集上清液并通过ELISA(安迪公司)测定Hu TNF-α。图26反映了结果，图显示与单独的LPS相比，用PSA-PLGA处理后24h的LPS活化细胞中TNF-α蛋白质水平受到显著抑制，使用Sidak多重比较检验得到PSA-PLGA LPS处理与空白PLGA和LPS之间的**p＝0.006和*p＝.01。
IX.实例14：示例性纳米颗粒对LPS活化巨噬细胞中VEGF分泌的影响
示例性纳米颗粒对LPS活化巨噬细胞中VEGF分泌的影响评估如下：将THP-1细胞以500,000个细胞/500μL培养基/孔的密度接种在24孔板中。使用10ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)分化细胞，并使用1μg/mL脂多糖(LPS)活化细胞。将细胞与75μg/mL示例性纳米颗粒、缺乏配体的对照纳米颗粒孵育24小时。24小时后，收集上清液并通过ELISA(安迪公司)测定Hu VEGF水平。图显示与单独的LPS相比，用PSA-PLGA处理后24h的LPS活化细胞中VEGF蛋白质水平受到显著抑制，使用Sidak多重比较检验得到PSA-PLGA LPS处理与空白PLGA和LPS之间的*p＝0.01和p＝.06。图15反映示例性纳米颗粒可抑制LPS活化巨噬细胞中的VEGF水平。
药理学实验和方法
HALOS(Siglec的高亲和力配体)平台由纳米颗粒组成，该纳米颗粒由聚乙二醇/聚乳酸-羟基乙酸核心组成，表面饰有天然和合成修饰的唾液酸。这种化学结构背后的原因是多方面的。首先，纳米颗粒核心可提供稳定但可生物降解的支架，用于将天然和合成修饰的唾液酸呈递给免疫细胞上存在的Siglec受体。其次，据信向免疫细胞呈递相对高密度的这些配体将通过增强亲合力而增强抗炎信号传导的效力，即通过多种弱相互作用增强细胞结合。唾液酸的天然和合成修饰旨在增加各个配体对靶向Siglec受体的亲和力，以同时增强纳米颗粒对抗炎信号传导的效力。
本文讨论的策略解决眼部严重慢性“未消退”炎症和各炎性疾病。我们的纳米颗粒配制剂不是阻断炎性细胞或特定细胞中一种炎症途径产生的细胞因子，而是利用活化的免疫细胞自然关闭机制。这种关闭机制涉及自相关分子模式(SAMP)与自相关模式识别受体(SPRR)的结合，从而将免疫细胞的表型从促炎转化为抗炎。唾液酸免疫球蛋白样凝集素(Siglec)对SPRR的激动作用是免疫系统固有的炎症消退机制。
在其他人研究的动物系统中，短链唾液酸聚合物似乎通过与免疫球蛋白样凝集素11(Siglec 11)受体结合(Karlsletter，2017)和诱导生物反应(上调IL-10等抗炎细胞因子和下调促炎信号，如活性氧物质(ROS)和细胞因子TNF-α、IL-12及VEGF)来减弱炎症。Siglec信号传导的激活最终与补体旁路途径相交(Gao,2015；Akhtar-Schafer,2018；Cascella,2014；Chan,2014；Jager,2007；Killingsworth,1990；Kelly,2007；Kauppinen,2020；Zhou,2017；Zhao,2013)。
本文所述的方法是通过将M1型巨噬细胞转化为M2c型巨噬细胞(也称为“消退巨噬细胞”)，选择性复极化疾病期间吞噬视网膜中感光细胞外节段的M1型巨噬细胞(Lurier,2017)。我们纳米颗粒配制剂的施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、眼内、视网膜下、皮下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、经气管、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗和肝内、皮下或直肠施用中的一种或多种，针对若干炎性疾病中严重慢性/急性“未消退”炎症的患者。颗粒可以通过两种方式发挥作用：(1)下调补体介导的炎症途径和(2)重新编程参与病理的炎症巨噬细胞。其他人的临床和实验证据表明，这两种途径在年龄相关性黄斑变性和其他炎性疾病患者中出现紊乱，并且可以进行治疗。Neumann团队(Karlsletter 2017)已证明Polysia是一种具有a2-8键的唾液酸聚合物。已知它与巨噬细胞上的Siglec 11结合。与Siglec 11的这种结合提供了其对眼中巨噬细胞、单核细胞和小胶质细胞的抗炎作用，这在激光CNV模型中用polysia处理的眼睛中得到证实。在这同一模型中，血管渗漏的减少程度与使用抗VEGF药物相同。
已进行体外药理学研究，以确认本文所述的不同配制剂批次(如AT-007-NP01-06)的颗粒对衍生自THP-1细胞系的巨噬细胞和衍生自正常人外周血单个核细胞(PBMC)、纤维细胞和中性粒细胞的巨噬细胞(M1和M2)的作用机制。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)对这些细胞的表达模式的分析表明，AT-007-NP01-06可调节细胞因子的产生、细胞死亡、纤维细胞分化和补体因子途径的组分。
使用1种或多种标识为配制剂编号(见上表4和8)的AT-007-NP01至06纳米颗粒制剂进行了一系列体外研究，证明AT-007-NP01至06在衍生自2种细胞类型的巨噬细胞中的抗炎特性，(1)LPS活化THP-1细胞系(ATCC TIB-202TM，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州)和(2)原代人外周血单个核细胞(PBMC；干细胞研究(Stem Cell Research)，目录号-70500.2)(3)PBMC衍生的中性粒细胞(4)单核细胞分化的纤维细胞。
表9描述了进行的实验
表9
IX.实例15：离体药理学研究
本文所述的支持性研究表明，在85+10岁的3只渗出性和非渗出性AMD眼(1名女性和2名男性供体)中获得的视网膜-RPE-脉络膜复合物中，Siglec 7、9和11的基因表达增加(qRT-PCR)。与正常供体相比，渗出性AMD供体表现出Siglec 7、9和11基因表达分别增加了90、64和58倍。类似地，与正常供体相比，非渗出性AMD供体的Siglec 7、9和11基因表达分别增加了77、32和27倍。我们从患有和不患有AMD的健康受试者中分离的视网膜-RPE-脉络膜复合物的基因表达和蛋白质水平数据显示，疾病状态上调，为我们选择Siglec受体作为治疗非渗出性AMD患者的靶点提供了进一步支持。表10总结了结果。
表10
1.AT-007-NP04的基于ELISA的结合亲和力
将Siglec Fc 7、9、11包被在ELISA板上，并使用抗PEG生物素/HRP标准制造商的ELISA方案(安迪公司)进行检测。在490nm处测量吸光度。图表明，与空白NP对照相比，AT-007-NP04对Siglec7、9和11的结合亲和力更高。参见图33。
THP-1LPS活化巨噬细胞的衍生
这些实验中使用的THP-1细胞是“单核细胞样”细胞系，来源于
1岁的白血病男孩(Tsuchiya,1980)。这些细胞表达补体3(C3)和Fc受体。它们具有吞噬性(对于乳胶珠和致敏红细胞等)，但缺乏表面和胞质免疫球蛋白。细胞处于未分化状态时对toll样受体激动剂的反应较弱，但分化后的反应加强。细胞在补充了20％胎牛血清(FBS；吉布科公司(Gibco)，10438026)的洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)培养基中生长。在T-25培养瓶中进行初始接种和孵育2-3天。在使用前48小时，在无血清RPMI中用10ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯12-乙酸酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为单核细胞。PMA的确切功能尚不清楚，但据信其可以模拟插入质膜内表面并刺激蛋白激酶C途径的信号传导分子。因此，该物质在添加后就不能洗涤掉，且分化是终末分化。在另外48小时后，已分化的细胞贴壁并可以用1μg/mL脂多糖(LPS)活化。使用适用于SHP-1磷酸化的蛋白质印迹评价细胞的生物活性，使用IHC评价细胞结合，并使用上清液进行基于ELISA的细胞因子释放测定。(使用的缩写：PMA＝佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；LPS＝脂多糖。)
来自PBMC的M1和M2巨噬细胞的衍生
除衍生自THP-1细胞系的巨噬细胞外，我们还从新鲜的LeukopakR包(干细胞技术有限公司，坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)中分离出原代人巨噬细胞。原代巨噬细胞难以从组织中足量分离，并且不会在培养物中增殖。因此，我们使用“Easy 50”EasySepmagnetTM(干细胞技术有限公司，坎布里奇，马萨诸塞州)细胞分离方法从单一供体来源的Leukopaks中分离和富集单核细胞。用CD14+磁珠富集所需单核细胞，并使用流式细胞术确认细胞群的均一性。冷冻CD14+富集的细胞。
在使用前约6天，将冻存的单核细胞解冻，并在24孔板中以250,000个细胞/250μL的浓度使用含50ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的无血清ImmunoCultTM-SF巨噬细胞分化培养基培养。使用培养基将单核细胞分化为M1(经典激活)和M2a(旁路激活)巨噬细胞。通过添加LPS(10ng/mL)和干扰素-γ(IFN-γ；50ng/mL)活化M1细胞。
通过添加IL-4(10ng/mL)活化M2细胞。从未添加任何活化剂的培养基中获得M0细胞。使用适用于SHP-1磷酸化的蛋白质印迹评价细胞的活力和生物活性，使用IHC评价细胞结合，并使用上清液进行基于ELISA的细胞因子释放测定，并且对于细胞因子释放使用了空白纳米颗粒对照。
2.Siglec效应子的活化：SHP1
最初的一系列体外药理学研究表明，不同批次的AT-007-NP01到06可以介导生物活性，如通过活化巨噬细胞中细胞因子的释放所测量的。更高级的研究设计为确定不同批次的AT-007-NP01至06与活化巨噬细胞表面的结合是否可以刺激与Siglec结合一致的细胞内效应子。Siglec具有抑制性或激活性细胞内信号传导结构域。
抑制结构域称为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，而激活结构域称为免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。尽管Siglec相当多样化，并且在人类和非人灵长类动物之间具有最大的同源性，但ITIM和ITAM基序在物种之间是保守的，代表免疫系统共同的免疫细胞全局活化和灭活开关。当配体与Siglec结合时，ITIM被激活，这一变化会募集含有Src同源区2结构域的磷酸酶-1,2(SHP1、SHP2)。
SHP1和SHP2是调节多种细胞过程(包括细胞信号传导、生长和分化以及致癌性转化)的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。当SHP1和SHP2被募集时，它们会使活性酪氨酸激酶去磷酸化，特别是在ITAM上发现的那些。
设计一系列蛋白质印迹实验以评价AT-007-NP02是否会激动巨噬细胞上的Siglec，进而介导髓样细胞中SHP1的募集和由SHP1调控的关键信号传导途径。巨噬细胞和单核细胞中受SHP1影响的一些信号传导途径包括通过含有ITIM的蛋白质募集SHP1以抑制ITAM受体介导的信号传导以及通过TLR和细胞因子受体对信号传导进行负调控(Abram,2017)。凝胶电泳分离蛋白，印迹，用SHP-1染色并将β肌动蛋白作为内部对照。结果表明，使用AT-007-NP02处理M1活化巨噬细胞后，募集的SHP-1表明AT-007-NP02在抑制炎症反应中发挥激动剂作用。这些数据提供了信心，即AT-007-NP02构建体是原代PBMC衍生的M1型和来自THP-1细胞系的LPS活化的巨噬细胞中Siglec途径的激动剂。
细胞结合
AT-007-NP-03用于研究衍生自活化的THP-1人单核细胞系(THP-1)细胞系和PBMC原代细胞的巨噬细胞中的结合。巨噬细胞在RPMI无血清分化培养基(用于THP-1细胞)或含有巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)(50ng/mL)的ImmunoCult-SF巨噬细胞去分化培养基(用于PBMC衍生的巨噬细胞)中铺板于腔室玻片中24小时。然后在37℃和5％ CO2下用AT-007-NP-03(75μg/mL)或FITC缀合的空白-NP处理细胞长达24小时。结果表明，经AT-007-NP03处理的细胞显示亮绿色点状荧光染色，表明AT-007-NP03在活化细胞表面成簇结合和共定位，而空白NP似乎与所有巨噬细胞非特异性结合。数据表明，FITC缀合的AT-007-NP03纳米颗粒未掺入细胞中，而是附着在外膜上。AT-007-NP03与巨噬细胞的明显结合似乎具有特异性。缺乏配体的空白NP未与细胞结合。这项结果与AT-007-NP03呈递的单独AT-007配体PSA与这些活化的巨噬细胞膜上的元素结合是一致的。
AT-007-NP对细胞因子释放的影响
通过测量活化巨噬细胞释放的细胞因子，探索了不同AT-007-NP配制剂通过Siglec结合巨噬细胞的生物活性。
3.纳米颗粒与AT-007的缀合抑制促炎细胞因子反应
使用10ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)分化THP-1细胞，并使用1μg/mL脂多糖(LPS)活化细胞。将细胞与75μg/ml剂量的AT-007-NP02和AT-007以及空白NP孵育24h。24h后，收集上清液，并通过ELISA(安迪公司)测定Hu TNF-α。图20中示出的图代表与AT-007单独处理相比，AT-007-NP02处理后24hLPS活化细胞中TNF-α蛋白水平受到显著抑制，*p＝0.05。下图显示，在LPS处理巨噬细胞后，仅存在AT-007(PSA)不足以抑制TNF-a反应，这为配体与NP缀合可以增加这些细胞的生物反应提供了支持性证据。
4.AT-007-NP04显示在活化的M1巨噬细胞中显著上调抗炎介质IL-10
从健康供体获得PBMC，并将其活化至M1表型(Hu IFN-γ50ng/mL，LPS 10ng/mL)。使用连续剂量范围的AT-007-NP04、蔗糖(媒介物对照)和LPS(100ng/ml)处理细胞过夜。收集处理后上清液，按照制造商说明通过ELISA(安迪公司)测定IL-10。图21中示出的图代表与经LPS处理相比，经AT-007-NP04处理后16h，抗炎介质IL-10蛋白质水平显示呈剂量依赖性增加。
5.AT-007-NP06显示在活化的M1巨噬细胞中显著下调促炎介质IL-6、TNF-a
从健康供体获得PBMC，并将其活化至M1表型(Hu IFN-γ50ng/mL，LPS 10ng/mL)。使用连续剂量范围的AT-007-NP06、空白NP和LPS(100ng/ml)处理细胞过夜。收集处理后上清液，通过ELISA(安迪公司)测定(A)TNF-a和(B)IL-6。图22A和图22B中示出的图代表与空白NP相比，经AT-007-NP06处理后16h，在剂量为0.4mg/ml至2.1mg/ml时，促炎介质IL-6和TNF-a的蛋白水平下调。使用turkey多重比较得***p＝.0005，****p<0.0001，*p<0.03。
通过ELISA定量人IL-10、TNF-α、IL-6的释放。所有测定均在细胞在活化培养基中孵育过夜并暴露于不同浓度的AT-007-NP06和AT-007-NP04后进行。数据包括用于研究纳米颗粒生物活性的一系列AT-007-NP06配制剂和剂量。数据表明，配制剂AT-007-NP06(其中PSA的还原端被呈递给分化的M1巨噬细胞)引发了体内再生巨噬细胞特有的反应，可能有助于抑制疾病的炎症级联反应并增加抗炎反应。
补体组分构成一个约30种血浆和膜相关血清蛋白质的复杂网络，用数字(C1-C9)或字母符号(例如，补体因子H、FH)表示，并被组织成分层蛋白水解级联。补体系统的激活涉及三个蛋白水解级联，即，经典、凝集素和旁路途径，其会导致C3转化酶活化，这是所有补体途径的聚合点。补体因子H也由RPE局部产生，并有助于C3转化酶的衰变，从而防止C3b沉积的放大(Geerlings,2016)。多条证据表明，补体失调，尤其是旁路途径，参与了AMD的发病机制。补体系统的过度激活与导致AMD发病机制的多种因素相关，例如衰老、吸烟和氧化应激。Nozaki等人(2006)通过免疫组织学和蛋白质组学研究支持了这一事实，免疫组织学和蛋白质组学研究确定补体组分为玻璃疣的成分，表明补体途径的局部激活。Scholl和许多其他人已经证明，在AMD患者外周血中，在补体激活期间释放的激活补体组分水平显著增加(Scholl,2008)。
将C3b固定在Biacore板上，并让含或不含AT-007-NP06的补体因子H流过进入溶液中，并实时测量折射率的变化。图32B中示出的图绘制为共振单位(RU)对时间的响应(传感图)。结果表明AT-007-NP04可以增强补体因子H与C3b的结合。
表11显示了实验设置。
表11
配体 分析物 浓度
C3b(950RU) 补体因子H 100nM
C3b(950RU) AT-007-NP04 130μg/ml
C3b(950RU) 补体因子H+AT-007-NP04 100nM+130μg/ml
与蔗糖对照相比，用AT-007-NP06共处理的平板上的C3b沉积减少
许多补体蛋白是由蛋白水解裂解活化的蛋白酶。这些蛋白质称为酶原。前体酶原分布于全身，这些在感染部位活化。这些酶原会激活完整的补体系统。在本文所述的研究中，通过免疫球蛋白IgM在去纤维蛋白血清中诱导补体激活进行经典途径激活，LPS用于旁路补体激活，酶原作为阳性对照用于补体激活，PBS用作对照。通过酶联免疫吸附测定进一步分析C3b沉积，以定量补体激活(Karlstetter,2017)。Turkey多重比较检验显示，对于激活因子补体途径酶原和IgM，蔗糖和AT-007-NP06之间存在显著差异，****p<0.0001。
图33A显示了实验设置的示意图。图33B显示了柱状图，其显示与蔗糖对照相比，用AT-007-NP06共处理的平板上C3b沉积减少。
X.实例16：体内药理学
在感光细胞损伤模型的鼠模型中进行了体内药理学研究。
强光损伤(BLD)模型通过活性氧物质(ROS)上调和旁路补体系统失调对感光细胞造成损伤。短暂暴露后，预计这些小鼠会损失80％的感光细胞层。此外，眼部有许多促炎和趋化细胞因子的表达，包括白细胞介素1β、趋化因子(C-C基序)配体2、环氧合酶2和TNFα-基因(Bian,2016)。通过感光细胞死亡表征眼部病症，如视网膜色素变性、眼底黄色斑点症(Stargardt disease)和非渗出性AMD(Bian,2016)。本文我们描述了我们使用鼠BLD模型研究AT-007-NP-02在预防感光细胞变性中的疗效。
1.小鼠眼部耐受性研究
本研究的目的是评价小鼠IVT注射施用AT-007-NP03、AT-007-NP02的眼部耐受性。在队列1中，在3只健康15-16周龄雄性C57BL/6JRj小鼠(Janvier，法国)的右眼IVT注射FITC-空白-NP(2μL)。注射后立即和3天进行眼底镜检查。准备两个视网膜(6只眼)并针对Iba1进行染色。为了进行组织病理学和免疫组化分析，将3只动物的双眼在4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中后固定四小时，并用于制备脉络膜和视网膜铺片。用兔抗Iba1(Wako，目录号019-19741)标记铺片
使用荧光显微镜(Leica DM6B，徕卡显微系统有限责任公司(LeicaMicrosystems))对样品进行成像，并通过使用图像处理软件FIJI/ImageJ确定免疫阳性区域(单位为mm2)对免疫反应性进行定量。定性观察结果未显示注射的眼中存在任何小胶质细胞活化或血管异常。注射FITC-空白-NP的眼具有强荧光信号，在IVT注射后立即检测到该信号。然而，第3天荧光减少，并且未观察到异常。在队列2中，小鼠在注射前5天进行(眼部检查)。在第-2天，根据fERG a波幅将动物随机分配至处理组。在注射日，小鼠在双侧IVT单次注射(2μL)：(a)AT-007-NP02；(1.3μg/μL AT-007，含3.4μg/μL总固体)，(b)空白-NP(对照)或(c)AT-007(AT-007；1.3μg/μL)。
在给药后第4、24、48和72小时；以及给药后1周和2周通过肉眼检查OE和IOP测量评估眼部耐受性。在2周临处死前，进行fERG、SD-OCT和详细的眼底镜OE。采集眼组织并进行H&E染色处理。将右眼后杯(OD)包埋在石蜡中，切成5μm厚的垂直切片(从上到下)。使用每组苏木精和伊红(H&E)染色的眼部切片测量总视网膜厚度。内层视网膜的内层厚度测量为从RGC层到内核层顶部的厚度，而外核层(ONL)厚度测量的是从外丛状层底部到外界膜的厚度。RGC–视网膜神经节细胞，IPL–内丛状层，INL–内核层，OPL–外丛状层，ONL–外核层，RPE–视网膜色素上皮在任何处理组中均未发现可见的大体形态变化。
进一步评价了小鼠IVT注射施用AT-007-NP03的眼部耐受性。其中，眼科检查期间未观察到可见变化。所有瞳孔对光的反应均正常。未检测到角膜水肿、白内障或出血体征。比较第0天至注射后2周的Heidelberg spectralis HRA(海德堡工程有限公司(HeidelbergEngineering))OCT扫描。
2.荷兰黑带兔(Dutch-Belted Rabbit)PK和耐受性研究(生物分布)
本研究的目的是评价向荷兰黑带兔(Kaninfarm，瑞典)单次IVT注射后，FITC缀合的AVD-104在血清、眼组织、肝脏、脾脏和肾脏中的生物分布。
本研究有两组。在一组中，在兔中单次IVT剂量注射AT-007-NP-03(0.412mg/mLAT-007和2.1mg/mL总固体)处理后，通过组织学分析评价了组织(血清、眼组织)中的生物分布。在第二组中，在单次IVT施用未缀合AT-007-NP-03(0.412mg/mL AT-007和2.1mg/mL总固体)后采集组织进行生物分析。在两组中通过眼底镜检查和眼内压评价眼科耐受性达28天。
施用药物前三天，对来自12月龄雄性兔的5只眼完成眼压测量和采血。第0天，双眼IVT注射AT-007-NP-03(50μL)。在第7、14、21和28天测量眼内压(IOP)。研究结束时，采集血清、双眼、肝脏、肾脏和脾脏，并将组织固定在4％多聚甲醛中48小时。制备切片(5μm)玻片用于H&E染色和荧光素显微镜检查。一个队列的兔用无FITC缀合的AVD-104处理。在研究第0天和第28天，在处死前采集血清。由兽医眼科医生检查动物。结果显示单次IVT注射AT-007-NP-03耐受良好。眼科检查期间未观察到可见变化。结膜无肿胀、分泌物或充血体征。虹膜对光有反应，未观察到异常皱襞。角膜和晶状体透明。房水中无前房闪辉体征，晶状体无混浊体征。玻璃体内无炎性细胞。视网膜无明显变化，未观察到视网膜脱离或出血。注射后立即在眼底观察IVT注射的AVD-104的荧光信号。在研究第3天和第7天，整个玻璃体看起来更亮，可能是因为扩散的荧光纳米颗粒。在任何后期时间点(第14或28天)，均未在玻璃体中检测到荧光信号。在第7、14、21和28天，给药组间的IOP无差异。所有值均与研究第3天的基线读数相似。用苏木精和伊红染色的兔视网膜定性检查未显示出变化。
AT-007-NP-03耐受性良好。IVT注射AT-007-NP-03的兔眼未显示炎症、肿胀或异常出血体征。玻璃体内注射后，FITC标记的纳米颗粒立即清晰可见。在第3天和第7天的一些情况中，可能由于扩散的荧光NP，整个玻璃体变得更亮。在第14天和第28天的成像中，未检测到NP来源的自体荧光。从第28天采集的视网膜垂直切片获取自体荧光图像时，未检测到荧光NP。
眼部检查未显示出结膜肿胀、分泌物或充血体征，虹膜对光有反应，未见异常皱襞，角膜透明，未观察到前房闪辉。玻璃体内无炎性细胞，未观察到视网膜脱离或出血。用苏木精和伊红染色的兔视网膜的进一步代表性图像表明，第28天时没有任何细胞层丢失且对药物耐受性良好。
3.小鼠强光损伤模型的概念验证
本研究的目的是评价AT-007-NP-02对小鼠强光诱导感光细胞损伤模型的药理学疗效。将8周龄雄性强光损伤模型BALB/cAnNCrl小鼠(查尔斯河实验室国际公司(CharlesRiver)，德国)随机分为4组
·第1组：未注射对照(n＝5)
·第2组：强光损伤+空白-NP对照(1μL，含3.4μg/μL总固体)(n＝11)
·第3组：强光损伤+AT-007-NP-02(1.3μg AT-007溶于1μL，含3.4μg/μL总固体)(n＝11)
·第4组：强光损伤+AT-007(1.3μg AT-007溶于1μL)(n＝11)
*总固体：包括AT-007、PEG和PLGA
在强光损伤诱导前5天获得闪光视网膜电图(fERG)和高分辨率SD-OCT的基线值。在第-1天，IVT OD施用供试品(2μL)，并让小鼠适应暗处。第0天早上，通过施加一滴0.5％托吡卡胺(Oftan Tropicamid.Santen Oy)使瞳孔完全扩张。将动物移入透明塑料笼中，暴露于强光刺激(10,000lux)四小时。暴露于连续强光后，将小鼠恢复至正常的光照/黑暗周期(10lux；12小时开/12小时关)。第7天，重新检查动物的fERG和SD-OCT。在实验终末日，动物经心脏灌注0.9％ NaCl溶液。采集双眼，并在未固定情况下用液氮冷冻。将组织储存在80℃下的最佳切割温度(OTC)化合物中，直至用于组织学/免疫组织化学。眼睛被切成5μm厚的切片，制成玻片。一组玻片用于苏木精和伊红(H&E)组织学染色。第二组玻片用于针对巨噬细胞标志物F4/80进行染色。
对定量数据进行绘图、分析，并以平均标准差(SD)表示。使用ROUT检验确定异常数据点，错误发现率为1％。使用GraphPad Prism软件(v8.0.1，GraphPad软件，美国)对数据进行分析。提供了内部投影(VIP)SD-OCT B扫描数据。组织学分析结果待定。SD-OCT B扫描取自以视神经乳头(ONH)为中心、位于ONH下方-0.4mm、ONH处以及ONH上方+0.4mm的VIP。在以ONH为中心的SD-OCT VIP扫描上放置25点网格，并使用软件测量各点的各视网膜层(内层视网膜外核层-IS/OS/RPE)厚度。
与空白-NP处理小鼠相比，等量AT-007的单独配体组中ONL的保留未达到统计学显著性。这表明单用配体不足以在光损伤条件下保护视网膜。热图相关性(未显示)表明通过OCT测量的视网膜层厚度的相对变化集中在眼睛的3个不同区域。如所预期的，一些视网膜区域比其他区域对光损伤更敏感。与仅用AT-007或空白-NP处理的小鼠相比，在用AT-007-NP02处理的小鼠中，上鼻部(SN)取向的深蓝色方块的强度较深，显示该区域的外核层(ONL)得到显著维持。结果(在图23中示出)表明在这些强烈强光的极端条件下，与单独使用AT-007或空白-NP的预防性处理相比，AT-007-NP02预防可能有助于维持ONL并保护视网膜免于变薄。该数据强烈支持存在纳米颗粒支架的要求，以增强AT-007配体的活性，更有效地靶向和参与Siglec受体结合，从而诱导抗炎/保护反应。
图23显示注射空白NP、AT-007和AT-007-NP02的动物的外核层厚度(μM)。数据显示为每组11只小鼠的平均值±SEM，通过Sidak多重比较分析数据，空白-NP相比于AT-007-NP02的显著性，*p＝0.0318。
使用谱域光学相干断层成像(SD-OCT)视网膜扫描评估视网膜结构，并分析外核层(ONL)。与用空白NP处理的眼睛相比，用AT-007-NP02处理的眼睛中所有分析网格点的ONL厚度均显著更厚。当将数据划分为眼睛的几个解剖区域时，也清楚地反映了这种差异。与颞区相比，上鼻部区具有更高的保护。
4.AT-007-NP04对纤维细胞分化的影响
从健康供体中获得PBMC，分离CD14+单核细胞，并以(2x10^5/ml)重悬于无血清纤维细胞分化培养基中，培养5天。在第4天，洗涤掉非贴壁细胞，取出一半培养基，并用新鲜培养基替换。将细胞铺板于有和无AT-007-NP04/SAP的24孔板中，用于明场成像和细胞计数。使用奥林巴斯公司(Olympus)的FLUOVIEW FV3000设置在10倍放大率下对细胞成像。标尺-100μM。通过对孔进行三次平行计数(每个孔三个视野)测定纤维细胞的数量。血清白蛋白(1μg/ml)(SAP)用作阳性对照。AT-007-NP06的处理浓度为50μg/ml。图24描述了实验设置的示意图。代表性明场图像显示出AT-007-NP04处理后纤维细胞分化减少的趋势。
显微镜图像清楚地显示，使用AT-007-NP06处理后可以减少单核细胞向纤维细胞的分化。纤维细胞数量的变化可能与防止进一步的病理学纤维化相关，甚至可能有助于其消退
结果在图25中以图形表示为纤维细胞分化％，基于上述图像计数，显示纤维细胞分化有减少的趋势。
5.使用Sytox橙色染料测量AT-007-NP06在延迟NET形成和延迟细胞死亡方面的作用
使用EasySep人中性粒细胞分离试剂盒(干细胞技术有限公司目录号19359)从健康对照的血液中分离中性粒细胞。按照制造商的说明，在存在不可透过膜的DNA结合染料SYTOX Orange Sytox橙色染料(赛默飞世尔科技公司目录号-S11368)的情况下，在用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(100nM)和50μg/ml AT-007-NP06处理前，将人PMN细胞静置1h。我们观察了随时间推移的细胞外DNA和NET形成。从这些图像获得的平均SYTOX Orange强度值用于定量孔中的总细胞外DNA释放，其中用100nM PMA作为阳性对照和纳米颗粒刺激PMN。这些数据表明，与PMA对照相比，在存在AT-007-NP06的情况下，NET形成延迟。实验设置的示意图见图26。结果在图27中以图形表示，其显示了动力学曲线随时间的变化。
Sytox阳性提示中性粒细胞死亡。PMA后Sytox阳性染色百分比较高，提示处理后细胞发生凋亡。我们的数据表明，AT-007-NP06连同PMA处理可随时间延迟中性粒细胞的死亡。处理后2h-4h左右的曲线发生偏移，显示中性粒细胞死亡减少接近30％-50％。该细胞死亡延迟是我们的AT-007-NP06可以预防NETosis的有力证据。
XI.实例17：多聚乙酰神经氨酸(PSA)与Siglec7、9和11的结合
使用表面等离子体共振效应(BIACoreTM仪器)研究了不同聚合度(DP)的聚唾液酸(PSA)分子与Siglec 7、9和11的结合。
应理解，DP的值是指分子整体中聚合物分子的平均长度。因此，具有DP 13的PSA是指平均长度为13个唾液酸残基的PSA分子整体。在该实验中，使用市售唾液酸二聚体(PSADP 2)作为对照。包含该二聚体的这种组成是均匀的且不具有长度分布。
结果表明，DP 13的PSA与Siglec 7、9和11强结合，而未观察到唾液酸二聚体(DP 2的PSA)的结合。
简言之，通过在80℃下在水中加热2.5h使多聚乙酰神经氨酸部分解聚，并通过超滤进行分馏，以获得平均DP为13的PSA馏分。通过肟连接对化合物进行修饰，得到化合物3
其使用生物素修饰(如下所述)。波浪线表示PSA分子的附着点。
生物素化
根据以下合成方案进行肟修饰PSA的生物素化：
方案8：生物素化寡唾液酸的合成
简言之，向反应管中添加1a/1b(1当量)、H2O、NaHCO3(1.5当量)和化合物2(1.2当量)并在室温下搅拌过夜。通过P2聚丙烯酰胺凝胶色谱法(3a)或使用10K自旋过滤器的超滤(3b)纯化反应，得到化合物3a或3b。
将修饰的PSA固定在链霉亲和素修饰的BIAcore SPR芯片上，并检测其与Siglec的结合。
二唾液酸苷和聚唾液酸苷的表面等离子体共振(SPR)分析
表面/样品缀合
所有分析均在GE Biacore T100机器上进行。使用标准EDC/NHS酰胺缀合化学(流通池1、2、3和4)，在S系列CM5芯片(思拓凡公司(Cytiva)编号29149603)上包被链霉亲和素(2,000反应单位，赛默飞世尔科技公司编号434301)。随后使用乙醇胺封闭所有流通池，并通过流动(10μL/min)PBS-P(10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl和0.5％表面活性剂P20(思拓凡公司编号BR100054)，pH 7.4)的脱气溶液过夜来稳定芯片表面。
向稳定基线引入生物素化二唾液酸苷和生物素化聚唾液酸苷，其中平均聚合度为13(DP13)。将二唾液酸苷溶于DI水中至浓度为50μg/mL(总体积＝200μL)。使用T100软件手动模式，将50μg/mL生物素化二唾液酸苷溶液以30μL/min的流速引入流通池2中90秒，然后以30μL/min的流速引入PBS-P 90秒。该过程重复三次，之后未观察到另外的生物素缀合。生物素化聚唾液酸苷(DP13)的稳定遵循与二唾液酸苷相同的方案，但将生物素化DP13结构引入流通池4。
Siglec-11筛选
冻干hFc-Siglec-11(安迪公司编号3258-SL-050)在PBS-P缓冲液中复溶至浓度为200μg/mL，并在分析前在冰上平衡30分钟。建立平行结合试验，通过分别减去从流通池2和1以及流通池4和3测量的反应单位，测量siglec-11与生物素化二唾液酸苷和聚唾液酸苷之间的相互作用。通过使用以下参数以三种不同浓度：200μg/mL、100μg/mL和50μg/mL引入siglec-11完成该分析：
a.流速＝30μL/min
b.接触时间＝60s
c.解离时间＝90s
d.稳定时间＝30s
Siglec-9筛选
冻干hFc-Siglec-9(安迪公司编号1139-SL-050)在PBS-P缓冲液中复溶至浓度为200μg/mL，并在分析前在冰上平衡30分钟。建立平行结合试验，通过分别减去从流通池2和1以及流通池4和3测量的反应单位，测量siglec-9与生物素化二唾液酸苷和聚唾液酸苷之间的相互作用。通过使用以下参数以100μg/mL的浓度引入siglec-9来完成该分析：
a.流速＝30μL/min
b.接触时间＝60s
c.解离时间＝90s
d.稳定时间＝30s
Siglec-7筛选
冻干hFc-Siglec-7(安迪公司编号1138-SL-050)在PBS-P缓冲液中复溶至浓度为200μg/mL，并在分析前在冰上平衡30分钟。建立平行结合试验，通过分别减去从流通池2和1以及流通池4和3测量的反应单位，测量siglec-7与生物素化二唾液酸苷和聚唾液酸苷之间的相互作用。通过使用以下参数以100μg/mL的浓度引入siglec-7来完成该分析：
a.流速＝30μL/min
b.接触时间＝60s
c.解离时间＝90s
d.稳定时间＝30s
结果见图34A至图34D中示出的传感图。可以看出，虽然DP 13的PSA与Siglec 7、9和13结合，但未检测到二唾液酸二聚体的结合。这些结果表明，与Siglec结合的功能取决于PSA长度。
本文引用的所有专利、公布的申请以及参考文献的教导都通过引用以其全文并入。
虽然本发明已参考其示例实施例进行了特别显示和描述，但本领域技术人员将理解，在不偏离由所附权利要求书涵盖的本发明范围的情况下，可以在其中进行形式和细节方面的各种改变。

Claims (63)

1.一种颗粒，该颗粒包含由以下结构式表示的分子：
P-L-G，
其中：
P是生物相容性聚合物支架，其包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、Pluronic F127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；
G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)；并且
L是共价接头，
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中该聚合物支架包含嵌段共聚物PLGA-PEG。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的颗粒，其中P由以下结构式表示：
其中符号表示该聚合物至该接头L的附着点，并且进一步其中：
x为0到20的整数，y为0到20的整数，m为1到1000的整数，n为5到450的整数，前提是x和y不同时为0。
4.根据权利要求3所述的颗粒，其中x为0到10的整数，y为0到10的整数，m为1到500的整数，n为5到450的整数。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的颗粒，其中G由以下结构式中的任一个表示：
或其药学上可接受的盐，
其中符号------表示G至该接头L的附着点，并且进一步其中p是4至198的整数。
6.根据权利要求5所述的颗粒，其中p的值选自以下范围中的任一个：10至20、20至30、30至40、40至50和50至60。
7.根据权利要求5所述的颗粒，其中p为5至25。
8.根据权利要求5所述的颗粒，其中p为10至20。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的颗粒，其中该接头L由以下结构式中的任一个表示，其中符号------表示该接头L至G的附着点，并且符号表示该接头L至P的附着点：
其中：
R11是–C(O)NH-或–CH2-NH-C(O)-CH2-O-；并且
R12不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X11)-(CH2)1-10-、-N(X12)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X11是H或乙酰基，并且X12是H或甲基；
其中：
R21是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；并且
R22不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X21)-(CH2)1-10-、-N(X22)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X21是H或乙酰基，并且X22是H或甲基；
其中：
R31是–(CH2)1-10-；并且
R32不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X31)-(CH2)1-10-、-N(X32)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X31是H或乙酰基，并且X32是H或甲基；
其中：
R41是–(CH2)1-10-；并且
R42不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X41)-(CH2)1-10-、-N(X42)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X41是H或乙酰基，并且X42是H或甲基；
其中：
R51是–(CH2)1-10-；并且
R52不存在或是–O-(CH2)1-10-、-(O-CH2CH2)1-10-、-N(X51)-(CH2)1-10-、-N(X52)-O-(CH2)1-10-或–NHNH-(CH2)1-10-中的任一个，其中X51是H或乙酰基，并且X52是H或甲基；
其中：
R61是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；
R62不存在，或是–(CH2)1-10-或–(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-；
其中：
R71是–NHC(O)-或–OCH2-C(O)NH-CH2-；并且
R72是–(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-；
其中：
R81和R82各自独立地是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；
其中：
R91是–NHC(O)-或–OCH2-C(O)NH-CH2-；并且
R92是–(CH2)1-10-或–(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-；
其中：
R101是H或甲基；
X10是O或NH；并且
R102是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X101、X102和X103各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基A的附着点；
其中：
R111和R111A各自独立地是H或C1-C3烷基；
X11和X11A各自独立地是O或NH；并且
R11和R11A独立地是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X111、X112和X113各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基B或羰基B’的附着点；
其中：
X12是-(CH2)1-10-或–C(O)-(CH2)1-10-；并且
R12是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X121、X122和X123各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10，并且其中符号表示至羰基C的附着点；以及
其中：
X13是–Ph-或–CH2-Ph-CH2-，其中Ph是苯基；并且
R13是–CH2O-或由以下结构式中的任一个表示的部分：
其中X131、X132和X133各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-，并且其中符号表示至羰基D的附着点；
其中：
X14和X15各自独立地是H或甲基，A14和A15各自独立地是NRA、NRANRB、O或S，其中RA和RB每次出现时独立地选自H、C1-4烷基和C6-C18芳基；并且R14和R15各自独立地是–(CH2)1-10-或–CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-。
10.根据权利要求9所述的颗粒，其中该接头L由以下结构式表示：
其中：
a为2至6的整数；并且
RA不存在或是–(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NH-。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的颗粒，其中该P是PLGA(10k)-PEG(5k)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的颗粒，其中每单位重量P的G的重量(配体密度)为10至75μg/mg。
13.一种治疗患有眼科疾病的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该眼科疾病是干性年龄相关性黄斑变性、湿性年龄相关性黄斑变性、非增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、葡萄膜炎、干眼症、结膜炎、甲状腺性眼病、眼内炎、视网膜变性、青光眼、视网膜静脉阻塞、睑缘炎、角膜炎、眼部感染或白内障。
15.根据权利要求13所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的拮抗剂。
16.一种治疗患有炎性疾病的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒。
17.根据权利要求16所述的方法，其中施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、眼内、视网膜下、眼球筋膜下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗以及肝内、皮下或直肠施用中的一种或多种。
18.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是结核病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管扩张、肺纤维化、间质性肺疾病、肺血管疾病、流感、病毒性肺炎、细菌性肺炎、过敏性支气管炎、非过敏性支气管炎、鼻炎或纤维化肺泡炎。
19.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是类风湿性关节炎、纤维肌痛、系统性红斑狼疮、系统性硬化病(硬皮病)、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、干燥综合征、风湿性多肌痛、痛风、骨关节炎、感染性关节炎或幼年型特发性关节炎。
20.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、乳糜泻、憩室炎、胃食管反流、乳糖不耐受、消化性溃疡、胆囊炎、胃炎、结肠炎、胰腺炎、自身免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎或胰腺炎。
21.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是脓毒症休克、动脉粥样硬化、舒张功能障碍、心力衰竭、心脏纤维化、柯萨奇病毒性心肌炎、先天性心脏传导阻滞、自身免疫性心肌炎或巨细胞性心肌炎。
22.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是肾移植排斥、肾小球肾炎、急性肾炎、膀胱炎、前列腺炎、糖尿病性肾炎或糖尿病肾病。
23.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是皮炎、湿疹、炎性皮疹、硬皮病、瘢痕疙瘩、痤疮、结节病、股癣、体癣、足癣、头癣、甲癣、酒渣鼻、白癜风、硬化性苔藓、自身免疫性荨麻疹、皮肌炎或化脓性汗腺炎。
24.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是糖尿病、SLE、多发性硬化、干燥综合征、艾迪生病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性血管炎、乳糜泻、恶性贫血、斑秃、自身免疫性肝炎、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性内耳疾病、吉兰-巴雷综合征、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、福格特-小柳-原田综合征、系统性血管炎、巨细胞性动脉炎、结节病或结节性多动脉炎。
25.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是神经脊髓炎、多发性硬化、脑炎、神经系统结节病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化或亨廷顿舞蹈症、横贯性脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、帕金森病或良性特发性震颤。
26.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是由甲型流感、乙型流感、丙型流感、SARS-CoV1、SARS-CoV2、新城疫病毒、仙台病毒、多瘤病毒、HIV、黄病毒、杯状病毒、疱疹病毒、微小核糖核酸病毒或冠状病毒引起的病毒性疾病。
27.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是由革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、需氧菌、厌氧菌或抗生素耐药菌引起的细菌性疾病。
28.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是真菌血症、真菌性角膜炎、念珠菌病、足癣或股癣。
29.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是阿米巴病、贾弟虫病、弓形体病或弓蛔虫病。
30.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是特发性肺纤维化、骨髓纤维化、肝纤维化、心脏纤维化伴舒张功能障碍和CHF、肾纤维化、视网膜纤维化、皮肤纤维化和瘢痕形成。
31.根据权利要求16所述的方法，其中该炎性疾病是脓毒症、细胞因子风暴或镰状细胞病。
32.根据权利要求16所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的拮抗剂。
33.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒，
其中该癌症是原发性肺癌、转移性肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、口腔癌、食管癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横纹肌肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、肾细胞癌、脊髓癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、眼癌、鼻咽癌或皮肤癌。
34.根据权利要求33所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的拮抗剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂。
35.根据权利要求33所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗量的选自伊匹单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗或西米普利单抗的检查点抑制剂。
36.根据权利要求33所述的方法，其中该颗粒的施用与放射疗法同时或顺序进行。
37.根据权利要求33所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗量的第二治疗剂，该第二治疗剂选自环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、多柔比星、环磷酰胺、多西他赛、博来霉素、达卡巴嗪、盐酸氮芥、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松龙、表柔比星、顺铂、他莫昔芬、泰索帝、Her2 neu抑制剂、抗VEGF抑制剂、EGFR抑制剂、ALK抑制剂、索拉非尼或mTOR抑制剂。
38.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒，
其中该癌症是急性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、非霍奇金或霍奇金淋巴瘤。
39.根据权利要求38所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的柔红霉素、阿糖胞苷或伊马替尼。
40.根据权利要求38所述的方法，其中该颗粒的施用与干细胞移植或骨髓移植同时或顺序进行。
41.一种治疗患有传染病的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒，
其中该传染病是由B组链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、空肠弯曲杆菌、克氏锥虫、HIV、甲型流感、乙型流感、或丙型流感、Sars CoV1、Sars CoV2或疱疹病毒科引起的。
42.根据权利要求41所述的方法，其中该唾液酸配体是Siglec3、5、7、8、9、10、11或15中的一种或多种的激动剂或拮抗剂，是Siglec 14或16中的一种或多种的激动剂或拮抗剂。
43.根据权利要求41所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的扎那米韦、奥司他韦、伐昔洛韦、阿昔洛韦或齐多夫定中的一种或多种。
44.根据权利要求41所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec11同源。
45.根据权利要求41所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec9同源。
46.根据权利要求41所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec7同源。
47.根据权利要求41所述的方法，其中该唾液酸配体与Siglec5同源。
48.一种调节免疫细胞中细胞介导的炎症反应的方法，该方法包括：
使该免疫细胞与根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒接触。
49.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒以及药学上可接受的载剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中该药学上可接受的载剂包括PBS缓冲液或盐水溶液。
51.根据权利要求49所述的药物组合物，其中该载剂中这些颗粒的浓度为0.01mg/ml至100mg/ml。
52.一种组合物，该组合物包含冻干的或冷冻干燥的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒。
53.一种制造颗粒的方法，该方法包括：
使生物相容性聚合物支架P和聚糖G反应，该生物相容性聚合物支架P包含第一不稳定部分，该聚糖G包含第二不稳定部分，反应条件足以产生该第一不稳定部分和第二不稳定部分的加合物L，
从而产生由以下结构式表示的分子：
P-L-G，
其中：
P包含至少一种选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚羟基乙酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚(3-羟基丁酸)、聚(乙二醇)、聚环氧乙烷、PluronicF127、Pluronic F68、泊洛沙姆、聚(甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、透明质酸、肝素、硫酸肝素、唾液酸和壳聚糖；并且
G是包含5至200个唾液酸重复单元的聚唾液酸(PSA)。
54.根据权利要求53所述的方法，其中该第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自胺、羧酸、叠氮化物、炔烃、TCO、四嗪、DCBO和二酰肼。
55.根据权利要求53所述的方法，其中该第一不稳定部分和该第二不稳定部分选自叠氮化物、炔烃或四嗪，该加合物L包括炔烃-叠氮化物加合物或炔烃-叠氮化物加合物，并且其中这些足以产生该加合物的条件是以下反应的条件：
铜(I)催化的叠氮化物-炔烃反应(CuAAC)；
无铜叠氮化物-炔烃反应；
应变促进的叠氮化物-炔烃反应(SPAAC)；
四嗪-烯烃连接反应；以及
TCO-四嗪反应。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中P包含PLGA-PEG共聚物。
57.一种抑制受试者中补体激活的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒。
58.根据权利要求57所述的方法，其中该受试者产生过量的补体成分C3、C3b。
59.根据权利要求57-58中任一项所述的方法，其中该颗粒是Siglec 11的激动剂。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的方法，其中这些颗粒与补体因子H结合。
61.一种治疗患有补体过度激活疾病的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的颗粒。
62.根据权利要求61所述的方法，其中施用途径是静脉内、玻璃体内、口服、口腔冲洗、眼内、视网膜下、眼球筋膜下、巩膜内、眼周、鼻腔和口腔吸入、肌内、动脉内、椎管内、鞘内、颅内、皮内、经皮(局部)、经粘膜、皮下、肺灌洗、胃灌洗以及肝内、皮下、直肠、关节内施用中的一种或多种。
63.根据权利要求61所述的方法，其中该补体过度激活疾病是干性和湿性黄斑变性、阵发性夜间血尿、系统性红斑狼疮、脓毒症、抗磷脂综合征、阿尔茨海默病、卒中、心肌梗死、休克、器官移植排斥、生物材料植入排斥、COPD加重、牙龈炎/牙周病、全身炎症反应综合征。
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