KR20230107212A - 시알산 리간드 장식된 치료제 - Google Patents

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마이클 톨렌티노
데렉 와이. 쿠니모토
아니타 크리슈난
모하메드 에이. 제내드
라제쉬 알. 신드
제라더스 제이.피.에이치 본스
치앙 리우
앤서니 알. 프루덴
프라딥 초파
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아비세다 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은, 예를 들어, Siglec(시알산-결합 면역글로불린형 렉틴) 및 보체 인자 H(CFH)와 같은 자기-회합 분자 패턴 인식 수용체의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 바이러스성 인플루엔자 A, B, C, SARS-CoV1, 2와 같은 감염성 유기체, 및 폐암, 유방암 및 피부암과 같은 암/종양 세포의 활성을 조절한다. 조성물은 하기 구조식으로 표시되는 분자를 포함하는 입자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다: P-L-G,
상기 식에서, P는 본원에 정의된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드이고, G는 시알산의 5 내지 200개의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이고; L은 공유 링커이다.

Description

시알산 리간드 장식된 치료제
본 개시내용은, 예를 들어, Siglec(시알산-결합 면역글로불린형 렉틴) 및 보체 인자 H(CFH: complement factor H)와 같은 자기-회합 패턴 인식 수용체의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 제공된 조성물은, 예를 들어, 나노입자, 마이크로입자, 숙주로의 진입, 증식 및 면역 감시의 회피를 허용하는 자기-회합 분자 패턴 인식 수용체 및 감염성 관련 시알산 결합 모이어티에 결합, 이를 효능작용하거나 길항작용하는 말단(end terminal) 시알산을 갖는 글리칸 구조로 장식된(decorated) 기타 중합체 구조를 포함한다.
이러한 자기-회합 패턴 인식 수용체에 대해 결합하고/하거나 이들의 활성을 효능작용하거나 길항작용하는 것은 선천성, 적응성, 다중 모드, 염증성 또는 보체-매개 면역 반응을 해결하여 하기 질환의 치료를 제공할 수 있다: (1) 급성 염증, 예컨대 바이러스, 세균, 알레르겐, 이식 거부반응, 또는 자가면역 유발 염증; (2) 만성 염증, 예컨대 만성 폐쇄성 폐 질환, 또는 류마티스 장애; 및 (3) 선천성 및 적응성 형태의 만성의 해소되지 않은(non-resolving) 염증, 예컨대 삼출성 또는 비삼출성 황반 변성, 또는 알츠하이머병.
제공된 조성물은 또한 암 세포, 감염원(infectious agent), 예컨대 바이러스, 세균, 연충(helminthic), 기생충(parasitic) 또는 손상-관련 분자 패턴(DAMP: damage-associated molecular pattern)이 선천성 또는 적응성 면역계에 의한 면역 감시, 검출 및 제거의 회피를 가능하게 하는 자기-회합 분자 패턴 인식 수용체를 차단하거나 길항작용하는 데 사용될 수 있다.
제공된 조성물은 또한 숙주의 시알산에 부착하고 숙주 세포로의 진입 및 증식을 촉진하는 시알산 수용체 및/또는 시알리다제에 결합함으로써 감염원, 예컨대 헤모필루스 인플루엔자, SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 및 스트렙토코커스(streptococcus)가 숙주 세포로 진입하는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다.
자기 인식 능력은 신체의 면역계를 하향 조절하여 자신의 건강한 숙주 세포를 파괴하지 않도록 하는 것이다. 특정 세포의 글리콤(glycome)(모든 세포를 코팅하는 탄수화물 모이어티)의 구성은 세포가 자기-회합 세포, 비자기 세포, 또는 손상된 세포로서 인식되는지 여부를 결정한다. 면역 감시 및 염증 프로세스 동안, 면역계는 마주치는 세포의 글리콤 시그니처를 확인하여 세포가 면역 활성화를 통한 제거를 필요로 하는지 또는 세포가 면역 활성화 또는 염증 해소의 억제 신호를 보내야 하는 손상되지 않은 숙주 세포를 구성하는지 결정한다. 이 글리콤 시그니처를 인식하는 역할을 하는 염증 세포에서 발견되는 수용체 또는 결합 영역은 자기-회합 패턴 인식 수용체로 간주된다.
가장 큰 자기-회합 분자 패턴 인식 수용체 계열은 Siglec(시알산-결합 면역글로불린형 렉틴)으로 불린다. 현재 16개의 Siglec이 설명되어 있다. Siglec은 상이한 염증 세포에서 발견되는 상이한 Siglec 발현 패턴을 가진 염증 세포의 표면 상에서 발견된다. 건강한 숙주 세포의 표면 상에 특이적인 시알산 리간드 패턴이 제시될 때, 효능작용 억제성 Siglec 수용체는 면역글로불린 티로신 키나제 억제 모티프(ITIM: immunoglobulin tyrosine kinase inhibitory motif)를 활성화시킬 것이며, 이는 src 상동성 2 도메인-함유 단백질 티로신 포스파타제 1 및 2(SHP-1 및 2)를 동원하며, 두 포스파타제 모두 염증 세포를 활성화된 상태로 유지하는 키나제를 탈인산화하는 포스파타제이다. 이러한 억제성 Siglec-제어 메커니즘은 활성화된 염증 세포를 근본적으로 차단하여 염증의 해소를 초래할 수 있다. 상이한 Siglec은 수용체에 결합하고 효능작용하는 상이한 시알산 시그니처를 가지고 있어 염증 세포의 극심한 비활성화를 초래한다.
Siglec 3, 5, 7, 9, 10, 11, 또는 15를 효능작용하는 것은 주어진 세포 내의 모든 활성화된(인산화된) 티로신 키나제를 탈인산화하여 그 특정 세포의 활성화를 세포내에서 차단한다. 시알산 리간드뿐만 아니라 특정 Siglec 수용체에 대한 이들 리간드의 밀도 및 제시는 수용체 결합 부위를 효능작용하거나 길항작용하거나 차단하는 그의 능력을 결정한다.
면역글로불린 티로신 키나제 활성화 모티프(ITAM)를 통해 염증을 활성화시키는 Siglec 14 또는 16을 길항작용하는 것은 염증을 비활성화시키는 또 다른 메커니즘이다. Siglec 14 또는 16이 효능작용할 때, ITAM이 활성화되고 ITAM 내의 티로신 잔기가 SRC 계열의 키나제에 의해 인산화되어 모티프가 SH2 도메인을 포함하는 단백질에 대한 도킹 부위가 되도록 하는 구조적 변화가 발생한다. Siglec 14 및 16을 효능작용하는 것은 또한 종양학 분야에서 감염성 질환의 치료를 위해 염증을 활성화하는 데 사용될 수 있다.
보체 인자 H(CFH)는 또 다른 시알산 결합 자기-회합 패턴 인식 수용체를 나타낸다. CFH는 보체 캐스케이드, 특히 대체 보체 경로의 활성화를 해결하는 역할을 한다. CFH는 보체 인자 3Bb(C3Bb)를 결합 및 분해함으로써 보체 캐스케이드를 하향 조절한다. C3Bb는 보체 캐스케이드를 전파하는 증폭 인자를 나타낸다. CFH는 대체 보체 경로의 중심 조절자이다. 대체 보체 경로가 항시적으로 활성화되기 때문에 CFH는 보체 캐스케이드가 가속화되어 막 공격 복합체를 통해 세포 용해를 야기하는 것을 방지하는 브레이크 역할을 한다. CFH가 활성화되고 적절한 자기-회합 분자 패턴(CFH에 적절하게 제시된 시알산 리간드)과 결합하면 CFH가 C3Bb에 결합하여 Bb가 C3Bb에 결합하는 것을 방지하여 C3BbBb의 형성을 방지한다. C3BbBb는 보체 캐스케이드를 전파하고 가속화하는 속도 제한 중간체이다. CFH가 적절한 자기-회합 분자 패턴(올바른 구성으로 제시된 시알산 리간드)에 결합되지 않는 경우, CFH는 C3Bb에 결합하지 않아 C3BbBb의 가속된 형성과, 막 공격 복합체의 증폭된 형성과 병원성 세포와 천연 세포 둘 모두의 억제되지 않은 세포 용해를 초래한다.
CFH는 20개 이하의 보체 조절 단백질(CCP: complement control protein) 모듈로 구성된다. CFH에는 두 가지 시알산 결합 영역인 CFH의 4-6 CCP 영역과 19-20 CCP 영역이 있다. 시알산에 의한 이들 영역의 결합은 보체 캐스케이드를 비활성화시킬, C3Bb에 대한 결합 영역을 여는 것으로 여겨진다. C3Bb에 대한 결합을 강화시키는 CFH의 구조적 변화를 형성하기 위해서는 이들 2개 부위의 동시 결합이 필요한 것으로 여겨진다.
Siglec 3, 5, 7, 9, 10, 11 또는 15의 결합 부위를 길항작용하거나 차단하는 것은 자기-회합 분자 패턴(SAMP)-모방 표면 시알산 리간드로 Siglec을 길항작용하는 질병을 치료하여 면역 감시 또는 면역 활성화를 회피하는 방법이다. 이러한 방법을 사용하는 질병에는 암과 감염이 포함된다. 암은 그들의 표면 상에 시알산 구조를 발현하여 대식세포, 자연 살해(NK: natural killer) 세포 및 단핵구의 면역 활성화를 회피하는 것으로 나타났다. 스트렙토코커스 비는 또한 Siglec 7에 결합하는 시알산 리간드를 그의 표면 상에 발현하여 면역 공격을 피한다.
시알산은 또한 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2와 같은 여러 계열의 바이러스에 대한 진입점으로서 사용된다. 이러한 바이러스에 대한 결합 수용체는 헤마글루티닌 에스테라아제(바이러스 HE), 뉴라미니다제(바이러스 N), 또는 숙주 세포의 표면에서 시알산 리간드에 결합하여 숙주 세포로의 바이러스 진입을 촉진하는 스파이크 단백질(바이러스 SP)과 같은 바이러스 캡시드 모이어티, 또는 SARS-CoV-2 및 플라스모듐 팔시파룸에 의한 감염 진입에 사용되는 시알산 결합 렉틴인 CD147일 수 있다. 이러한 시알산 수용체를 데코이 시알산 리간드와 결합하면 바이러스가 숙주 세포를 감염시키는 것을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 감염된 세포로부터 바이러스 입자가 유출되는 것을 방지할 수 있다.
급성, 만성, 또는 비정상적인 면역계 활성화로부터 초래되는 질환의 치료를 위해, 시알산 결합 자기-회합 패턴 인식 수용체를 효능작용시키기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다. 또한, 면역 감시 및 공격을 피하기 위해 이러한 SAMP 수용체가 암과 감염에 의해 강제되는 것을 차단할 필요성이 존재한다. 본 발명은 특정 Siglec 수용체를 특이적이고 심오하게 효능작용하거나 차단하거나 길항작용하는 밀도로 시알산 리간드를 제시할 수 있는 나노입자를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기 구조식으로 표시되는 분자를 포함하는 입자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00001
상기 식에서, P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드이고; G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이고; L은 공유 링커이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 안과 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 암은 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 여기서 감염성 질환은 B군 스트렙토코커스(Streptococcus group B), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 이. 콜리(E. coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 티르파노소마 크루지(Tyrpanosoma cruzi), HIV, 인플루엔자 A, B, 또는 C, Sars CoV1, Sars Co V2, 또는 헤르페스 비리다에(Herpes viridae)에 의해 야기된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 면역 세포를 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역 세포에서 세포-매개 염증 반응을 조절하는 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 보체 활성화를 억제하는 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시형태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 보체 과다활성화 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 입자를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 불안정 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드 P를 제1 불안정 모이어티와 제2 불안정 모이어티의 부가물 L을 생성하기에 충분한 조건 하에 제2 불안정 모이어티를 포함하는 글리칸 G와 반응시켜 하기 구조식으로 표시되는 분자를 생성하는 단계를 포함한다:
Figure pct00002
상기 식에서, P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하고; G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이다.
본원에 개시된 주제를 더 잘 이해하고 그것이 실제로 어떻게 수행될 수 있는지를 예시하기 위해, 첨부된 도면을 참조하여 비제한적인 예로서 실시형태가 이제 설명될 것이다. 도면을 구체적으로 참조하면, 나타낸 특정사항은 예시로서 그리고 본원에 개시된 실시형태의 예시적인 논의를 목적으로 한다는 것을 강조한다.
도 1 구리(CU) 비함유 클릭 화학을 위한 디벤조사이클로옥틴(DBCO) 작용기를 갖는 모듈형 나노입자.
2. 촉매된 알킨-아지드 고리화첨가(CuAAC) 클릭 화학을 위한 알킨 작용기를 갖는 모듈형 나노입자. 구리 비함유 클릭 화학은 디벤질사이클로옥틴(DBCO) 모이어티와 같은 알킨과 아지드-표지된 모이어티의 반응을 기반으로 한다. 이러한 반응은 변형-촉진된 알킨 아지드 고리화첨가(SPAAC: strain-promoted alkyne azide cycloaddition)로 알려져 있다.
3. 폴리시알산 아지드 리간드 합성.
4. 시알릴락토스-폴리시알산 아지드-아지드 리간드의 접합을 위해 DBCO를 사용한 모듈형 나노입자.
도 5. 모듈형 PLGA-PEG-DBCO 나노입자에 대한 2-3 시알릴락토스 또는 2-6 시알릴락토스 리간드 접합.
도 6. CuAAC 클릭 화학을 사용하여 알킨-PEG-PLGA 나노입자와 폴리시알산-아지드의 반응으로 폴리시알산-작용화된 나노입자를 형성한다.
도 7. CuA AC 클릭 화학을 사용하여, 알킨-PEG-PLGA 나노입자와 NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-아지드의 반응으로 폴리시알산-작용화된 나노입자를 형성한다.
도 8. CuAAC 클릭 화학을 사용하여, 알킨-PEG-PLGA 및 테트라진-PEG-PLGA로 형성된 나노입자와 폴리시알산-아지드 및 NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-트랜스-사이클로옥텐 각각의 반응은 폴리시알산 및 NeuAcα2-3Galβ1-4Glc로 작용화된 나노입자를 형성한다.
9. Siglec 활성 조절을 위한 세포 메커니즘.
도 10. 리간드의 상이한 밀도를 도시하는 나노입자.
11. 시알산 나노입자는 용량 의존적 방식으로 siglec 11(도 11a)에, siglec 9(도 11b)에, siglec 7(도 11c)에, siglec 5(도 11d)에 고친화도로 결합한다.
도 12. 시알산 나노입자는 MTT 검정에 의해 입증된 바와 같이 말초 혈액 단핵구(도 12a) 및 THP-1 단핵구 유래 대식세포(도 12b)에 무독성이다.
13. 예시적인 나노입자가 활성화된 대식세포에서 IL-10을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
14a 및 도 14b 모두는, 예시적인 나노입자가 CFH 생성을 증가시킨다는 것을 나타내는 막대 플롯이다.
도 15 예시적인 나노입자가 LPS-활성화된 대식세포에서 TNF-알파를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 16 예시적인 나노입자가 LPS-활성화된 대식세포에서 VEGF를 유의하게 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 17은 아지드 작용기에 대한 PSA의 비환원 말단 접합에 대한 합성 반응식이다.
도 18은 PSA의 열적 가수분해를 위한 작업 흐름의 개략도이다.
도 19는 중합도(DP: Degree of Polymerization)를 결정하기 위해 사용된 가수분해된 PSA의 1H-NMR 스펙트럼에 의한 것이다.
도 20은 본원에 기재된 나노입자와 함께 인큐베이션한 후 LPS-시험감염된 THP-1 세포에서 TNF-알파 생산의 억제를 나타내는 막대 플롯이다.
도 21은 AT-007-NP04로 처리한 후 LPS-시험감염된 M1 대식세포에서 항염증 매개체 IL-10의 용량 의존적 증가를 나타내는 막대 플롯이다.
도 22a도 22b는 AT-007-NP06으로 처리한 후 LPS-시험감염된 M1 대식세포에서 염증촉진 매개체 IL-6(도 22b) 및 TNF-a(도 22a)의 하향 조절을 나타낸다.
도 23은 블랭크-NP, AT-007 및 AT-007-NP02를 주사한 동물로부터의 외부 핵층 두께(μM)를 나타내는 막대 플롯이다.
도 24는 섬유세포의 분화에 대한 AT-007-NP04의 효과를 측정하기 위해 사용된 실험 설정의 개략도이다.
도 25는 지시된 제제로 처리한 후 섬유세포 분화%를 나타내는 막대 플롯이다.
도 26은 Sytox 오렌지 염료를 사용하여 측정된 NET 형성 지연 및 세포 사멸 지연에 있어서 AT-007-NP06의 효과를 측정하기 위해 사용된 실험 설정의 개략도이다.
도 27은 SyTOX 양성%에 대한 시간의 함수로서 동역학 곡선을 나타낸다.
도 28은 보체 경로의 개략도이다.
도 29는 Bb를 대체하는 C3b에 결합하여 보체 증폭을 차단하는 본원에 기재된 나노입자의 개략도이다.
도 30a는 표면 플라즈몬 공명(SPR- Biacore)에 의해 결정된 C3b에 대한 결합이 강화된 보체 인자 H에 대한 AT-007-NP04의 강한 결합을 도시하는 센소그램이다.
도 30b는 표면 플라즈몬 공명(SPR- Biacore)에 의해 결정된 C3b에 대한 결합이 강화된 보체 인자 H에 대한 AT-007-NP04의 강한 결합을 도시하는 센소그램이다.
도 31a는 도 31b에 나타내고 본원에 기재된 실험 결과의 설정을 도시하는 개략도이다.
도 31b는 대체 또는 고전적 경로를 통해 보체 활성화를 직접적으로 방지하는 AT-007-NP06 나노입자의 능력을 도시하는 막대 플롯이다.
도 32a, 도 32b, 및 도 32c는 ELISA-측정된 AT-007-NP04 및 AT-007-NP06의 CFH 단백질에 대한 결합 친화도를 나타내는 플롯이다.
도 33은 배치 AT-007-NP04가 490 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 바와 같이 Siglec 7, 9 및 11에 대해 결합 친화도를 나타냄을 보여주는 플롯이다.
도 34a 내지 도 34d는 Siglec 7, 9 및 13에 대한 PSA의 센소그램(BIACore™ PSR 측정 결과)이다.
상세한 설명
본원에 사용된 바와 같이, "시알산 리간드"는 시알산 수용체 중 적어도 하나와 동족(cognate)인 시알산의 임의의 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드 유도체를 지칭한다. 시알산은 뉴라민산 또는 자연적으로 발생하거나 합성적으로 유도된 뉴라민산의 임의의 화학적 변형을 지칭한다. 뉴라민산의 구조식은 다음과 같이 재현된다:
Figure pct00003
시알산 유도체의 예는 하기 구조식으로 표시되는 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac):
Figure pct00004
하기 구조식으로 표시되는 N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc)
Figure pct00005
을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 탄수화물 잔기는 하나 이상의 위치가 공유 결합을 위해 변형된 모노사카라이드이다.
본원에 사용된 바와 같이, "감염원"은 바이러스, 세균, 또는 기생충 병원체이고, 수용체는 캡시드/캡슐, 막 또는 핵 글리칸 결합 분자/단백질/효소(렉틴), 예컨대 헤마글루티닌 에스테라제, 코로나바이러스 스파이크 단백질, 바이러스성 뉴라미니다제/시알리다제일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "평균 단면폭"은 입자의 앙상블에 걸쳐 평균화된 비구형 나노입자에서 가장 넓은 부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "입자"는 본원에 정의된 바와 같은 마이크로입자 및 나노입자를 포함한다.
본 개시내용은 면역 감시를 강화하기 위해 면역계 조절제, 즉 면역계의 억제제 또는 활성화제, 바이러스/세균/기생충 감염의 억제제, 암 세포의 비차폐 또는 손상-관련 분자 패턴(DAMP)으로서 사용하기 위한 시알산 리간드를 포함하는 치료제를 제공한다. 표적 세포 집단은 Siglec 수용체, CFH CCP 4-6, 19-20, 바이러스 HE, 바이러스 N, 바이러스 SP, 및 CD147을 발현하는 세포 집단을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전달 비히클은 나노입자 표면 상에 제시하기 위해 시알산, 시알산 유도체, 시알산 유사체, 시알산 단량체, 및/또는 시알산 중합체를 포함하는 리간드(본원에서 전체적으로 "시알산 리간드"로서 지칭됨)에 테더링된(접합되거나 연결된) 나노입자 또는 마이크로입자로서 제형화된 중합체를 포함한다. 테더링된 시알산은 표적화된 세포의 표면 상에 발현되는 Siglec 수용체와 같은 수용체에 나노입자의 표적화된 결합을 위한 리간드로서 기능한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 나노입자 표면 상에 제시하기 위해 시알산 리간드의 공유 화학적 접합을 통해 테더링을 제공하는 중합체를 포함하는 나노입자를 제공한다. 나노입자는 염증 프로세스를 조절하기 위해 시알산-결합 면역글로불린형 렉틴(Siglec)을 발현하는 면역 세포와 접촉하는 데 사용될 수 있다. 시알산 결합 면역글로불린유사 렉틴(Siglec)을 발현하는 면역 세포를 표적화하고 이에 결합할 수 있는 시알산 리간드를 제공하여 표적화된 세포 및 관련 환경에서 염증 반응을 조절하는 데 사용될 수 있는 것으로 결정되었다. Siglec은 수용체의 자기-회합 패턴 인식 계열의 구성원이며 상이한 세포 집단에서 선택성을 발현하는 Siglec 이소형을 포함한다. 따라서, 특정 Siglec 수용체에 선택적으로 결합하는 나노입자를 설계하는 능력은 관심 있는 원하는 세포 집단에 대한 결합을 표적화할 수 있게 한다. Siglec 수용체에 대한 나노입자의 이러한 결합은 관심 있는 세포 내에서 Siglec 수용체의 신호 전달 활성을 조절하기 위한 수단으로서 사용될 수 있으며, 치료된 대상체에서 염증 반응의 감소 또는 항염증 반응의 강화를 초래할 수 있다.
나노입자 표면 상에 시알산 리간드의 제시는 시알산 리간드가 표적 세포 또는 유기체 상의 Siglec 수용체에 의해 결합될 수 있도록 나노입자 상에 장식된다는 것을 의미한다. 적합하게는, 그들은 수용체에 결합, 활성화 또는 수용체를 차단하도록 제공될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 나노입자 상에 시알산의 제시는 염증 반응을 조절하거나, 면역 감시를 강화하거나, 감염성을 차단하기 위해 시알산 리간드가 특정 농도 밀도로 제시되는 것을 필요로 한다.
단일 나노입자는 시알산 리간드의 다가 복합체로 장식될 수 있으며, 이는 이러한 단일 나노입자에 의해 상이한 Siglec 수용체의 다가 결합을 허용하여 염증 반응의 조절을 초래할 것이다. 독특한 리간드로 장식된 나노입자는 또한 상이한 Siglec 수용체를 표적으로 할 수 있는 다른 리간드 장식된 나노입자와 혼합될 수 있으며, 다시 원하는 염증 반응 조절을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 마이크로입자의 표면 상의 시알산 리간드의 제시는 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 또는 적어도 약 10배의 세포에 의한 입자의 증가된 흡수를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자 또는 마이크로입자의 표면 상의 시알산 리간드의 제시는 염증 반응을 감소시킬 수 있다. 비제한적인 실시형태에서, 염증 반응의 감소는 약 2배 초과, 약 3배 초과, 약 4배 초과, 약 5배 초과, 약 10배 초과, 약 20배 초과, 약 50배 초과, 약 100배 초과, 약 500배 초과 또는 약 1000배 초과이다.
나노입자 또는 마이크로입자는 선천성 및 적응성 염증을 해소하거나, 강화된 면역 감시가 요구될 때 선천성 및/또는 적응성 면역을 활성화시키거나, 감염성 유기체의 감염성을 감소시키기 위해 대상체에서 염증 반응의 조절을 초래하는 치료를 필요로 하는 상기 대상체에서 병든 조직을 표적화하는 전신 전달 또는 국소 전달을 위해 사용될 수 있다. 표적화된 면역 세포 또는 바이러스는 각각 Siglec 수용체 또는 바이러스 시알산-리간드 결합 영역을 보유해야 한다. 선천성 면역계의 활성은, 예를 들어, 선천성 면역계의 세포 반응; 선천성 면역계, 보체계, 대체 보체 경로, 대체 보체 경로의 증폭 루프, 및/또는 보체 인자 H에 의해 활성화된 대체 보체 경로의 증폭 루프의 비세포성/체액성 반응을 포함한다. 적응성 면역계의 활성은 수지상 세포 성숙 및 T 세포에 대한 제시, T-세포 활성화, T-세포 조절, T-세포 체크포인트 억제 또는 활성화, 호중구 NETosis 및 B-세포 활성화를 포함한다. 감염성의 감소는 숙주 세포로의 바이러스 침투 감소, 바이러스 입자의 재생성 감소, 또는 바이러스 감염에 대한 염증 반응 감소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 제공된 치료 방법에 따라 치료되는 대상체를 지칭한다. 대상체는 인간, 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 뮤린 등일수 있다. 대상체는 또한 실험실 시험에 사용되는 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "나노입자"는 하나 이상의 중합체로 구성된 입자를 지칭하며, 그 크기는 나노미터(nm) 단위로 10 나노미터와 2000 나노미터 사이의 선형 치수 범위를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "선형 치수"는 직선으로 측정된 나노입자의 표면 상의 임의의 두 점 사이의 거리를 지칭한다. 본 개시내용의 나노입자는 불규칙형, 타원형, 방추형, 막대형, 원통형, 팬케이크형, 원반형, 구형, 양면 오목형, 또는 적혈구 형상일 수 있다. 선형 치수는 나노입자 크기를 결정하는 표준 수단 중 일부인 투과 전자 현미경 또는 조정 가능한 저항 펄스 감지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 나노입자의 크기를 측정하기 위해 널리 사용되는 기술 중 하나는 나노입자의 직경과 다분산도를 제공할 수 있는 동적 광산란(DLS)이다. DLS는 나노입자가 본질적으로 구형이라고 가정하고, 나노입자의 크기는 이러한 가정된 구체의 평균 직경(또는 반경)이다. 이러한 측정에서, 나노입자는 10 nm 내지 1000 nm 또는 1 nm 내지 500 nm의 크기 범위를 갖는 것으로 기술될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "마이크로입자"는 하나 이상의 중합체로 구성된 미세한 입자를 지칭하는 것으로, 그 크기는 마이크로미터(μm) 단위로 1000 μm 미만이고 1 μm 이상인 최대 단면폭을 포함한다.
나노입자의 여러 유형 및 구성이 본 개시내용에 포괄된다. 예를 들어, 나노입자는 생분해성 중합체, 생체적합성 중합체, 생흡수성 중합체, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 물질로 구성될 수 있다. 생체적합성은 조직의 생물학적 기능을 바람직하지 않게 방해하지 않는 중합체를 지칭한다. 생분해성, 생흡수성 및 생침식성뿐만 아니라 분해된, 침식된 및 흡수된 이라는 용어는 (문맥에서 달리 나타내지 않는 한) 상호 교환적으로 사용되며 혈액과 같은 체액 및 효소와 같은 그 성분에 노출될 때 분해되거나 흡수될 수 있고 신체에 의해 점진적으로 재흡수, 흡수 및/또는 제거될 수 있는 중합체 및 금속을 지칭한다.
시알산 리간드가 연결된 나노입자의 중합체 골격은 탄수화물 또는 단백질과 같은 자연 발생 중합체로 구성될 수 있거나, 합성 중합체로 구성될 수 있다. 중합체 골격은 시알산 리간드를 나노입자 표면에 테더링하기 위해 독특한 말단 작용기를 가질 것이다. 중합체 골격은 먼저 화학적 접합 방법을 통해 나노입자를 형성하기 전에 복수의 시알산 리간드와 연결될 수 있거나, 중합체 골격은 먼저 나노입자로 형성된 다음, 나노입자의 표면에 표시된 작용기가 화학적 접합 방법을 통해 시알산 리간드와 결합될 수 있다.
적합한 나노입자는 중합체 입자 및 하이드로겔 입자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중합체"는 공유 결합에 의해 연결된 복수의 반복 구조 단위로 구성된 분자(들)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중합체 입자"는 리포좀 및 폴리머좀의 쉘유사 구조 및 상대적으로 개방된 구조의 하이드로겔 입자와 대조적으로 고체 또는 다공성 입자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "하이드로겔 입자"는 흡수성이지만 수성 환경에서 안정한 중합체 사슬의 가교결합된 네트워크를 지칭한다.
나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있는 중합체는 폴리(N-아세틸글루코사민) (Chitin), 키토산, 폴리(3-하이드록시발레레이트), 폴리(D,L-락타이드-co-글리콜라이드), 폴리(1-락타이드-co-글리콜라이드) 폴리(3-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트), 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 폴리(L-락트산), 폴리(L-락타이드), 폴리(D,L-락트산), 폴리((D,L)락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-아지드, 폴리(DL-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-메틸테트라진, 폴리(D,L-락타이드), 폴리(L-락타이드-co-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-카르복실산, 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르-블록-폴리(락타이드-co-글리콜라이드), 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-co-글리콜라이드), 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-아지드, 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-알킨, 폴리((D,L)락트산)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-아지드, 폴리((D,L)락트산)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-알킨, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리카프로락톤-b-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락타이드-co-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(락타이드-co-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-co-카프로락톤), 폴리(글리콜라이드-co-카프로락톤), 폴리(DL-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(DL-락타이드), 폴리(트리메틸렌 카르보네이트), 폴리에스테르 아미드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌 카르보네이트), 아크릴레이트-폴리(카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-알킨, co-폴리(에테르-에스테르) (예를 들어, PEO/PLA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-co-아크릴산), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-co-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트), 폴리포스파젠, 생체 분자(예컨대, 피브린, 피브린 글루, 피브리노겐, 셀룰로스, 전분, 콜라겐 및 히알루론산, 엘라스틴 및 히알루론산), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 폴리아크릴레이트 이외의 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체(예컨대, 폴리비닐 클로라이드), 폴리비닐 에테르(예컨대, 폴리비닐 메틸 에테르), 폴리비닐리덴 할로겐화물(예컨대, 폴리비닐리덴 클로라이드), 폴리(비닐리덴 플루오라이드), 폴리(비닐리덴 플루오라이드-co-헥사플루오로프로필렌), 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 방향족(예컨대, 폴리스티렌), 폴리비닐 에스테르(예컨대, 폴리비닐 아세테이트), 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, ABS 수지, 폴리아미드(예컨대, Nylon 66 및 폴리카프로락탐), 티로신계 폴리카르보네이트를 포함하는 폴리카르보네이트, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리우레탄, 레이온, 레이온-트리아세테이트, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀로판, 셀룰로스 니트레이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로스 및 풀러렌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 양태에서, 나노입자는 생분해성 중합체 폴리카프로락톤으로부터 형성되고, 다른 실시형태에서는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산)을 포함하는 중합체로 형성된다. 실시형태에서, 나노입자는 중합체 입자일 수 있으며, 특히 입자는 생분해성 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락타이드) (PLA), 폴리(글리콜라이드)(PGA), 폴리 락트산-10-글리콜산(PLGA), 폴리(부틸 시아노아크릴레이트) (PBCA), 또는 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(HPMA) 공중합체로부터 형성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 나노입자는 비생분해성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올 및 폴리(비닐피롤리돈)으로부터 형성된다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 PLGA-블록-PEG의 바람직한 실시형태를 포함하여 블록 공중합체(BCP)로서 생분해성 중합체와 비생분해성 중합체의 혼합물로부터 형성된다. 블록 공중합체는 공유 결합에 의해 연결된 2개 이상의 상이한 중합체 서브유닛을 갖는 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 PLGA-블록-PEG의 바람직한 실시형태를 포함하여 블록 공중합체로서 생분해성 중합체와 비생분해성 중합체의 혼합물로부터 형성된다. 또 다른 양태에서, 나노입자는 콜라겐, 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 키토산, 및 알지네이트로부터 형성된 것을 포함하는 하이드로겔 나노입자 형태의 천연 유래 중합체로부터 형성된다.
나노입자의 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며[예를 들어, 문헌(Spence et al., Science Translational Medicine, 2015, 7: 303 303ra140) 및 여기에 인용된 참조문헌을 참조한다], 예를 들어, 알려진 분해율을 갖는 나노입자의 합성 방법은 Gregoriadis 등의 미국 특허 제6,451,338호, Samuel 등의 미국 특허 제6,168,804호 및 Schneider 등의 미국 특허 제6,258,378호에 기재된 바와 같이 당업자에게 알려져 있으며, 특허들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
관심 있는 표적 세포 상에 발현되는 수용체에 대한 선택적인 결합에 사용하기 위해 시알산 리간드로 테더링된 제형화된 나노입자 또는 마이크로입자가 제공된다. 시알산이란 용어는 Siglec 수용체에 결합할 수 있는 디시알산을 포함하여 임의의 모노시알산, 올리고머성 시알산 또는 중합체성 시알산 또는 폴리시알산, 특히 예를 들어, Siglec 7과 같은 억제성 Siglec 수용체에 대한 결합 특이성을 갖는 시알산을 지칭한다. 실시형태에서, 현재 개시된 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 시알산은 동물 조직 및 혈액 세포에서 뮤코단백질 및 당단백질의 성분인 아미노 탄수화물의 임의의 군일 수 있다. 실시형태에서, 시알산(노눌로손산으로도 알려짐)은 9개 이상의 탄소 원자를 함유하는 아미노 함유 당 계열의 구성원, 예를 들어, N-아세틸뉴라민산(5-(아세틸아미노)-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-D-갈락토-노눌로손산, 락타민산 및 O-시알산으로도 알려짐)을 함유한다.
실시형태에서, 시알산은 모노시알산, 또는 디시알산을 포함한 폴리시알산일 수 있는 것으로 예상된다. 폴리시알산은 일반적으로 α-배열에서 2→8 및/또는 2→9, 및/또는 2→6 및/또는 2→3으로 연결될 수 있다. 실시형태에서, 시알산 또는 폴리시알산은 나노입자 또는 마이크로입자의 표면에 테더링된다. 폴리시알산은 여러 시알산 단위로 구성된 단독중합체이다. 폴리시알산은 5개 미만의 시알산 단위, 바람직하게는 4개 미만의 시알산 단위, 3개 미만의 시알산 단위 길이, 가장 바람직하게는 2개의 시알산 단위 길이일 수 있다. 실시형태에서, 중합도(DP)는 DP2 내지 DP100 초과의 범위일 수 있다. DP는 DP2 내지 DP100, DP2 내지 90, DP2 내지 DP80, DP2 내지 DP70, DP2 내지 DP60, DP2 내지 DP50, DP2 내지 DP40, DP2 내지 DP30, DP2 내지 DP30, DP2 내지 DP20, DP2 내지 DP10일 수 있다. 구체적인 비제한적인 실시형태에서, 중합도는 DP3 내지 DP100이다. 대안적인 실시형태에서, 폴리시알산은 5개 이상의 시알산 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리시알산은 적어도 6개의 시알산 단위, 적어도 7개의 시알산 단위, 또는 적어도 8개의 시알산을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 중합도(DP)는 DP5 내지 DP1000의 범위일 수 있다. 예를 들어, 중합도는 DP5 내지 DP500, DP5 내지 DP100, DP5 내지 DP90, DP5와 DP80 사이, DP5 내지 DP70, DP5 내지 DP60, DP5 내지 DP50, DP5 내지 DP40, DP5 내지 DP30, DP5 내지 DP20, DP5 내지 DP10일 수 있다. 구체적인 비제한적인 실시형태에서, 중합도는 DP10 내지 DP400, DP20 내지 DP300, 또는 DP30 내지 DP200이다. 특정 실시형태에서, DP는 DP5 내지 DP30, 예를 들어, DP5, DP10, DP15, DP20, DP25, DP30, DP35, DP40, DP45 또는 DP50이다. 특정 실시형태에서, DP는 DP5 내지 DP500이다. 예시적인 실시형태에서, DP는 DP10 내지 DP30이다.
시알산의 유사체가 사용되는 실시형태에서, 유사체는 본원에 개시된 바와 같은 시알산과 구조적 유사성을 가질 수 있고, 특정 Siglec에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 적합한 유사체는 당업계에 알려져 있을 것이다. Siglec 수용체에 대한 시알산 리간드의 결합에 영향을 미치는 특징은 시알산의 카르복실산 작용기 사이의 전하-거리-배위 관계인 것으로 여겨진다.
특정 실시형태에서, 시알산은 NeuAcα2-3Galβ1-4Glc, NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc, NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc, NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc, NeuAcα2-6Galβ1-4Glc, NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc, NeuAcα2-6GalNAc, Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc, NeuGcα2-6Galβ1-4Glc, NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc, NeuGcα2-6GalNAc, NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc, NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc, NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc, NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S, NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc, NeuAcα2-8NeuAc, NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc, NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc, 및 NeuAcα2-8NeuAc 또는 이러한 시알산의 시알로사이드 유도체, 예를 들어 BPCNeuAc 시알로사이드로부터 선택된다.
다른 많은 합성/비자연 발생 시알리오사이드/시알산 유도체가 이용 가능하다. 시알산은 각각의 Siglec 수용체에 대한 최고 친화도 결합 시알산 유사체/유도체를 얻기 위해 고처리량 스크리닝 또는 세포-기반 마이크로어레이로부터 얻을 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 시알산은 표적화되는 Siglec 수용체에 따라 선택될 수 있으며, 여기서 특정 Siglec에 대한 결합 선호도는 표 1로부터 선택될 수 있다.
표 1
Figure pct00006
일부 실시형태에서, 적절한 시알산 리간드 또는 유사체는 원하는 수용체 특이성에 따라 나노입자에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시알산은 2-8 디시알산, 또는 적어도 하나의 위치가 시알산으로 채워진 2-6 또는 2-3개의 변이체 중 적어도 하나이다. 일부 실시형태에서, 시알산은 알파-2-8 디-아세틸뉴라민산, 알파-NeuNAc-(2→6)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc 및 알파-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 나노입자에는 알파 2-8 아세틸뉴라민산이 제공될 수 있다.
시알산은 Siglec 수용체 상호작용을 통해 면역계의 세포에 자연적으로 결합하고 결합을 통해 상기 세포의 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 나노입자는 면역 세포 표면 상에 발현되는 특이적 Siglec에 대한 결합 친화도를 기반으로 면역계의 특정 세포에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 대식세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 7, Siglec 9, Siglec 11, Siglec 12, Siglec 15에 결합하고 효능작용하거나, Siglec 16에 결합하고 길항작용하는 시알산 리간드를 갖는 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 대식세포의 표면 상에 발현된다. 잠재적인 치료적 생물학적 반응은 대식세포에 대한 항염증 상태를 해소하는 M2c 또는 대식세포의 노화 상태인 M0에 대한 대식세포의 분극화이다. 또 다른 예에서, 단핵구의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 7, Siglec 9, Siglec 10, Siglec 13에 결합하고 효능작용하거나, Siglec 14에 결합하고 길항작용하는 시알산 리간드를 갖는 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 단핵구의 표면 상에 발현된다. 생물학적 반응은 단핵구, 예컨대 인터루킨-1 베타(IL-1베타), IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-23, IL-23p40, CCL17, CXCL10, MCP-1, 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타1), 인터페론 감마(IFNγ)의 사이토카인 생산을 억제하는 것이다. 또 다른 예에서, NK 세포의 활성은 NK 세포의 표면 상에 발현된 Siglec 7에 결합하도록 설계된 시알산 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 생물학적 반응은 파이롭토시스(pyroptosis)의 억제이다. 파이롭토시스의 마커는 NOD-, LRR- 및 피린 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)의 하향 조절, IL-1베타의 하향 조절 및 그랜자임 B의 감소이다. 또 다른 예에서, 호산구의 활성은 호산구의 표면 상에 발현되는 Siglec 7, Siglec 8(그의 뮤린 상동체 Siglec F 포함), 또는 Siglec 10에 결합하고 효능작용하는 시알산이 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 생물학적 반응은 호산구의 유도된 세포 사멸, 비만 세포 탈과립의 감소 및 히스타민 생산의 감소이다. 또 다른 예에서, 호중구의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 9에 결합하고 효능작용하거나 Siglec 14에 결합하고 길항작용하도록 설계된 시알산 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 호중구의 표면 상에 발현된다. 생물학적 반응은 NETosis의 억제이다. NETosis 억제의 마커는 호중구 엘라스타제, 카텝신 G, 락토페린 및 젤라티나아제의 하향 조절이다. 또 다른 예에서, 중추신경계의 미세아교세포 또는 다른 조직에서의 수지상 세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 7, 또는 Siglec 9에 결합하고 효능작용하도록 설계된 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 중추신경계의 미세아교세포 또는 수지상 세포의 표면 상에서 발현된다. 생물학적 반응은 CD80, CD83, 및/또는 CD86 성숙 및 항원 제시 마커의 상향 조절이다. 또 다른 예에서, B 세포의 활성은 Siglec 2, Siglec 5, 또는 Siglec 10에 결합하고 효능작용하도록 설계된 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec 발현은 B 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 사이토카인 반응은 림포톡신, Il-6, 인터페론-감마, 및 TNF의 억제이다. 생물학적 세포 마커 반응은 IGM 형성의 하향 조절, 클래스 스위치 DNA 재조합의 감소, 및/또는 클래스 스위치 형질 세포의 감소이다. 또 다른 예에서, CD8+ T 세포의 활성은 Siglec 7 또는 Siglec 9에 결합하고 효능작용하도록 설계된 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 각각의 경우 이러한 Siglec은 T 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 사이토카인 반응은 림포톡신, Il-6, 인터페론-감마, 및/또는 TNF의 억제이다. 생물학적 반응은 인터페론-감마, TNF, LAG-3 또는 CD160의 억제이다. 생물학적 세포 마커 반응은 2b4 및 PD-1의 하향 조절이다. 또 다른 예에서, CD34+ T 세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 9, 또는 Siglec 10에 결합하고 효능작용하도록 설계된 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 T 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 사이토카인 반응은 림포톡신, Il-6, 인터페론-감마, 및 TNF의 억제이다. 생물학적 반응은 인터페론-감마, TNF, LAG-3 또는 CD160의 억제이다. 생물학적 세포 마커 반응은 2b4 및 PD-1의 하향 조절이다. 또 다른 예에서, 비만 세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 6, 또는 Siglec 8(그의 뮤린 상동체 Siglec F 포함)에 결합하고 효능작용하는 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 호산구의 표면 상에 발현된다. 생물학적 반응은 비만 세포의 유도된 세포 사멸, 비만 세포 탈과립의 감소 및 히스타민 생산의 감소이다. 또 다른 예에서, 호염기성 세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 6, 또는 Siglec 8(그의 뮤린 상동체 Siglec F 포함)에 결합하고 효능작용하는 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 호염기성 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 반응은 호염기성 세포의 유도된 세포 사멸, 비만 세포 탈과립의 감소 및 히스타민 생산의 감소이다. 다른 예에서, 대체 보체 캐스케이드의 활성화는 CCP 영역 4 내지 6 및/또는 19와 20에서 CFH에 결합하고 Y402H 다형성으로 CFH와 CFH 둘 모두의 기능을 과활성화하는 시알산 리간드를 함유하는 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 생물학적 반응은 막 공격 복합체 및 C3bBb 또는 C5와 같은 기타 보체 인자의 형성 감소 및/또는 야생형 및 Y402H 다형성 CFH 둘 모두에서 절단된 C3bBb 분해 생성물의 증가일 것이다. CFH 활성화의 다른 다운스트림 측정에는 보체 활성화의 양(sheep) RBC 모델에서 용해를 감소시키는 능력이 포함된다. 또 다른 예에서, 바이러스의 감염성은 뉴라미니다제 또는 시알리다제에 결합하고 바이러스에 의해 발현되는 뉴라민다제/시알리다제에 의한 뉴라민산/시알산의 절단을 억제할 수 있는 시알산 리간드를 함유하는 나노입자에 의해 조절될 것이다. 이것은 인플루엔자 A, B 및 C를 갖는 감염에서 바이러스 입자의 방출을 감소시켜야 한다. 또 다른 예에서, 바이러스의 감염성은 인플루젠자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, SARS-CoV1 또는 SARS-CoV2의 각각의 스파이크 단백질과 같은 바이러스의 캡시드에서 발견되는 시알산 결합 부위에 결합하는 시알산 리간드를 함유하는 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 이것은 바이러스 부착을 차단, 간섭 또는 조절하거나 분자를 도킹하고 이러한 숙주 세포에 결합하고 감염시키는 그들의 능력을 차단함으로써 호흡기 세포 또는 다른 숙주 세포에 결합하고 이를 감염시키는 이들 바이러스의 능력을 감소시킬 것이다. 또 다른 예에서, 폐 염증의 감소는 뉴라미니다제 또는 시알리다제에 결합하고 기관지, 폐포 및/또는 호흡기의 상피 세포에 의해 발현되는 뉴라민다제/시알리다제에 의한 뉴라민산/시알산의 절단을 억제할 수 있는 시알산 리간드를 함유하는 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 이것은 시알리다제에 의해 절단되어 항시적 항염증을 초래하는 천연 폐 Siglec에 결합하는 항시적 시스 결합 시알산의 분해에 의해 야기된 염증을 감소시킬 것이다. 또 다른 예에서, 종양 관련 대식세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 7, Siglec 9, Siglec 11, Siglec 12, Siglec 15에 결합하고 길항작용하거나 Siglec 16에 결합하고 효능작용하는 시알산 리간드를 갖는 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 대식세포의 표면 상에 발현된다. 잠재적인 치료적 생물학적 반응은 암 세포가 면역 감시를 회피하기 위해 종양 Siglec 효능작용을 사용하는 것을 비차폐하기 위해 대식세포를 M1 및 M2a, b, 또는 d로 분극화하는 것이다. 대식세포 세포 반응은 식균작용과 사이토카인 사멸 및 종양 세포의 파괴의 증가이다. 또 다른 예에서, 종양 관련 단핵구의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 7, Siglec 9, Siglec 10, Siglec 13에 결합하고 길항작용하거나 Siglec 14에 결합하고 효능작용하는 시알산 리간드를 갖는 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 단핵구의 표면 상에 발현된다. 생물학적 반응은 단핵구, 예컨대 IL-1베타, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-23, IL-23p40, CCL17, CXCL10, MCP-1, 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 및 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타1), 인터페론 감마(IFNγ)의 사이토카인 생산을 강화하는 것으로, 이는 종양 감시를 피하기 위해 Siglec 효능작용을 이용하는 암 세포를 공격하는 것과 관련이 있기 때문에 면역 감시의 회복을 나타낸다. 단핵구 세포 반응은 식균작용과 사이토카인 사멸 및 종양 세포의 파괴의 증가일 것이다. 또 다른 예에서, 종양-관련 NK 세포의 활성은 이러한 NK 세포의 표면 상에 발현되는 Siglec 7에 결합하고 길항작용하도록 설계된 시알산 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있다. 생물학적 반응은 파이롭토시스의 강화이다. 파이롭토시스의 마커는 NLRP3의 상향 조절, IL-1베타의 상향 조절, 그랜자임 B의 상향 조절, 톨유사 수용체 1-4의 활성화이다. NK 세포 반응은 파이롭토시스 사이토카인 사멸 및 종양 세포 파괴의 증가이다. 또 다른 예에서, 종양-관련 CD8+ T 세포의 활성은 Siglec 7 또는 Siglec 9에 결합하고 길항작용하도록 설계된 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 종양 관련 T 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 사이토카인 반응은 암세포의 존재 하에 림포톡신, Il-6, 인터페론-감마 및 TNF의 상향 조절이다. 생물학적 세포 마커 반응은 2b4, LAG-3, CD160 및 PD-1의 상향 조절이다. T-세포의 생물학적 반응은 종양 세포를 공격하고 사멸시키는 적응성 면역계의 활성화의 증가일 것이다. 또 다른 예에서, CD34+ T 세포의 활성은 Siglec 3, Siglec 5, Siglec 9 또는 Siglec 10에 결합하고 길항작용하도록 설계된 시알산 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있으며, 각각의 경우 이러한 Siglec은 T 세포의 표면 상에 발현된다. 생물학적 사이토카인 반응은 암 세포의 존재 하에 림포톡신, IL-6, 인터페론-감마 및 TNF의 상향 조절이다. 생물학적 세포 마커 반응은 2b4, LAG-3, CD160, 및 PD-1의 상향 조절이다. T 세포의 생물학적 반응은 종양 세포를 공격하고 사멸시키는 적응성 면역계의 활성화의 증가이다. 또 다른 예에서, 파골세포의 활성은 파골세포의 표면 상에 발현된 Siglec 15에 결합하는 시알산 리간드 결합된 나노입자에 의해 조절될 수 있다.
표 2는 Siglec과 그들이 가장 일반적으로 발현되는 세포 유형뿐만 아니라 각 Siglec에 대한 효과적인 유형의 시알산 결합을 나타낸다.
표 2
Figure pct00007
나노입자 표면에 테더링된 시알산 리간드는 단량체, 올리고머 또는 중합체의 형태일 수 있다. 특정 실시형태에서, 시알산 리간드는 화학적 접합 기술을 통해 먼저 중합체 골격에 연결될 수 있고, 이어서 후속적으로 중합체-접합-시알산 리간드 구성체가 나노입자 표면에 형성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 중합체는 나노입자 표면 상에 노출된 작용기를 갖는 나노입자로 형성되어, 이들 작용기가 시알산 리간드와 접합될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 스크리닝 방법은 하나 이상의 Siglec 수용체(들)에 특이적으로 결합하는 나노입자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 확인된 나노입자를 시험하여 Siglec 수용체에 대한 상기 결합이 검출 가능한 세포 반응을 유도하는지 여부를 결정할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 스크리닝 라이브러리 및 고처리량 스크리닝 방법은 복수의 나노입자의 사용을 기반으로 제공되며, 여기서 나노입자의 연결된 시알산 리간드는 다양하다. 이러한 라이브러리는 나노입자 라이브러리를 상기 Siglec 수용체 또는 Siglec 수용체를 포함하는 지지체를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, Siglec 수용체에 특이적으로 결합하는 나노입자를 확인하는 방법에서 사용될 수 있다. 일단 Siglec 수용체에 대한 나노입자 라이브러리의 구성원의 결합이 확인되면, 나노입자를 시험하여 Siglec 수용체에 대한 상기 결합이 검출 가능한 세포 반응을 유도하는지 여부를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 중합체는 나노입자 표면 상에 노출된 작용기를 갖는 나노입자로 형성되어, 이들 작용기를 사용하여 시알산 리간드를 나노입자 표면에 테더링할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "모듈형" 나노입자는 하나 이상의 시알산 리간드를 원하는 방식으로 나노입자에 연결하기 위한 범용 플랫폼으로서 사용될 수 있는 특정 작용기를 갖는 나노입자를 지칭한다.
올리고머 및 중합체를 포함하는 시알산 리간드는 α2-3, α2-6, α2-8, 또는 α2-9 글리코시드 결합의 임의의 조합에 의해 함께 연결될 수 있다. 시알산 또는 시알산 유사체를 나노입자 표면에 연결하는 글리코시드 결합 유형을 제어하여 표적 Siglec 수용체에 대한 결합 친화도를 최대화하고 특정 Siglec에 대한 특이성을 강화시킬 수 있다. 상이한 Siglec이 상이한 세포 유형에 의해 차등적으로 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에, 특정 유형의 시알산 결합의 선택은 시알산 리간드를 갖는 나노입자에 의해 접촉되거나 이에 의해 표적화될 세포의 유형을 결정하는 데 사용될 수 있다. 올리고머 및 중합체 형태의 시알산 리간드는 선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다. 올리고머 또는 중합체 형태의 분지형 구조는 인접한 글리코시드 결합과 상이한 글리코시드 결합의 도입에 의해 생성될 수 있다. 올리고머 및 중합체 형태는 한 유형의 시알산으로 구성되어 조성이 균질할 수 있거나, 그들은 복수의 시알산으로 구성되어 조성이 이질적일 수 있다. 올리고머 및 중합체 형태는 또한 다른 탄수화물 단량체, 예컨대 갈락토스, N-아세틸갈락토세아민, 글루코스, N-아세틸글루코세아민, 만노스, N-아세틸만노사민, 푸코스, 또는 시알산 및/또는 시알산 유사체 이외에 다른 당/탄수화물로 구성될 수 있다.
시알산은 천연 유래(예를 들어, Neu5Ac, Neu5Gc, Neu5Ac9Ac 등)일 수 있거나, 임의의 합성적으로 제조된 시알산 유사체를 포함할 수 있다. 시알산 유사체는 당업계에 알려져 있다. 실시형태에서, 이러한 유사체는 위치 C9에서 대체물을 가질 수 있다. 유사체는 또한 C1, C4, C5, C7 및 C8에서 대체물을 가질 수 있다. 유사체는 뉴라민산 유도체, 시알로사이드, 및 적어도 하나의 뉴라민산 분자를 포함하는 임의의 당을 포함할 수 있다.
시알산 유사체는 화학적 합성, 화학효소적 합성(예를 들어, 원-포트 다중효소; OPME(one-pot multienzyme))에 의해, 또는 전구체 탄수화물(예를 들어, 만노스 유도체)의 세포 공급, 재조합 방법 또는 유전 공학 방법과 같은 포유동물 또는 세균 세포 합성을 통해 제조될 수 있다. 나노입자 리간드로서 사용하기 위해 제조된 시알산 유사체는 원-포트 합성 또는 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 제조될 수 있다. 시알산 유사체 리간드의 어레이는 HTS 방법을 사용하여 원 위치에서 제조될 수 있다.
나노입자 표면에 대한 시알산 리간드의 화학적 결합은 클릭 화학 반응의 사용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 반응에서, 나노입자 중합체의 말단 작용기와 시알산 리간드의 말단 작용기(본원에서 "말단 작용기 접합체 쌍"으로 지칭됨) 사이에 화학 반응이 일어나 중합체와 시알산 리간드의 연결을 초래한다. 중합체 및 이의 결합 파트너 리간드의 표면에서 발견되는 말단 작용기의 유형은 시알산 리간드를 나노입자의 표면에 화학적으로 연결하는 데 사용될 클릭 화학 반응의 유형을 결정할 것이다. 추가적으로, 특정 말단 작용기를 갖는 중합체의 선택은 나노입자의 표면 상에 제시될 시알산 리간드 접합체 파트너의 유형, 밀도 및 공간 배열을 제어하는데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 중합체는 아지드, 알킨, 아릴 에스테르, 아미드, 아민, 아릴 아미드, 알데하이드, 아세틸, 치환된 아릴 에스테르, 알킬 에스테르, 알킬 케톤, 아릴 케톤, 치환된 아릴 케톤, 케톤, 알킬 할라이드, 암니옥시, 알코올, 아자-일라이드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 바이사이클로노닌, 디하이드라지드, 할로-카르보닐, 할로설포닐, 하이드라지드, N-하이드록시석신이미드, 석신이미딜 에스테르, 모노플루오르화 및 디플루오르화 사이클로옥틴, 이소티오시아네이트, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 메틸사이클로프로펜, 하이드라진, 니트릴, 니트로, 포스핀, 포스파지드, 테트라진, 메틸-테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, 변형된(strained) 알킨, 디벤조사이클로옥틴, 바이아릴아자사이클로옥티논, 아자디벤질사이클로옥틴, 비닐, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 티오카르복실레이트, 티오에스테르, 설포닐 할라이드, 티올, 및 티올렌을 포함한, 형성된 나노입자 표면에 화학적 접합 부위를 제공하는 특정 작용기를 갖는다.
이러한 접합 부위는 클릭 화학 반응의 수행을 통해 나노입자의 표면에 대한 시알산 리간드의 연결을 위한 위치를 제공한다. 일 예에서, 나노입자는 아지드 또는 알킨 말단 작용기를 갖는 PLGA-PEG 중합체로 형성된다. 비제한적인 실시형태에서, 상이한 말단 작용기를 갖는 상이한 중합체의 블렌드가 사용될 수 있다. 이러한 중합체는, 예를 들어, PLGA-PEG-알킨, PLGA-PEG-에스테르 및 PLGA-PEG-DBCO를 포함한다. 특정 양태에서, PLGA-PEG-알킨과 PLGA-PEG-카르복실산의 블렌드가 나노입자로서 제조될 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, PLGA-PEG-알킨과 PLGA-PEG-에스테르의 블렌드는 나노입자로서 제조될 수 있다. 또 다른 특정 실시형태에서, PLGA-PEG-DBCO와 PLGA-PEG-카르복실산의 블렌드가 나노입자로서 제조될 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, PLGA-PEG-DBCO와 PLGA-PEG-에스테르의 블렌드가 나노입자로서 제조될 수 있다.
PLGA 중합체는 자유 말단 알킨기를 가질 수 있지만, 이들 중 다수는 입자 매트릭스에 매립될 수 있고 입자 표면에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, 입자의 제1 PGLA 중합체 또는 공중합체 이외에 제2 중합체 또는 공중합체 계면활성제 또는 코팅을 제공함으로써 더 많은 알킨기가 입자에 도입될 수 있다. 적합하게는, 제2 중합체 또는 공중합체는 분지형 또는 선형일 수 있고, 복수의 말단 알킬기를 가질 수 있으며, 여기서 알킬기는 탄소와 수소만을 함유하고, 일반식 CnH2n+1과 상동 시리즈를 형성한다. 다른 실시형태에서, 시알산 리간드 또는 유사체는 공유 결합을 통해 입자, 예를 들어, 중합체 나노입자에 부착될 수 있다.
다른 실시형태에서, 시알산 리간드는 나노입자 표면에서 테더링을 제공하는 말단 작용기(즉, 접합 부위)를 포함한다. 이러한 말단 작용기는 아지드, 알킨, 아릴 에스테르, 아미드, 아민, 아릴 아미드, 알데하이드, 아세틸, 치환된 아릴 에스테르, 알킬 에스테르, 알킬 케톤, 아릴 케톤, 치환된 아릴 케톤, 케톤, 알킬 할라이드, 암니옥시, 알코올, 아자-일리드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 바이사이클로노닌, 디하이드라지드, 할로-카르보닐, 할로설포닐, 하이드라지드, N-하이드록시석신이미드, 노르보르넨, 옥사노르보르나디엔, 석신이미딜 에스테르, 이소티오시아네이트, 요오도아세트아미드, 모노플루오르화 및 디플루오르화 사이클로옥틴, 말레이미드, 메틸사이클로프로펜, 이소시아노프로파노에이트, 하이드라진, 니트릴, 니트로, 포스핀, 포스파지드, 테트라진, 메틸-테트라진, 트랜스-사이클로옥텐, 변형된 알킨, 디벤조사이클로옥틴, 바이아릴아자사이클로옥티논, 프로파르길, 이소시아나이드, 아자디벤질사이클로옥틴, 비닐, 설포닐 에스테르, 티오에스테르, 티오카르복실레이트, 티오에스테르, 설포닐 할라이드, 티올, 및 티올렌을 포함한다. 이러한 접합 부위는 클릭 화학 반응의 수행을 통해 시알산 리간드를 나노입자 표면에 연결하기 위한 위치를 제공한다. 나노입자 상의 작용기(예를 들어, 알킨)의 연결은 전형적으로 접합체 클릭 화학 작용기(예를 들어, 아지드) C2 탄소 연결을 통한 접합체 클릭 화학을 통해 이루어진다,
시알산 리간드의 작용기는 C1, C2, C4, C5, C7, C8, 또는 C9 위치에 위치한 시알산 코어 분자 구조 상의 상이한 위치에서 발견될 수 있다. 따라서, 나노입자의 표면에 대한 시알산 리간드의 연결은 C1, C2, C4, C5, C7, C8, 또는 C9 위치에서 접합을 통해 발생하여, 나노입자 표면 상의 3차원 공간에서 리간드의 상이한 배향을 생성할 수 있으며, 이는 관심 있는 면역 세포에 대한 리간드 제시에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 리간드 제시는 수용체 결합을 통해 면역 세포와 접촉할 때 원하는 세포 반응을 유도하기 위해 이러한 방식으로 제어될 수 있다.
리간드의 알려진 간격 및/또는 밀도를 갖는 시알산 올리고머 및 시알산 중합체, 및 이들의 시알산 유사체는 Siglec 수용체에 대한 리간드로서 나노입자의 표면 상에 제시되어야 한다. 특정 시알산 유사체 리간드를 나노입자의 표면에 테더링함으로써, 나노입자는 특정 생물학적 반응을 유도하여 염증을 조절하기 위해 Siglec 수용체를 발현하는 알려진 면역 세포 세트와 접촉할 수 있다. 나노입자의 표면 상에 제시된 시알산 조성, 구조, 밀도 및 구조(architecture)의 다양성은 면역 세포의 반응 조절 정도와 방향을 조절하는 수단을 제공한다.
복수의 시알산 및/또는 시알산 유사체는 단량체, 중합체 또는 올리고머 형태로 인접한 글리칸과 함께, 화학적 접합에 의해 나노입자의 표면에 테더링될 수 있다. 이러한 화학적 접합은, 예를 들어, 클릭 화학, 카르보디이미드 화학, 환원성 아민화, 또는 화학흡착을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 클릭 화학 반응은 시알산 리간드를 나노입자 표면에 연결하기 위해 사용된다. 이러한 클릭 화학 반응은 다른 분자, 생체분자, 나노입자 및 기타 표면을 변형시키기 위해 화학적 라이게이션(chemical ligation)에 사용되는 생체접합에 일반적으로 사용되는 생체적합성 소분자 반응의 한 부류로 특징지어진다. 일반적으로, 클릭 화학 반응은 하기 특성을 가지고 있다: 모듈성, 용매 파라미터에 대한 무감각성, 높은 화학적 수율, 산소와 물에 대한 무감각성, 위치 특이성 및 입체특이성, 및 단일 반응 생성물과의 반응을 선호하는 큰 열역학적 구동력(> 20 kcal/mol). 클릭 화학 반응은 높은 반응 특이성을 제공하여 위치 특이성과 입체 특이성 둘 모두의 제어를 제공한다. 반응 특이성은 나노입자의 표면 상에 시알산 리간드의 원하는 제시를 달성하는데 특히 유용하며, 이에 의해 면역세포 Siglec 수용체에 대한 나노입자의 최적 결합을 허용한다. 접합 동안 클릭 반응에 의해 형성된 결합은 시알산 리간드와 나노입자 사이의 매우 안정적인 공유 결합에 대한 접근성을 제공하며, 이는 재배열 또는 반응을 거치지 않거나 생물학적 조건에서 분해 또는 가수분해를 초래하지 않는다.
다양한 상이한 클릭 화학 반응이 시알산 리간드를 나노입자의 표면에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 클릭 화학 반응의 사용은 원하는 시알산 리간드 밀도 및 공간 배열을 갖는 나노입자의 생성을 위한 제어된 반응 매질을 제공한다. 나노입자 표면 상의 시알산 리간드의 밀도 및 공간적 배열은, 예를 들어, 나노입자를 형성하는 데 사용된 작용기를 갖는 중합체의 양, 중합체 분자량, 중합체 밀도, 중합체 당 작용기의 수, 용매, 작용기의 유형, 리간드의 농도, 사용된 클릭 화학의 유형 및 클릭 화학 접합체 쌍의 유형을 제어함으로써 제어될 수 있다. 리간드의 공간적 배열은 또한 리간드 상의 시알산과 기타 탄수화물의 연결에 의해 제어될 수 있다. 올리고머 및/또는 중합체 리간드의 길이는 또한 밀도 및 공간적 배열을 제어할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 중합체, 예를 들어, PEG, PLGA, PEG-PLGA 블록 공중합체, 또는 폴리시알산의 평균 분자량은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예컨대 특히 음이온-교환 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피, 점도 측정에 의해 결정될 수 있다.
시알산 리간드를 중합체에 테더링하기 위해 사용되는 클릭 화학 반응은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 후이스겐(Huisgen) 1,3-이극성 고리화첨가, 1,3-치환된 생성물을 생성하는 구리(I)-촉매된 아지드-알킨 고리화첨가(CuAAC), 1,5-치환된 트리아졸을 생성하는 루테늄-촉매된 알킨-아지드 고리화첨가(RuAAC), 1,4-치환된 생성물을 생성하는 변형 촉진된 알킨 아지드 고리화첨가(SPAAC), 변형-촉진된 알킨-니트론 고리화첨가, 알켄 및 테트라진 역수요 딜스-알더(inverse-demand Diels-Alder), 테트라진 트랜스-사이클로옥텐 라이게이션, 티올-엔 반응, 티올-인 반응, 스타우딩거 반응(Staudinger reaction), [4+1] 고리화첨가, 쿼드리사이클란(quadricyclane) 라이게이션 [2+2+2] 고리화첨가, 노르보르넨 고리화첨가, 및 알켄 테트라졸 포토클릭 반응을 포함한다.
시알산 또는 시알산 유사체(단량체, 중합체 또는 올리고머의 형태)를 나노입자의 표면에 테더링하는 것은 면역 세포의 표면 상에 발현된 Siglec 수용체 또는 바이러스 입자의 표면 상에 발현된 시알산 리간드 수용체에 대한 최대 결합 친화도에 대한 시알산 리간드의 제시를 제공하기 위한 방식으로 수행된다. 리간드 밀도는 면역 세포와 접촉할 때 Siglec 수용체와 원하는 다가 또는 다원자가(polyvalent) 리간드 상호작용을 제공하도록 제어될 수 있는데, 이러한 상호작용은 원하는 세포 면역 반응과 상관관계가 있기 때문이다. 다가 또는 다원자가 시알산-수용체 상호작용은 나노입자 표면 상에 제공된 리간드의 밀도에 기초하여 제어될 수 있고, 이러한 밀도는 접촉 시 면역 세포에 의해 유도되는 반응에 영향을 미칠 수 있다.
적합하게는, 시알산 또는 이의 유사체는 나노입자의 표면 상에 고정화될 수 있다. 시알산은 나노입자에 직접 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 링커를 통해 결합될 수 있다. 나노입자는 시알산 또는 유사체의 결합을 허용하도록 유도체화되거나 활성화될 수 있다. 대안적으로, 나노입자는 나노입자에 대한 링커의 결합을 허용하도록 유도체화되거나 활성화될 수 있고, 링커는 시알산에 부착될 수 있다. 시알산 또는 이의 유사체를 나노입자에 연결함으로써, 나노입자는 세포 내 염증촉진 사이토카인의 생성이 억제되거나 항염증 사이토카인의 생성이 증가되어 염증촉진 면역 반응을 억제하도록 Siglec 수용체의 결합을 유도하기 위해 Siglec 수용체를 포함하는 세포를 표적화하도록 적응될 수 있다.
개시된 바와 같이, 클릭 화학 반응의 사용은 나노입자의 중합체와 시알산 리간드의 중합체 둘 모두가 나노입자 표면에 대한 리간드의 원하는 접합을 허용하도록 기능화될 것을 필요로 한다. 일 실시형태에서, 말단 알킨은 구리(I)-촉매된 아지드-알킨(CuAAC) 반응; 구리 비함유 반응; 변형-촉진된 아지드-알킨(SPAAC) 반응; 테트라진-알켄 라이게이션 반응 또는 트랜스-사이클로옥텐(TCO)-테트라진 반응의 수행을 통해 아지드-제시 시알산 리간드와의 공유 화학적 접합을 위해 나노입자 표면에 제시된다. 아지드 작용기는, 예를 들어, 시알리트랜스퍼라제 ST8SIA4를 사용하여 시알산 리간드에 추가될 수 있다.
일 양태에서, 리간드/나노입자 접합체 쌍은 아지드를 갖는 시알산 리간드 및 알킨 작용기를 갖는 나노입자를 사용한, 또는 알킨을 갖는 시알산 리간드 및 아지드 작용기를 갖는 나노입자를 사용한 구리(I) 아지드-알킨 고리화첨가로 제조될 수 있다. 디벤질사이클로옥틴, 디플루오로옥틴 또는 바이아릴아자사이클로옥티논을 갖는 시알산 리간드는 SPACC를 통해 아지드와 반응할 수 있다. 트랜스-사이클로옥텐을 갖는 리간드는 테트라진 작용기를 갖는 나노입자와 반응할 수 있다.
구체적인 비제한적인 실시형태에서, PLGA-PEG-알킨 또는 PLGA-PEG-카르복실산 나노입자를 형성한 다음, 클릭 화학을 사용하여 α2-8 중합체 시알산-아지드 리간드를 나노입자의 표면에 공유 테더링함으로써 변형시킨다. 알킨-작용화된 PLGA 나노입자는 Greene 등(Chem Sci 2018)이 사용한 프로토콜을 기반으로 에멀젼 방법을 통해 제조되어 코어 나노입자 구성체를 생성한다. 형성된 나노입자는 aCuAAC 클릭 화학 반응을 포함한 클릭 화학 방법을 통해 공유 화학적 접합에 사용 가능한 표면에 알킨 작용기를 제공한다.
구체적인 비제한적인 실시형태에서, PLGA-PEG-DBCO 또는 PLGA-PEG-카르복실산 나노입자를 형성한 다음, SPACC 클릭 화학 반응을 사용하여 α2-8 중합체 시알산-아지드 리간드를 나노입자의 표면에 공유 테더링함으로써 변형시킨다. DBCO-작용화된 PLGA 나노입자는 Greene 등(Chem Sci 2018)이 사용한 프로토콜을 기반으로 에멀젼 방법을 통해 제조되어 코어 나노입자 구성체를 생성한다. 형성된 나노입자는 SPAAC 클릭 화학 반응을 포함한 클릭 화학 방법을 통해 공유 화학적 접합에 사용 가능한 표면에 DBCO 작용기를 제공한다.
구체적인 비제한적인 실시형태에서, PLGA-PEG-DBCO 또는 PLGA-PEG-카르복실산 나노입자를 형성한 다음, SPACC 클릭 화학 반응을 사용하여 NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-아지드 리간드를 나노입자의 표면에 공유 테더링함으로써 변형시킨다. DBCO-작용화된 PLGA 나노입자는 Greene 등(Chem Sci 2018)이 사용한 프로토콜을 기반으로 에멀젼 방법을 통해 제조되어 코어 나노입자 구성체를 생성한다. 형성된 나노입자는 SPAAC 클릭 화학 반응을 포함한 클릭 화학 방법을 통해 공유 화학적 접합에 사용 가능한 표면에 DBCO 작용기를 제공한다.
구체적인 비제한적인 실시형태에서, PLGA-PEG-DBCO 또는 PLGA-PEG-카르복실산 나노입자를 형성한 다음, 변형-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 클릭 화학을 사용하여 NeuAcα2-6Galβ1-4Glc-아지드 리간드를 나노입자의 표면에 공유 테더링함으로써 변형시킨다. DBCO-작용화된 PLGA 나노입자는 Greene 등(Chem Sci 2018)이 사용한 프로토콜을 기반으로 에멀젼 방법을 통해 제조되어 코어 나노입자 구성체를 생성한다. 형성된 나노입자는 SPAAC 클릭 화학 반응을 포함한 클릭 화학 방법을 통해 공유 화학적 접합에 사용 가능한 표면에 DBCO 작용기를 제공한다.
나노입자는 폴리(D,L-락타이드-co-글리콜라이드-COOH)-PEG-COOH(PLGA 10,000 Da-PEG-COOH 5000 Da)와 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-아지드(PLGA-PEG-알킨; 10,000 Da PLGA:1,000 PEG Da)를 PLGA-COOH:PLGA-알킨(DBCO)의 75:25 (w/w) 비율로 혼합하여 제조된다. 이러한 75:25 비율은 나노입자 표면 상의 아지드 작용기의 밀도의 일 실시형태이다. 나노입자 제조에 사용되는 PLGA-PEG-COOH 대 PLGA-PEG-알킨(DBCO)의 다른 비율은 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50이다. PLGA-PEG-COOH 대 PLGA-PEG-알킨(DBCO)의 비율은 작용기 사이에 충분한 공간을 제공하여 중합체 리간드의 효율적인 접합을 허용하고 원하는 리간드 밀도가 달성되도록 설계된다.
나노입자는 그들의 시알산 리간드 접합 파트너와 짝을 이루기 위해 상이한 클릭 화학 작용기를 갖는 하나 이상의 중합체를 포함하여 제조될 수 있으며, 이에 의해 밀도 및/또는 공간 배열이 상이한 하나 이상의 시알산 리간드 유형을 나노입자 표면 상에 제시 가능하게 한다. 상이한 접합체 쌍의 사용은 하나 이상의 나노입자 중합체/리간드 쌍을 사용함으로써 나노입자로 설계될 수 있다
구체적인 비제한적인 실시형태에서, PLGA-PEG-DBCO//PLGA-PEG-카르복실산 나노입자가 형성된다. 이어서, 후속적인 2단계 프로세스 반응을 사용하여 이종 클릭 화학을 사용하는 나노입자의 표면에 2개의 상이한 리간드를 접합시킨다. 이어서, 제1 단계에서는 변형 촉진된 아지드-알킨 고리화첨가 클릭 화학을 사용하여 NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc-아지드 리간드를 나노입자의 표면 상에 공유 테더링함으로써 변형된다. 제2 단계의 반응 단계에서, 나노입자를 세척하여 불순물을 제거한 후, α2-8 올리고머성 시알산-아지드를 CuAAC 클릭 화학을 사용하여 표면에 접합시킬 수 있다. DBCO-/알킨-작용화된 PLGA 나노입자는 Greene 등(Chem Sci 2018)이 사용한 프로토콜을 기반으로 에멀젼 방법을 통해 제조되어 코어 나노입자 구성체를 생성한다. 형성된 나노입자는 SPAAC에 뒤따른 CuAAC의, 단계적 방식(step-wise fashion)의 클릭 화학 방법을 통해 공유 화학적 접합에 사용 가능한 표면 상에 DBCO 및 알킨 작용기를 제공한다.
나노입자 표면 상에 사용 가능한 상이한 클릭 화학 작용기를 가짐으로써, 상이한 유형의 시알산 리간드가 나노입자의 표면에 접합될 수 있다. 상이한 작용기의 밀도는 서로 상이한 중합체의 비율, 중합체의 농도, 및 클릭 화학 접합체 쌍의 유형, 클릭 화학 반응의 유형, 및 시알산 리간드의 크기 및 형상에 의해 제어될 수 있다. 표면 상에 제시될 수 있는 상이한 리간드의 수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 비제한적인 실시형태에서, 나노입자 표면 상에 존재하는 상이한 리간드의 수는 1 내지 20의 범위이다. 상이한 리간드의 수는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자 표면 상에 존재하는 상이한 리간드의 수는 2 내지 20의 범위이다. 상이한 리간드의 수는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 적어도 2개의 상이한 시알산 리간드를 포함할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 적어도 3개의 상이한 시알산 리간드를 포함할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 적어도 4개의 상이한 시알산 리간드를 포함할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 나노입자는 적어도 5개의 상이한 시알산 리간드를 포함할 것이다.
일반적으로, 나노입자 표면 상의 작용기의 밀도는 클릭 화학을 통한 공유 화학적 접합을 통해 나노입자의 표면에 테더링될 수 있는 최대 리간드 밀도를 좌우한다. 리간드 밀도는 표면적의 제곱 나노미터당 작용기의 수의 관점에서 제어되고 정량화될 수 있다. 밀도에 도달하면 중합체 시알산 리간드가 머쉬룸(mushroom) 확인으로부터 브러시(brush) 확인으로 전환으로의 전환을 허용한다. 브러시 확인은 중합체 폴리시알산의 최고 밀도 패킹을 제공한다. 나노입자 표면 상의 리간드의 밀도의 조정은 나노입자에 의해 접촉된 표적 면역 세포의 생물학적 반응이 조절될 수 있는 수단을 제공한다. 나노입자의 표면 상에 제시된 리간드의 밀도는 전체 나노입자 고체의 mg당 리간드의 nmol로서 정량화될 수 있다. 밀도는 나노입자의 0.05 nmol/mg 내지 50 nmol/mg의 범위일 수 있다. 나노입자의 직경은 25 nm 내지 200 nm의 범위일 수 있다.
나노입자 표면 상의 리간드의 밀도는 화학적 접합 기술, 중합체 상의 리간드 밀도, 리간드 유형, 용매, pH 및 이온 강도를 포함하는 여러 방법에 의해 제어될 수 있다. 나노입자의 표면 상의 리간드 밀도는 면역 세포를 이러한 나노입자와 접촉시켜 항염증성 생물학적 반응을 포함한 면역-조절 반응을 초래하도록 조정될 수 있다. 리간드 밀도의 제어는 또한 원하는 항염증 반응의 규모를 조절하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 시알산 또는 이의 유사체는 적어도 2개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 또는 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 또는 적어도 400개의 기로 나노입자 상에 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시알산 또는 이의 유사체는 나노입자의 표면 상에 이격될 수 있어서 그들 또는 나노입자가 하나 초과의 Siglec 수용체에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시알산 또는 이의 유사체는 나노입자의 표면 상에 이격될 수 있고, 그에 따라 그들 또는 나노입자가 개별 세포 유형 상에 제시된 다수의 Siglec 수용체에 결합할 수 있으며, 이는 그들의 원형질막 상에 제시된 Siglec 수용체의 양에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 0.05 nmol/mg의 나노입자에 대한 시알산 내지 250 nmol/mg의 나노입자에 대한 시알산, 바람직하게는 나노입자 mg당 0.5 nmol/mg 내지 25 nmol/mg, 가장 바람직하게는 0.5 내지 15 nmol의 시알산 범위의 농도로 시알산을 포함하는 중합체를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 장치는 이러한 나노입자로 코팅될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 장치는 중합체로부터 형성될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 장치는 마이크로입자 또는 나노입자이며, 여기서 시알산은 0.05 nmol/mg의 나노입자에 대한 시알산 내지 250 nmol/mg의 나노입자에 대한 시알산, 바람직하게는 나노입자 mg당 1 nmol/mg 내지 25 μg/mg, 가장 바람직하게는 2 내지 15 nmol의 시알산 범위의 농도로 중합체에 제공된다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 약 1000 nm 미만, 약 500 nm 미만, 약 250 nm 미만 또는 약 200 nm 미만의 최대 단면 폭 또는 직경을 가질 수 있다. 실시형태에서, 나노입자는 약 1 nm 초과, 약 10 nm 초과, 약 50 nm 초과, 또는 약 100 nm 초과의 폭을 가질 수 있다. 실시형태에서, 시알산 또는 시알산 유사체로 코팅된 나노입자는 약 130 nm 내지 약 170 nm 범위의 최대 단면 폭 또는 직경, 보다 바람직하게는 약 150 nm의 폭을 가질 수 있다. 실시형태에서, 이러한 크기 범위는 나노입자의 평균 폭일 수 있다. 실시형태에서, 나노입자의 적어도 80%는 개시된 범위 내에 존재한다.
적합하게는, 일부 실시형태에서, 입자의 대략 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%는 130 nm 내지 170 nm의 최대 단면 폭을 갖는다. 실시형태에서, 입자는 150 nm의 평균 최대 단면폭을 가질 수 있고, 이때 입자는 150 nm의 하나의 표준편차 내에 있지 않은 값보다 크거나 작은 폭을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 10 nm 내지 500 nm, 적합하게는 50 nm 내지 250 nm, 또는 100 nm 내지 200 nm, 또는 130 nm 내지 170 nm 직경을 가진 구체의 부피와 동일한 부피를 가질 수 있다.
바람직한 비제한적인 실시형태에서, 나노입자는 직경이 약 100 nm인 구체와 동일한 부피를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 나노입자와 시알산 리간드의 연결은 나노입자가 면역계, 즉 세망내피계(RES: reticuloendothelial system)를 통한 옵소닌화 및 식균작용을 회피하는 수단을 제공한다. 나노입자의 페길화, 즉 폴리에틸렌 글리콜로 나노입자를 코팅하면 면역 세포에 의한 검출로부터 보호 장벽을 제공하는 것으로 알려져 있다. 그러나, PEG는 독성, 면역원성, 세포 흡수 감소, 결합 감소, 및 비생분해성 또는 생체흡수성 특성의 단점을 갖는다. 나노입자의 시알산 코팅은 PEG의 단점을 극복하고, RES 및 면역 검출을 회피할 수 있는 천연의 비면역원성 나노입자 코팅을 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 나노입자는 면역 검출을 회피하고 면역원성 반응을 감소시키는 능력을 갖는다.
본원에 개시된 나노입자 또는 마이크로입자는 상기 나노입자의 구조 내에 캡슐화되거나, 이의 표면에 부착되거나, 이에 통합된 생물활성제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 나노입자는 항생제, 항바이러스제, 항염증제, 사이토카인, 사이토카인 억제제, 면역조절제, 면역독소, 항혈관신생제, 항고혈압제, 항부종제, 방사선감작제, DNA 또는 RNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 항암제, 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 나노입자의 구조 내에 캡슐화되거나, 이의 표면에 부착되거나, 이에 통합된 생물활성제를 포함하는 나노입자를 제조하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 시알산 리간드 연결된 나노입자를 포함하는 약제학적 또는 수의학적 조성물을 추가로 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 양립 가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 유리체내, 경구, 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 정맥내, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 간내, 피하, 및 직장 투여를 포함한, 경구 투여 방법과 비경구 투여 방법 둘 모두를 포함한다:
적합하게는, 일부 실시형태에서 나노입자는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여 후, 나노입자는 특정 조직 또는 신체 위치에 선택적으로 축적될 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 세포 또는 조직에 치료용 페이로드(payload)를 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 강화된 투과성 및 보유 효과를 통해 병든 조직에 접근할 수 있다.
일반적으로, 약제학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 애쥬번트, 및/또는 담체와 함께 유효량의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 다양한 완충액 함량(예를 들어, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 첨가제, 예컨대 세제 및 가용화제(예를 들어, tween 80, polysorbate 80), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들어, 티메르솔, 벤질 알코올) 및 벌킹 물질(예를 들어, 락토스, 만니톨)을 포함한다. 이러한 조성물은 나노입자의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712]을 참조한다. 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나, 동결건조된 형태와 같은 건조된 분말로 제형화될 수 있다.
본 개시내용은 이러한 약제학적 조성물의 투여를 통해 피해를 입은 대상체에서 각 경우에 건성 및 습성 황반 변성, 망막 혈관 질환, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 낭포 황반 부종, 증식성 당뇨병성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 안구 건조증, 알레르기성 결막염, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 루푸스, 신염, 면역 복합체 신증, 알레르기성 식도염, 알레르기성 위염, 간염, 간 섬유성 질환, 특발성 폐 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 패혈증, 세균 및 바이러스 감염, 인플루엔자, SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2, HIV/AIDS, B군 스트렙토코커스 감염, 나이세리아 감염, 고형 장기 관련 암, 또는 조혈암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 및 염증-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 세포에서 염증 반응을 조절하는 방법을 제공하고, 방법은 시알산 또는 이의 유사체를 세포에 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 시알산 또는 유사체는 세포에서 염증촉진 반응이 억제되거나 세포에서 항염증 반응이 증가되도록 나노입자 상에 제시된다. 실시형태에서, 방법은 염증촉진 반응의 억제를 제공한다. 대안적인 실시형태에서, 방법은 항염증 반응의 증가를 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 감염 또는 암과 같은 상황에서 염증촉진 반응의 강화를 제공한다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 (1) 질환, 장애 또는 질병의 발병을 지연 또는 예방하거나; (2) 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상의 진행, 악화(aggravation) 또는 저하(deterioration)를 늦추거나 중단하거나; (3) 질환, 장애 또는 질병의 증상을 개선하거나; (4) 질환, 장애 또는 질병의 중증도 또는 발생률을 감소시키거나; (5) 질환, 장애 또는 질병을 치유하는 것을 목적으로 하는 방법 또는 프로세스를 특징으로 하도록 사용된다. 치료는 예방 또는 방지 조치를 위해 질환, 장애 또는 질병의 발병 전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 치료는 치료 작용을 위해 질환, 장애, 또는 질병의 개시 후에 투여될 수 있다.
투여 경로 및 질환에 따라, 유효 용량은 치료될 대상체의 체중, 체표면적(body surface area), 원발성 기관/종양 크기, 및/또는 전이의 수, 크기 및/또는 유형에 따라 계산될 수 있다. 적절한 투여량의 최적화는 인간 임상 시험에서 관찰된 약동학적 데이터를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 최종 투여 요법은 약물의 작용을 변형시키는 다양한 요인, 예를 들어, 약물의 특정 활성, 손상의 중증도 및 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 현재 감염의 중증도, 투여 시간, 다른 요법의 사용 (또는 사용하지 않음), 및 기타 임상적 요인을 고려하여 결정될 것이다.
일 양태에서, 염증촉진 반응은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%만큼 억제될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 항염증 반응은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 및 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99%만큼 증가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 염증촉진 반응의 억제 및 항염증 반응의 증가를 제공할 수 있다.
적합하게는, 염증촉진 사이토카인을 측정하여 나노입자 약물 치료의 효능을 결정될 수 있다. 이러한 측정은 대상체의 실제 치료 동안, 또는 대안적으로, 본원에 개시된 나노입자의 동물 실험 동안 이루어질 수 있다. 실시형태에서, 염증촉진 사이토카인은, 예를 들어, TNF-α 및 IL-6을 포함할 수 있다. 적합하게는, 항염증 사이토카인, 예를 들어, IL-10이 또한 측정될 수 있다. 당업자는 이러한 사이토카인을 측정하기에 적합한 검정 방법을 알 것이다. 예를 들어, Bio-Plex™ 사이토카인 검정(Bio-Rad)이 사용될 수 있다. 세포가 염증촉진 사이토카인을 더 많이 또는 적게 생산하는지 여부를 결정하기 위해, 사용할 수 있는 적합한 방법은 세포를 재현탁시키고 96웰 플레이트에서 2×105개 세포/ml 및 웰당 200 μl로 시딩하는 것이다. 이어서, 이들을 밤새 플레이트에 부착되도록 방치하고 농도 범위에서 24시간 동안 LPS 및 리간드로 처리할 수 있다. 이어서, 상청액을 제거하고 -70℃에서 보관할 수 있다. 이어서, 사이토카인 수준은 ELISA(R&D systems)에 의해 평가될 수 있다. 인식되는 바와 같이, 항염증 사이토카인을 결정하기 위해 유사한 방법을 적용할 수 있다.
일 실시형태에서, TNF-α 수준은 96웰 플레이트를 1×인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 TNF-α 포획 항체로 밤새 코팅함으로써 적합하게 결정할 수 있다. 모든 단계는 실온에서 수행할 수 있다. 웰은 1×PBS에 용해된 1% BSA(BDH)로 1시간 동안 차단하기 전에 1×PBS/0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween 20)에서 3회 세척될 수 있다. 세척 단계를 반복할 수 있고, 2000 pg/ml 내지 0 pg/ml 범위의 50 μl의 처리된 세포 상청액 또는 표준물질을 웰에 첨가하고 2시간 동안 방치할 수 있다. 이어서, 상청액을 흡인할 수 있고, 웰을 3회 세척하고, 1% BSA/1×PBS에 희석된 50 μl의 TNF-α 검출 항체를 2시간 동안 첨가할 수 있다. 다시, 웰을 3회 세척할 수 있고, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP: Horse Radish Peroxidase) 접합 항체를 20분 동안 1% BSA/1×PBS에 1/200 희석으로 첨가할 수 있다. 이 단계에서, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮을 수 있다. 웰이 세척되면 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 20분 동안 첨가하고, 다시 빛으로부터 보호할 수 있다. 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중단하고 450 nM에서 플레이트 판독기 상에서 흡광도를 판독할 수 있다. 이어서, 표준 곡선으로부터 TNF-α 농도를 외삽할 수 있다. 인식되는 바와 같이, 검출 항체 또는 적용 가능한 사이노카인에 특이적인 다른 제제를 TNF-α 검출 항체로 대체하여 다른 사이토카인 수준을 결정하기 위한 유사한 방법론을 적용할 수 있다.
일 실시형태에서, IL-10 수준은 96웰 플레이트를 1×인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 IL-10 포획 항체로 밤새 코팅함으로써 적합하게 결정할 수 있다. 모든 단계는 실온에서 수행할 수 있다. 웰은 1×PBS에 용해된 1% BSA(BDH)로 1시간 동안 차단하기 전에 1×PBS/0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween 20)에서 3회 세척될 수 있다. 세척 단계를 반복할 수 있고, 2000 pg/ml 내지 0 pg/ml 범위의 50 μl의 처리된 세포 상청액 또는 표준물질을 웰에 첨가하고 2시간 동안 방치할 수 있다. 이어서, 상청액을 흡인할 수 있고, 웰을 3회 세척하고, 1% BSA/1×PBS에 희석된 50 μl의 IL-10 검출 항체를 2시간 동안 첨가할 수 있다. 다시, 웰을 3회 세척할 수 있고, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합 항체를 20분 동안 1% BSA/1×PBS에 1/200 희석으로 첨가할 수 있다. 이 단계에서, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮을 수 있다. 웰이 세척되면 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 20분 동안 첨가하고, 다시 빛으로부터 보호할 수 있다. 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중단하고 450 nM에서 플레이트 판독기 상에서 흡광도를 판독할 수 있다. 이어서, 표준 곡선으로부터 IL-10 농도를 외삽할 수 있다. 인식되는 바와 같이, 검출 항체 또는 적용 가능한 사이토카인에 특이적인 다른 제제를 IL-10 검출 항체로 대체하여 다른 사이토카인 수준을 결정하기 위해 유사한 방법론을 적용할 수 있다.
치료된 대상체 또는 시험 동물이 더 크거나 더 적은 염증촉진 반응을 일으키는지 여부를 결정하기 위해, 사용될 수 있는 방법은 혈청 사이토카인 수준의 분석이다. 예를 들어, 이것은 모세관을 사용하여 치료 대상체로부터 50 μl의 혈액을 수집함으로써 달성될 수 있다. 이 혈액은 적혈구를 펠릿화하기 위해 1300 rpm에서 원심분리하기 전에 실온에서 30분 동안 응고되도록 한다. 혈청을 깨끗한 마이크로원심분리 튜브에 따르고 ELISA로 분석한다. 보다 광범위한 분석을 위해, 직접적인 심장 천자에 의해 더 많은 부피의 혈액(대략 600 μl-1 ml)을 채취하여 더 많은 부피의 혈청을 수집하고 ELISA 또는 기타 기술로 분석되게 할 수 있다. 치료된 대상체 또는 시험 동물이 더 크거나 더 적은 염증촉진 반응을 일으키는지 여부를 결정하기 위한, 특히 사이토카인을 검출하고 측정하기 위한 다른 적합한 기술들이 당업계에 알려져 있을 것이다.
나노입자가 제공되는 방법의 일부 실시형태에서, 세포 상의 Siglec 수용체에 결합하면 세포에 의한 염증촉진 사이토카인의 생성을 억제하고 항염증 사이토카인을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 실시형태에서, 세포 상의 Siglec 수용체에 대한 나노입자의 결합은 수용체의 활성화를 초래할 수 있고, 수용체 및 나노입자의 세포 내로의 내재화를 유도할 수 있다. 나노입자의 내재화 후에 세포에 의한 염증촉진 사이토카인의 생성은 억제될 수 있고/있거나 항염증 사이토카인의 생성은 증가될 수 있다.
따라서, 염증성 질환 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 시알산 또는 이의 유사체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 시알산 또는 유사체는 대상체에서 염증촉진 면역 반응이 억제되거나 항염증 면역 반응이 증가되도록 나노입자 상에 제시된다.
상기 방법은 염증촉진 면역 반응을 갖고/갖거나 염증촉진 면역 반응과 관련되거나 이에 의해 야기되는 장애를 앓고 있거나 염증촉진 면역 반응 발병 위험이 있거나 염증촉진 면역 반응과 관련되거나 이에 의해 야기된 장애를 앓고 있는 대상체를 확인하는 단계; 시알산 또는 이의 유사체를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 시알산 또는 유사체는 나노입자 상에 제시된 것인 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 폐의 염증성 및 비염증성 질병을 포함하지만 결핵, 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 폐 섬유증, 간질성 폐질환, 폐혈관 질환, 인플루엔자, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴, 알레르기성 기관지염, 비알레르기성 기관지염, 비염, 및 섬유성 폐포염에 한정되지 않는 폐 질환이 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 경화증(피부경화증), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군(sjogrens syndrome), 류마티스성 다발성 근육통, 통풍, 골관절염, 감염성 관절염, 및 소아 특발성 관절염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 류마티스 질환의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 셀리악병(celiac disease), 게실염, 위식도 역류, 유당 불내증, 소화성 궤양, 담낭염, 위염, 대장염, 췌장염, 자가면역 간염, 간염, 감염성 간염, 및 췌장염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 위장 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 패혈성 쇼크, 죽상동맥경화증, 이완기능 장애, 심부전, 심장 섬유증, 콕사키 심근염, 선천성 심장차단, 자가면역성 심근염, 거대 세포 심근염, 및 염증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 심혈관 질환의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 콩팥 이식 거부반응, 사구체신염, 급성 신염, 방광염, 전립선염 당뇨병성 신염, 당뇨병성 콩팥 질환, 및 요로 감염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 신장 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 피부염, 습진, 염증성 발진, 피부경화증, 켈로이드, 여드름, 유육종증, 완선(tinea cruris), 체부 백선, 족부 백선, 두부 백선, 조갑 백선, 주사비, 백반증, 경화 태선, 자가면역 두드러기, 피부근염, 및 화농성 한선염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 피부 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 신경척수염, 다발성 경화증, 뇌염, 신경 사르코이드증, 알츠하이머, 근위축성 측삭 경화증, 및 헌팅턴 무도병(huntingtons chorea)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 신경학적 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 당뇨병, SLE, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병(Addison's disease), 그레이브스병(Graves Disease), 하시모토 갑상선염(Hashimotos thyroiditis), 중증 근무력증, 자가면역 혈관염, 셀리악병, 악성 빈혈, 원형 탈모증, 자가면역 간염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 내이 질환(autoimmuneinner ear disease), 길랑 바레(Guillain barre), 가와사키병(Kawasaki disease), 램버트-이튼 증후군(lambert-eaton syndrome), 보그트-코야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome), 전신 혈관염, 거대 세포 동맥염, 유육종증, 및 결절성 다발동맥염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 자가면역 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 인플루엔자 A, B, C, SARS-CoV1, SARS-CoV2, 뉴캐슬병(Newcastle Disease), 센다이 바이러스(Sendai virus), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), HIV, 플라비바이러스(Flavivirus), 카클리바이러스(Caclivirus), 헤르페스바이러스(Herpes virus), 피코로노바이러스(Picoronovirus), 및 코로나바이러스(Coronavirus)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 바이러스성 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 진균혈증, 진균성 농양, 진균성 각막염, 칸디다증, 족부 백선, 및 완선을 포함하지만 이에 한정되지 않는 진균성 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 아메바증, 편모충증, 톡소플라즈마병, 및 톡소카라를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기생충 염증의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 간섬유증, 이완기능 장애 및 CHF를 동반한 심장 섬유증, 콩팥 섬유증, 망막 섬유증, 피부 섬유증, 및 흉터형성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 섬유성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 패혈증 및 사이토카인 폭풍 시알산을 포함하지만 이에 한정되지 않는 급성의 생명을 위협하는 염증의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 복수의 안구 염증성 질환, 예컨대 황반 변성, 포도막염, 시신경염, 신경척수염, 및 눈의 감염, 약물 및 독소로의 눈 노출로부터 발생하는 염증, 및 자가면역 장애를 포함한 일반적인 면역 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 비제한적인 실시형태에서, 환자에서 황반 변성, 예컨대 건성 황반 변성, 습성 황반 변성, 지리적 위축, 중간 황반 변성 및 연령-관련 황반 변성을 예방, 치료 또는 개선하는데 유용한 방법이 제공된다. 황반 변성을 포함한 안구 염증을 치료, 예방 또는 개선하는 방법은 시알산 리간드 나노입자의 조성물을 황반 변성과 같은 안구 염증을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 안과용 제제는 점안제, 안연고 또는 안과용 주사제로서 제공된다. 안과용 주사제의 경우, 유리체내 또는 결막하 주사를 사용하여 나노입자를 투여할 수 있다.
황반 변성을 치료, 예방 또는 개선하는 방법에 적용되는 추가 화합물의 공동 투여는 황반 변성을 치료하기 위해 사용되는 나노입자 함유 약제학적 조성물과 함께 공동 투여될 수 있다. 예를 들어, 페가프타닙 나트륨, 라니비주맙, 베바시주맙, 아플리브레셉트 및 브롤루시주맙과 같은 습성 연령-관련 황반 변성을 치료하기 위한 항혈관신생 약제를 조합하여 사용할 수 있다. 본 개시내용의 특정 실시형태가 도시되고 설명되었지만, 그의 더 넓은 양태에서 본 개시내용으로부터 벗어나지 않고 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 이러한 모든 변경 및 변형을 본 개시내용의 진정한 사상과 범위 내에 속하는 것으로써 그 범위 내에 포괄하고자 한다.
따라서, 제1 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 하기 구조식으로 표시되는 분자를 포함하는 입자이다:
Figure pct00008
.
제1 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드이고; G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이고; L은 공유 링커, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
제1 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 중합체 스캐폴드는 블록 공중합체 PLGA-PEG를 포함한다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제3 양태에서, P는 하기 구조식으로 표시된다:
Figure pct00009
상기 식에서, 기호
Figure pct00010
는 링커 L에 대한 중합체의 부착점을 나타내고, 추가로 여기서: x는 0 내지 20, 예를 들어, 0 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 20, 예를 들어, 0 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 1000, 예를 들어, 1 내지 500의 정수이고, n은 5 내지 450의 정수이고, 단 x 및 y는 동시에 0이 아니다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제4 양태에서, nG는 하기 구조식 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 표시된다:
Figure pct00011
상기 식에서, 기호
Figure pct00012
는 링커 L에 대한 G의 부착점을 나타내고, 추가로 여기서 중합도(DP)로도 알려진 p는 4 내지 198의 정수이다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제5 양태에서, p의 값은 하기 범위 중 어느 하나로부터 선택된다: 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 및 50 내지 60. 예를 들어, p의 값은 5 내지 25 또는 10 내지 20일 수 있다. 예를 들어, p의 값은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60일 수 있다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제6 양태에서, 링커 L은 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되고, 여기서 기호
Figure pct00013
는 G에 대한 링커 L의 부착점을 나타내고, 기호
Figure pct00014
는 P에 대한 링커 L의 부착점을 나타낸다:
Figure pct00015
(상기 식에서, R11은 -C(O)NH- 또는 -CH2-NH-C(O)-CH2-O-이고; R12는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X11)-(CH2)-1-10-, -N(X12)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X11은 H 또는 아세틸이고, X12는 H 또는 메틸임);
Figure pct00016
(상기 식에서, R21은 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-이고; R22는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X21)-(CH2)-1-10-, -N(X22)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NH-NH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X21은 H 또는 아세틸이고, X22는 H 또는 메틸임);
Figure pct00017
(상기 식에서, R31은 -(CH2)1-10-이고; R32는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X31)-(CH2)-1-10-, -N(X32)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X31은 H 또는 아세틸이고, X32는 H 또는 메틸임);
Figure pct00018
(상기 식에서, R41은 -(CH2)1-10-이고; R42는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X41)-(CH2)-1-10-, -N(X42)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X41은 H 또는 아세틸이고, X42는 H 또는 메틸임);
Figure pct00019
(상기 식에서, R51은 -(CH2)1-10-이고; R52는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X51)-(CH2)-1-10-, -N(X52)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X51은 H 또는 아세틸이고, X52는 H 또는 메틸임);
Figure pct00020
(상기 식에서, R61은 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-이고; R62는 부재이거나, -(CH2)1-10-O-(CH2)-1-10-NH-임);
Figure pct00021
(상기 식에서, R71은 -NHC(O)- 또는 -OCH2-C(O)NH-CH2-이고; R72는 -(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-임);
Figure pct00022
(상기 식에서, R81 및 R82는 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-임);
Figure pct00023
(상기 식에서, R91은 -NHC(O)- 또는 -OCH2-C(O)NH-CH2-이고; R92는 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-임);
Figure pct00024
[상기 식에서, R101은 H 또는 메틸이고; X10은 O 또는 NH이고; R102는 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
Figure pct00025
(상기 식에서, X101, X102, 및 X103은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
Figure pct00026
는 카르보닐 A에 대한 부착점을 나타냄)임];
Figure pct00027
[상기 식에서, R111 및 R111A는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고; X11 및 X11A는 각각 독립적으로 O 또는 NH이고; R11 및 R11A는 독립적으로 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
Figure pct00028
(상기 식에서, X111, X112, 및 X113은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
Figure pct00029
는 카르보닐 B 또는 카르보닐 B'에 대한 부착점을 나타냄)임];
Figure pct00030
[상기 식에서, X12는 -(CH2)1-10- 또는 -C(O)-(CH2)1-10-이고; R12는 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
Figure pct00031
(상기 식에서, X121, X122, 및 X123은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
Figure pct00032
는 카르보닐 C에 대한 부착점을 나타냄)임]; 및
Figure pct00033
[상기 식에서, X13은 -Ph- 또는 -CH2-Ph-CH2-이고, 여기서 Ph는 페닐이고; R13은 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
Figure pct00034
(상기 식에서, X131, X132, 및 X133은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-이고, 여기서 기호
Figure pct00035
는 카르보닐 D에 대한 부착점을 나타냄)임];
Figure pct00036
(상기 식에서, X14 및 X15는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고, A14 및 A15는 각각 독립적으로 NRA, NRANRB, O 또는 S이고, 여기서 RA 및 RB는 각각의 경우 독립적으로 H, C1-4 알킬 및 C6-C18 아릴로부터 선택되고; R14 및 R15는 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-임). 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제8 양태에서, 링커 L은 하기 구조식으로 표시된다:
Figure pct00037
상기 식에서, a는 2 내지 6의 정수이고; RA는 부재이거나, RA는 부재이거나, -(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NH-이다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제9 양태에서, P는 PLGA(10k)-PEG(5k)이다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제1 예시적인 실시형태의 제10 양태에서, P의 단위 중량당 G의 중량(리간드 밀도)은 0.5 μg/mg 내지 100 μg/mg이다. 예를 들어, 리간드 밀도는 10 내지 75 μg/mg 또는 10 내지 75 μg/mg일 수 있다. 다른 예에서, 리간드 밀도는 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 μg/mg일 수 있다. 제1 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제2 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 안과 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
제2 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 안과 질환은 건성 연령-관련 황반 변성, 습성 연령-관련 황반 변성, 비증식성 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 포도막염, 안구 건조증, 결막염, 갑상선 안병증, 안내염, 망막 변성, 녹내장, 망막 정맥 폐색, 안검염, 각막염, 안구 감염, 또는 백내장이다. 제2 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제2 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 길항제이다. 제2 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
제3 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 투여 경로는 정맥내, 유리체내, 경구, 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 또는 직장 중 하나 이상이다.
제3 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 염증성 질환은 결핵, 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 폐 섬유증, 간질성 폐질환, 폐혈관 질환, 인플루엔자, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴, 알레르기성 기관지염, 비알레르기성 기관지염, 비염, 또는 섬유성 폐포염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제3 양태에서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 경화증(피부경화증), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 통풍, 골관절염, 감염성 관절염 또는 소아 특발성 관절염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제4 양태에서, 염증성 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 셀리악병, 게실염, 위식도 역류, 유당 불내증, 소화성 궤양, 담낭염, 위염, 대장염, 췌장염, 자가면역 간염, 간염, 감염성 간염, 또는 췌장염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제5 양태에서, 염증성 질환은 패혈성 쇼크, 죽상동맥경화증, 이완기능 장애, 심부전, 심장 섬유증, 콕사키 심근염, 선천성 심장차단, 자가면역성 심근염, 또는 거대 세포 심근염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제6 양태에서, 염증성 질환은 콩팥 이식 거부반응, 사구체신염, 급성 신염, 방광염, 전립선염, 당뇨병성 신염, 또는 당뇨병성 콩팥 질환이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제7 양태에서, 염증성 질환은 피부염, 습진, 염증성 발진, 피부경화증, 켈로이드, 여드름, 유육종증, 완선, 체부 백선, 족부 백선, 두부 백선, 조갑 백선, 주사비, 백반증, 경화 태선, 자가면역 두드러기, 피부근염, 또는 화농성 한선염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제8 양태에서, 염증성 질환은 당뇨병, SLE, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 자가면역 혈관염, 셀리악병, 악성 빈혈, 원형 탈모증, 자가면역 간염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 내이 질환, 길랑 바레, 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 보그트-코야나기-하라다 증후군, 전신 혈관염, 거대 세포 동맥염, 유육종증, 또는 결절성 다발동맥염이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제9 양태에서, 염증성 질환은 신경척수염, 다발성 경화증, 뇌염, 신경 사르코이드증, 알츠하이머, 근위축성 측삭 경화증, 또는 헌팅턴 무도병, 횡단 척수염, 길랑 바레 증후군, 파킨슨병, 또는 양성 본태 떨림(benign essential tremor)이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제10 양태에서, 염증성 질환은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, SARS-CoV1, SARS-CoV2, 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 폴리오마바이러스, HIV, 플라비바이러스, 카클리바이러스, 헤르페스바이러스, 피코로노바이러스, 또는 코로나바이러스에 의해 야기된 바이러스성 질환이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제11 양태에서, 염증성 질환은 그람 음성균, 그람 양성균, 호기성균, 혐기성균, 또는 항생제 내성균에 의해 야기된 세균성 질환이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제12 양태에서, 염증성 질환은 진균혈증, 진균성 각막염, 칸디다증, 족부 백선, 또는 완선이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제13 양태에서, 염증성 질환은 아메바증, 편모충증, 톡소플라즈마병, 또는 톡소카라이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제14 양태에서, 염증성 질환은 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 간섬유증, 이완기능 장애 및 CHF를 동반한 심장 섬유증, 콩팥 섬유증, 망막 섬유증, 피부 섬유증, 및 흉터형성이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제15 양태에서, 염증성 질환은 패혈증, 사이토카인 폭풍, 또는 겸상 적혈구병(sickle cell disease)이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제3 예시적인 실시형태의 제16 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제이다. 제3 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제4 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
제4 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 암은 원발성 폐암, 전이성 폐암, 유방암, 결장암, 뇌암, 구강암, 식도암, 위암, 담도암, 간암, 횡문근육종, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 전립선암, 신세포암, 척추암, 신경모세포종, 신경내분비암, 안구암, 비인두암, 또는 피부암이다.
제4 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제이다. 제4 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제4 예시적인 실시형태의 제3 양태에서, 방법은 치료학적 양의 이필리무맙, 니볼리무맙, 페브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 또는 세미플리맙으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 제4 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제4 예시적인 실시형태의 제4 양태에서, 입자를 투여하는 단계는 방사선 요법과 동시에 또는 순차적으로 이루어진다. 제4 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제4 예시적인 실시형태의 제5 양태에서, 방법은 치료학적 양의 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 비노렐빈, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 블레오마이신, 다카르바진, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 에피루비신, 시스플라틴, 타목시펜, 탁소테레, Her2 neu 억제제, 항-VEGF 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, 소라페닙, 또는 mTOR 억제제로부터 선택된 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 제4 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제5 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다. 제5 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 암은 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종이다.
제5 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 방법은 치료학적 유효량의 다우노루비신, 시타라빈, 또는 이마티닙을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
제5 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 입자를 투여하는 단계는 줄기 세포 이식 또는 골수 이식과 동시에 또는 순차적으로 이루어진다. 제5 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다. 제6 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 감염성 질환은 B군 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 이. 콜리, 슈도모나스 아에루지노사, 나이세리아 메닌지티디스, 캄필로박터 제주니, 티르파노소마 크루지, HIV, 인플루엔자 A, B, 또는 C, Sars CoV1, Sars Co V2, 또는 헤르페스 비리다에에 의해 야기된다.
제6 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제이다. 제6 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태의 제3 양태에서, 방법은 치료학적 유효량의 자나미비르, 오셀타미비르, 발시클로비르, 아시클로비르, 또는 지도부딘 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 제5 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태의 제4 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 11과 동족이다. 제6 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태의 제5 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 9와 동족이다. 제6 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태의 제6 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 7과 동족이다. 제6 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제6 예시적인 실시형태의 제7 양태에서, 시알산 리간드는 Siglec 5와 동족이다. 제6 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제7 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 면역 세포를 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역 세포에서 세포-매개 염증 반응을 조절하는 방법이다.
제8 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 제8 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 PBS 완충액 또는 식염수를 포함한다.
제8 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 담체 중 입자의 농도는 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml이다. 제8 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제9 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 동결건조된 또는 냉동-건조된 입자를 포함하는 조성물이다.
제10 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 입자를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 불안정 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드 P를 제1 불안정 모이어티와 제2 불안정 모이어티의 부가물 L을 생성하기에 충분한 조건 하에 제2 불안정 모이어티를 포함하는 글리칸 G와 반응시켜 하기 구조식으로 표시되는 분자를 생성하는 단계를 포함한다:
Figure pct00038
상기 식에서, P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하고; G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이다.
제10 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아민, 카르복실산, 아지드, 알킨, TCO, 테트라진, DCBO, 및 디하이드라지드로부터 선택된다.
제10 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아지드, 알킨, 또는 테트라진으로부터 선택되고, 부가물 L은 알킨-아지드 부가물 또는 알킨-아지드 부가물을 포함하고, 여기서 부가물을 생성하기에 충분한 조건은 다음에 대한 조건이다: 구리(I)-촉매된 아지드-알킨 반응(CuAAC); 구리-비함유 아지드-알킨 반응; 변형-촉진된 아지드-알킨 반응(SPAAC); 테트라진-알켄 라이게이션 반응; 및 TCO-테트라진 반응. 제10 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제10 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, P는 PLGA-PEG 공중합체를 포함한다. 제10 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제11 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
제11 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 대상체는 과도한 보체 성분 C3, C3b를 생성한다.
제11 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 입자는 Siglec 11의 효능제이다. 제11 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제11 예시적인 실시형태의 제3 양태에서, 입자는 보체 인자 H에 결합한다. 제11 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
제12 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제1 예시적인 실시형태의 임의의 양태에 따른 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 보체 과다활성화 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다.
제12 예시적인 실시형태의 제1 양태에서, 투여 경로는 정맥내, 유리체내, 경구, 경구 세정(oral rinse), 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 직장, 관절내 중 하나 이상이다.
제12 예시적인 실시형태의 제2 양태에서, 보체 과다활성화 질환은 건성 및 습성 황반 변성, 발작성 야간 혈뇨증, 전신 홍반성 루푸스, 패혈증, 항인지질 증후군, 알츠하이머, 뇌졸중, 심근경색, 쇼크, 장기 이식 거부반응, 생체재료 이식 거부반응, COPD 악화, 치은염/치주 질환, 전신 염증 반응 증후군이다. 제11 예시적인 실시형태의 나머지 특징들 및 예시적인 특징들은 그 다양한 양태들에 대해 정의된 바와 같다.
합성 반응식
합성예 1
반응식 1
Figure pct00039
조건: i) 화합물 2(20 당량), 아세트산나트륨 완충액, r.t. 1시간; ii) 화합물 4(2 당량), 트리에틸아민(3 당량), DMF, r.t. 1시간; iii) 화합물 6(20 당량), H2O, r.t. 24시간
화합물 3: 플라스크에 화합물 1(1 당량), 링커 2(20 당량) 및 아세트산나트륨 완충액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 0.1 M 중탄산암모늄을 용리액으로서 사용하여 P2 바이오-겔 여과로 혼합물을 정제하여 화합물 3을 얻었다.
화합물 5: 화합물 3(1 당량), BCN-PNP 4(2 당량), 트리에틸아민(3 당량) 및 DMF를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. C18 컬럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 화합물 5를 얻었다.
화합물 7: 화합물 5(1 당량), H2O, 아지도 중합체 6(20 당량)을 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 크기-배제 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 화합물 7을 얻었다.
합성예 2
반응식 2
Figure pct00040
조건: i) 화합물 2(20 당량), 아세트산나트륨 완충액, r.t. 1시간; ii) 화합물 4(2 당량), 트리에틸아민(3 당량), DMF, r.t. 1시간; iii) 화합물 6(20 당량), H2O, r.t. 24시간
화합물 3: 플라스크에 화합물 1(1 당량), 링커 2(20 당량) 및 아세트산나트륨 완충액을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 0.1 M 중탄산암모늄을 용리액으로서 사용하여 P2 바이오-겔 여과로 혼합물을 정제하여 화합물 3을 얻었다.
화합물 5: 화합물 3(1 당량), BCN-PNP 4(2 당량), 트리에틸아민(3 당량) 및 DMF를 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. C18 컬럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 화합물 5를 얻었다.
화합물 7: 화합물 5(1 당량), H2O, 아지도 중합체 6(20 당량)을 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 크기-배제 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 화합물 7을 얻었다.
합성예 3
아미노알킬 또는 아미노 올리고-에틸렌글리콜과 같은 다양한 적절한 링커로 변형된 락토스는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다(Nat. Chem. 1, 611-622, 2009). 생성된 화합물은 미생물 또는 포유류 시알릴 트랜스퍼라제를 사용하여 폴리시알산(PSA)에 의해 연장될 수 있다(Glycobiology, 18, 177-186, 2008). 상기 변형된 락토스의 예는 하기 구조식으로 표시되는 것들이다:
Figure pct00041
.
링커의 아민은 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 같은 활성화된 에스테르를 갖는 중합체에 부착하기 위한 작용기를 제공한다(Chem. Rev. 2016, 116, 3, 1434-1495). 아민은 적절하게 작용화된 중합체에 부착하기 위해 다양한 작용기로 전환될 수 있다. 예를 들어, 아민은 아지도 전이 반응에 의해 아지드로 전환될 수 있으며(ACS Comb. Sci. 2013, 15, 7, 331-334), 이어서, BCN 또는 DBCO와 같은 사이클로옥틴에 의해 변형된 중합체와 접합될 수 있다(Accounts Chemical Research, 9, 805-815, 2011). 대안적으로, 아민은 이들 시약의 활성화된 에스테르 또는 카르바메이트를 사용함으로써 BCN 또는 DBCO 모이어티를 인스톨(install)하기 위해 사용될 수 있다. 생성물은 아지도 모이어티에 의해 변형된 중합체에 연결될 수 있다. 티올은 아민과 S-(2-브로모-2-옥소에틸) 에탄티오에이트의 반응에 이어 온화한 염기로 처리하여 인스톨될 수 있다. 이어서, 티올은 표준 조건을 사용하여 말레이미드 변형 중합체와 반응될 수 있다.
락토스 모이어티에 연결된 PSA를 생합성할 수 있는 미생물이 기재되어 있다(Richard et al. Glycobiology, 2016, vol. 26, no. 7, 723-731). 이 경우에, 적절하게 작용화된 중합체에 접합을 위해 적절한 링커가 부착될 필요가 있다. 이는 환원성 아민화 또는 적절하게 작용화된 하이드록실아민을 사용한 처리에 의해 달성될 수 있다(Glycobiology. 2006;16:21C-27C, and Chem. Commun., 2014, 50, 7132-7135). 이러한 방식으로, 활성 에스테르 작용화된 중합체로의 직접 접합을 위해 사용되거나 상기 기재된 바와 같이 유도체화될 수 있는 아미노기가 인스톨될 수 있다. 합성 반응식의 예를 아래에 나타낸다:
Figure pct00042
.
아미노기는 또한 미국 특허 제2015/0150997호에 기재된 바와 같이 비환원 말단에 인스톨될 수 있으며, 그 전체 교시는 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 제2015/0150997호에 기재된 바와 같이 요오드산나트륨을 사용한 PSA의 처리는 비환원성 말단에 환원성 아미노화(Bioconjug Chem. 2008; 19(7): 1485-1490) 또는 옥심 또는 하이드라존 라이게이션(Chem. Rev. 2017, 117, 15, 10358-10376, 및 Nat. Methods. 2009; 6(3): 207-209)을 통해 다양한 작용기(즉, 아민, 반응식 1 참조)를 인스톨하는 데 사용할 수 있는 알데히드를 인스톨한다. PSA의 비환원 말단 변형에 대해서는 하기 합성 반응식 3을 참조한다:
반응식 3
Figure pct00043
PSA는 또한 페닐렌디아민 유도체(Glycobiology, 2016, vol. 26, no. 7, 723-731)와의 반응에 의해 링커를 함유하는 아미노로 아노머 중심(anomeric center)에서 변형되어 아미노 말단을 갖는 형광 퀴녹살리논을 생성할 수 있으며, 이는 상기 언급된 화학을 통해 추가로 연장될 수 있다. 하기 반응식 4를 참조한다: PSA 화합물 1은 아미노 말단으로 작용화된 페닐렌디아민 2 유도체와 반응하여 NHS 작용화된 중합체와 같은 다양한 작용기에 의해 변형될 수 있는 형광체 3을 형성할 수 있다.
반응식 4: PSA의 환원 말단의 페닐렌디아민 변형
Figure pct00044
합성예 4
하기 반응은 트리아졸 연결을 통해 PSA와 중합체를 접합하는 데 사용될 수 있다.
반응식 5A
Figure pct00045
반응식 5B
Figure pct00046
반응식 5C
Figure pct00047
반응식 5A 내지 5C에 나타낸 각각의 반응에 대한 조건은 다음과 같다: CuSO4, THPTA, 아스코르브산.
합성예 5
하기 반응은 DBCO 연결을 통해 PSA와 중합체를 접합하는 데 사용될 수 있다.
반응식 6A
Figure pct00048
반응식 6B
Figure pct00049
반응식 6A 및 6B에 나타낸 각각의 반응에 대한 조건은 다음과 같다: H2O, r.t. 24시간.
합성예 6
하기 반응은 티오-말레이미드 연결을 통해 PSA와 중합체를 접합하는 데 사용될 수 있다.
반응식 7
Figure pct00050
추가 실시형태
특정 실시형태에서, 본 발명은 하기의 넘버링된 예시적인 실시형태에 의해 정의된다:
1. 입자로서,
생체적합성 중합체 스캐폴드; 및 스캐폴드에 공유 부착된 글리칸을 포함하고, 여기서 글리칸은 적어도 하나의 시알산 리간드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 시알산 리간드는 5개 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는, 입자.
2. 제1항에 있어서, 글리칸의 평균 분자량은 900 Da 내지 100,000 Da인, 입자.
3. 제1항에 있어서, 입자는 나노입자인, 입자.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 시알산 리간드 및 제1 시알산 리간드와 상이한 적어도 제2 시알산 리간드를 포함하는, 입자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Sigelc 1, Siglec 2, Siglec 3, Siglec 4, Siglec 5, Siglec 6, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 10, Siglec 11, Siglec 12, Siglec 13, Siglec 14, Siglec 15, Siglec 16, Siglec 17, Siglec E, Siglec F, 또는 Siglec H로부터 선택된 Siglec 수용체와 동족인, 입자.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 혈소판 면역글로불린유사 2형 수용체(PILR-알파 또는 PILR-베타), 혈소판 내피 세포 부착 분자(PECAM-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM) 및 바시긴(CD147)으로부터 선택된 수용체와 동족인, 입자.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 감염원으로부터 유도된 수용체와 동족인, 입자.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드의 생체적합성 중합체는 생분해성 중합체를 포함하는, 입자.
9. 제8항에 있어서, 생분해성 중합체는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 및 폴리(3-하이드록시부티르산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 입자.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드는 비생분해성 중합체를 포함하는, 입자.
11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 입자.
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드는 블록 공중합체 PLGA-PEG를 포함하는, 입자.
13. 제12항에 있어서, PEG 블록의 평균 분자량은 900 내지 50,000 Da인, 입자.
14. 제13항에 있어서, PEG의 평균 분자량은 1,000 Da 내지 5000 Da인, 입자.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 입자는 비구형이고, 평균 단면 폭이 적어도 50 nm 및 750 nm 이하인 입자.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 입자는 구형이고, 20 내지 2000 nm의 직경을 갖는, 입자.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 입자는 비구형이고, 입자의 평균 최대 단면 폭은 1 미크론 내지 5 미크론인, 입자.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 Neu5Ac 및 Neu5Gc 중 하나 이상을 포함하는, 입자.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 Neu5Ac 및 Neu5Gc 중 하나 또는 둘 모두의 시알산 중합체인, 입자.
20. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 글리코시드 α2-3, α2-6, α2-8, 또는 α2-9 결합에 의해 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착되는, 입자.
21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 DP5 내지 DP200의 중합도를 갖는 폴리사카라이드인, 입자.
22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 선형 또는 분지형 폴리사카라이드인, 입자.
23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 GlcNAc, GluNAc, GalNAc, ManAc, 푸코스 중 둘 이상의 폴리사카라이드이고, 여기서 폴리사카라이드는 시알산으로 말단화되는, 입자.
24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 제2 치료제를 추가로 포함하는, 입자.
25. 제27항에 있어서, 제2 치료제는 항체, 폴리펩티드, 지질, 소분자 또는 시알산 변형 세포로부터 선택되는, 입자.
26. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 입자의 nm2당 0.0001 내지 10개 분자의 밀도로 존재하는, 입자.
27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3 내지 16과 동족인, 입자.
28. 제27항에 있어서, Siglec 3 내지 16은 대식세포, 미세아교세포, 수지상 세포, NK 세포, 호중구, 다형핵 세포, T-세포 CD8, T-세포 CD34, 호염기성 세포, 비만 세포 및 호산구로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포 상에서 발견되는, 입자.
29. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 대식세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 9, 11, 12, 15 또는 16과 동족인, 입자.
30. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 단핵구이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 9, 10, 13 또는 14와 동족인, 입자.
31. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 수지상 세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 7, 또는 9와 동족인, 입자.
32. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 호중구이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 9 또는 14와 동족인, 입자.
33. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 자연 살해 세포(NK)이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 7과 동족인, 입자.
34. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 B 세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 5 또는 10과 동족인, 입자.
35. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 CD8+ T-세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 7 또는 9와 동족인, 입자.
36. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 CD34+ T-세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 9, 또는 10과 동족인, 입자.
37. 제28항에 있어서, 면역 세포는 호산구이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 7, 8, 또는 10과 동족인, 입자.
38. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 비만 세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 6, 또는 8과 동족인, 입자.
39. 제28항에 있어서, 면역 세포는 활성화된 호염기성 세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 6, 8, 또는 14와 동족인, 입자.
40. 제28항에 있어서, 면역 세포는 미세아교세포이고, 적어도 하나의 시알산 리간드는 Siglec 11과 동족인, 입자.
41. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 보체 조절 단백질(CCP) 영역 4 내지 6 및 19와 20에서 보체 인자 H와 동족인, 입자.
42. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 뉴라미니다제 또는 시알리다제의 억제제를 포함하는, 입자.
43. 제42항에 있어서, 뉴라미니다제 또는 시알리다제는 인플루엔자 A, B 또는 C 바이러스성 뉴라미니다제 또는 시알리다제인, 입자.
44. 제42항에 있어서, 뉴라미니다제 또는 시알리다제는 호흡기 상피 세포에서 발현되는 뉴라미니다제 또는 시알리다제인, 입자.
45. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 시알산 리간드는 바이러스성 캡시드 시알산 결합 부위와 동족인, 입자.
46. 제45항에 있어서, 바이러스성 캡시드 시알산 결합 부위는 인플루엔자 A, B, 또는 C 바이러스 상의 헤마글루티닌 에스테라제인, 입자.
47. 제45항에 있어서, 바이러스성 캡시드 시알산 결합 부위는 SARS-CoV1 또는 SARS-CoV2 바이러스의 스파이크 단백질의 숙주 부착/감염성 부위인, 입자.
48. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체는 PLGA-PEG 공중합체이고; 시알산 리간드는 하기 구조식으로 표시되는, 입자:
Figure pct00051
(상기 식에서, x는 0 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 500의 정수이고, n은 5 내지 450의 정수이고, p는 1 내지 200의 정수이며, 단 x 및 y는 동시에 0이 아님).
49. 면역 세포에서 세포-매개 염증 반응을 조절하는 방법으로서, 면역 세포를 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
50. 염증성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 제50항에 있어서, 투여 경로는 정맥내, 유리체내, 경구, 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 또는 직장 중 하나 이상인, 방법.
52. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 결핵, 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 폐 섬유증, 간질성 폐질환, 폐혈관 질환, 인플루엔자, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴, 알레르기성 기관지염, 비알레르기성 기관지염, 비염, 또는 섬유성 폐포염인, 방법.
53. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 경화증(피부경화증), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 통풍, 골관절염, 감염성 관절염 또는 소아 특발성 관절염인, 방법.
54. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 셀리악병, 게실염, 위식도 역류, 유당 불내증, 소화성 궤양, 담낭염, 위염, 대장염, 췌장염, 자가면역 간염, 간염, 감염성 간염, 또는 췌장염인, 방법.
55. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 패혈성 쇼크, 죽상동맥경화증, 이완기능 장애, 심부전, 심장 섬유증, 콕사키 심근염, 선천성 심장차단, 자가면역성 심근염, 또는 거대 세포 심근염인, 방법.
56. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 콩팥 이식 거부반응, 사구체신염, 급성 신염, 방광염, 전립선염, 당뇨병성 신염, 또는 당뇨병성 콩팥 질환인, 방법.
57. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 피부염, 습진, 염증성 발진, 피부경화증, 켈로이드, 여드름, 유육종증, 완선, 체부 백선, 족부 백선, 두부 백선, 조갑 백선, 주사비, 백반증, 경화 태선, 자가면역 두드러기, 피부근염, 또는 화농성 한선염인, 방법.
58. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 당뇨병, SLE, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 자가면역 혈관염, 셀리악병, 악성 빈혈, 원형 탈모증, 자가면역 간염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 내이 질환, 길랑 바레, 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 보그트-코야나기-하라다 증후군, 전신 혈관염, 거대 세포 동맥염, 유육종증, 또는 결절성 다발동맥염인, 방법.
59. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 신경척수염, 다발성 경화증, 뇌염, 신경 사르코이드증, 알츠하이머, 근위축성 측삭 경화증, 또는 헌팅턴 무도병, 횡단 척수염, 길랑 바레 증후군, 파킨슨병, 또는 양성 본태 떨림인, 방법.
60. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, SARS-CoV1, SARS-CoV2, 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 폴리오마바이러스, HIV, 플라비바이러스, 카클리바이러스, 헤르페스바이러스, 피코로노바이러스, 또는 코로나바이러스에 의해 야기된 바이러스성 질환인, 방법.
61. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 그람 음성균, 그람 양성균, 호기성균, 혐기성균, 또는 항생제 내성균에 의해 야기된 세균성 질환인, 방법.
62. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 진균혈증, 진균성 각막염, 칸디다증, 족부 백선, 또는 완선인, 방법.
63. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 아메바증, 편모충증, 톡소플라즈마병, 또는 톡소카라인, 방법.
64. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 간섬유증, 이완기능 장애 및 CHF를 동반한 심장 섬유증, 콩팥 섬유증, 망막 섬유증, 피부 섬유증, 및 흉터형성인, 방법.
65. 제50항에 있어서, 염증성 질환은 패혈증, 사이토카인 폭풍, 또는 겸상 적혈구병인, 방법.
66. 제50항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제인, 방법.
67. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
치료학적 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서, 암은 원발성 폐암, 전이성 폐암, 유방암, 결장암, 뇌암, 구강암, 식도암, 위암, 담도암, 간암, 횡문근육종, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 전립선암, 신세포암, 척추암, 신경모세포종, 신경내분비암, 안구암, 비인두암, 또는 피부암인, 방법.
68. 제67항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제인, 방법.
69. 제67항에 있어서, 치료학적 양의 이필리무맙, 니볼리무맙, 페브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 또는 세미플리맙으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
70. 제67항에 있어서, 입자를 투여하는 단계는 방사선 요법과 동시에 또는 순차적으로 이루어지는, 방법.
71. 제67항에 있어서, 치료학적 양의 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 비노렐빈, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 블레오마이신, 다카르바진, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 에피루비신, 시스플라틴, 타목시펜, 탁소테레, Her2 neu 억제제, 항-VEGF 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, 소라페닙, 또는 mTOR 억제제로부터 선택된 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
72. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 암은 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종인, 방법.
73. 제72항에 있어서, 치료학적 유효량의 다우노루비신, 시타라빈, 또는 이마티닙을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
74. 제72항에 있어서, 입자를 투여하는 단계는 줄기 세포 이식 또는 골수 이식과 동시에 또는 순차적으로 이루어지는, 방법.
75. 감염성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 감염성 질환은 B군 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 이. 콜리, 슈도모나스 아에루지노사, 나이세리아 메닌지티디스, 캄필로박터 제주니, 티르파노소마 크루지, HIV, 인플루엔자 A, B, 또는 C, Sars CoV1, Sars Co V2, 또는 헤르페스 비리다에에 의해 야기되는, 방법.
76. 제75항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제인, 방법.
77. 제76항에 있어서, 치료학적 유효량의 자나미비르, 오셀타미비르, 발시클로비르, 아시클로비르, 또는 지도부딘 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
78. 제77항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 11과 동족인, 방법.
79. 제77항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 9와 동족인, 방법.
80. 제77항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 7과 동족인, 방법.
81. 제77항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 5와 동족인, 방법.
82. 안과 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
83. 제82항에 있어서, 안과 질환은 건성 연령-관련 황반 변성, 습성 연령-관련 황반 변성, 비증식성 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 포도막염, 안구 건조증, 결막염, 갑상선 안병증, 안내염, 망막 변성, 녹내장, 망막 정맥 폐색, 안검염, 각막염, 안구 감염, 또는 백내장인, 방법.
84. 제82항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 길항제인, 방법.
85. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
86. 제85항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체는 PBS 완충액 또는 식염수를 포함하는, 약제학적 조성물.
87. 제85항에 있어서, 담체 중 입자의 농도는 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml인, 약제학적 조성물.
88. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 동결건조된 또는 냉동-건조된 입자를 포함하는 조성물.
89. 입자를 제조하는 방법으로서, 방법은
제1 불안정 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체인, 생체적합성 중합체 스캐폴드를
제1 불안정 모이어티와 제2 불안정 모이어티의 부가물을 생성하기에 충분한 조건 하에
적어도 하나의 시알산 리간드를 포함하는 글리칸으로서, 글리칸은 제2 불안정 모이어티를 포함하는 글리칸과 반응시키는 단계
를 포함하며,
여기서 시알산 리간드는 적어도 3개의 시알산 유도체를 포함하는, 방법.
90. 제89항에 있어서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아민, 카르복실산, 아지드, 알킨, TCO, 테트라진, DCBO, 및 디하이드라지드로부터 선택되는, 방법.
91. 제89항에 있어서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아지드, 알킨, 또는 테트라진으로부터 선택되고, 부가물은 알킨-아지드 부가물 또는 알킨-아지드 부가물로부터 선택되고, 여기서 부가물을 생성하기에 충분한 조건은 다음에 대한 조건인, 방법:
구리(I)-촉매된 아지드-알킨 반응(CuAAC);
구리-비함유 아지드-알킨 반응;
변형-촉진된 아지드-알킨 반응(SPAAC);
테트라진-알켄 라이게이션 반응; 및
TCO-테트라진 반응.
92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐폴드는 PEG 중합체를 포함하는, 방법.
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예시
시약에 대한 표:
Figure pct00052
설명된 검정에 사용된 모든 시약에 대한 부록
Figure pct00053
Figure pct00054
사용된 기기
Figure pct00055
약어
Figure pct00056
Figure pct00057
일반적인 방법:
I. 폴리시알산 리간드를 갖는 나노입자의 제조방법
1A. 나노입자에 대한 커플링을 위한 폴리시알산-아지드 리간드의 제조
폴리시알산-아지드 리간드(본원에서 PSA-N3로도 지칭되는 폴리시아-N3)는 말단 CMP-아지도-시알산 모이어티(CMP-아지도-시알산; R&D Systems)를 폴리시알산의 C2 아노머 하이드록실기(α2-8 Neu5Ac; 콜로민산 DP 약 150)에 접합시켜 제조할 수 있다. 이 접합은 정제된 인간 재조합 시알릴트랜스퍼라제 ST8SIA4(CMP-N-아세틸뉴라미네이트-폴리-알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제; R&D Systems)를 사용하여 수행하였다. 후속 폴리시아-N3은 폴리시알산 중합체 분자당 단일 클릭 화학-활성화 아지드 작용기를 제공할 수 있으므로 PLGA-알킨 나노입자 표면에 매우 특이적인 접합을 허용할 수 있다. 표적화된 클릭 화학의 사용은 Siglec-발현 세포에 제시하기 위한 폴리시아 리간드의 최적 3D 배향을 생성할 수 있으며 카르보디이미드 화학(즉, EDC-NHS)에 비해 상당히 우수한 합성 경로를 제공한다. 도 3은 폴리시알산-아지드 리간드(폴리시아-N3)의 제조를 위한 합성 반응식을 도시한다.
1B. DBCO-작용화된 PLGA 나노입자의 제조
폴리시알산 리간드가 부착된 코어 나노입자를 형성하는 DBCO-작용화된 PLGA 나노입자는 에멀젼 방법을 통해 제조될 수 있다. 코어 PLGA 나노입자는 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-카르복실산(PLGA-PEG-COOH; Nanosoft Polymers; MW 약 10,000:5,000 Da)와 폴리(락타이드-co-글리콜라이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-아지드(PLGA-PEG--디벤조-바이사이클로-옥틴(DBCO); Nanosoft Polymers; MW 약 10,000:5,000 Da)을 (PLGA-H):(PLGA-PEG-COOH+PLGA-PEG-DBCO)의 75:25 (w/w) 비율로 블렌딩하여 제조될 수 있다. 75:25의 비율은 50:50 또는 25:75로 변경될 수도 있다. PLGA-PEG-COOH:PLGA-PEG-DBCO의 비율은 나노입자 표면 상의 DBCO 기의 농도를 증가 또는 감소시키기 위해 변경될 수 있다. 선택된 비율은 나노입자 표면 상에 합리적으로 높은 밀도의 아지드 작용기를 제공하면서 작용기 사이에 충분한 공간을 허용하여 중합체 리간드의 효율적인 접합을 가능하게 한다.
나노입자 내로 형광 모이어티를 도입하기 위해, 중합체인 플루오레세인-PLA 또는 플루오레세인-PLGA가 사용되었다. 나노입자 제조에 사용된 총 중합체 중 플루오레신 중합체의 총 분율은 1 중량%였다. 후속 실험에서 블랭크 나노입자가 대조군으로 사용되었다. 이들 블랭크 나노입자는 상기 기재된 바와 같은 동일한 배치의 나노입자로부터 유래되었지만, 어떠한 PSA 리간드 접합도 적용되지 않았다.
1C. 나노입자 표면에서 유리 DBCO 기를 정량화하는 방법
나노입자 표면에서 유리 DBCO 기를 정량화하기 위해 분광형광 검정 방법이 사용될 수 있다. 방법은 표면에 DBCO 기를 갖는 제조된 나노입자에 아지드-작용화된 형광단(예를 들어, Cy3-N3)을 접합하는 것을 포함한다. 접합 후, 나노입자 용액을 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 용액의 형광을 측정한다. 나노입자 표면에서 사용 가능한 DBCO 기의 농도는 Cy-3을 사용하여 생성된 표준 곡선으로부터 결정된다.
1D-1. DBCO-작용화된 나노입자에 대한 PSA-N3 리간드의 접합
정제된 PSA-N3 리간드는 SPAAC 구리-비함유 클릭 화학 프로토콜을 통해 정제된 PLGA-DBCO 나노입자의 표면에 접합될 수 있다. 간단히 말해서, DBCO를 갖는 나노입자를 4℃ 또는 실온에서 또는 37℃에서 밤새 PSA-아지드와 함께 인큐베이션하였다. 접합 반응이 완료되면, TFF를 사용하여 나노입자를 세척하여 미반응 성분을 제거하고, MES 완충액을 PBS 또는 적절한 등장액, 예컨대 10% 수크로스로 대체한다. 이어서, 나노입자 용액을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과한다. 최종 PSA-접합된 PLGA 나노입자(PSA-PLGA NP)의 크기는 동적 광산란(DLS)에 의해 측정된다. PSA-PLGA 나노입자는 시알산 모이어티의 높은 음전하와 PEG-COOH 사슬의 존재로 인해 안정화되며, 이는 제타 전위 측정으로 확인할 수 있다. 최종 폴리시아-PLGA 나노입자 생성물은 4℃에서 1 mg/ml 농도로 PBS에 저장하거나, 후속 사용을 위해 -20℃에서 10% 수크로스에 저장할 수 있다. 최종 생성물인 PSA-PLGA 나노입자는 크기(DLS) 및 표면 전하(제타 전위 측정)에 대해 특성화될 수 있다.
1D-2. DBCO-작용화된 나노입자에 대한 PSA-N3 리간드의 접합
나노입자의 제조에 사용된 DBCO-PEG-PLGA 중합체의 분획을 사용하여 나노입자의 총 고체 mg당 존재하는 이 중합체의 양을 결정하였다. 정제된 PSA-N3 리간드는 SPAAC 구리-비함유 클릭 화학 프로토콜을 통해 정제된 PLGA-DBCO 나노입자의 표면에 접합되었다. 간단히 말해서, DBCO를 갖는 나노입자를 4℃ 또는 실온에서 또는 37℃에서 밤새 PSA-아지드와 함께 인큐베이션하였다. 나노입자에 존재하는 PSA-아지드 대 DBCO-PEG-PLGA의 비율은 중량 기준으로 0.75:1.0 내지 1:1의 범위였다. 접합 반응이 완료되면, TFF를 사용하여 나노입자를 세척하여 미반응 성분을 제거하고, MES 완충액을 PBS 또는 적절한 등장액, 예컨대 10% 수크로스로 대체하였다. 이어서, 나노입자 용액을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다. 최종 PSA-접합 PLGA 나노입자(PSA-PLGA NP)의 크기는 동적 광산란(DLS)에 의해 측정되었다. PSA-PLGA 나노입자는 시알산 모이어티의 높은 음전하와 PEG-COOH 사슬의 존재로 인해 안정화되며, 이는 제타 전위 측정으로 확인할 수 있다. 최종 PSA-PLGA 나노입자 생성물은 4℃에서 PBS에 저장하거나, 후속 사용을 위해 -20℃에서 10% 수크로스에 저장할 수 있다. 최종 생성물인 PSA-PLGA 나노입자는 크기(DLS) 및 표면 전하(제타 전위 측정)에 대해 특성화될 수 있다.
1Ε. 나노입자에 대한 폴리시알산(PSA)-함유 리간드의 접합 효율 결정.
나노입자 표면에 접합된 PSA-산 리간드의 밀도 결정 및 클릭 화학 반응 접합 효율은 본원에 기재된 나노입자를 최적화하는데 있어 핵심이다. 알킨 표면 작용기의 밀도는 나노입자의 표면에 접합될 수 있는 중합체 리간드의 최대 밀도를 좌우하는 경향이 있을 것이다. 접합된 폴리시아 리간드의 실제 밀도는 또한 폴리시알산(폴리시아)의 중합도(DP; 시알산 단위의 수)에 따라 달라질 것이다. 그러나, 음으로 하전된 시알산의 입체 효과 및 반발력은 표면 작용기의 완전한 접합을 방지할 수 있다. 접합 전에 나노입자 표면 알킨 작용기의 밀도를 결정할 필요가 있을 것이며, 이는 형광단-아지드 접합을 통해 달성될 수 있고 분광형광계를 사용하여 표준 곡선으로부터 정량화될 수 있다. 또한, 알킨 작용기 밀도는 잠재적으로 더 정확할 수 있는 X선 광전자 분광법(XPS) 맵핑에 의해 검증될 수 있다. 리간드 접합 전에 알킨기의 밀도를 정량화하고, 후속적으로 접합 단계 후 비접합된 리간드의 양을 정량화함으로써, PLGA 폴리시알산 시스템에 대한 클릭 화학 반응의 접합 효율이 계산될 수 있다.
추가로, 나노입자의 표면 상의 리간드 접합의 밀도를 결정할 필요가 있을 것이다. 리간드 밀도는 질소 탈착 방법을 통해 mg 기준 단위로 비접합된 나노입자의 전체 표면을 정량화함으로써 결정될 수 있으며, m2 또는 nm2로 주어진다. 나노입자를 폴리시알산 리간드와 접합한 후, 폴리시알산의 질량은 시차 주사 열량계(DSC) 및/또는 열중량 분석(TGA)에 의해 정량화될 수 있다. 폴리시알산의 질량을 분자 수로 변환(접합된 폴리시알산의 평균 분자량 사용)한 다음, 분자의 수를 나노입자 샘플의 주어진 질량의 총 면적으로 나누면 분자/nm2 단위의 폴리시알산 리간드 밀도가 산출된다. 특정 실시형태에서, 입자 상의 폴리시알산 리간드의 밀도는 0.1개 분자/nm2 내지 5개 분자/nm2이다.
1F. 나노입자에 대한 폴리시알산(PSA)-함유 리간드의 농도 결정
나노입자의 표면에 접합된 폴리시아의 농도는 사용 가능한 시알산 검정 키트에 의해 결정되었다. 시알산 분석 키트는 다양한 샘플에서 유리 시알산(주로 N-아세틸뉴라민산 또는 NANA)을 측정한다. 검출은 유리 시알산의 산화가 프로브와 화학량론적으로 반응하는 중간체를 생성하여 흡광도(OD = 570 nm) 또는 형광(Ex/Em = 535/587 nm)으로 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소 결합 반응에 기반한다. 키트는 약 1 μM 농도의 검출 감도로 0.1 내지 10 nmol의 선형 범위에서 시알산을 측정한다(참조: https://www.abcam.com/sialic-acid-nana-assaykit-ab83375.html). PSA의 농도는 나노입자의 총 중량 또는 나노입자의 mg당 PSA의 nmol로 정규화되었다.
II. 실시예 1: 예시적인 나노입자의 제조.
9개의 나노입자의 배치를 제조하였다. 표 2는 제조된 각 배치를 확인하고 각 배치의 제조에 대한 세부사항을 제공한다.
배치 AT-007 NP06을 제외하고, 에멀젼 방법으로 나노입자를 제조하였다. 나노입자 제조의 대표적인 예는 다음을 포함한다. PLGA(10k)-PEG(5k)-COOH 및 PLGA(10k)-PEG(5k)-DBCO를 3:1의 중량비로 칭량하고 유기 용매의 혼합물에 용해시켰다. 중합체의 농도는 유기 용매(59.5% 에틸 아세테이트 및 40.5% 벤질 알코올) 중에서 37 mg/mL였다. 10 mL의 중합체 용액을 물 중 0 또는 0.1% Tween 80으로 이루어진 40 mL의 수성 상에 첨가하고, 로터스테이터(Rotastator)를 사용하여 균질화하여 미정제 에멀젼을 형성하였다. 미정제 에멀젼을 미세유동화기를 사용하여 3회 통과시켜 미세 나노에멀젼으로 더 균질화하였다. 이어서, 나노에멀젼을 450 mL의 냉수에 첨가함으로써 켄칭하여 나노입자를 경화시켰다. 이어서, 켄칭된 나노입자 용액을 농축하고, 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 세척하여 유기 용매를 제거하였다. 알려진 부피의 나노입자 용액으로부터 물을 증발시킴으로써 중합체성 나노입자의 농도를 결정하였다. 이어서, 나노입자 용액 중 물을, TFF를 사용하거나 농축된 MES 완충액을 첨가하여 pH 5에서 50 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 수화물 완충액으로 대체하였다. 이어서, 나노입자 용액을 시알산(PSA-N3) 리간드에 접합하여 제조하였다.
나노입자 조성물에 대한 상세한 설명은 표 3에 제공된다. 나노입자를 특성화하였고 결과를 표 4에 나타낸다.
표 3: 나노입자 제조 단계
Figure pct00058
표 4: 나노입자 배치의 조성
Figure pct00059
주의:
1- 나노입자에 사용된 PLGA의 주요 특성은 문헌("Graner, J. et al., International Journal of Pharmaceutics; 495(2015) 87-92)에서 발견된 절차에 따라 결정될 수 있다.
2- NP06을 제외한 모든 제형은 실시예 1(I)에 따라 제조되었다; AT-007 NP06은 실시예 4(V)에 따라 제조되었다.
III. 실시예 2: 콜로민산(PSA-N3)에 대한 CMP-아지도-시알산의 효소 첨가
표 5: PSA-N3을 제조하는 프로세스에 대한 설명
Figure pct00060
IV. 실시예 3: SPAAC 화학을 통한 코어 DBCO 나노입자 표면에 대한 PSA-아지드 접합
상기 기재된 바와 같이 제조된 정제된 PSA-N3 리간드를 SPAAC 구리-비함유 클릭 화학 프로토콜을 통해 정제된 PLGA-DBCO 나노입자의 표면에 접합하였다. 간단히 말해, DBCO를 갖는 나노입자를 4℃ 또는 실온에서 또는 37℃에서 밤새 PSA-아지드와 함께 인큐베이션하였다. 접합 반응이 완료되면, TFF를 사용하여 나노입자를 세척하여 미반응 성분을 제거하고, MES 완충액을 PBS 또는 적절한 등장액, 예컨대 10% 수크로스로 대체하였다. 이어서, 나노입자 용액을 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과하였다.
표 6: SPAAC 화학을 통한 코어 DBCO 나노입자에 대한 PSA-아지드 접합에 대한 세부사항
Figure pct00061
표 7: 나노입자의 접합 후 처리
Figure pct00062
표 8: 접합 후 나노입자에 대한 세부사항
Figure pct00063
Figure pct00064
1- 나노입자의 크기는 하기 절차에 따라 결정된다: 문헌[Hackley VA, Clogston JD, NIST-NCL Joint Assay Protocol, PCC-1: Measuring the Size of Nanoparticles in Aqueous Media Using Batch-Mode Dynamic Light Scattering. https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols DOI:10.17917/3F5S-6728]
2- 폴리시알산 나노입자에서 시알산의 정량은 상기 방법 1F에 기재되고 아래에 자세히 설명된 NANA 검정을 사용하여 결정되었다.
3- 제타 전위는 하기 방법에 따라 결정되었다: 문헌[Clogston JD, Vermilya A, NCL Method PCC-2: Measuring Zeta Potential of Nanoparticles. https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols DOI: 10.17917/ZB8P-FB40]
구체적으로, PSA-NP 중 시알산 함량은 NANA 검정(NANA 검정 키트, Abcam으로부터의 ab83375)에 의해 결정되었다. NANA 검정은 유리 시알산(N-아세틸 뉴라민산 또는 NANA)을 측정하는 간단하고 편리한 방법이다. 검출은 유리 시알산의 산화가 흡광도(OD = 570 nm) 또는 형광(Ex/Em = 535/587 nm)으로 검출할 수 있는 중간 생성물을 생성하는 효소 커플링 반응을 기반으로 한다. 더 높은 감도를 보장하기 위해 나노입자 제형에서 시알산 함량을 정량화하기 위해 형광 검출을 선택하였다. NANA 검정에 대한 단계별 설명은 아래 표에 제공된다.
Figure pct00065
다음 식을 사용하여 시험 샘플에서 시알산 농도(nmol/μL)를 계산하였다.
Figure pct00066
상기 식에서,
CSA = 시알산의 농도(nmol/μL)
A = 샘플 웰에서 시알산의 양(nmol)
V = 웰에서 샘플의 부피(μL)
D = 샘플 희석 인자
시험관내 연구에 사용된 PSA-PLGA 배치
Figure pct00067
Figure pct00068
V . 실시예 4: 예시적인 나노입자의 추가 제조
에멀젼 방법으로 나노입자를 제조하였다. 나노입자 제조의 대표적인 예는 이하에 설명된다. PSA(Carbosynth로부터의 콜로민산)의 비환원 말단을 아지드기로 변형하였다(도 17 참조). 비환원 말단에 아지드기를 갖는 10 mg의 PSA를 0.6 mL의 DMSO에 용해시켰다. PSA-아지드 용액을 15 mg의 PLGA(10k)-PEG(5k)-DBCO(에틸 아세테이트:벤질 알코올의 유기 용매 혼합물에 용해)에 첨가하였다. 아지드-DBCO 클릭 화학 커플링을 통해 PSA-아지드가 PLGA-PEG-DBCO에 접합되도록 혼합물을 교반하고 밤새 혼합하였다. 밤새 혼합한 후, 285 PLGA(10k)-PEG(5k)-COOH를 이 반응 혼합물에 첨가하고, 용액이 시각적으로 투명해질 때까지 용액을 혼합/교반하였다.
유기 용매의 최종 부피는 60:40의 부피비로 2.43 mL의 에틸 아세테이트:벤질 알코올과 0.6 mL의 DMSO를 포함한 3.03 mL였다. 나노입자 내로 형광 모이어티를 도입하기 위해, 중합체인 플루오레세인-PLGA를 사용하였다. 나노입자를 제조하는 데 사용된 총 중합체 중 플루오레세인 중합체의 총 분율은 1 중량%로, 즉 3 mg의 PLGA-플루오레세인도 중합체 용액에 첨가하였다.
이 중합체 용액을 27 mL의 냉수(에틸 아세테이트로 포화됨)에 첨가하고, IKA T-18 로터스테이터를 사용하여 균질화하여 미정제 에멀젼을 형성하였다. 미정제 에멀젼을 미세유동화기(Microfluidics LM10)를 사용하여 3회 통과시켜 미세 나노에멀젼으로 더 균질화하였다. 이어서, 나노에멀젼을 270 mL의 냉수에 첨가함으로써 켄칭하여 나노입자를 경화시켰다. 이어서, 켄칭된 나노입자 용액을 농축하고, 접선 유동 여과(KR2i TFF, Repligen)에 의해 냉수를 사용하여 세척하여 유기 용매와 미반응 PSA-아지드를 제거하였다. 알려진 부피의 나노입자 용액으로부터 물을 증발시킴으로써 중합체성 나노입자의 농도를 결정하였다. 수크로스를 나노입자 용액에 10% wt/wt로 첨가하고, 0.2 μm Millipore 주사기 필터를 사용하여 여과하였다. 나노입자 용액을 -20℃에서 냉동시켰다.
나노입자의 크기는 Malvern Zetasizer를 사용하여 동적 광산란을 사용하여 측정하였다. 동적 광산란 기술은 크기를 측정하기 위해 브라운 운동(Brownian motion)으로 불리는 입자와 분자의 일정한 무작위 열 운동을 사용한다. 입자는 크기와 관련된 속도로 확산되며 더 작은 입자는 더 큰 입자보다 빠르게 확산된다. 확산 속도는 레이저로 입자를 조사하여 생성된 스페클(speckle) 패턴으로부터 측정된다. 특정 각도에서 산란 강도의 변동은 민감한 광 다이오드 검출기를 사용하여 검출된다. 강도 변화는 디지털 자동상관기로 분석하여 상관 함수를 생성한다. 이 곡선을 분석하여 입자의 크기와 크기 분포를 제공한다. 깨끗한 물을 사용하여 나노입자를 대략 0.1 내지 1.0 mg/mL의 농도로 희석하고 제타사이저(Zetasizer)에서 측정하였다. 생성된 각 값은 3개 판독치의 평균이었다. NANA 검정을 사용하여 PSA 리간드의 농도를 결정하였다. 콜로민산 또는 PSA 사슬은 산 가수분해 또는 시알리다제 효소를 사용하여 시알산 단량체로 가수분해되었다. 유리 시알산은 유리 PSA 또는 이 처리를 사용하여 나노입자에 접합된 PSA로부터 방출되고 가수분해되었다. 시알산 검정 키트(ab83375)는 PSA로부터 유리 시알산(주로 N-아세틸뉴라민산 또는 NANA)을 측정하는 데 사용되었다. 검출은 유리 시알산의 산화가 시알산 프로브와 화학량론적으로 반응하는 중간체를 생성하여 흡광도(OD = 570 nm) 또는 형광(Ex/Em = 535/587 nm)으로 검출할 수 있는 생성물을 생성하는 효소 결합 반응을 기반으로 한다. 검출된 시알산의 최종 농도는 시알산 표준물질의 검량선을 사용하여 결정된다.
나노입자의 총 고체 농도는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 알려진 양의 나노입자 용액을 칭량하여 결정하였다. 이어서, 용액을 냉동시키고, 동결건조시켰다. 동결건조된 나노입자 분말의 중량을 용액의 중량으로 정규화하여 수중 나노입자의 wt/wt 농도를 얻었다. 생성된 나노입자 제형은 총 고체 mg당 PSA의 ug을 계산하여 특성화되었다. 상기 실시예 2에 기재된 절차에 의해 제조된 나노입자에 대해, 접합 효율은 다음과 같이 결정하였다. PSA와 유기 상을 만드는데 사용된 총 고체(중합체 + PSA)의 비율이 계산되었다. 총 고체에 대한 PSA의 최종 비율은 NANA 검정 및 나노입자 용액의 동결건조를 사용하여 결정하였다(상기 설명됨). 전체 접합 효율은 다음과 같이 계산되었다:
Figure pct00069
.
VI. 실시예 5: 옥심 라이게이션 및 열적 가수분해에 의한 폴리시알산의 화학적 변형
1. PSA에 대한 옥심 라이게이션
일반적인 절차
1H 스펙트럼을 600 MHz Agilent DD2에 기록하였다. 화학적 이동 보정은 4.79 ppm에서의 물 잔류물 피크를 기준으로 사용하였다. NMR 데이터는 다음과 같이 표시된다: 화학적 이동, 다중성(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, dd = 이중선의 이중선, m = 다중선 및/또는 다중 공명, br. = 넓은 신호), J 커플링, 적분, 및 피크 동일성. 3b의 NMR 신호는 1H NMR, 13C-NMR, gCOSY, gHSQC, 및 HMBC 실험을 기반으로 할당되었다. 0.1 M 아세트산나트륨 완충액(pH=5)은 pH를 조정하기 위해 1 M 수성 HCl을 사용하여 탈기된 MilliQ 물에 아세트산나트륨을 용해시킴으로써 제조되었다. 시알산 올리고머는 Nacalai Tesque Inc.로부터 구입하였다.
옥심 라이게이션을 위한 일반적인 절차
합성 절차는 반응식 1에 도시되어 있다:
반응식 1
Figure pct00070
반응식 1. 옥심 라이게이션 화학을 통한 아미노 링커 작용화된 Neu5Ac(N-아세틸뉴라민산) 올리고머 3a-f의 합성.
화합물 1a-f(1 당량) 및 화합물 2(20 당량)를 0.2 mL NaOAc 완충액(0.1 M, pH = 5)에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 용리액으로 0.1 M NH4HCO3을 사용하여 P2 바이오-겔 크로마토그래피로 정제하였다. 분획은 ESI 및 TLC로 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 40℃에서 감압 하에 농축시키고 동결건조시켜 3a-f를 백색 고체로서 수득하였다.
합성된 화합물의 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼(이용 가능한 경우)은 아래에 제공된다:
화합물 1a(1.00 mg, 3.24 μmol) 및 화합물 2(4.92 mg, 64.80 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3a(1.10 mg, 3.00 μmol, 정량적 수율)를 합성하였다.
Figure pct00071
화합물 1b(1.00 mg, 1.55 μmol) 및 화합물 2(2.36 mg, 31.00 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3b(1.10 mg, 1.59 μmol 정량적 수율)를 합성하였다.
Figure pct00072
화합물 1c(1.00 mg, 1.04 μmol) 및 화합물 2(1.58 mg, 20.80 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3c(0.90 mg, 0.92 μmol, 88% 수율)를 합성하였다.
Figure pct00073
화합물 1d(2.00 mg, 1.57 μmol) 및 화합물 2(2.39 mg, 31.40 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3d(0.90 mg, 0.92 μmol, 59% 수율)를 합성하였다.
Figure pct00074
화합물 1e(1.00 mg, 0.63 μmol) 및 화합물 2(0.96 mg, 12.60 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3e(0.90 mg, 0.56 μmol, 89% 수율)를 합성하였다.
Figure pct00075
화합물 1f(4.00 mg, 2.11 μmol) 및 화합물 2(3.21 mg, 42.20 μmol)를 사용하여 일반적인 절차에 따라 화합물 3f(3.60 mg, 1.89 μmol, 90% 수율)를 합성하였다.
Figure pct00076
2. PSA의 열적 가수분해 및 이의 정제
콜로민산(20 mg)을 H2O(2 mL)에 용해시키고, 용액을 80℃에서 2.5시간 동안 교반한 후, 10K 스핀 필터(Nanosep 원심분리 장치, 4회)를 사용한 한외여과로 정제하였다. 상부 잔류물을 수집하여 "PSA-2.5h-장(long)"으로 표지하였다(도 18). 10 K 스핀 필터의 여액을 감압 하에 농축시켜 대부분의 용매를 제거하고, 3 K 스핀 필터(Nanosep 원심분리 장치, 4회)를 사용한 한외여과로 추가 정제하였다. 상부 잔류물을 수집하여 "PSA-2.5h-중(medium)"으로 표지하였다. 유사하게, 3 K 스핀 필터의 여과를 감압 하에 농축시켜 대부분의 용매를 제거하고, "PSA-2.5h-단(short)"으로 표지하였다. 3개의 분획을 동결건조시키고, D2O 중에서 1H-NMR로 분석하여 중합도(DP)를 결정하였다(도 19).
PSA-2.5h-장: 8.7 mg, 43.5% 수율(콜로민산으로부터), 평균 DP = 20.1, 평균 Mw = 5884(DP 값으로 계산됨); PSA-2.5h-중: 3.7 mg, 18.5% 수율(콜로민산으로부터), 평균 DP = 12.8, 평균 Mw = 3757(DP 값으로 계산됨); PSA-2.5h-단: 7.6 mg, 38.0% 수율(콜로민산으로부터), 평균 DP = 6.8, 평균 Mw = 2011(DP 값으로 계산됨).
3. 링커에 의한 PSA의 변형
도 18을 참조하여, PSA-2.5h-장/중/단(1 당량), 화합물 2(20 당량)를 0.2 mL NaOAc 완충액(0.1 M, pH = 5)에서 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 용리액으로서 0.1 M NH4HCO3을 사용하여 P2/P4 바이오-겔 크로마토그래피로 정제하였다. 분획은 ESI 및 TLC로 분석하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 40℃에서 감압 하에 농축시키고, 동결건조시켜 PSA-2.5h-장/중/단-링커를 백색 고체로서 수득하였다.
링커 라이게이션 전과 후의 화합물에 대한 1H-NMR 연구를 수행하였다. 주요 양성자 신호의 화학적 이동을 할당함으로써, 링커의 성공적인 도입을 확인하고 시알산의 링커 "CH2"와 아세틸 "CH3"의 적분 비율로 DP를 계산하였다.
다음의 링커-접합된 PSA 화합물을 수득하였다: PSA-2.5h-장(5 mg)을 출발 물질로서 사용하고, 생성물을 P4 바이오-겔 크로마토그래피로 정제하여 PSA-2.5h-장-링커를 수득하였다. (0.9 mg, 18.0% 수율, 평균 DP = 16.61, 평균 Mw = 4910); PSA-2.5h-중(3.7 mg)을 출발 물질로서 사용하고, 생성물을 P4 바이오-겔 크로마토그래피로 정제하여 PSA-2.5h-중-링커를 수득하였다. (1.6 mg, 43.2% 수율, 평균 DP = 13.33, 평균 Mw = 3955); 2.0 mg PSA-2.5h-단을 출발 물질로서 사용하고, 생성물을 P2 바이오-겔 크로마토그래피로 정제하여 PSA-2.5h-단-링커를 수득하였다. (1.3 mg, 65% 수율, 평균 DP = 5.17, 평균 Mw = 1580)
생물학적 실험 및 방법
마이크로입자의 배치는 표 4에서 발견된 확인에 기초하여 본원에서 언급된다.
I. 실시예 6: 선택된 표적에 대한 예시적인 나노입자의 친화도.
옥텟 검정은 바이오-층 간섭법(BLI: Bio-Layer Interferometry)이라 불리는 기술을 사용한다. 바이오-층 간섭법은 생체분자 상호작용을 측정하기 위한 비표지(label-free) 기술이다. 이는 바이오센서 팁에 고정된 단백질 층과 내부 기준층의 두 표면으로부터 반사되는 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기술이다(도 11a, 11b, 및 11c). 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 임의의 변화는 실시간으로 측정될 수 있는 간섭 패턴의 이동을 야기한다. 바이오센서에 결합하거나 바이오센서로부터 분리되는 분자만이 간섭 패턴을 이동시키고 Octet® 시스템에서 반응 프로파일을 생성할 수 있다. 결합되지 않은 분자, 주변 매질의 굴절률 변화 또는 유속 변화는 간섭 패턴에 영향을 미치지 않는다. 이것은 BLI의 고유한 특성이며 단백질 결합, 정량화, 친화도 및 동역학과 같은 단백질 응용 분야에 사용되는 미정제(crude) 샘플에서 수행되는 능력을 확장한다.
예시적인 나노미립자 및 상이한 Siglec 수용체의 친화도는 다음과 같이 옥텟 검정을 사용하여 측정하였다: 프로브 센서를 PBS + 1% BSA로 차단하였다. PBS 중 25 μg/mL의 농도로 Siglec 11, 9, 7 및 5에 특이적인 상이한 Siglec Fc 융합 단백질을 항인간 Fc 포획 항체 코팅된(AHC) 딥 및 판독 바이오센서를 사용하여 포획하였다. 프로브를 상이한 희석률의 분석물을 함유하는 웰에 침지했을 때 연관 곡선이 생성되었다. 분석물은 PBS 중 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160의 비율로 희석된 예시적인 나노입자 또는 리간드가 없는 나노입자였다. 프로브를 PBS에 침지했을 때 해리율(dissociation rate)(rate off)을 측정하였다. 25 μg/mL의 농도에서 항-인간 Fc 융합 단백질 및 Siglec 11, 9, 7 및 5를 포함하는 검정 완충액(1 × PBS) 중 상이한 농도의 예시적인 나노입자 사이의 결합 반응을 측정하였다. 그래프는 BLI 플랫폼에 결합된 양 대 시간(초)에 정비례하는 나노미터 이동에 의한 결합 반응을 나타낸다. 참고로, 완충액만 로딩된 센서를 사용하였다. 도 11a는 예시적인 나노입자와 Siglec 11 사이의 결합 친화도를 나타내고, 도 11b는 예시적인 나노입자와 Siglec 9 사이의 결합 친화도를 나타내고, 도 11c는 예시적인 나노입자와 Siglec 7 사이의 결합 친화도를 나타내고, 도 11d는 예시적인 나노입자와 Siglec 5 사이의 결합 친화도를 나타낸다. 결합 친화도는 또한 아래 표에 나타낸다.
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
II. 실시예 7: 말초 혈액 단핵구(PBMC)에 대한 예시적인 나노입자의 무독성 프로파일
예시적인 나노입자의 무독성 프로파일을 평가하기 위해 PBMC-유래 대식세포에 대한 MTT 검정에 의한 세포 생존율의 분석을 수행하였다. FITC로 표지된 예시적인 나노입자의 세포독성을 PBMC 세포에서 평가하였다. PBMC는 건강한 기증자로부터 얻었고, 48시간 동안 M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/ml, LPS 10 ng/ml 사용) 및 M2 표현형(hu IL-4-10 ng/ml 사용)으로 활성화되었다. 이어서, 세포를 50 내지 750 μg/mL의 예시적인 나노입자로 24시간 동안 처리하였다. MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 검정을 사용하여 세포 생존을 결정하였다. 대식세포(M0, M1, M2)를 각 웰에 100 × 103개 세포/200 μl 배지의 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 50 내지 750 μg/mL의 예시적인 나노입자 및 리간드가 결여된 대조군 나노입자와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 세척하고, 37℃에서 3 내지 4시간 동안 1 mg/mL 1의 MTT와 함께 인큐베이션하였다. 생성된 포르마잔 결정을 100 μl의 MTT 가용화 완충액에 용해시키고, Spectra iMax-플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 값을 대조군 세포와 비교하였다. 그래프는 대조군 미처리 세포와 비교할 때의 세포 생존율을 나타낸다. 도 12a는 예시적인 나노입자가 MTT 검정에 의해 입증된 바와 같이 말초 혈액 단핵구에 대해 무독성임을 반영한다.
III. 실시예 8: 대식세포에 대한 예시적인 나노입자의 무독성 프로파일
예시적인 나노입자의 무독성 프로파일을 결정하기 위하여, THP-1 단핵구 유래 대식세포에 대한 시험관내 세포독성 검정을 수행하였다. THP-1 세포를 각 웰에 100 × 103개 세포/200 ul의 밀도로 96웰 플레이트에 시딩하였다. THP-1 단핵구 분화된 대식세포를 50 내지 750 μg/mL의 예시적인 나노입자로 24시간 동안 처리하였다. 세포는 10 ng/mL 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 사용하여 분화되었고, 1 μg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS)를 사용하여 활성화되었다. 세포를 50 내지 750 μg/mL 용량의 예시적인 나노입자 및 리간드가 결여된 대조군 나노입자와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 세척하고, 37℃에서 3 내지 4시간 동안 1 mg/mL 1의 MTT와 함께 인큐베이션하였다. 생성된 포르마잔 결정을 100 μl의 MTT 가용화 완충액에 용해시키고, Spectra iMax-플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 값을 대조군 세포와 비교하였다. 그래프는 대조군 미처리 세포와 비교할 때 세포 생존율을 나타낸다. 도 12b는 예시적인 나노입자가 THP-1 유래 대식세포에 대해 무독성임을 보여준다.
IV. 실시예 9: 활성화된 대식세포에서 IL-10에 대한 예시적인 나노입자의 효과
인간 PBMC-유래 대식세포에서 IL-10 생성을 상향 조절하는 예시적인 나노입자의 능력은 다음과 같이 입증되었다: 건강한 기증자로부터의 PBMC를 M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/mL, LPS 10 ng/mL 사용) 및 M2 표현형(hu IL-4-10 ng/ml 사용)으로 48시간 동안 활성화시킨 다음, 75 μg/mL의 예시적인 나노입자 및 대조군 나노입자로 24시간 동안 처리하였다. 웰로부터 상청액을 수집하고, ELISA(R&D systems)에 의해 IL-10에 대해 검정하였다. 그래프는 리간드를 함유하지 않은 대조군 나노입자 및 비처리 대조군과 비교할 때 예시적인 나노입자로 처리한지 24시간 후 IL-10의 상향 조절을 나타내는 IL-10 단백질 수준을 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험 M1 대 M1-PSA-PLGA **p=0.0002, M1-PSA-PLGA 대 M1-블랭크-PLGA ***p=0.0008. 이들 결과를 도 24에 나타낸다.
V. 실시예 10: CFH 생성에 대한 예시적인 나노입자의 효과
인간 PBMC-유래 대식세포에서 보체 인자 H(CFH) 생성을 상향 조절하는 예시적인 나노입자의 능력은 다음과 같이 입증되었다: 건강한 기증자로부터의 PBMC를 M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/mL, LPS 10 ng/mL) 및 M2 표현형(hu IL-4-10 ng/mL)으로 48시간 동안 활성화시킨 다음, 75 μg/mL의 예시적인 나노입자 및 리간드가 결여된 대조군 나노입자로 24시간 동안 처리하였다. 웰로부터 수집된 상청액을 ELISA(Abcam)에 의해 CFH에 대해 검정하였다. 도 14a의 그래프는 리간드가 결여된 대조군 나노입자와 비처리 군을 비교할 때 예시적인 나노입자로 처리한지 24시간 후 CFH의 상향 조절을 나타내는 CFH 단백질 수준을 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험 M1 대 M1-PSA-PLGA **** p<0.0001, M2 대 M2-PSA-PLGA **p= 0.0032 M1-PSA-PLGA 대 M1-블랭크-PLGA ***p= 0.0001 M2-PSA-PLGA 대 M2-블랭크-PLGA **p=0.004
VI. 실시예 11: 인간 PBMC-유래 대식세포에서 보체 C3 수준을 감소시키는 예시적인 나노입자의 능력
건강한 기증자로부터의 PBMC는 M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/mL, LPS 10 ng/mL 사용) 및 M2 표현형(hu IL-4-10 ng/ml 사용)으로 48시간 동안 활성화시킨 다음, 75 μg/mL의 예시적인 나노입자 또는 리간드가 결여된 대조군 나노입자로 24시간 동안 처리하였다. 수집된 상청액을 ELISA(Abcam)에 의해 C3 수준에 대해 검정하였다. 도 14b는 결과를 나타내고 리간드가 결여된 대조군 나노입자 및 비처리 군과 비교하여 M0 및 M1 대식세포 상의 예시적인 나노입자로 처리한지 24시간 후 보체 C3 수준의 명확한 억제를 나타내는 보체 C3 단백질 수준을 반영한다. Sidak의 다중 비교 시험 M1-PSA-PLGA 대 M1-블랭크-PLGA **p=0.007.
VII. 실시예 12: AT-007-NP04 나노입자에 의해 매개된 보체 조절
보체 경로는 이펙터 막 공격 복합체를 통해 세포막의 비특이적 세포 용해를 초래하는 선천성 면역계의 중요한 구성요소이다. 캐스케이드는 고전적, 대체 및 렉틴 경로의 3개의 개별 경로를 통해 진행될 수 있다. 고전적 경로는 항체 또는 항체 복합체에 의해 유발된다. 대체 경로는 항시적으로 활성화되고, 비숙주 세포 또는 분자 패턴이 발생할 때 증폭된다. 렉틴 경로는 병원체의 세포벽에서 볼 수 있는 것과 같이 비자기 회합 당 잔류물이 발생할 때 활성화된다.
이러한 경로는 C3 컨버타제(C3bBb)의 형성인 속도 제한 단계를 공유한다. 비표적 세포 용해의 가능성 때문에, C3 컨버타제의 형성은 보체 인자 H(CFH)에 의해 엄격하게 조절된다. CFH는 이어서 자기 회합 분자 패턴(SAMP, 시알산)에 결합하는 그 능력에 의해 조절되어 CFH가 C3b에 결합하게 하고 Bb에 결합하는 그 능력이 감소되게 한다. CFH가 SAMP에 결합하지 않을 때, C3b는 높은 친화도로 Bb에 결합하여 숙주 및 병원체 세포 모두의 증식 및 증폭 막 공격 복합체 형성 및 세포 용해를 초래한다(도 28). 본 발명의 성질은 자기 회합 분자 패턴을 모방하기 위해 시알산 리간드를 제시하는 것이다. 아래에서 본 발명자들은 본 발명의 AT-007-NP04 나노입자가 CFH에 결합하고 활성화하여 이어서 C3b에 더 높은 친화도로 결합하고 C3b의 형성을 감소시키는 방법을 보여준다(도 29).
1. AT-007-NP04의 능력은 C3B에 대한 CFH의 결합을 강화시킨다
C3b에 대한 CFH 결합을 강화시키기 위해 AT-007-NP04 나노입자가 CFH에 결합할 수 있는지 결정하기 위해, Biacore 검정을 수행하였다. 본 실시예에서, C3b를 1600 RU에서 Fc2, 1450 RU, 950 RU에서 Fc3으로 고정화하였다. 검정은 완충액 단독을 사용하여 수행되었다. 200 nm(도 30a) 및 100 nM(도 30b)에서 인간 보체 인자 H 및 1:20 희석에서 인간 보체 인자 H+AT-007-NP04(실온에서 10분 동안 인큐베이션). AT-007-NP04를 CFH와 함께 인큐베이션하였을 때, C3B에 대한 CFH의 결합이 증가하였다. CFH에 의한 C3B의 결합은 CFH가 구조적으로 변경될 때 발생한다. 생체내에서 CFH는 구조적으로 CFH를 변경하고 C3B 결합을 강화시키기 위해 숙주 세포에 의해 제시된 자기 회합 분자 패턴에 결합해야 한다. 본 실시예는 AT-007-NP04가 숙주 세포가 부재 하에 자기 회합 분자 패턴으로서 거동하는 능력을 보여준다. 이것은 AT-007-NP04가 CFH를 활성화함으로써 보체 캐스케이드를 하향 조절할 수 있다는 직접적인 증거를 제공한다. AT-007-NP04가 없으면, CFH는 활성화되지 않으므로 C3B에 결합하지 않는다.
제1 실험의 설정은 하기 표에 제공된다:
Figure pct00082
본 실험에서, C3b를 Biacore 플레이트에 고정하고 AT-007-NP04를 포함하거나 포함하지 않는 보체 인자 H를 용액내로 관류시켜 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하였다. 도 30a의 그래프는 공명 단위(RU: resonance unit) 대 시간(센서그램)의 반응으로서 플롯팅된다.
제2 실험의 설정은 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00083
본 실험에서, C3b를 Biacore 플레이트에 고정하고 AT-007-NP04를 포함하거나 포함하지 않는 보체 인자 H를 용액에 관류시켜 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하였다. 도 30b의 그래프는 공명 단위(RU) 대 시간(센서그램)의 반응으로서 플롯팅된다.
2. 대체 또는 고전적 경로를 통해 보체 활성화를 직접적으로 방지하는 AT-007-NP06 나노입자의 능력
AT-007-NP06 나노입자가 대체 및 고전적 경로를 억제할 수 있는지를 결정하기 위해, 보체 활성화 검정은 AT-007-NP06 나노입자를 포함하거나 포함하지 않는 IgM(고전적 보체 활성화제), 자이모겐 및 LPS(둘 다 대체 보체 활성화제)와 함께 인큐베이션된 탈피브린화된(defibrinated) 혈청을 사용한다. 이 검정을 수행하기 위해, 플레이트를 1% BSA로 차단한 후 탈피브린화된 혈청, 자이모겐, LPS, 또는 IgM, +/- AT-007-NP06 나노입자 또는 수크로스와 함께 인큐베이션하였다. 3시간 인큐베이션한 후, 항-C3b 항체를 첨가한 다음, 1시간 후에 Strep HRP를 첨가하고, 이어서 20분 후에 플레이트 판독기로 판독한다.
본 검정의 결과는 자이모겐 및 LPS의 첨가가 AT-007-NP06 나노입자 및 자이모겐 및 IgM과 함께 인큐베이션하였을 때 C3b 형성에서 통계적으로 유의한 감소를 보였음을 보여주며, LPS 처리된 혈청은 경향을 보였지만, 주로 LPS 수크로스 아암이 보체 및 C3b 상향 조절을 유의하게 활성화할 수 없었기 때문에 통계적으로 유의하지 않았다.
이러한 특정 예는 AT-007-NP06 나노입자가 C3b 형성 방지를 통해 고전적 및 대체 경로 둘 모두에 대한 보체 증폭을 억제할 수 있음을 나타낸다. C3b 형성은 CFH의 직접적인 결합 표적이다.
실험의 설정은 도 31a에 나타내고(코팅된 플레이트 상에서 C3b 침착을 위한 탈피브린화된 혈청) 결과는 도 31b에 나타낸다.
전 실시예로부터 CFH를 갖는 AT-007-NP06 나노입자는 C3b에 대한 CFH의 결합을 증가시켰다. 이들 두 가지 예의 조합은 AT-007-NP06 나노입자가 C3b에 대한 CFH의 결합을 증가시켜 대체 또는 고전적 보체 경로에 의해 유발되는 c3b의 감소를 초래하는 능력을 보여준다.
3. CFH에 대한 AT-007-NP04 나노입자의 직접적인 결합의 입증.
AT-007-NP04 나노입자가 CFH에 직접 결합할 수 있는지 결정하기 위해, 본 발명자들은 플레이트를 His로 사전 코팅하고, CFH를 플레이트에 고정하는 인간 CFH His 태그 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, IC50과 용량 동역학 결합 관계를 계산할 수 있는지 결정하기 위해 상이한 농도의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커를 포함하는 AT-007-NP04 나노입자와 함께 플레이트를 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 항-PEG 비오틴과 함께 인큐베이션하고, 490 nm 흡광도에서 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하였다.
이 검정은 대략 2 mg/ml의 IC50을 갖는 S 결합 곡선을 입증하였다. 이러한 결과로 본 발명의 AT-007-NP04 나노입자가 용량 의존적 방식으로 인간 CFH에 결합하여 잠재적인 약제학적 및 치료학적 특성을 제공하는 능력을 확인한다.
CFH 단백질에 대한 AT-007-NP04 및 AT-007-NP06의 ELISA 기반 결합 친화도
His 태그 인간 CFH 단백질(1 ug/ml 농도) (Antibody Clone-카탈로그 번호-ABIN1079269)을 실온에서 밤새 니켈 코팅된 플레이트 ELISA(Thermo Fisher 카탈로그 번호 15142 피어스 니켈 코팅된 클리어 플레이트) 상에 코팅하였다. 이들은 ELISA 기반 방법으로 폴리히스티딘-태그된 융합 단백질(His 태그)을 분석하는 데 이상적이다. 아미노 또는 카르복실 말단에 여러 히스티딘 잔기를 연속적으로 함유하는 단백질은 금속에 강한 결합 친화도를 갖는다. 폴리히스티딘-태그된 융합 단백질을 함유하는 단백질은 플레이트에 직접 추가될 수 있다.
표준 제조업체의 ELISA 프로토콜 및 R&D Systems으로부터의 시약에 따라, His 태그-CFH 플레이트를 세척하고 AT-007-NP04(10 mg/ml 내지 0.001 mg/ml 범위의 농도) 및 AT-004-NP06(0.1 mg/ml 내지 0.001 mg/ml)의 총 고체의 나노입자(NP)를 실온에서 3시간 동안 첨가하였다. 나노입자 내의 PEG는 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 항 PEG 비오틴(재조합 비오틴 항-폴리에틸렌 글리콜 항체-Abcam ab53449)을 사용하여 검출하였다. 스트렙타비딘 HRP(1:40)를 사용하여 비오틴에 결합하고 발색 시약(color reagent) (R&D Systems)을 사용하여 현상하였다. 흡광도는 490 nm에서 측정하였다. 그래프는 AT-007-NP04가 블랭크 나노입자 대조군과 비교할 때 CFH 단백질에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타낸다는 것을 시사한다.
본 실험의 결과는 도 32a, 32b 및 도 32c에 제시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, AT-007-NP06 및 AT-007-NP04의 100 ug/ml(도 32a)의 최대 농도는 블랭크 나노입자와 비교할 때 CFH 단백질에 대한 결합 친화도에서 차이를 나타내지 않았다. 1 mg/ml(도 32b)의 최대 농도는 고농도의 블랭크 나노입자와 비교할 때 CFH 단백질에 대한 결합 친화도에서 유의한 차이를 나타내었다. AT-007-NP06의 10 mg/ml(도 32c)의 최대 농도는 블랭크 나노입자와 비교할 때 CFH 단백질에 대한 결합 친화도에서 유의한 차이가 있는 S자형 S 결합 곡선을 나타내었다.
VIII. 실시예 13: LPS-활성화된 대식세포에서 TNF-알파에 대한 예시적인 나노입자의 효과
LPS-활성화된 대식세포에서 TNF-알파에 대한 예시적인 나노입자의 효과의 효과를 다음과 같이 평가하였다: THP-1 세포를 각 웰에서 500,000개 세포/500 ul 배지의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩하였다. 세포는 10 ng/ml의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 사용하여 분화되었고 1 μg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS)를 사용하여 활성화되었다. 세포를 75 μg/mL의 예시적인 나노입자, 리간드가 결여된 대조군 나노입자와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고, ELISA(R&D systems)에 의해 Hu TNF-알파에 대해 검정하였다. 도 26은 결과를 반영하며, 그래프는 LPS 단독과 비교할 때 PSA-PLGA로 처리한지 24시간 후 LPS 활성화된 세포에서 TNF-알파 단백질 수준의 유의한 억제를 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험을 사용하여 PSA-PLGA LPS 처리된 및 블랭크-PLGA 및 LPS 사이에 **p=0.006 및 *p=.01.
IX. 실시예 14: LPS-활성화된 대식세포에서 VEGF 분비에 대한 예시적인 나노입자의 효과
LPS-활성화된 대식세포에서 VEGF 분비에 대한 예시적인 나노입자의 효과를 다음과 같이 평가하였다: THP-1 세포를 각 웰에서 500,000개 세포/500 μL 배지의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩하였다. 세포는 10 ng/mL의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 사용하여 분화되었고 1 μg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS)를 사용하여 활성화되었다. 세포를 75 μg/mL의 예시적인 나노입자, 리간드가 결여된 대조군 나노입자와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고, ELISA(R&D systems)에 의해 Hu VEGF 수준에 대해 검정하였다. 그래프는 LPS 단독과 비교할 때 PSA-PLGA로 처리한지 24시간 후 LPS 활성화된 세포에서 VEGF 단백질 수준의 유의한 억제를 나타낸다. Sidak의 다중 비교 시험을 사용하여 PSA-PLGA LPS 처리된 및 블랭크-PLGA 및 LPS 사이에 *p=0.01 및 p=.06. 도 15는 예시적인 나노입자가 LPS-활성화된 대식세포에서 VEGF 수준을 억제한다는 것을 반영한다.
약리학적 실험 및 방법
HALOS(Siglec에 대한 고친화도 리간드) 플랫폼은 그 표면이 천연 및 합성 변형된 시알산으로 장식된 폴리에틸렌-글리콜/폴리락트산-글리콜산 코어로 구성된 나노입자로 구성된다. 이러한 화학 구조의 배경 논리는 여러 가지이다. 첫째, 나노입자 코어는 면역 세포 상에 존재하는 Siglec 수용체에 대한 천연 및 합성 변형된 시알산을 제시하기 위한 안정하면서도 생분해 가능한 스캐폴드를 제공한다. 둘째, 상대적으로 높은 밀도의 이러한 리간드를 면역 세포에 제시하면 결합력의 강화, 즉 다수의 약한 상호작용을 통한 강한 세포 결합을 통해 항염증 신호전달의 효능을 증가시킬 것으로 여겨진다. 시알산의 천연 및 합성 변형은 표적화된 Siglec 수용체에 대한 개별 리간드의 친화도를 증가시켜 항염증 신호전달에 대한 나노입자의 효능을 또한 증가시키는 것을 목표로 한다.
본원에서 논의된 전략은 눈의 중증 만성 "해소되지 않은" 염증 및 모든 염증성 질환을 해결한다. 주어진 세포에서 염증 세포 또는 하나의 염증 경로에 의해 생성된 사이토카인을 차단하는 대신, 본 발명자들의 나노입자 제형은 활성화된 면역 세포 자연 차단 메커니즘을 활용한다. 이 차단 메커니즘은 자기-회합 분자 패턴(SAMP)을 자기-회합 패턴 인식 수용체(SPRR)에 결합시켜 결과적으로 면역 세포의 표현형을 염증촉진성으로부터 항염증성으로 전환시키는 것을 포함한다. 시알산 면역글로불린유사 렉틴(Siglec)에 의한 SPRR의 효능작용은 면역계의 선천성 염증 해소 메커니즘이다.
다른 사람들이 연구한 동물 시스템에서, 단쇄 시알산 중합체는 면역글로불린유사 렉틴 11(Siglec 11) 수용체에 결합하고(Karlsletter, 2017) IL-10과 같은 항염증 사이토카인을 상향 조절하고 반응성 산소 종(ROS: reactive oxygen species) 및 사이토카인 TNF-α, L-12 및 VEGF와 같은 염증촉진 신호를 하향 조절하는 생물학적 반응을 유도함으로써 염증을 약화시키는 것으로 보인다. Siglec 신호전달의 활성화는 궁극적으로 보체 대체 경로와 교차한다(Gao, 2015; Akhtar-Schafer, 2018; Cascella, 2014; Chan, 2014; Jager, 2007; Killingsworth, 1990; Kelly, 2007; Kauppinen, 2020; Zhou, 2017; Zhao, 2013).
본원에 기재된 접근법은 "해소 대식세포"로도 알려진 M2c형 대식세포로 이들을 전환시킴으로써 질환 동안 망막에서 광수용체 외부 분절을 식균하는 M1형 대식세포를 선택적으로 재분극하는 것이다(Lurier, 2017). 본 발명자들의 나노입자 제형의 투여 경로는 여러 염증성 질환에서 중증 만성/급성의 "해소되지 않은" 염증이 있는 환자에게 정맥내, 유리체내, 경구, 안내, 망막하, 피하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 경기관내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 또는 직장 중 하나 이상이다. 입자는 두 가지 방식으로 기능할 수 있다: (1) 보체 매개 염증 경로의 하향 조절 및 (2) 병리학에 기여하는 염증성 대식세포 재프로그래밍. 다른 사람들의 임상 및 실험적 증거는 이 두 경로가 연령-관련 황반 변성 및 기타 염증성 질환이 있는 환자에서 혼란스럽고 치료가 가능할 수 있음을 나타낸다. Neumann group(Karlsletter 2017)은 폴리시아가 a2-8 연결을 갖는 시알산 중합체임을 보여주었다. Siglec 11은 대식세포에 결합하는 것으로 알려져 있다. Siglec 11의 이러한 결합은 레이저 CNV 모델에서 폴리시아로 치료된 눈에서 입증된 눈의 대식세포, 단핵구 및 미세아교세포에 대한 항염증 효과를 제공한다. 이러한 동일한 모델에서, 혈관 누출도 항-VEGF 제제를 사용하는 것과 동일한 수준으로 약화되었다.
THP-1 세포주로부터 유래된 대식세포 및 정상 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 섬유세포 및 호중구로부터 유래된 대식세포(M1 및 M2)에서 상이한 제형 배치(예컨대 AT-007-NP01-06)에서 본원에 기재된 입자의 작용 메커니즘을 확인하기 위해 시험관내 약리학 연구가 수행되었다.
효소 결합 면역흡착 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)을 사용하는 이들 세포의 발현 패턴의 분석은 AT-007-NP01-06이 사이토카인의 생성, 세포 사멸, 섬유세포 분화 및 보체 인자 경로의 구성요소를 조절함을 시사한다.
두 가지 세포 유형인 (1) LPS-활성화된 THP-1 세포주(ATCC TIB-202™, Gaithersburg, MD) 및 (2) 1차 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; Stem Cell Research, 카탈로그 번호-70500.2), (3) PBMC 유래 호중구, (4) 단핵구 분화된 섬유세포로부터 유래된 대식세포에서 AT-007-NP01 내지 06의 항염증성 특성을 입증하기 위한 일련의 시험관내 연구는, 제형 번호로 확인된 하나 이상의 AT-007-NP01 내지 06 나노입자 제형을 사용하여 수행되었다(상기 표 4 및 8 참조).
표 9는 수행된 실험을 기술한다.
표 9
Figure pct00084
Figure pct00085
IX. 실시예 15: 생체외-약리학 연구
본원에 제시된 지원 연구는 85 ± 10세의 3개의 삼출성 및 비삼출성 AMD 눈(여성 기증자 1명 및 남성 기증자 2명)으로부터 얻은 망막-RPE-맥락막 복합체에서 Siglec 7, 9 및 11의 증가된 유전자 발현(qRT-PCR)을 나타낸다. 삼출성 AMD 기증자는 Siglec 7, 9 및 11 유전자 발현이 정상 기증자에 비해 각각 90배, 64배 및 58배 증가한 것으로 나타났다. 유사하게, 비삼출성 AMD 기증자는 Siglec 7, 9 및 11 유전자 발현이 정상 기증자에 비해 각각 77배, 32배 및 27배 증가한 것으로 나타났다. AMD가 있거나 없는 건강한 대상체로부터 단리된 망막-RPE-맥락막 복합체로부터의 본 발명자들의 유전자 발현 및 단백질 수준 데이터는 질환 상태에서 상향 조절을 보여 비삼출성 AMD 환자를 치료하기 위한 표적으로써의 본 발명자들의 Siglec 수용체의 선택을 더 뒷받침한다. 표 10은 결과를 요약한 것이다.
표 10
Figure pct00086
1. AT-007-NP04의 ELISA 기반 결합 친화도
Siglec Fc 7, 9, 11을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 항 PEG 비오틴/HRP 표준 제조업체의 ELISA 프로토콜(R&D Systems)을 사용하여 검출하였다. 흡광도를 490 nm에서 측정하였다. 그래프는 AT-007-NP04가 블랭크 NP 대조군에 비해 Siglec 7, 9 및 11에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타냄을 시사한다. 도 33을 참조한다.
THP-1 LPS-활성화된 대식세포의 유도
이러한 실험에 사용된 THP-1 세포는 백혈병이 있는 1세 소년으로부터 유래된 "단핵구유사" 세포주이다(Tsuchiya, 1980). 세포는 보체 3(C3) 및 Fc 수용체를 발현한다. 이들은 식세포(라텍스 비드와 감작된 적혈구 및 기타 둘 모두에 대해)이지만 표면 및 세포질 면역글로불린이 결여되어 있다. 세포는 미분화 상태에서 톨유사 수용체 효능제에 약하게 반응하지만 분화 후에는 더 반응한다. 세포는 20% 소 태아 혈청(FBS; Gibco, 10438026)이 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배양 배지에서 성장되었다. 초기 시딩 및 인큐베이션은 T-25 플라스크에서 2 내지 3일 동안 수행되었다. 사용 48시간 전에, 무혈청 RPMI에서 10 ng/mL, 포르볼 12-미리스테이트 12-아세테이트(PMA)로 THP-1 세포의 단핵구로의 분화를 유도하였다. PMA의 정확한 기능은 알려져 있지 않지만 원형질막의 내부 면에 삽입되어 단백질 키나아제 C 경로를 자극하는 신호전달 분자를 모방하는 것으로 여겨진다. 따라서, 일단 첨가되면 씻겨나갈 수 없으며 분화가 종결된다. 추가 48시간 후, 분화된 세포가 부착되었고 1 μg/mL 리포폴리사카라이드(LPS)로 활성화할 준비가 되었다. 세포는 SHP-1 인산화에 대한 웨스턴 블롯을 사용하여 생물활성에 대해 평가되었고 IHC를 사용하여 세포 결합에 대해 평가되었고, 상청액은 ELISA 기반 사이토카인 방출 검정에 사용되었다. (사용된 약어: PMA = 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; LPS = 리포폴리사카라이드.)
PBMC로부터 M1 및 M2 대식세포의 유도
THP-1 세포주로부터 유래된 대식세포 외에도, 본 발명자들은 신선한 팩 LeukopakR(Stemcell Technologies, Cambridge, MA)로부터 1차 인간 대식세포를 단리하였다. 1차 대식세포는 조직으로부터 충분한 양으로 단리하기 어렵고 배양시 증식하지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 "Easy 50" EasySep magnet™(Stemcell Technologies; Cambridge, MA) 세포 분리 방법을 사용하여 단일-기증자 유래 Leukopak로부터 단핵구를 단리하고 농축시켰다. 원하는 단핵구를 CD14+ 자성 비드로 농축시켰고 유세포분석을 사용하여 집단의 균질성을 확인하였다. CD14+ 농축된 세포를 냉동시켰다
사용 대략 6일 전에, 동결보존된 단핵구를 해동하고 50 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(MCSF: macrophage colony stimulating factor)를 포함하는 무혈청 ImmunoCult-SF™ 대식세포 분화 배지를 사용하여 250,000개 세포/250 μL로 24웰 플레이트에서 배양하였다. 배지를 사용하여 단핵구를 M1(고전적으로 활성화된) 및 M2a(대안적으로 활성화된) 대식세포로 분화시켰다. M1 세포는 LPS(10 ng/mL) 및 인터페론-감마(IFN-γ; 50 ng/mL)의 첨가에 의해 활성화되었다.
IL-4(10 ng/mL)를 첨가하여 M2 세포를 활성화하였다. 어떠한 활성화제도 첨가하지 않은 배지로부터 M0 세포를 얻었다. 세포는 SHP-1 인산화에 대한 웨스턴 블롯을 사용하여 생존율 및 생체활성에 대해 평가되었고 IHC를 사용하여 세포 결합에 대해 평가되었고, 상청액은 ELISA 기반 사이토카인 방출 검정 및 사이토카인 방출을 위한 블랭크 나노입자 대조군에 사용되었다.
2. Siglec 이펙터의 활성화: SHP1
초기 일련의 시험관내 약리학 연구는 AT-007-NP01 내지 06의 상이한 배치가 활성화된 대식세포에서 사이토카인 방출에 의해 측정된 바와 같이 생물학적 활성을 매개할 수 있음을 입증하였다. 활성화된 대식세포의 표면에 결합하는 AT-007-NP01 내지 06의 상이한 배치가 Siglec 결합과 일치하는 세포내 이펙터를 자극할 수 있는지를 결정하기 위해 보다 진보된 연구가 설계되었다. Siglec은 억제 또는 활성화되는 세포내 신호전달 도메인을 가지고 있다.
억제 도메인은 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM)로 알려져 있는 반면, 활성화 도메인은 면역수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)로 알려져 있다. Siglec은 인간과 비인간 영장류 사이에서 가장 상동성이며, 매우 다양하지만, ITIM 및 ITAM 모티프는 종에 걸쳐 보존되며 면역 세포에 대한 면역계의 공통적인 전체적 활성화 및 비활성화 스위치를 나타낸다. 리간드가 Siglec에 결합하면, ITIM이 활성화되고 이러한 변화는 Src 상동성 영역 2 도메인-함유 포스파타제-1,2(Src homology region 2 domain-containing Phosphatase-1,2)(SHP1, SHP2)를 동원한다.
SHP1 및 SHP2는 세포 신호전달, 성장 및 분화, 및 발암성 변형을 포함한 다양한 세포 프로세스를 조절하는 단백질 티로신 포스파타제(PTP)이다. SHP1 및 SHP2가 동원될 때, 그들은 활성 티로신 키나제, 특히 ITAM에서 발견되는 티로신 키나제를 탈인산화한다.
일련의 웨스턴 블롯 실험은 AT-007-NP02가 대식세포에서 Siglec을 효능작용하고 결과적으로 골수 세포에서 SHP1 및 SHP1에 의해 조절되는 주요 신호전달 경로의 동원을 중재하는지 여부를 평가하도록 설계되었다. 대식세포와 단핵구에서 SHP1에 의해 영향을 받는 일부 신호전달 경로에는 ITAM 수용체-매개 신호전달 및 TLR 및 사이토카인 수용체를 통한 신호전달의 음성 조절을 약화시키기 위한 ITIM-함유 단백질에 의한 SHP1의 동원이 포함된다(Abram, 2017). 단백질은 겔 전기영동에 의해 분해되고, 블롯팅되고, 내부 대조군으로서 SHP-1 및 베타 액틴으로 염색되었다. 결과는 M1 활성화된 대식세포에서 AT-007-NP02로 처리한 후 SHP-1을 동원한다는 것을 나타냈으며, 이는 AT-007-NP02가 염증 반응을 억제하는 효능제 역할을 한다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 AT-007-NP02 구성체가 THP-1 세포주로부터의 1차 PBMC-유래 M1형 및 LPS-활성화된 대식세포에서 Siglec 경로의 효능제라는 확신을 제공한다.
세포 결합
AT-007-NP-03은 활성화된 THP-1 인간 단핵구 세포주(THP-1) 세포주 및 PBMC 1차 세포로부터 유래된 대식세포에서 결합을 조사하기 위해 사용되었다. 대식세포를 RPMI 무혈청 분화 배지(THP-1 세포용) 또는 PBMC-유래 대식세포용 대식세포 콜로니 자극 인자(MCSF)(50 ng/mL)가 있는 ImmunoCult-SF 대식세포 역분화 배지에서 24시간 동안 챔버 슬라이드에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 AT-007-NP-03(75 μg/mL) 또는 FITC-접합된 블랭크-NP로 37℃에서 최대 24시간의 시간 동안 5% CO2로 처리하였다. 결과는 AT-007-NP03으로 처리된 세포가 활성화된 세포 표면의 클러스터에서 AT-007-NP03 결합 및 공동국소화(colocalization)를 나타내는 밝은 녹색 점상 형광 염색을 나타내는 반면, 블랭크 NP는 모든 대식세포 세포에 비특이적으로 결합하는 것으로 나타남을 시사하였다. 데이터는 FITC-접합된 AT-007-NP03 나노입자가 세포에 통합되지 않고 외막에 부착됨을 시사하였다. AT-007-NP03과 대식세포의 명백한 연관성은 특이적으로 보였다. 리간드가 없는 블랭크-NP는 세포와 회합하지 않았다. 이러한 결과는 AT-007-NP03에 의해 제시된 AT-007 리간드 PSA 단독이 이들 활성화 대식세포의 막 상의 요소와 회합한다는 것과 일치한다.
사이토카인 방출에 대한 AT-007-NP의 효과
대식세포에 대한 Siglec 결합을 통한 AT-007-NP의 상이한 제형의 생체 활성은 활성화된 대식세포로부터의 사이토카인 방출을 측정함으로써 조사되었다.
3. AT-007에 대한 나노입자의 접합은 염증촉진 사이토카인 반응을 억제한다
THP-1 세포는 10 ng/mL의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)를 사용하여 분화되고 1 μg/mL의 리포폴리사카라이드(LPS)를 사용하여 활성화되었다. 세포를 75 μg/ml 용량의 AT-007-NP02 및 AT-007 및 블랭크 NP에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 상청액을 수집하고, ELISA(R&D systems)에 의해 Hu TNF-알파에 대해 검정하였다. 도 20에 나타낸 그래프는 AT-007 단독과 비교할 때 AT-007-NP02로 처리한지 24시간 후 LPS 활성화된 세포에서 TNF-알파 단백질 수준의 유의한 억제를 나타낸다 *p=0.05. 아래 그래프는 AT-007(PSA 단독의 존재가 대식세포에서 LPS 처리 후 TNF-a 반응을 억제하기에 충분하지 않다는 것을 보여주며, 이러한 세포에서 생물학적 반응을 증가시키기 위해 리간드를 NP에 접합시키는 것에 대한 뒷받침하는 증거를 추가한다.
4. AT-007-NP04는 활성화된 M1 대식세포에서 항염증 매개체 IL-10의 유의한 상향 조절을 입증하였다
PBMC는 건강한 기증자로부터 얻었고, M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/mL, LPS 10 ng/mL)으로 활성화되었다. 세포를 LPS(100 ng/ml)와 함께 일련의 용량 범위의 AT-007-NP04, 수크로스(비히클 대조군)로 밤새 처리하였다. 처리 후, 상청액을 수집하여 ELISA(R&D systems, 제조 지침을 따름)에 의해 IL-10에 대해 검정하였다. 도 21에 나타낸 그래프는 LPS 처리된 것과 비교할 때 AT-007-NP04로 처리한지 16시간 후 항염증성 매개체 IL-10의 용량 의존적 증가를 나타내는 단백질 수준을 나타낸다.
5. AT-007-NP06은 활성화된 M1 대식세포에서 염증촉진 매개체 IL-6, TNF-a의 유의한 하향 조절을 입증하였다
PBMC는 건강한 기증자로부터 얻었고, M1 표현형(Hu IFN-y 50 ng/mL, LPS 10 ng/mL)으로 활성화되었다. 세포를 LPS(100 ng/ml)와 함께 일련의 용량 범위의 AT-007-NP06, 블랭크 NP로 밤새 처리하였다. 처리 후, 상청액을 수집하여 TNF-a(도 22a) 및 IL-6(도 22b)에 대해 ELISA(R&D systems)에 의해 검정하였다. 도 22a 및 도 22b에 나타낸 그래프는 블랭크-NP와 비교할 때 AT-007-NP06으로 처리한지 16시간 후 0.4 mg/ml 내지 2.1 mg/ml 용량에서 염증촉진 매개체 IL-6 및 TNF-a의 하향 조절을 나타내는 단백질 수준을 나타낸다. 터키(turkey) 다중 비교 사용 ***p=.0005, ****p<0.0001, *p<0.03.
인간 IL-10, TNF-α, IL-6의 방출을 ELISA로 정량하였다. 모든 검정은 세포를 활성화 배지에서 밤새 인큐베이션하고 상이한 농도의 AT-007-NP06 및 AT-007-NP04에 노출시킨 후에 수행하였다. 데이터에는 나노입자의 생물학적 활성을 조사하기 위한 다양한 AT-007-NP06 제형 및 용량이 포함된다. 데이터는 PSA의 환원 말단이 분화된 M1 대식세포에 제시되는 제형 AT-007-NP06이 생체내 재생 대식세포의 특징인 반응을 유발하고 잠재적으로 질환의 염증성 캐스케이드를 약화시키고 항염증 반응을 증가시키는 데 유용할 수 있음을 나타낸다.
보체 구성요소는 숫자(C1-C9) 또는 문자 기호(예를 들어, 보체 인자 H, FH)로 지정된 약 30개의 혈장 및 막 관련 혈청 단백질의 복잡한 네트워크를 구성하며, 이는 계층적 단백질분해 캐스케이드로 구성된다. 보체 시스템의 활성화는 3개의 단백질분해 캐스케이드, 즉 고전적, 렉틴 및 대체 경로를 포함하며, 이는 모든 보체 경로의 수렴 지점인 C3 컨버타제의 활성화로 이어진다. 보체 인자 H는 또한 RPE에 의해 국부적으로 생성되며 C3 컨버타제 붕괴에 기여하여 C3b 침착의 증폭을 방지한다(Geerlings, 2016). 여러 증거는 보완적 조절장애, 특히 대체 경로가 AMD의 발병 기전에 관여한다는 것을 보여주었다. 보체 시스템의 과도한 활성화는 노화, 흡연 및 산화 스트레스와 같은 AMD 병인에 기여하는 여러 요인과 관련이 있다. Nozaki 등(2006)은 보체 경로의 국소 활성화를 시사하는, 보체 구성요소를 드루젠(drusen)의 구성요소로서 확인한 면역 조직학 및 단백질학 연구에 의해 이 사실을 뒷받침했다. Scholl과 많은 다른 사람들은 AMD 환자의 말초 혈액에서 보체 활성화 동안 방출되는 활성화된 보체 성분의 수준이 상당히 증가한다는 것을 보여주었다(Scholl, 2008).
C3b를 Biacore 플레이트에 고정화하고 AT-007-NP06을 포함하거나 포함하지 않는 보체 인자 H를 용액에 관류시켜 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하였다. 도 32b에 나타낸 그래프는 공명 단위(RU) 대 시간(센서그램)의 반응으로서 플롯팅된다. 결과는 C3b에 결합하는 보체 인자 H에 대한 AT-007-NP04의 강화된 효과를 입증한다.
표 11은 실험 설정을 보여준다.
표 11
Figure pct00087
수크로스 대조군과 비교하여 AT-007-NP06으로 공동처리된 플레이트 상의 감소된 C3b 침착
많은 보체 단백질은 단백질분해 절단에 의해 활성화되는 프로테아제이다. 이러한 단백질은 자이모겐이라 불린다. 전구체 자이모겐은 몸 전체에 분포하며 감염 부위에서 활성화된다. 이러한 자이모겐은 완전한 보체 시스템을 활성화시킨다. 본원에 기재된 연구에서, 보체 활성화는 고전적 경로 활성화를 위한 면역글로불린 IgM, 대체 보체 활성화를 위한 LPS 및 보체 활성화를 위한 양성 대조군으로서 자이모겐에 의해 탈피브린화된 혈청에서 유도되었고, PBS는 대조군으로 사용되었다. 보체 활성화를 정량화하기 위해 추가 C3b 침착을 효소 결합 면역흡착 검정으로 분석하였다(Karlstetter, 2017). 터키 다중 비교 시험은 활성화제 보체 경로 자이모겐 및 IgM 둘 모두에 대해 수크로스와 AT-007-NP06 사이의 유의성 ****p-<0.0001을 보여주었다.
도 33a는 실험 설정의 개략도를 나타낸다. 도 33b는 수크로스 대조군과 비교하여 AT-007-NP06으로 공동 처리된 플레이트 상에서 감소된 C3b 침착을 보여주는 막대 플롯을 나타낸다.
X. 실시예 16: 생체내 약리학
생체내 약리학 연구는 광수용체 손상 모델의 뮤린 모델에서 수행되었다. 밝은 빛 손상(BLD) 모델은 반응성성 산소 종(ROS)의 상향 조절 및 대체 보체 시스템의 조절 장애에 의해 광수용체에 손상을 야기한다. 짧은 노출 후, 이러한 마우스는 이들의 광수용체 층의 80%를 상실할 것으로 예상할 수 있다. 또한, 인터루킨 1β, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2, 사이클로옥시게나제-2 및 TNFα-유전자를 포함한 다수의 염증촉진성 및 화학주성 사이토카인의 안구 발현이 있다(Bian, 2016). 색소성 망막염, 스타르가르트병(Stargardt disease) 및 비삼출성 AMD와 같은 안구 질병은 광수용체 세포 사멸을 특징으로 한다(Bian, 2016). 본원에서 본 발명자들은 광수용체 변성의 예방에서 AT-007-NP-02의 효능을 조사하기 위해 뮤린 BLD 모델의 사용을 설명한다.
1. 마우스 안구 내약성 연구
본 연구의 목적은 마우스에서 IVT 주사에 의해 투여된 AT-007-NP03, AT-007-NP02의 안구 내약성을 평가하는 것이었다. 코호트 1에서, 3마리의 건강한 15-16주령의 수컷 C57BL/6JRj 마우스(Janvier, France)의 오른쪽 눈에 FITC-블랭크-NP의 IVT 주사(2 μL)를 투여받았다. 안저검사(fundoscopy)는 주사 직후와 주사 3일 후에 수행되었다. 양쪽 망막(6개의 눈)을 준비하고 Iba1에 대해 염색하였다. 조직병리학적 및 면역조직화학적 분석을 위해, 3마리의 동물로부터의 두 눈을 0.1M 인산염 완충액, pH 7.4 중 4% 파라포름알데히드에 4시간 동안 후고정하고, 맥락막 및 망막 평면 표본고정(flat mount)을 제조하는데 사용하였다. 평면 표본고정에는 토끼 항-Iba1(Wako, Cat. #019-19741)이 표지되어 있다.
형광 현미경(Leica DM6B, Leica Microsystems)을 사용하여 샘플을 이미지화고 이미지 처리 소프트웨어 FIJI/ImageJ를 사용하여 면역양성 영역(mm2 단위)을 결정하여 면역 반응성을 정량화하였다. 정성적 관찰에서는 주사된 눈에서 어떠한 미세아교세포 활성화 또는 혈관 이상도 나타나지 않았다. FITC-블랭크-NP를 주사한 눈은 강한 형광 신호를 보였고, 이는 IVT 주사 직후에 검출되었다. 그러나, 3일차에는 형광이 감소되었고 이상은 관찰되지 않았다. 코호트 2에서, 마우스는 주사 5일 전에 (안구 검사)를 받았다. -2일차에 동물을 fERG a-파 진폭에 기초하여 치료군으로 무작위 배정하였다. 주사 당일에, 마우스는 하기 중 하나의 단일 양측 IVT 주사(2 μL)를 투여받았다: (a) AT-007-NP02; 3.4 μg/μL의 총 고체를 함유하는 1.3 μg/μL의 AT-007), (b) 블랭크-NP(대조군) 또는 (c) AT-007(AT-007; 1.3 μg/μL).
안구 내약성은 투약 후 4, 24, 48 및 72시간; 그리고 1 및 2주째에 거시적 OE 및 IOP 측정으로 평가하였다. 2주째에 희생하기 직전에, fERG, SD-OCT 및 상세한 안저검사 OE를 수행하였다. 안구 조직을 수집하여 H&E 염색을 위해 처리하였다. 오른쪽 눈의 후방 컵(OD)을 파라핀에 매립하고 5 μm 두께의 수직 절편(위에서 아래로)으로 절편화하였다. 총 망막 두께를 이들 각 군에서 헤마톡실린(Hematoxylin) 및 에오신(Eosin)(H&E) 염색된 안구 절편을 사용하여 측정하였다. 내부 망막의 내층의 두께는 RGC 층에서 내부 핵층의 상부까지의 두께로 측정하였고, 외부 핵층(ONL) 두께는 외부 망상층의 하부에서 외부 경계막까지 측정하였다. RGC - 망막 신경절 세포, IPL - 내부 망상층, INL - 내부 핵층, OPL - 외부 망상층, ONL - 외부 핵층, RPE - 망막 색소 상피. 어떠한 처리군에서도 눈에 띄는 총체적 형태학적 변화가 발견되지 않았다.
마우스에서 IVT 주사에 의해 투여된 AT-007-NP03의 안구 내약성을 추가로 평가하였다. 여기서, 안과 검사 동안 눈에 띄는 변화는 관찰되지 않았다. 모든 동공은 빛에 대해 정상적인 반응을 가졌다. 각막 부종, 백내장 또는 출혈의 징후는 발견되지 않았다. 하이델베르그 스펙트럼 HRA(하이델베르그 엔지니어링) OCT 스캔은 주사 후 0일차부터 2주차까지 비교되었다.
2. 더치-벨티드(Dutch-Belted) 토끼의 PK 및 내약성 연구(체내분포)
이 연구의 목적은 더치-벨티드 토끼(Kaninfarm, Sweden)에게 단일 IVT 주사 후 혈청, 안구 조직, 간, 비장 및 콩팥에서 FITC 접합된 AVD-104의 체내분포를 평가하는 것이었다.
이 연구에는 두 아암이 있었다. 한쪽 아암에서, 토끼에서 AT-007-NP-03(0.412 mg/mL AT-007 및 2.1 mg/mL 총 고체)의 단일 IVT 용량 주사로 처리한 후 조직학적 분석에 의해 조직(혈청, 안구 조직)에서 체내분포를 평가하였다. 제2 아암에서, 미접합된 AT-007-NP-03(0.412 mg/mL AT-007 및 2.1 mg/mL 총 고체)의 단일 IVT 투여 후 생체분석을 위해 조직을 수집하였다. 양쪽 아암에서 최대 28일 동안 안저검사 및 안압으로 안과 내약성을 평가하였다.
약물 투여 3일 전에, 12개월령 수컷 토끼의 5개의 눈에서 안압 측정 및 채혈을 완료하였다. 0일차에, AT-007-NP-03(50 μL)을 두 눈에 IVT로 주사하였다. 안압(IOP)은 7일, 14일, 21일 및 28일차에 측정하였다. 연구 종료 시, 혈청, 두 눈, 간, 콩팥 및 비장을 수집하고 조직을 48시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 절편(5 μm) 슬라이드는 H&E 염색 및 플루오레세인 현미경검사를 위해 만들어졌다. 토끼의 한 코호트를 FITC 접합 없이 AVD-104로 처리하였다. 연구 0일차 및 28일차에, 희생 전에 혈청을 수집하였다. 수의 안과 의사가 동물을 검사하였다. 결과는 AT-007-NP-03의 단일 IVT 주사는 내약성이 좋았다는 것을 보여준다. 안과 검사 동안 눈에 띄는 변화는 관찰되지 않았다. 결막은 부기, 분비물 또는 충혈의 징후를 보이지 않았다. 홍채는 빛에 반응했으며 비정상적인 주름은 발견되지 않았다. 각막과 수정체는 투명하였다. 수정체(crystalline lens)에서는 수용액에서 전방 플레어(anterior chamber flare)의 징후나 혼탁의 징후가 없었다. 유리체 내부에는 염증 세포가 없었다. 망막은 평범했으며 망막 박리나 출혈이 관찰되지 않았다. IVT 주사된 AVD-104로부터의 형광 신호가 주입 직후 안저에서 관찰되었다. 연구 3일차와 7일차에, 전체 유리체가 더 밝게 보였는데, 아마도 확산된 형광 나노입자 때문일 수 있다. 임의의 이후 시점(14일 또는 28일차)에 유리체에서 형광 신호가 검출되지 않았다. 7일, 14일, 21일 및 28일차에 IOP에서 치료군 간에 차이가 없었다. 모든 값은 연구 3일차에 취한 기준선 판독값과 유사하였다. 헤마톡실린과 에오신으로 염색된 토끼 망막의 정성적 검사에는 변화가 없었다.
AT-007-NP-03은 내약성이 좋았다. AT-007-NP-03으로 IVT 주사된 토끼 눈은 염증, 부기 또는 비정상적인 출혈의 징후를 보이지 않았다. FITC 표지된 나노입자는 유리체내 주사 직후에 명확하게 보였다. 3일차에 그리고 일부 경우 7일차에, 전체 유리체는 아마도 확산된 형광 NP로 인해, 더 밝게 나타났다. 이미징 14일 및 28일차에, NP 유래 자가형광이 검출되지 않았다. 28일차에 수집된 망막의 수직 단면으로부터 자가형광 이미지를 획득할 때 형광 NP가 검출되지 않았다.
안구 검사는 결막이 부기, 분비물 또는 충혈의 징후를 보이지 않았고 홍채는 빛에 반응했고 비정상적인 주름이 발견되지 않았고 각막은 투명했고 전방 플레어는 관찰되지 않았음을 나타냈다. 유리체내 염증 세포가 없었고 망막박리 또는 출혈도 관찰되지 않았다. 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 염색된 토끼 망막의 추가 대표 이미지는 28일차에 임의의 세포층이 손실되지 않고 내약성이 좋은 약물임을 나타낸다.
3. 마우스의 밝은 빛 손상 모델의 개념 증명
본 연구의 목적은 마우스의 밝은 빛-유도된 광수용체 손상 모델에서 AT-007-NP-02의 약리학적 효능을 평가하는 것이었다. 8주령 수컷 밝은 빛 손상 모델 BALB/cAnNCrl 마우스(Charles River, Germany)를 4개의 군으로 무작위로 나누었다.
ㆍ 군 1: 주사되지 않은 대조군 (n=5)
ㆍ 군 2: 밝은 빛 손상 + 블랭크-NP 대조군(3.4 μg/μL의 총 고체를 함유하는 1 μL) (n=11)
ㆍ 군 3: 밝은 빛 손상 + AT-007-NP-02(3.4 μg/μL의 총 고체를 함유하는 1 μL 중 1.3 μg의 AT-007) (n=11)
ㆍ 군 4: 밝은 빛 손상 + AT-007(1 μL 중 1.3 μg의 AT-007) (n=11)
* 총 고체: AT-007, PEG, 및 PLGA를 포함함
플래시 망막전위도(fERG: flash electroretinography) 및 고해상도 SD-OCT에 대한 기준선 값은 밝은 빛 손상 유도 5일 전에 얻어졌다. -1일차에, 시험 물품에 IVT OD를 투여하고(2 μL) 마우스를 암실에서 채택했다. 0일차에, 아침에 동공은 0.5% 트로피카미드(Oftan Tropicamid. Santen Oy) 한 방울을 적용하여 완전히 확장되었다. 동물을 투명한 플라스틱 케이지로 옮기고 4시간 동안 밝은 빛 자극(10,000 lux)에 노출시켰다. 연속적인 밝은 빛에 노출된 후, 마우스를 정상적인 명/암 주기(10 lux; 12시간 켜짐/12시간 꺼짐)로 되돌렸다. 7일차에, 동물을 fERG 및 SD-OCT로 재검사하였다. 실험 종료일에 동물에 0.9% NaCl 용액을 경심관류로 살포하였다. 두 눈을 수집하여 액체 질소로 고정시키지 않고 냉동시켰다. 조직은 조직학/면역조직화학에 사용될 때까지 80℃에서 최적 절단 온도(OTC: optimal cutting temperature) 화합물에 보관되었다. 슬라이드를 위해 눈을 5 μm 두께의 절편으로 분할하였다. 한 세트의 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 조직학적 염색에 사용하였다. 제2 세트의 슬라이드를 대식세포 마커 F4/80에 대한 염색에 사용하였다.
정량적 데이터를 그래프로 작성하고 분석하여 평균 표준 편차(SD)로 표시하였다. 1%의 위발견률(false discovery rate)로 ROUT의 시험을 사용하여 이상치(Outlier) 데이터 포인트를 확인하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(v8.0.1 GraphPad Software, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 내부 프로젝션(VIP) SD-OCT B-스캔 데이터가 제시되어 있다. 조직학적 분석 결과는 보류 중이다. SD-OCT B-스캔은 시신경 유두(ONH: optic nerve head)를 중심으로 하고 ONH보다 -0.4 mm 아래, 그리고 ONH보다 +0.4 mm 위에 위치한 VIP로부터 촬영되었다. ONH를 중심으로 SD-OCT VIP 스캔에 25포인트 그리드를 배치하고 소프트웨어를 사용하여 각 포인트에 대해 다양한 망막층(내부 망막 외부 핵층-IS/OS/RPE)의 두께를 측정하였다.
동등한 양의 AT-007을 갖는 리간드 단독 군에서 ONL의 보존은 블랭크-NP-처리된 마우스에 비해 통계적 유의성에 도달하지 않았다. 이것은 리간드 단독으로는 빛 손상 조건 하에 망막을 보호하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다. 히트 맵 상관관계(나타내지 않음)는 눈의 3개의 다른 영역을 중심으로 OCT로 측정한 망막층 두께의 상대적 변화를 나타낸다. 예상대로, 망막의 일부 영역은 다른 영역보다 빛 손상에 더 민감하다. AT-007-NP02 처리된 마우스의 상비강 배향(SN)에서 암청색 사각형의 더 어두운 강도는 AT-007 단독 또는 Blank-NP로 처리된 마우스와 비교하여 해당 영역에서 외부 핵층(ONL)의 유의한 유지를 보여준다. 도 23에 나타낸 결과는 강렬한 밝은 빛의 이러한 극한 조건 하에, AT-007-NP02 예방이 ONL의 유지에 기여할 수 있고, AT-007 또는 블랭크-NP 단독을 사용한 예방적 치료와 비교하여 망막이 얇아지는 것을 방지할 수 있음을 시사한다. 이 데이터는 항염증/보호 반응을 유도하기 위해 Siglec 수용체 결합을 보다 효율적으로 표적화하고 결합하기 위해 AT-007 리간드의 활성을 강화하기 위한 나노입자 스캐폴드의 존재의 필요성을 강력하게 뒷받침한다.
도 23은 블랭크-NP, AT-007 및 AT-007-NP02를 주사한 동물로부터의 외부 핵층 두께(μM)를 나타낸다. 데이터는 군당 11마리의 마우스로부터의 평균 ± SEM으로서 제시된다. 데이터는 Sidak 다중 비교 유의성 블랭크-NP 대 AT-007-NP02에 의해 분석되었다. *p = 0.0318.
스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층촬영(SD-OCT: Spectral Domain Optical Coherence Tomography) 망막 스캔은 망막 구조를 평가하고 외부 핵층(ONL)을 분석하는 데 사용되었다. ONL 두께는 블랭크-NP로 처리된 눈과 비교할 때 AT-007-NP02를 받은 눈의 모든 분석된 그리드 포인트에서 유의하게 더 컸다. 이 차이는 데이터가 눈의 여러 해부학적 영역으로 나뉘었을 때도 명확하게 반영되었다. 상비강 영역은 측두 영역에 비해 더 높은 보호를 받았다.
4. 섬유세포 분화에 대한 AT-007-NP04의 효과
PBMC를 건강한 기증자로부터 얻었고, CD14+ 단핵구 세포를 단리하고 (2 x 10^5/ml) 무혈청 섬유세포 분화 배지에 재현탁하고 5일 동안 배양하였다. 4일차에, 부착되지 않은 세포를 세척하고 배지의 절반을 제거하고 새로운 배지로 교체한다. 명시야 이미징 및 세포 계수를 위해 AT-007-NP04/SAP를 포함하거나 포함하지 않는 24웰 플레이트에 세포를 플레이팅하였다. FLUOVIEW FV3000 설정을 사용하여 Olympus를 사용하여 10x 배율로 세포를 이미지화하였다. 스케일 - 100 μM. 섬유세포의 수는 웰당 3개의 시야를 가진 3중 웰을 계수하여 결정하였다. 혈청 알부민 단백질(1 μg/ml)(SAP)을 양성 대조군으로서 사용하였다. AT-007-NP06을 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 도 24는 실험 설정에 대한 개략도를 도시한다. 대표적인 명시야 이미지는 AT-007-NP04 처리 후 섬유세포 분화가 감소하는 경향을 나타내었다.
현미경 이미지는 AT-007-NP06으로 처리하면 단핵구의 섬유세포로의 분화를 감소시킬 수 있다는 증거를 명확하게 보여주었다. 섬유세포 수의 변화는 추가 병적 섬유증을 예방하는 것과 관련이 있거나 심지어 그 해소에 기여할 수도 있다.
결과는 도 25에서 상기 이미지로부터의 계수에 기초한 섬유세포 분화의 감소 경향을 나타내는 섬유세포 분화%로서 그래프로 나타내었다.
5. Sytox 오렌지 염료를 사용하여 측정된 NET 형성 지연 및 세포 사멸 지연에 있어서의 AT-007-NP06의 효과
호중구는 EasySep 인간 호중구 분리 키트(StemCell Technologies Catalog # 19359를 사용하여 건강한 대조군의 혈액으로부터 단리하였다. 세포. 인간 PMN은 제조업체의 지시에 따라 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA: phorbol myristate acetate)(100 nM) 및 50 μg/ml의 AT-007-NP06과 막-비투과성 DNA-결합 염료 SYTOX 오렌지 Sytox 오렌지 염료(Thermo Fisher Catalog #- S11368)의 존재와 함께 처리하기 전에 1시간 동안 휴지시켰다. 본 발명자들은 시간이 경과함에 따라 세포외 DNA와 NET 형성을 관찰하였다. 이들 이미지로부터 유도된 평균 SYTOX 오렌지 강도 값은 PMN이 양성 대조군 및 나노입자로서 100 nM PMA로 자극된 웰에서 총 세포외 DNA 방출을 정량화하는 데 사용되었다. 이러한 데이터는 AT-007-NP06이 존재하는 경우 PMA 대조군에 비해 NET 형성이 지연되었음을 보여준다. 실험 설정의 개략도는 도 26에 나타낸다. 결과는 도 27에 그래프로 표시되어 있으며 이는 시간 경과에 따른 동역학 곡선을 나타낸다.
Sytox 양성은 호중구 세포 사멸을 나타낸다. PMA에서 더 높은 백분율의 Sytox 양성 염색은 세포가 처리 후 아폽토시스를 겪는다는 것을 시사한다. 본 발명자들의 데이터는 PMA 치료와 함께 AT-007-NP06이 시간이 경과함에 따라 호중구 세포 사멸을 지연시킨다는 것을 시사한다. 호중구 세포 사멸의 30 내지 50%에 가까운 감소를 나타내는, 처리한지 대략 2시간 내지 4시간 후의 곡선의 이동이 있다. 이러한 세포 사멸의 지연은 본 발명의 AT-007-NP06이 NETosis를 예방할 수 있다는 강력한 증거이다.
XI. 실시예 17: Siglec 7, 9, 및 11에 대한 콜루민산(PSA)의 결합
Siglec 7, 9 및 11에 대한 상이한 중합도 DP의 폴리시알산(PSA) 분자의 결합은 표면 플라즈몬 공명 효과(BIACore™ 기기)를 사용하여 조사되었다.
DP의 값은 분자 앙상블에서 중합체 분자의 평균 길이를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, DP 13을 갖는 PSA는 13개의 시알산 잔기의 평균 길이를 갖는 PSA 분자의 앙상블을 지칭한다. 본 실험에서는 상업적으로 입수 가능한 시알산 이량체(PSA DP2)가 대조군으로서 사용되었다. 이러한 이량체를 포함하는 이러한 조성물은 균질하고, 길이 분포를 갖지 않았다.
결과는 DP 13을 갖는 PSA가 Siglec 7, 9 및 11에 강력하게 결합하는 반면, 시알산의 이량체(DP 2를 갖는 PSA)에 대해서는 결합이 관찰되지 않았음을 나타낸다.
간단히 말해, 콜로민산을 80℃의 물에서 2.5시간 동안 가열하여 부분적으로 해중합하고 한외여과로 분별하여 평균 DP가 13인 PSA 분획을 얻었다. 화합물은 옥심 라이게이션에 의해 변형되어 하기 화합물 3:
Figure pct00088
을 얻었고, 이는 비오틴에 의해 변형되었다(아래에 기재된 바와 같음). 물결선은 PSA 분자에 대한 부착점을 나타낸다.
비오티밀화
옥심-변형된 PSA의 비오티닐화는 하기 합성 반응식에 따라 수행되었다:
반응식 8: 비오티닐화된 올리고 시알산의 합성
Figure pct00089
간단히 말해, 반응 튜브에 1a/1b(1 당량), H2O, NaHCO3(1.5 당량) 및 화합물 2(1.2 당량)를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 P2 바이오-겔 크로마토그래피(3a) 또는 10K 스핀 필터를 사용한 한외여과(3b)로 정제하여 화합물 3a 또는 3b를 얻었다.
변형된 PSA를 스트렙타비딘에 의해 변형된 BIAcore SPR 칩에 고정시키고 Siglec에 대한 결합을 시험하였다.
디- 및 폴리시알로이드의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석
표면/샘플 접합
모든 분석은 GE Biacore T100 기계에서 수행되었다. 시리즈 S CM5 칩(Cytiva No. 29149603)에 표준 EDC/NHS 아미드 접합 화학(유동 셀 1, 2, 3 및 4)을 사용하여 스트렙타비딘(2,000개 반응 유닛, Thermo Fisher Scientific No.434301)을 코팅하였다. 모든 유동 셀을 후속적으로 에탄올아민을 사용하여 차단하고, PBS-P(10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl 및 0.5% 계면활성제 P20(Cytiva No. BR100054), pH 7.4)의 탈기된 용액을 밤새 유동시켜(10 μL/분) 칩 표면을 안정화시킨다.
안정화된 기준선에는 비오티닐화된 디시알로사이드 및 평균 중합도가 13(DP13)인 비오티닐화된 폴리시알로사이드를 도입한다. 디시알로사이드를 DI 수에 50 μg/mL의 농도로 용해시킨다(총 부피 = 200 μL). 수동 모드에서 T100 소프트웨어를 사용하여 비오티닐화된 디시알로사이드의 50 μg/mL 용액을 30 μL/분의 유속으로 90초 동안 유동 셀 2에 도입한 다음, PBS-P를 30 μL/분의 유속으로 90초 동안 도입한다. 이 프로세스를 3회 반복하고 그 후 추가적인 비오틴 접합은 관찰되지 않았다. 비오티닐화된 폴리시알로사이드(DP13)의 안정화는 비오티닐화된 DP13 구조가 유동 셀 4에 도입된다는 점을 제외하고는 디시알로사이드와 동일한 프로토콜을 따른다.
Siglec-11 스크리닝
동결건조된 hFc-Siglec-11(R&D Systems 번호 3258-SL-050)을 PBS-P 완충액에서 200 μg/mL의 농도로 재구성하고, 분석 전 30분 동안 얼음에서 평형을 이룰 수 있도록 한다. 유동 셀 2 및 1, 및 유동 셀 4 및 3으로부터 각각 측정된 반응 유닛을 빼서 siglec-11과 비오티닐화된 디시알로사이드 및 폴리시알로사이드 사이의 상호작용을 측정하도록 병렬 결합 검정을 설정한다. 이 분석은 하기 파라미터를 사용하여 200 μg/mL, 100 μg/mL 및 50 μg/mL의 세 가지 상이한 농도로 siglec-11을 도입하여 달성된다:
a. 유속 = 30 μL/분
b. 접촉 시간 = 60초
c. 해리 시간 90초
d. 안정화 시간 = 30초
Siglec-9 스크리닝
동결건조된 hFc-Siglec-9(R&D Systems 번호 1139-SL-050)를 PBS-P 완충액에서 200 μg/mL의 농도로 재구성하고, 분석 전 30분 동안 얼음에서 평형을 이룰 수 있도록 한다. 유동 셀 2 및 1, 및 유동 셀 4 및 3으로부터 각각 측정된 반응 유닛을 빼서 siglec-9와 비오티닐화된 디시알로사이드 및 폴리시알로사이드 사이의 상호작용을 측정하도록 병렬 결합 검정을 설정한다. 이 분석은 하기 파라미터를 사용하여 100 μg/mL의 농도로 siglec-9를 도입하여 수행된다.
a. 유속 = 30 μL/분
b. 접촉 시간 = 60초
c. 해리 시간 90초
d. 안정화 시간 = 30초
Siglec-7 스크리닝
동결건조된 hFc-Siglec-7(R&D Systems 번호 1138-SL-050)을 PBS-P 완충액에서 200 μg/mL의 농도로 재구성하고, 분석 전 30분 동안 얼음에서 평형을 이룰 수 있도록 한다. 유동 셀 2 및 1, 및 유동 셀 4 및 3으로부터 각각 측정된 반응 유닛을 빼서 siglec-7과 비오티닐화된 디시알로사이드 및 폴리시알로사이드 사이의 상호작용을 측정하도록 병렬 결합 검정을 설정한다. 이 분석은 하기 파라미터를 사용하여 100 μg/mL의 농도로 siglec-7을 도입하여 수행된다:
a. 유속 = 30 μL/분
b. 접촉 시간 = 60초
c. 해리 시간 90초
d. 안정화 시간 = 30초
결과는 도 34a 내지 도 34d에 나타낸 센소그램으로 제시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, DP 13을 갖는 PSA는 Siglec 7, 9 및 13에 결합하는 반면, 디시알릴 이량체에 대해서는 결합이 검출되지 않는다. 이러한 결과는 Siglec에 결합하는 기능이 PSA 길이에 따라 달라진다는 것을 시사한다.
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참조문헌의 교시는 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명은 이의 예시적인 실시형태를 참조하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 당업자라면 첨부된 청구범위에 의해 포괄된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 본원에서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (63)

  1. 하기 구조식으로 표시되는 분자를 포함하는 입자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00090

    (상기 식에서,
    P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드이고;
    G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)이고;
    L은 공유 링커임).
  2. 제1항에 있어서, 중합체 스캐폴드는 블록 공중합체 PLGA-PEG를 포함하는, 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, P는 하기 구조식으로 표시되는, 입자:
    Figure pct00091

    (상기 식에서, 기호
    Figure pct00092
    는 링커 L에 대한 중합체의 부착점을 나타내고, 추가로 여기서:
    x는 0 내지 20의 정수이고, y는 0 내지 20의 정수이고, m은 1 내지 1000의 정수이고, n은 5 내지 450의 정수이며, 단 x 및 y는 동시에 0이 아님).
  4. 제3항에 있어서, x는 0 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이고, m은 1 내지 500의 정수이고, n은 5 내지 450의 정수인, 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, G는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는, 입자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00093

    (상기 식에서, 기호
    Figure pct00094
    는 링커 L에 대한 G의 부착점을 나타내고, 추가로 여기서 p는 4 내지 198의 정수임).
  6. 제5항에 있어서, p의 값은 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 및 50 내지 60의 범위 중 어느 하나로부터 선택되는, 입자.
  7. 제5항에 있어서, p는 5 내지 25인, 입자.
  8. 제5항에 있어서, p는 10 내지 20인, 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 L은 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되고, 여기서 기호
    Figure pct00095
    는 G에 대한 링커 L의 부착점을 나타내고, 기호
    Figure pct00096
    는 P에 대한 링커 L의 부착점을 나타내는, 입자:
    Figure pct00097

    (상기 식에서,
    R11은 -C(O)NH- 또는 -CH2-NH-C(O)-CH2-O-이고;
    R12는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X11)-(CH2)-1-10-, -N(X12)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X11은 H 또는 아세틸이고, X12는 H 또는 메틸임);
    Figure pct00098

    (상기 식에서,
    R21은 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-이고;
    R22는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X21)-(CH2)-1-10-, -N(X22)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X21은 H 또는 아세틸이고, X22는 H 또는 메틸임);
    Figure pct00099

    (상기 식에서,
    R31은 -(CH2)1-10-이고;
    R32는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X31)-(CH2)-1-10-, -N(X32)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X31은 H 또는 아세틸이고, X32는 H 또는 메틸임);
    Figure pct00100

    (상기 식에서,
    R41은 -(CH2)1-10-이고;
    R42는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X41)-(CH2)-1-10-, -N(X42)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X41은 H 또는 아세틸이고, X42는 H 또는 메틸임);
    Figure pct00101

    (상기 식에서,
    R51은 -(CH2)1-10-이고;
    R52는 부재이거나, -O-(CH2)1-10-, -(O-CH2CH2)1-10-, -N(X51)-(CH2)-1-10-, -N(X52)-O-(CH2)-1-10-, 또는 -NHNH-(CH2)1-10- 중 어느 하나이고, 여기서 X51은 H 또는 아세틸이고, X52는 H 또는 메틸임);
    Figure pct00102

    (상기 식에서,
    R61은 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-이고;
    R62는 부재이거나, -(CH2)1-10- 또는 -(CH2)1-10-O-(CH2)-1-10-NH-임);
    Figure pct00103

    (상기 식에서,
    R71은 -NHC(O)- 또는 -OCH2-C(O)NH-CH2-이고;
    R72는 -(CH2)1-10-O-(CH2)1-10-NH-임);
    Figure pct00104

    (상기 식에서,
    R81 및 R82는 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-임);
    Figure pct00105

    (상기 식에서,
    R91은 -NHC(O)- 또는 -OCH2-C(O)NH-CH2-이고;
    R92는 -(CH2)1-10- 또는 -(CH2CH2-O)1-10-(CH2)1-10-임);
    Figure pct00106

    [상기 식에서,
    R101은 H 또는 메틸이고;
    X10은 O 또는 NH이고;
    R102는 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
    Figure pct00107

    (상기 식에서, X101, X102, 및 X103은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
    Figure pct00108
    는 카르보닐 A에 대한 부착점을 나타냄)임];
    Figure pct00109

    [상기 식에서,
    R111 및 R111A는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    X11 및 X11A는 각각 독립적으로 O 또는 NH이고;
    R11 및 R11A는 독립적으로 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
    Figure pct00110

    (상기 식에서, X111, X112, 및 X113은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
    Figure pct00111
    는 카르보닐 B 또는 카르보닐 B'에 대한 부착점을 나타냄)임];
    Figure pct00112

    [상기 식에서,
    X12는 -(CH2)1-10- 또는 -C(O)-(CH2)1-10-이고;
    R12는 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
    Figure pct00113

    (상기 식에서, X121, X122, 및 X123은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10이고, 여기서 기호
    Figure pct00114
    는 카르보닐 C에 대한 부착점을 나타냄)임]; 및
    Figure pct00115

    [상기 식에서,
    X13은 -Ph- 또는 -CH2-Ph-CH2-이고, 여기서 Ph는 페닐이고;
    R13은 -CH2O-, 또는 하기 구조식 중 어느 하나로 표시되는 모이어티:
    Figure pct00116

    (상기 식에서, X131, X132, 및 X133은 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-이고, 여기서 기호
    Figure pct00117
    는 카르보닐 D에 대한 부착점을 나타냄)임];
    Figure pct00118

    (상기 식에서,
    X14 및 X15는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고, A14 및 A15는 각각 독립적으로 NRA, NRANRB, O 또는 S이고, 여기서 RA 및 RB는 각각의 경우 독립적으로 H, C1-4 알킬 및 C6-C18 아릴로부터 선택되고; R14 및 R15는 각각 독립적으로 -(CH2)1-10- 또는 -CH2CH2-(OCH2CH2)1-10-임).
  10. 제9항에 있어서, 링커 L은 하기 구조식으로 표시되는, 입자:
    Figure pct00119

    (상기 식에서,
    a는 2 내지 6의 정수이고;
    RA는 부재이거나, -(CH2)1-2-O-(CH2)1-2-NH-임).
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, P는 PLGA(10k)-PEG(5k)인, 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, P의 단위 중량당 G의 중량(리간드 밀도)은 10 내지 75 μg/mg인, 입자.
  13. 안과 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 안과 질환은 건성 연령-관련 황반 변성, 습성 연령-관련 황반 변성, 비증식성 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 포도막염, 안구 건조증, 결막염, 갑상선 안병증, 안내염, 망막 변성, 녹내장, 망막 정맥 폐색, 안검염, 각막염, 안구 감염, 또는 백내장인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 길항제인, 방법.
  16. 염증성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 투여 경로는 정맥내, 유리체내, 경구, 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 또는 직장 중 하나 이상인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 결핵, 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD), 천식, 급성 폐 손상, 급성 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증, 폐 섬유증 간질성 폐질환, 폐혈관 질환, 인플루엔자, 바이러스성 폐렴, 세균성 폐렴, 알레르기성 기관지염, 비알레르기성 기관지염, 비염, 또는 섬유성 폐포염인, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 전신성 경화증(피부경화증), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 통풍, 골관절염, 감염성 관절염 또는 소아 특발성 관절염인, 방법.
  20. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 셀리악병, 게실염, 위식도 역류, 유당 불내증, 소화성 궤양, 담낭염, 위염, 대장염, 췌장염, 자가면역 간염, 간염, 감염성 간염, 또는 췌장염인, 방법.
  21. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 패혈성 쇼크, 죽상동맥경화증, 이완기능 장애, 심부전, 심장 섬유증, 콕사키 심근염, 선천성 심장차단, 자가면역성 심근염, 또는 거대 세포 심근염인, 방법.
  22. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 콩팥 이식 거부반응, 사구체신염, 급성 신염, 방광염, 전립선염, 당뇨병성 신염, 또는 당뇨병성 콩팥 질환인, 방법.
  23. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 피부염, 습진, 염증성 발진, 피부경화증, 켈로이드, 여드름, 유육종증, 완선(tinea cruris), 체부 백선, 족부 백선, 두부 백선, 조갑 백선, 주사비, 백반증, 경화 태선, 자가면역 두드러기, 피부근염, 또는 화농성 한선염인, 방법.
  24. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 당뇨병, SLE, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 애디슨병(Addison's disease), 그레이브스병(Graves' Disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증, 자가면역 혈관염, 셀리악병, 악성 빈혈, 원형 탈모증, 자가면역 간염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 내이 질환(autoimmuneinner ear disease), 길랑 바레(Guillain barre), 가와사키병(Kawasaki disease), 램버트-이튼 증후군(lambert-eaton syndrome), 보그트-코야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada Syndrome), 전신 혈관염, 거대 세포 동맥염, 유육종증, 또는 결절성 다발동맥염인, 방법.
  25. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 신경척수염, 다발성 경화증, 뇌염, 신경 사르코이드증, 알츠하이머, 근위축성 측삭 경화증, 또는 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 횡단 척수염, 길랑 바레 증후군, 파킨슨병, 또는 양성 본태 떨림(benign essential tremor)인, 방법.
  26. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, SARS-CoV1, SARS-CoV2, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle Disease virus), 센다이 바이러스(Sendai virus), 폴리오마바이러스(Polyomavirus), HIV, 플라비바이러스(Flavivirus), 카클리바이러스(Caclivirus), 헤르페스바이러스(Herpes virus), 피코로노바이러스(Picoronovirus), 또는 코로나바이러스(Coronavirus)에 의해 야기된 바이러스성 질환인, 방법.
  27. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 그람 음성균, 그람 양성균, 호기성균, 혐기성균, 또는 항생제 내성균에 의해 야기된 세균성 질환인, 방법.
  28. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 진균혈증, 진균성 각막염, 칸디다증, 족부 백선, 또는 완선인, 방법.
  29. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 아메바증, 편모충증, 톡소플라즈마병, 또는 톡소카라인, 방법.
  30. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 특발성 폐 섬유증, 골수섬유증, 간섬유증, 이완기능 장애 및 CHF를 동반한 심장 섬유증, 콩팥 섬유증, 망막 섬유증, 피부 섬유증, 및 흉터형성인, 방법.
  31. 제16항에 있어서, 염증성 질환은 패혈증, 사이토카인 폭풍, 또는 겸상 적혈구병(sickle cell disease)인, 방법.
  32. 제16항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 길항제인, 방법.
  33. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 투여하는 단계를 포함하며,
    여기서 암은 원발성 폐암, 전이성 폐암, 유방암, 결장암, 뇌암, 구강암, 식도암, 위암, 담도암, 간암, 횡문근육종, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 전립선암, 신세포암, 척추암, 신경모세포종, 신경내분비암, 안구암, 비인두암, 또는 피부암인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 치료학적 양의 이필리무맙, 니볼리무맙, 페브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙, 또는 세미플리맙으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 입자를 투여하는 단계는 방사선 요법과 동시에 또는 순차적으로 이루어지는, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 치료학적 양의 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 비노렐빈, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 블레오마이신, 다카르바진, 무스틴, 빈크리스틴, 프로카르바진, 프레드니솔론, 에피루비신, 시스플라틴, 타목시펜, 탁소테레, Her2 neu 억제제, 항-VEGF 억제제, EGFR 억제제, ALK 억제제, 소라페닙, 또는 mTOR 억제제로부터 선택된 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 암은 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 치료학적 유효량의 다우노루비신, 시타라빈, 또는 이마티닙을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 입자를 투여하는 단계는 줄기 세포 이식 또는 골수 이식과 동시에 또는 순차적으로 이루어지는, 방법.
  41. 감염성 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    여기서 감염성 질환은 B군 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 이. 콜리, 슈도모나스 아에루지노사, 나이세리아 메닌지티디스, 캄필로박터 제주니, 티르파노소마 크루지, HIV, 인플루엔자 A, B, 또는 C, Sars CoV1, Sars Co V2, 또는 헤르페스 비리다에에 의해 야기되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 15 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제이고, Siglec 14 또는 16 중 하나 이상의 효능제 또는 길항제인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 치료학적 유효량의 자나미비르, 오셀타미비르, 발시클로비르, 아시클로비르, 또는 지도부딘 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 11과 동족인, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 9와 동족인, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 7과 동족인, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 시알산 리간드는 Siglec 5와 동족인, 방법.
  48. 면역 세포에서 세포-매개 염증 반응을 조절하는 방법으로서,
    면역 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체는 PBS 완충액 또는 식염수를 포함하는, 약제학적 조성물.
  51. 제49항에 있어서, 담체 중 입자의 농도는 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml인, 약제학적 조성물.
  52. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 동결건조된 또는 냉동-건조된 입자를 포함하는 조성물.
  53. 입자를 제조하는 방법으로서, 방법은
    제1 불안정 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체 스캐폴드 P를 제1 불안정 모이어티와 제2 불안정 모이어티의 부가물 L을 생성하기에 충분한 조건 하에 제2 불안정 모이어티를 포함하는 글리칸 G와 반응시켜
    하기 구조식으로 표시되는 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법:
    Figure pct00120

    (상기 식에서,
    P는 폴리글리콜산, 폴리(L-락트산), 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리(3-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리에틸텐 옥사이드, Pluronic F127, Pluronic F68, 폴록사머, 폴리(하이드록시메틸메타크릴레이트), 폴리비닐 알코올, 폴리(비닐피롤리돈), 히알루론산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 시알산 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 중합체를 포함하고;
    G는 5 내지 200개의 시알산의 반복 단위를 포함하는 폴리시알산(PSA)임).
  54. 제53항에 있어서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아민, 카르복실산, 아지드, 알킨, TCO, 테트라진, DCBO, 및 디하이드라지드로부터 선택되는, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 제1 및 제2 불안정 모이어티는 아지드, 알킨, 또는 테트라진으로부터 선택되고, 부가물 L은 알킨-아지드 부가물 또는 알킨-아지드 부가물을 포함하고, 여기서 부가물을 생성하기에 충분한 조건은 다음에 대한 조건인, 방법:
    구리(I)-촉매된 아지드-알킨 반응(CuAAC);
    구리-비함유 아지드-알킨 반응;
    변형-촉진된 아지드-알킨 반응(SPAAC);
    테트라진-알켄 라이게이션 반응; 및
    TCO-테트라진 반응.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, P는 PLGA-PEG 공중합체를 포함하는, 방법.
  57. 대상체에서 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 방법은
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 대상체는 과도한 보체 성분 C3, C3b를 생성하는, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 입자는 Siglec 11의 효능제인, 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 입자는 보체 인자 H에 결합하는, 방법.
  61. 보체 과다활성화 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 투여 경로는 정맥내, 유리체내, 경구, 경구 세정(oral rinse), 안내, 망막하, 테논낭하, 공막내, 안구주위, 흡입 비강 및 경구, 근육내, 동맥내, 척수내, 척수강내, 두개내, 피내, 경피(국소), 경점막, 피하, 폐 세척, 위 세척, 및 간내, 피하, 직장, 관절내 중 하나 이상인, 방법,
  63. 제61항에 있어서, 보체 과다활성화 질환은 건성 및 습성 황반 변성, 발작성 야간 혈뇨증, 전신 홍반성 루푸스, 패혈증, 항인지질 증후군, 알츠하이머, 뇌졸중, 심근경색, 쇼크, 장기 이식 거부반응, 생체재료 이식 거부반응, COPD 악화, 치은염/치주 질환, 전신 염증 반응 증후군인, 방법.
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