JP2023543527A - シアル酸リガンド修飾治療薬 - Google Patents

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クリシュナン，アニサ
ゲネッド，モハメド，エイ．
シャインデ，ラジェシュ，アール．
ブーンズ，ジェラルダス，ジェイ．ピー．エイチ．
リウ，チアン
プルッデン，アンソニー，アール．
チョプラ，プラディープ
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アビセーダ セラピューティクス，インコーポレイテッド
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Abstract

本開示は、例えば、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン）及び補体因子Ｈ（ＣＦＨ）などの自己関連分子パターン認識受容体の活性を調節するための方法及び組成物を提供する。ウイルス性インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、２などの感染性生物並びに肺癌、乳癌及び皮膚癌などの癌／腫瘍細胞の活性を調節する。本組成物は、以下の構造式：Ｐ－Ｌ－Ｇ（式中、Ｐは、本明細書で定義される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含む生体適合性ポリマー足場であり、Ｇは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）であり；及びＬは、共有結合リンカーである）によって表される分子又はその薬学的に許容される塩を含む粒子を含む。

Description

本開示は、例えば、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン）及び補体因子Ｈ（ＣＦＨ）などの自己関連パターン認識受容体の活性を調節するための方法及び組成物を提供する。提供される組成物は、例えば、宿主における免疫監視の侵入、伝播及び回避を可能にする、自己関連分子パターン認識受容体及び感染性関連シアル酸結合部分に結合するか、それらを刺激するか又はそれらに拮抗する末端シアル酸を有するグリカン構造で修飾されたナノ粒子、微粒子、他のポリマー構造を含む。
そのような自己関連パターン認識受容体への結合及び／又はそれらの活性の刺激若しくはそれに対する拮抗は、自然、適応、マルチモーダル、炎症性又は補体媒介性免疫応答を消散し、それにより、（１）ウイルス、細菌、アレルゲン、移植拒絶反応若しくは自己免疫誘発性炎症などの急性炎症；（２）慢性閉塞性肺疾患若しくはリウマチ性疾患などの慢性炎症；（３）滲出性若しくは非滲出性黄斑変性症又はアルツハイマー病などの先天性及び適応型の慢性非消散性炎症の疾患の治療を提供することができる。
提供される組成物を使用して、癌細胞、ウイルス性、細菌性、蠕虫性、寄生虫性又は損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）などの感染性因子が自然又は適応免疫系による免疫監視、検出及びクリアランスを回避することを可能にする自己関連分子パターン認識受容体を阻害するか又はそれに拮抗することもできる。
さらに、提供される組成物を使用して、宿主のシアル酸に付着し、宿主細胞への侵入及び細胞内での増殖を促進するシアル酸受容体及び／又はシアリダーゼに結合することにより、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びレンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などの感染因子が宿主細胞に侵入するのを防ぐこともできる。
自己を認識する能力は、自らの健康な宿主細胞を破壊しないように身体の免疫系を下方制御するものである。特定の細胞のグライコーム（全ての細胞を被覆する炭水化物部分）の組成は、細胞が自己関連細胞、非自己細胞又は損傷細胞として認識されるかどうかを決定する。免疫監視及び炎症のプロセスにおいて、免疫系は、遭遇した細胞のグライコームシグネチャをチェックして、細胞が免疫活性化による排除を必要とするか否か、又は細胞が、免疫活性化若しくは炎症消散の抑制をシグナルで示すはずの非損傷宿主細胞を構成しているかどうかを判断する。このグライコームシグネチャの認識を担う、炎症細胞上に存在する受容体又は結合領域は、自己関連パターン認識受容体とみなされる。
自己関連分子パターン認識受容体の最大のファミリーは、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン）と呼ばれる。現在、１６のシグレックが記載されている。シグレックは、炎症細胞の表面に存在し、異なる炎症細胞に見出される様々なシグレック発現パターンを有する。健康な宿主細胞の表面に特定のシアル酸リガンドパターンが提示されると、刺激された阻害性シグレック受容体が免疫グロブリンチロシンキナーゼ阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を活性化し、これは、ｓｒｃ相同性２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１及び２（ＳＨＰ－１及び２）を動員するが、これらのホスファターゼのいずれも、炎症細胞を活性化状態に保つキナーゼを脱リン酸化する。この阻害性シグレック制御メカニズムは、活性化された炎症細胞を強力にシャットダウンすることにより、炎症の消散をもたらすことができる。異なるシグレックは、受容体に結合して、それを刺激する様々なシアル酸シグネチャーを有することから、炎症細胞の強力な不活性化をもたらす。
シグレック３、５、７、９、１０、１１又は１５を刺激すると、所与の細胞内の活性化（リン酸化）チロシンキナーゼが全て脱リン酸化され、その特定の細胞の活性化の細胞内シャットダウンが起こる。シアル酸リガンド及び特定のシグレック受容体に対するこれらのリガンドの密度及び提示は、受容体結合部位を刺激するか、それに拮抗するか又はそれをブロックするその能力を決定する。
免疫グロブリンチロシンキナーゼ活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して炎症を活性化するシグレック１４又は１６に対する拮抗は、炎症を不活性化する別のメカニズムである。シグレック１４又は１６が刺激されると、ＩＴＡＭが活性化され、ＩＴＡＭ内のチロシン残基がＳＲＣファミリーのキナーゼによってリン酸化され、モチーフがＳＨ２ドメインを含むタンパク質のドッキング部位になることを可能にする立体構造変化が生じる。シグレック１４及び１６の刺激を用いて、感染症の治療の目的で又は腫瘍学の現場で炎症を活性化することができる。
補体因子Ｈ（ＣＦＨ）は、別のシアル酸結合自己関連パターン認識受容体を表す。ＣＦＨは、補体カスケード、特に代替補体経路の活性化を解消する役割を担っている。ＣＦＨは、補体因子３Ｂｂ（Ｃ３Ｂｂ）を結合及び分解することにより、補体カスケードを下方制御する。Ｃ３Ｂｂは、補体カスケードを伝播する増幅係数を表す。ＣＦＨは、代替補体経路の中心的な調節因子である。代替補体経路は、構成的に活性化されるため、ＣＦＨは、補体カスケードが加速し、膜攻撃複合体を介して細胞溶解を引き起こすことを防ぐブレーキとして作用する。ＣＦＨが活性化され、適切な自己関連分子パターン（ＣＦＨに適切に提示されるシアル酸リガンド）と結合すると、ＣＦＨは、Ｃ３Ｂｂに結合し、ＢｂがＣ３Ｂｂに結合することを防ぎ、これによりＣ３ＢｂＢｂの形成を防止する。Ｃ３ＢｂＢｂは、補体カスケードを伝播及び加速する律速中間体である。ＣＦＨが適切な自己関連分子パターン（正しい立体配置で提示されたシアル酸リガンド）に結合しなければ、ＣＦＨは、Ｃ３Ｂｂに結合せず、その結果、Ｃ３ＢｂＢｂの形成加速及び膜攻撃複合体の形成増大並びに病原性細胞及び天然細胞の両方の制御不能な細胞溶解を引き起こす。
ＣＦＨは、２０個の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュールから構成される。ＣＦＨには、２つのシアル酸結合領域、即ちＣＦＨの４～６ＣＣＰ領域及び１９～２０ＣＣＰ領域がある。シアル酸によるこれらの領域の結合は、Ｃ３Ｂｂの結合領域を開放し、これが補体カスケードを失活させると考えられる。Ｃ３Ｂｂとの結合を増強するＣＦＨの立体構造変化を形成するために、これらの２つの部位の同時結合が必要であると考えられている。
シグレック３、５、７、９、１０、１１又は１５の結合部位に対する拮抗又はそのブロッキングは、免疫監視又は免疫活性化を回避するために自己関連分子パターン（ＳＡＭＰ）模倣表面シアル酸リガンドでシグレックを刺激する状態を治療する方法である。この方法を使用する状態としては、癌及び感染症が挙げられる。癌は、その表面にシアル酸構造を発現することにより、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び単球の免疫活性化を回避することがわかっている。Ｂ群レンサ球菌も、免疫侵襲を回避するために、シグレック７に結合するシアル酸リガンドをその表面に発現する。
シアル酸は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのいくつかのウイルスファミリーの侵入点としても使用される。これらのウイルス上の結合受容体は、ヘマグルチニンエステラーゼ（ウイルスＨＥ）、ノイラミニダーゼ（ウイルスＮ）又は宿主細胞の表面上のシアル酸リガンドに結合して、宿主細胞へのウイルス侵入を促進するスパイクタンパク質（ウイルスＳＰ）などのウイルスキャプシド部分又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）による感染性侵入に使用されるシアル酸結合レクチンであるＣＤ１４７であり得る。これらのシアル酸受容体をデコイシアル酸リガンドと結合させることにより、ウイルスが宿主細胞に感染することを防ぐと共に、感染細胞からのウイルス粒子の流出を防止することができる。
急性、慢性又は異常な免疫系活性化から生じる疾患の治療のために、シアル酸結合自己関連パターン認識受容体を刺激するための改良された組成物及び方法が必要とされている。これらのＳＡＭＰ受容体が、癌及び感染症によって免疫監視及び攻撃を回避するように指令されることを阻止することも必要とされる。本発明は、特定のシグレック受容体を特異的且つ強力に刺激するか、遮断するか又はそれに拮抗する密度でシアル酸リガンドを提示することができるナノ粒子を提供する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造式：
Ｐ－Ｌ－Ｇ
（式中、Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含む生体適合性ポリマー足場であり；Ｇは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）であり；及びＬは、共有結合リンカーである）
によって表される分子又はその薬学的に許容される塩を含む粒子である。
別の実施形態では、本発明は、眼科疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
別の実施形態では、本発明は、癌に罹患している対象を治療する方法であり、これは、治療有効量の、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含み、癌は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である。
別の実施形態では、本発明は、感染症に罹患している対象を治療する方法であり、これは、治療有効量の、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含み、感染症は、Ｂ群レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クルーズ・チルパノソーマ（Ｔｙｒｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ＨＩＶ、インフルエンザＡ、Ｂ若しくはＣ、Ｓａｒｓ ＣｏＶ１、Ｓａｒｓ ＣｏＶ２又はヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる。
別の実施形態では、本発明は、免疫細胞における細胞媒介性炎症反応を調節する方法であって、免疫細胞を、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の粒子と接触させることを含む方法である。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
別の実施形態では、本発明は、対象における補体活性化を阻害する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
別の実施形態では、本発明は、補体過剰活性化疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
別の実施形態では、本発明は、粒子を製造する方法であって、第１の不安定部分を含む生体適合性ポリマー足場Ｐと、第２の不安定部分を含むグリカンＧとを、第１の不安定部分及び第２の不安定部分の付加物Ｌを生成するのに十分な条件下で反応させ、それにより、以下の構造式：
Ｐ－Ｌ－Ｇ
（式中、Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーであり；及びＧは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）である）
によって表される分子を生成することを含む方法である。
本明細書に開示される主題をよりよく理解し、それが実際にどのように実施され得るかを例示するために、添付の図面を参照して、非限定的な例として実施形態を説明する。特に図面に関して、示される詳細は、例として且つ本明細書に開示される実施形態の例示的論述の目的のためのものであることが強調される。
銅（ＣＵ）フリークリックケミストリーのためのジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）官能基を有するモジュール式ナノ粒子を示す。 触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）クリックケミストリーのためのアルキン官能基を有するモジュール式ナノ粒子を示す。銅フリークリックケミストリーは、ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分などのアルキンとアジド標識部分との反応に基づく。この反応は、歪み促進型アルキンアジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）として知られている。 ポリシアル酸アジドリガンド合成を示す。 シアリルラクトース－ポリシアル酸アジド－アジドリガンドの共役のためにＤＢＣＯを用いたモジュール式ナノ粒子を示す。 モジュール式ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯナノ粒子に対する２－３シアリルラクトース又は２－６シアリルラクトースリガンドの共役を示す。 ポリシアル酸官能化ナノ粒子を形成するための、ＣｕＡＡＣクリックケミストリーを用いたアルキン－ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノ粒子とポリシアル酸アジドとの反応を示す。 ポリシアル酸官能化ナノ粒子を形成するための、ＣｕＡＡＣクリックケミストリーを用いたアルキン－ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノ粒子とＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－アジドとの反応を示す。 ポリシアル酸及びＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃで官能化されたナノ粒子を形成するための、それぞれＣｕＡＡＣクリックケミストリーを用いる、アルキン－ＰＥＧ－ＰＬＧＡで形成されたナノ粒子及びテトラジン－ＰＥＧ－ＰＬＧＡと、ポリシアル酸アジド及びＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－トランス－シクロオクテンとの反応を示す。 シグレック活性の調節のための細胞機構を示す。 異なる密度のリガンドを例示するナノ粒子を示す。 シアル酸ナノ粒子は、（ａ）シグレック１１、（ｂ）シグレック９、（ｃ）シグレック７、（ｄ）シグレック５に高親和性で且つ用量依存的に結合する。 シアル酸ナノ粒子は、ＭＴＴアッセイによって実証されるように、（ａ）末梢血単球、及び（ｂ）ＴＨＰ－１単球由来マクロファージに対して非毒性である。 例示的なナノ粒子が活性化マクロファージにおけるＩＬ－１０を増加させることを示す。 例示的なナノ粒子がＣＦＨ産生を増加させることを示す棒グラフをまとめて示す。 例示的なナノ粒子がＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＴＮＦ－αを阻害することを示す。 例示的なナノ粒子がＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＶＥＧＦを有意に減少させることを示す。 アジド官能基とのＰＳＡの非還元末端共役のための合成スキームである。 ＰＳＡの熱加水分解のためのワークフローの概略図である。 重合度（ＤＰ）を決定するために使用される加水分解ＰＳＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 本明細書に記載されるナノ粒子とのインキュベーション後のＬＰＳチャレンジＴＨＰ－１細胞におけるＴＮＦ－α産生の抑制を示す棒グラフ図である。 ＡＴ－００７－ＮＰ０４による処理後のＬＰＳチャレンジＭ１マクロファージにおける抗炎症メディエーターＩＬ－１０の用量依存的増加を示す棒グラフである。 ＡＴ－００７－ＮＰ０６による処理後のＬＰＳチャレンジＭ１マクロファージにおける炎症誘発性メディエーターＩＬ－６（Ｂ）及びＴＮＦ－ａ（Ａ）の下方制御を示す。 ブランク－ＮＰ、ＡＴ－００７及びＡＴ－００７－ＮＰ０２を注射した動物からの外顆粒層厚さ（μＭ）を示す棒グラフである。 線維細胞の分化に対するＡＴ－００７－ＮＰ０４の効果を測定するために用いた実験セットアップの概略図である。 表示される薬剤による処理後の線維細胞分化率（％）を示す棒グラフである。 Ｓｙｔｏｘオレンジ色素を用いて測定されたＮＥＴ形成の遅延及び細胞死の遅延におけるＡＴ－００７－ＮＰ０６の効果を測定するために使用される実験セットアップの概略図である。 ％ＳｙＴＯＸ陽性について時間の関数としての動態曲線を示す。 補体経路の概略図である。 補体増幅をシャットダウンするためにＣ３ｂ置換Ｂｂに結合する本明細書に記載のナノ粒子の概略図である。 補体因子Ｈに対するＡＴ－００７－ＮＰ０４の強力な結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定されるＣ３ｂと結合を増強したことを示すセンサグラムである。 補体因子Ｈに対するＡＴ－００７－ＮＰ０４の強力な結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ－Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定されるＣ３ｂと結合を増強したことを示すセンサグラムである。 実験セットアップを例示する概略図であり、その結果は、図３１Ｂに示され、本明細書に記載される。 ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子が代替経路又は古典経路を介した補体活性化を直接防止する能力を示す棒グラフである。 ＣＦＨタンパク質に対するＡＴ－００７－ＮＰ０４及びＡＴ－００７－ＮＰ０６のＥＬＩＳＡで測定された結合親和性を示すプロットである。 バッチＡＴ－００７－ＮＰ０４が、４９０ｎｍでの吸光度によって測定されるシグレック７、９及び１１に対して結合親和性を示すことを実証するプロットである。 シグレック７、９及び１３に対するＰＳＡのセンサグラム（ＢＩＡＣｏｒｅ（商標）ＰＳＲ測定の結果）である。
本明細書において使用される場合、「シアル酸リガンド」とは、シアル酸受容体の少なくとも１つと同族であるシアル酸の任意の単糖又は多糖誘導体を指す。シアル酸とは、天然に存在するか又は合成により得られたいずれかのノイラミン酸又はノイラミン酸の任意の化学修飾を指す。ノイラミン酸の構造式を以下に再現する。
Figure 2023543527000002
シアル酸誘導体の例としては、以下の構造式：
Figure 2023543527000003
 によって表されるＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）及び以下の構造式：
Figure 2023543527000004
 によって表されるＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、炭水化物残基は、共有結合のために１つ以上の位置が修飾されている単糖である。
本明細書で使用される場合、「感染性病原体」は、ウイルス性、細菌性又は寄生虫性病原体であり、受容体は、ヘマグルチニンエステラーゼ、コロナウイルススパイクタンパク質、ウイルスノイラミニダーゼ／シアリダーゼなどのカプシド／莢膜、膜又は核グリカン結合分子／タンパク質／酵素（レクチン）であり得る。
本明細書で使用される場合、「平均断面幅」は、粒子の集合全体で平均した非球状ナノ粒子の中で最も広い部分である。
本明細書で使用される場合、用語「粒子」は、本明細書で定義されるような微粒子及びナノ粒子を含む。
本開示は、免疫系モジュレーター、即ち免疫系のサプレッサー又はアクチベーター、ウイルス／細菌／寄生虫感染力の阻害剤、癌細胞のマスキング解除又は免疫監視を強化するための損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として使用するためのシアル酸リガンドを含む治療薬を提供する。標的細胞集団には、シグレック受容体、ＣＦＨ ＣＣＰ４～６、１９～２０、ウイルスＨＥ、ウイルスＮ、ウイルスＳＰ及びＣＤ１４７を発現するものが含まれる。具体的な実施形態では、送達ビヒクルは、ナノ粒子又は微粒子として製剤化され、ナノ粒子表面上に提示するためのシアル酸、シアル酸誘導体、シアル酸類似体、シアル酸モノマー及び／又はシアル酸ポリマー（本明細書では「シアル酸リガンド」と総称する）を含むリガンドに係留された（共役又は連結された）ポリマーを含む。係留されたシアル酸は、標的細胞の表面に発現されるシグレック受容体などの受容体に対するナノ粒子の標的結合のためのリガンドとして機能する。
一態様において、本開示は、ナノ粒子表面上に提示するためのシアル酸リガンドの共有結合的化学共役を介した係留を達成するポリマーを含むナノ粒子を提供する。炎症プロセスを調節するために、ナノ粒子を用いて、シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン（シグレック）を発現する免疫細胞と接触させることができる。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（シグレック）を発現する免疫細胞を標的とし、これに結合することができるシアル酸リガンドを提供すれば、これを用いて、標的細胞及び関連環境における炎症反応を調節することができると判定された。シグレックは、受容体の自己関連パターン認識ファミリーのメンバーであり、異なる細胞集団上で選択性を発現するシグレックアイソタイプを含む。従って、特定のシグレック受容体に選択的に結合するナノ粒子を設計する能力は、目的の所望の細胞集団に対する標的結合を可能にする。シグレック受容体とナノ粒子のそのような結合は、目的の細胞内のシグレック受容体のシグナル伝達活性を調節し、それにより治療対象における炎症反応の低減又は抗炎症反応の増強をもたらすための手段として使用され得る。
ナノ粒子表面上のシアル酸リガンドの提示は、シアル酸リガンドが、標的細胞又は生物のシグレック受容体によって結合され得るように、それらがナノ粒子上で修飾されることを意味する。好適には、それらは受容体に結合し、それを活性化又は阻害するために提供され得る。理論に縛られることを望むものではないが、炎症反応を調節するか、免疫監視を強化するか又は感染力を阻害するために、ナノ粒子上にシアル酸を提示するには、シアル酸リガンドを特定の濃度密度で提示する必要がある。
単一ナノ粒子をシアル酸リガンドの多価複合体で修飾することができ、これによりこの単一ナノ粒子による異なるシグレック受容体の多価結合が可能になり、その結果、炎症反応が調節される。ユニークなリガンドで修飾されたナノ粒子は、異なるシグレック受容体を標的とし得る他のリガンド修飾ナノ粒子と混合することもでき、これもやはり炎症反応の所望の調節を可能にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子又は微粒子の表面へのシアル酸リガンドの提示は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍又は少なくとも約１０倍の細胞による粒子の取込みの増加をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子又は微粒子の表面へのシアル酸リガンドの提示は、炎症反応を低減することができる。非限定的な実施形態では、炎症反応の低減は、約２倍超、約３倍超、約４倍超、約５倍超、約１０倍超、約２０倍超、約５０倍超、約１００倍超、約５００倍超又は約１０００倍超である。
ナノ粒子又は微粒子は、治療を必要とする対象における標的罹患組織への全身送達又は局所送達に使用することができ、それにより前記対象における炎症反応を調節して、自然炎症及び適応炎症を消散するか、免疫監視の増強が望まれる場合には自然免疫及び／若しくは適応免疫を活性化するか、又は感染性生物の感染力を低減する。標的とされる免疫細胞又はウイルスは、それぞれシグレック受容体又はウイルスシアル酸リガンド結合領域を有する必要がある。自然免疫系の活性としては、例えば、自然免疫系の細胞応答；自然免疫系、補体系、代替補体経路、代替補体経路の増幅ループ及び／又は補体因子Ｈによって活性化される代替補体経路の増幅ループの非細胞性／液性応答が挙げられる。適応免疫系の活性は、樹状細胞の成熟及びＴ細胞への提示、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞調節、Ｔ細胞チェックポイント阻害若しくは活性化、好中球ＮＥＴｏｓｉｓ及びＢ細胞活性化を含む。感染力の低下としては、宿主細胞へのウイルス侵入の減少、ウイルス粒子の繁殖の減少又はウイルス感染に対する炎症反応の低減が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「対象」は、提供される治療方法に従って治療を受ける対象を指す。対象は、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウスなどであり得る。対象は、実験室試験に使用される動物も指す。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、１つ以上のポリマーから構成される粒子を指し、そのナノメートル（ｎｍ）単位のサイズは、１０ナノメートルから２０００ナノメートルの直線寸法の範囲を含む。本明細書で使用される場合、「直線寸法」は、直線で測定されたナノ粒子の表面上の任意の２点間の距離を指す。本開示のナノ粒子は、不規則、長楕円形、紡錘形、棒状、円筒形、パンケーキ状、円盤状、球状、両凹形又は赤血球状であり得る。直線寸法は、限定されないが、ナノ粒子サイズを測定する標準的な手段の一部である透過型電子顕微鏡又は調整可能な抵抗パルスセンシングをはじめとする複数の方法を用いて測定することができる。ナノ粒子のサイズを測定するために広く使用されている技術の１つは、ナノ粒子の直径及び多分散性を賦与することができる動的光散乱（ＤＬＳ）である。ＤＬＳは、ナノ粒子が本質的に球状であり、ナノ粒子のサイズがそうした想定球体の平均直径（又は半径）であると仮定する。このような測定において、ナノ粒子は、１０ｎｍ～１０００ｎｍ又は１ｎｍ～５００ｎｍのサイズ範囲を有すると記述することができる。
本明細書で使用される場合、「微粒子」は、そのマイクロメートル（μｍ）単位のサイズが、１０００μｍ未満且つ１μｍ以上の最大断面幅を含む、１つ以上のポリマーから構成される微小粒子を指す。
ナノ粒子のいくつかのタイプ及び立体配置が本開示に包含される。例えば、ナノ粒子は、限定されないが、生分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、生体吸収性ポリマー又はそれらの組合せを含む様々な材料から構成され得る。生体適合性とは、組織の生物学的機能を不要に妨害しないポリマーを指す。生分解性、生体吸収性及び生体分解性並びに分解、侵食及び吸収という用語は、（文脈上別の解釈が示されない限り）置き換え可能に使用され、血液及び酵素などのその成分などの体液に曝露されたときに分解又は吸収されることが可能であり、及び身体により徐々に再吸収、吸収され得、且つ／又は排除され得るポリマー及び金属を指す。
ナノ粒子のポリマー骨格は、シアル酸リガンドが連結した際、炭水化物若しくはタンパク質などの天然に存在するポリマーで構成され得るか、又は合成ポリマーで構成され得る。ポリマー骨格は、ナノ粒子表面へのシアル酸リガンドの係留をもたらすユニークな末端官能基を有する。ポリマー骨格は、化学的結合法によってナノ粒子を形成する前に、まず複数のシアル酸リガンドと連結され得るか、又はポリマー骨格を最初にナノ粒子に形成した後、ナノ粒子の表面に展示された官能基を化学的結合法によってシアル酸リガンドと連結され得る。
好適なナノ粒子には、ポリマー粒子及びヒドロゲル粒子が含まれる。本明細書で使用される場合、「ポリマー」は、共有結合によって連結された複数の反復構造単位から構成される分子を指す。本明細書で使用される場合、「ポリマー粒子」は、リポソーム及びポリマーソームのシェル様構造及びヒドロゲル粒子の比較的開いた構造とは対照的に、固体又は多孔質粒子を指す。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル粒子」は、水性環境において吸収性であるが、安定したポリマー鎖の架橋ネットワークを指す。
ナノ粒子を調製するために使用され得るポリマーとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：ポリ（Ｎ－アセチルグルコサミン）（キチン）、キトサン、ポリ（３－ヒドロキシバレレート）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（１－ラクチド－コ－グリコリド）ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（４－ヒドロキシブチレート）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバレレート）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アジド、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－メチルテトラジン、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－カルボン酸、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル－ブロック－ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アジド、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アルキン、ポリ（（Ｄ，Ｌ）乳酸）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アジド、ポリ（（Ｄ，Ｌ）乳酸）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アルキン、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）、ポリカプロラクトン－ｂ－ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（グリコリド－コ－カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ－ラクチド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ＤＬ－ラクチド）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリエステルアミド、ポリ（グリコール酸－コ－トリメチレンカーボネート）、アクリレート－ポリ（カプロラクトン）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アルキン、コ－ポリ（エーテルエステル）（例えば、ＰＥＯ／ＰＬＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－コ－アクリル酸）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－コ－メトキシポリ（エチレングリコール）メタクリレート）、ポリホスファゼン、生体分子（フィブリン、フィブリン糊、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン及びヒアルロン酸、エラスチン及びヒアルロン酸など）、ポリウレタン、シリコーン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイソブチレン及びエチレン－アルファオレフィン共重合体、ポリアクリレート以外のアクリル系ポリマー及びコポリマー、ハロゲン化ビニルポリマー及びコポリマー（ポリ塩化ビニルなど）、ポリビニルエーテル（ポリビニルメチルエーテルなど）、ポリハロゲン化ビニリデン（ポリ塩化ビニリデンなど）、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（フッ化ビニリデン－コ－ヘキサフルオロプロピレン）、ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン、ポリビニル芳香族化合物（ポリスチレンなど）、ポリビニルエステル（ポリ酢酸ビニルなど）、アクリロニトリル－スチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド（ナイロン６６及びポリカプロラクタムなど）、チロシン系ポリカーボネートなどのポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリイミド、ポリエーテル、ポリウレタン、レーヨン、レーヨン－トリアセテート、セルロース、セルロースアセテート、セルロースブチレート、セルロースアセテートブチレート、セロハン、硝酸セルロース、セルロースプロピオネート、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース及びフラーレン。
一態様において、ナノ粒子は、生分解性ポリマーポリカプロラクトンから形成され、他の実施形態では、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）を含むポリマーから形成される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ポリマー粒子であり得、特に、粒子は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－１０－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）（ＰＢＣＡ）又はＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマーなどの生分解性ポリエステルから形成され得る。別の態様では、ナノ粒子は、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール及びポリ（ビニルピロリドン）などの非生分解性ポリマーから形成される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ブロックコポリマー（ＢＣＰ）としての生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーの混合物から形成され、ＰＬＧＡ－ブロック－ＰＥＧの好ましい実施形態を含む。ブロックコポリマーは、共有結合によって連結された２つ以上の異なるポリマーサブユニットを有するポリマーを含む。いくつかの実施形態ではナノ粒子は、ブロックコポリマーとしての生分解性及び非生分解性ポリマーの混合物から形成され、ＰＬＧＡ－ブロック－ＰＥＧの好ましい実施形態を含む。さらに別の態様において、ナノ粒子は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キトサン及びアルギン酸塩から形成されるものを含め、ヒドロゲルナノ粒子の形態の天然由来ポリマーから形成される。
ナノ粒子の合成方法は、当業者に周知である。（例えば、Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，７：３０３ ３０３ｒａ１４０及びそこで引用される参考文献を参照されたい）、例えば、既知の分解速度を有するナノ粒子の合成方法は、当業者に公知であり、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，４５１，３３８号明細書、Ｓａｍｕｅｌ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，１６８，８０４号明細書及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，２５８，３７８号明細書に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
目的の標的細胞に発現する受容体への選択的結合に使用するためのシアル酸リガンドで係留された製剤化ナノ粒子又は微粒子が提供される。シアル酸という用語は、任意のモノシアル酸、オリゴマーシアル酸又はポリマーシアル酸若しくはポリシアル酸を指し、シグレック受容体に結合することができるジシアル酸、特に、例えば、シグレック７などの阻害性シグレック受容体に結合特異性を有するシアル酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物又は方法に使用するためのシアル酸は、動物組織及び血液細胞におけるムコタンパク質及び糖タンパク質の成分であるアミノ炭水化物の任意の群であり得る。いくつかの実施形態では、シアル酸（ノヌロソン酸としても知られる）は、９個以上の炭素原子を含むアミノ含有糖のファミリーのメンバーであり、例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（５－（アセチルアミノ）－３，５－ジデオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－Ｄ－ガラクト－ノヌロソン酸、ラクタミン酸及びＯ－シアル酸としても知られる）である。
複数の実施形態では、シアル酸は、モノシアル酸又はジシアル酸などのポリシアル酸であり得ると考えられる。ポリシアル酸は、通常、α立体配置で、２→８及び／又は２→９、及び／又は２→６、及び／又は２→３に連結することができる。複数の実施形態では、シアル酸又はポリシアル酸は、ナノ粒子又は微粒子の表面に係留されている。ポリシアル酸は、複数のシアル酸単位からなるホモポリマーである。ポリシアル酸は、５シアル酸単位未満、好ましくは４シアル酸単位未満、３シアル酸単位未満の長さ及び最も好ましくは２シアル酸単位の長さである。複数の実施形態では、重合度（ＤＰ）は、ＤＰ２～ＤＰ１００超の範囲であり得る。ＤＰは、ＤＰ２～ＤＰ１００、ＤＰ２～９０、ＤＰ２～ＤＰ８０、ＤＰ２～ＤＰ７０、ＤＰ２～ＤＰ６０、ＤＰ２～ＤＰ５０、ＤＰ２～ＤＰ４０、ＤＰ２～ＤＰ３０、ＤＰ２～ＤＰ３０、ＤＰ２～ＤＰ２０、ＤＰ２～ＤＰ１０であり得る。特定の非限定的な実施形態では、重合度は、ＤＰ３～ＤＰ１００である。代替実施形態では、ポリシアル酸は、５つ以上のシアル酸単位を含むことができる。例えば、ポリシアル酸は、少なくとも６つのシアル酸単位、少なくとも７つのシアル酸単位又は少なくとも８つのシアル酸を含むことができる。複数の実施形態では、重合度（ＤＰ）は、ＤＰ５～ＤＰ１０００の範囲であり得る。例えば、重合度は、ＤＰ５～ＤＰ５００、ＤＰ５～ＤＰ１００、ＤＰ５～ＤＰ９０、ＤＰ５～ＤＰ８０、ＤＰ５～ＤＰ７０まで、ＤＰ５～ＤＰ６０、ＤＰ５～ＤＰ５０、ＤＰ５～ＤＰ４０、ＤＰ５～ＤＰ３０、ＤＰ５～ＤＰ２０、ＤＰ５～ＤＰ１０であり得る。特定の非限定的な実施形態では、重合度は、ＤＰ１０～ＤＰ４００、ＤＰ２０～ＤＰ３００又はＤＰ３０～ＤＰ２００である。特定の実施形態では、ＤＰは、ＤＰ５～ＤＰ３０、例えば、ＤＰ５、ＤＰ１０、ＤＰ１５、ＤＰ２０、ＤＰ２５、ＤＰ３０、ＤＰ３５、ＤＰ４０、ＤＰ４５又はＤＰ５０である。特定の実施形態では、ＤＰは、ＤＰ５～ＤＰ５００である。実施形態例では、ＤＰは、ＤＰ１０～ＤＰ３０である。
シアル酸の類似体が使用される実施形態では、この類似体は、本明細書に開示されるシアル酸と構造類似性を有し、特定のシグレックに対する結合親和性を有し得る。適切な類似体は、当技術分野において公知であろう。シアル酸リガンドとシグレック受容体への結合に影響を与える特徴は、シアル酸のカルボン酸官能基間の電荷－距離－配位関係であると考えられる。
具体的な実施形態では、シアル酸は、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＧｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＧｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－６ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１－３（ＮｅｕＡｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＧｃａ２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＧｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＧｃα２－６ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－８ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］ＧｌｃＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－８ＮｅｕＡｃ、ＮｅｕＡｃα２－３ＧａｌβＳβ１－４ＧｌｃＮＡｃα２－３Ｆｕｃ、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ６Ｓα２－３Ｆｕｃ及びＮｅｕＡｃα２－８ＮｅｕＡｃ又はそのようなシアル酸のシアロシド誘導体、例えば、ＢＰＣＮｅｕＡｃシアロシドが挙げられる。
他の多くの合成／非天然に存在するシアリオシド／シアル酸誘導体が利用可能である。シアル酸は、ハイスループットスクリーニング又は細胞ベースのマイクロアレイから取得して、それぞれのシグレック受容体に対して最も高い親和性結合シアル酸類似体／誘導体を得ることができる。
複数の実施形態では、本開示で使用されるシアル酸は、標的とされるシグレック受容体に応じて選択することができ、具体的なシグレックに対する結合優先傾向は、表１から選択され得る。
Figure 2023543527000005
いくつかの実施形態では、適切なシアル酸リガンド又は類似体を、所望する受容体特異性に従ってナノ粒子に共役させることができる。いくつかの実施形態では、シアル酸は、２－８ジシアル酸又は少なくとも１つの位置がシアル酸で占められた２－６若しくは２－３変異体の少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、シアル酸は、α２－８ジアセチルノイラミン酸、α－ＮｅｕＮＡｃ－（２→６）－β－Ｄ－Ｇａｌ－（１→４）－Ｄ－Ｇｌｃ及びα－ＮｅｕＮＡｃ－（２→３）－β－Ｄ－Ｇａｌ－（１→４）－Ｄ－Ｇｌｃの少なくとも１つから選択することができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は、α２－８アセチルノイラミン酸を備えることができる。
シアル酸は、シグレック受容体相互作用を介して免疫系の細胞に自然に結合し、結合を介して前記細胞の活性を調節することができる。従って、本明細書で開示されるナノ粒子は、免疫細胞の表面に発現される特定のシグレックに対するその結合親和性に基づいて、免疫系の特定の細胞に結合するように設計することができる。例えば、マクロファージの活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック７、シグレック９、シグレック１１、シグレック１２、シグレック１５に結合して、これを刺激するか、又はシグレック１６に結合して、これに拮抗するシアル酸リガンド担持ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そのようなシグレックは、マクロファージの表面に発現される。有望な治療的生物学的応答は、マクロファージの消散抗炎症状態であるＭ２ｃ又はマクロファージの老化状態であるマクロファージＭ０へのマクロファージの分極である。別の例では、単球の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック７、シグレック９、シグレック１０、シグレック１３に結合して、これを刺激するか、又はシグレック１４に結合して、これに拮抗するシアル酸リガンド担持ナノ粒子によって調節することができ、それぞれの場合において、このようなシグレックは単球の表面に発現される。生物学的応答は、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３、ＩＬ－２３ｐ４０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ－１、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）及びトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β１）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）などの単球のサイトカイン産生の阻害である。別の例では、ＮＫ細胞の活性は、ＮＫ細胞の表面に発現されたシグレック７に結合するように設計されたシアル酸結合ナノ粒子によって調節され得る。生物学的応答は、パイロトーシスの阻害である。パイロトーシスのマーカーは、ＮＯＤ－、ＬＲＲ－及びパイリンドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）の下方制御、ＩＬ－１βの下方制御及びグランザイムＢの減少である。別の例では、好酸球の活性は、好酸球の表面に発現されるシグレック７、シグレック８（そのマウスホモログシグレックＦを含む）又はシグレック１０に結合して、それを刺激するシアル酸結合ナノ粒子によって調節することができる。生物学的応答は、好酸球の細胞死、肥満細胞の脱顆粒の減少及びヒスタミン産生の減少の誘導である。別の例では、好中球の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック９に結合して、これを刺激するか、又はシグレック１４に結合して、これに拮抗するように設計されたシアル酸結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、このようなシグレックは好中球の表面に発現される。生物学的応答は、ＮＥＴｏｓｉｓの阻害である。ＮＥＴｏｓｉｓ阻害のマーカーは、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、ラクトフェリン及びゼラチナーゼの下方制御である。別の例では、中枢神経系のミクログリア又は他の組織における樹状細胞の活性は、シグレック３、シグレック７又はシグレック９に結合して、これを刺激するように設計されたシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは中枢神経系のミクログリア又は樹状細胞の表面に発現される。生物学的応答は、ＣＤ８０、ＣＤ８３及び／若しくはＣＤ８６成熟及び抗原提示マーカーの上方制御である。別の例では、Ｂ細胞の活性は、シグレック２、シグレック５又はシグレック１０に結合して、これを刺激するように設計されたシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは、Ｂ細胞の表面に発現される。生物学的サイトカイン応答は、リンホトキシン、Ｉｌ－６、インターフェロン－γ及びＴＮＦの阻害である。生物学的細胞マーカー応答は、ＩＧＭ形成の下方制御、クラススイッチＤＮＡ組換えの低減及び／又はクラススイッチ形質細胞の減少である。別の例では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、シグレック７又はシグレック９に結合して、これを刺激するように設計されたシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは、Ｔ細胞の表面に発現される。生物学的サイトカイン応答は、リンホトキシン、Ｉｌ－６、インターフェロンγ及び／又はＴＮＦの阻害である。生物学的応答は、インターフェロンγ、ＴＮＦ、ＬＡＧ－３又はＣＤ１６０の阻害である。生物学的細胞マーカー応答は、２ｂ４及びＰＤ－１の下方制御である。別の例では、ＣＤ３４＋Ｔ細胞の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック９又はシグレック１０に結合して、これを刺激するように設計されたシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは、Ｔ細胞の表面に発現される。生物学的サイトカイン応答は、リンホトキシン、Ｉｌ－６、インターフェロン－γ及びＴＮＦの阻害である。生物学的応答は、インターフェロンγ、ＴＮＦ、ＬＡＧ－３又はＣＤ１６０の阻害である。生物学的細胞マーカー応答は、２ｂ４及びＰＤ－１の下方制御である。別の例では、肥満細胞の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック６又はシグレック８（そのマウスホモログ、シグレックＦを含む）に結合して、これを刺激するシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、それぞれの場合において、そうしたシグレックは、好酸球の表面に発現される。生物学的応答は、肥満細胞の細胞死、肥満細胞の脱顆粒の減少及びヒスタミン産生の減少の誘導である。別の例では、好塩基球の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック６又はシグレック８（そのマウスホモログ、シグレックＦを含む）に結合して、これを刺激するシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは、好塩基球の表面に発現される。生物学的応答は、好塩基球の細胞死、肥満細胞の脱顆粒の減少及びヒスタミン産生の減少の誘導である。別の例では、代替補体カスケードの活性化は、ＣＣＰ領域４～６及び／又は１９～２０においてＣＦＨに結合し、ＣＦＨ及びＹ４０２Ｈ多型を有するＣＦＨの両方の機能を過活性化するシアル酸リガンドを含むナノ粒子によって調節することができる。生物学的応答は、膜攻撃複合体及びＣ３ｂＢｂ若しくはＣ５などの他の補体因子の形成の減少並びに／又は野生型及びＹ４０２Ｈ多型ＣＦＨの両方における切断Ｃ３ｂＢｂ分解産物の増加である。ＣＦＨ活性化の他の下流尺度は、補体活性化のヒツジＲＢＣモデルにおける溶解を低減する能力を含む。別の例では、ウイルスの感染力は、ノイラミニダーゼ又はシアリダーゼに結合して、ウイルスによって発現されるノイラミニダーゼ／シアリダーゼによるノイラミン酸／シアル酸の切断を阻害することができるシアル酸リガンドを含むナノ粒子によって調節することができる。これにより、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣによる感染症でのウイルス粒子の放出が減少するはずである。別の例では、ウイルスの感染力は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のそれぞれのスパイクタンパク質などのウイルスのキャプシドに存在するシアル酸結合部位に結合するシアル酸リガンドを含むナノ粒子によって調節することができる。これは、ウイルス付着又はドッキング分子を阻害、妨害又は調節し、そのような宿主細胞に結合及び感染する能力をブロックすることにより、これらのウイルスが気道細胞又は他の宿主細胞に結合し、感染する能力を低下させるはずである。別の例では、肺炎症の軽減は、ノイラミニダーゼ又はシアリダーゼに結合し、気管支、肺胞及び又は気道の上皮細胞によって発現されるノイラミニダーゼ／シアリダーゼによるノイラミン酸／シアリダーゼによるノイラミン酸／シアル酸の切断を阻害することができるナノ粒子によって調節することができる。これにより、シアリダーゼによって切断され、構成的な抗炎症をもたらす天然の肺シグレックに結合する構成的シス結合シアル酸の分解によって引き起こされる炎症が軽減されるはずである。別の例では、腫瘍関連マクロファージの活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック７、シグレック９、シグレック１１、シグレック１２、シグレック１５に結合して、これに拮抗するか、又はシグレック１６に結合して、これを刺激するシアル酸リガンド担持ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは、マクロファージの表面に発現される。有望な治療的生物学的応答は、免疫監視回避のための腫瘍シグレックアゴニズムの使用から癌細胞を曝露するためのＭ１及びＭ２ａ、ｂ又はｄへのマクロファージの分極である。マクロファージ細胞応答は、貪食及びサイトカイン死滅並びに腫瘍細胞破壊の増大である。別の例では、腫瘍関連単球の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック７、シグレック９、シグレック１０、シグレック１３に結合して、これに拮抗するか、又はシグレック１４に結合して、これを刺激するシアル酸リガンド担持ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは単球の表面に発現する。生物学的応答は、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－２３、ＩＬ－２３ｐ４０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１０、ＭＣＰ－１、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）及びトランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β１）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）などの単球のサイトカイン産生の増強であり、これは、腫瘍監視を回避するためにシグレックアゴニズムを利用する癌細胞の攻撃に関連するため、免疫監視の回復を示すものである。単細胞細胞応答は、貪食及びサイトカイン死滅並びに腫瘍細胞破壊の増大であろう。別の例では、腫瘍関連ＮＫ細胞の活性は、そのようなＮＫ細胞の表面に発現されるシグレック７に結合して拮抗するように設計されるシアル酸結合ナノ粒子によって調節され得る。生物学的応答は、パイロトーシスの増強である。パイロトーシスのマーカーは、ＮＬＲＰ３の上方制御、ＩＬ－１βの上方制御、グランザイムＢの上方制御、トール様受容体１－４の活性化である。ＮＫ細胞応答は、パイロトーシスサイトカイン死滅及び腫瘍細胞破壊の増大である。別の例では、腫瘍関連ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性は、シグレック７又はシグレック９に結合して拮抗するように設計されたシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックは腫瘍関連Ｔ細胞の表面に発現される。生物学的サイトカイン応答は、癌細胞の存在下でのリンホトキシン、Ｉｌ－６、インターフェロン－γ及びＴＮＦの上方制御である。生物学的細胞マーカー応答は、２ｂ４、ＬＡＧ－３、ＣＤ１６０及びＰＤ－１の上方制御である。Ｔ細胞の生物学的応答は、腫瘍細胞を攻撃して、死滅させるための適応免疫系の活性化の増大である。別の例では、ＣＤ３４＋Ｔ細胞の活性は、シグレック３、シグレック５、シグレック９又はシグレック１０に結合して拮抗するように設計されたシアル結合ナノ粒子によって調節することができ、いずれの場合にも、そうしたシグレックはＴ細胞の表面に発現される。生物学的サイトカイン応答は、癌細胞の存在下でのリンホトキシン、ＩＬ－６、インターフェロン－γ及びＴＮＦの上方制御である。生物学的細胞マーカー応答は、２ｂ４、ＬＡＧ－３、ＣＤ１６０及びＰＤ－１の上方制御である。Ｔ細胞の生物学的応答は、腫瘍細胞を攻撃して、死滅させるための適応免疫系の活性化の増大である。別の例では、破骨細胞の活性は、破骨細胞の表面に発現されたシグレック１５に結合するシアル酸リガンド結合ナノ粒子によって調節され得る。
表２は、シグレック及びそれらが最も一般的に発現される細胞型並びに各シグレックの有効なタイプのシアル酸結合を示す。
Figure 2023543527000006
ナノ粒子表面に係留されたシアル酸リガンドは、モノマー、オリゴマー又はポリマーの形態であり得る。特定の実施形態では、シアル酸リガンドは、化学的結合法を用いて、最初にポリマー骨格上に連結され得、続いてポリマー共役－シアル酸リガンド構築物をナノ粒子表面に形成することができる。他の実施形態では、ポリマーは、ナノ粒子表面に露出した官能基を有するナノ粒子に形成され、それによりこれらの官能基がシアル酸リガンドと共役できるようにする。
別の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、１つ以上のシグレック受容体に特異的に結合するナノ粒子を同定することができる。次に、そのような同定されたナノ粒子を試験して、シグレック受容体への前記結合が検出可能な細胞応答を誘導するかどうかを決定することができる。
別の実施形態では、複数のナノ粒子の使用に基づいて、スクリーニングライブラリ及びハイスループットスクリーニング方法が提供され、ナノ粒子の連結シアル酸リガンドは、多様である。このようなライブラリーは、シグレック受容体に特異的に結合するナノ粒子を同定する方法に使用することができ、この方法は、ナノ粒子ライブラリーを、前記シグレック受容体又はシグレック受容体を含む支持体を発現する細胞と接触させることを含む。ナノ粒子ライブラリーのメンバーとシグレック受容体との結合が認められたら、ナノ粒子を試験して、シグレック受容体との前記結合が、検出可能な細胞応答を誘導するかどうかを決定することができる。特定の実施形態では、ポリマーは、ナノ粒子表面に露出した官能基を有するナノ粒子に形成され、それによりこれらの官能基を用いてシアル酸リガンドをナノ粒子表面に係留することができる。本明細書で使用される場合、「モジュール式」ナノ粒子は、１つ以上のシアル酸リガンドを所望の様式でナノ粒子に結合するための普遍的なプラットフォームとして使用することができる特定の官能基を有するナノ粒子を指す。
オリゴマー及びポリマーを含むシアル酸リガンドは、α２－３、α２－６、α２－８又はα２－９グリコシド連結の任意の組合せによって互いに結合され得る。シアル酸又はシアル酸類似体をナノ粒子表面に連結させるグリコシド連結のタイプを調節して、標的シグレック受容体に対する結合親和性を最大化し、特定のシグレックに対する特異性を高めることができる。異なるシグレックは、異なる細胞型によって差次的に発現されることが知られているため、特定のタイプのシアル酸結合の選択を使用して、ナノ粒子とシアル酸リガンドによって接触又は標的にされる細胞のタイプを決定することができる。オリゴマー及びポリマーの形態のシアル酸リガンドは、線状又は分岐構造を有し得る。オリゴマー又はポリマー形態の分岐構造は、隣接するグリコシド結合と異なるグリコシド結合の導入によって形成され得る。オリゴマー及びポリマー形態は、１種類のシアル酸から構成される組成が均一であり得るか、又は複数のシアル酸から構成される組成が不均一であり得る。オリゴマー及びポリマー形態は、シアル酸及び／又はシアル酸類似体に加えて、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトースアミン、グルコース、Ｎ－アセチルグルコースアミン、マンノース、Ｎ－アセチルマンノサミン、フコース又は他の糖／炭水化物などの他の炭水化物モノマーからも構成され得る。
シアル酸は、天然由来（例えば、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ９Ａｃなど）であり得るか、又は任意の合成により調製されたシアル酸類似体を含み得る。シアル酸類似体は、当技術分野で公知である。複数の実施形態では、このような類似体は、位置Ｃ９に置換物を有し得る。類似体は、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７及びＣ８にも置換物を有し得る。類似体は、ノイラミン酸誘導体、シアロシド及び少なくとも１つのノイラミン酸分子を含む任意の糖を含み得る。
シアル酸類似体は、化学合成、化学酵素合成（例えば、ワンポット多重酵素；ＯＰＭＥ）又は前駆体炭水化物（例えば、マンノース誘導体）の細胞供給によるなどの哺乳動物若しくは細菌の細胞合成、組換え法若しくは遺伝子工学的方法を用いて調製され得る。ナノ粒子リガンドとして使用するために調製されるシアル酸類似体は、ワンポット合成又はマイクロアレイプラットフォームを用いて調製され得る。シアル酸類似体リガンドのアレイは、ＨＴＳ法を用いてインサイチュで調製することができる。
ナノ粒子表面へのシアル酸リガンドの化学的結合は、クリックケミストリー反応の使用によって達成され得る。このような反応では、ナノ粒子ポリマーの末端官能基とシアル酸リガンドの末端官能基（本明細書では「末端官能基コンジュゲート対」呼ぶ）との間で化学反応が起こり、これによりポリマーとシアル酸リガンドとの結合が生じる。ポリマーの表面に存在する末端官能基の種類及びその結合パートナーリガンドは、シアル酸リガンドをナノ粒子の表面に化学的に結合するために使用されるクリックケミストリー反応のタイプを決定する。さらに、特定の末端官能基を有するポリマーの選択を用いて、ナノ粒子の表面に提示しようとするシアル酸リガンドコンジュゲートパートナーの種類、密度及び空間配置を制御することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、形成されたナノ粒子表面に化学的結合部位を与える特定の官能基を有し、こうした官能基として、以下のものが挙げられる：アジド、アルキン、アリールエステル、アミド、アミン、アリールアミド、アルデヒド、アセチル、置換アリールエステル、アルキルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、ケトン、ハロゲン化アルキル、アムニオキシ、アルコール、アザ－イリド、カルボン酸、エステル、アミド、ビシクロノニン、ジヒドラジド、ハロ－カルボニル、ハロスルホニル、ヒドラジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、スクシンイミジルエステル、モノフッ素化及びジフッ素化シクロオクチン、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、メチルシクロプロペン、ヒドラジン、ニトリル、ニトロ、ホスフィン、ホスファジド、テルタジン、メチル－テトラジン、トランス－シクロオクテン、歪アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビアリールアザシクロオクチノン、アザジベンジルシクロオクチン、ビニル、スルホニルエステル、チオエステル、チオカルボキシレート、チオエステル、ハロゲン化スルホニル、チオール並びにチオレン。
このような共役部位は、クリックケミストリー反応の性能を通じて、ナノ粒子の表面へのシアル酸リガンドの結合のための位置を提供する。一例では、ナノ粒子は、アジド又はアルキン末端官能基を有するＰＬＧＡ－ＰＥＧポリマーから形成される。非限定的な実施形態では、異なる末端官能基を有する様々なポリマーのブレンドを使用し得る。こうしたポリマーとしては、例えば、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキン、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－エステル及びＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯが挙げられる。特定の態様では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキンとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸とのブレンドをナノ粒子として調製し得る。別の特定の態様では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アキンとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－エステルとのブレンドをナノ粒子として調製し得る。別の具体的な実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸とのブレンドをナノ粒子として調製し得る。別の特定の態様では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－エステルのブレンドをナノ粒子として調製し得る。
ＰＬＧＡポリマーは、遊離末端アルキン基を有することができるが、これらの多くは、粒子マトリックス中に埋没し、粒子の表面への結合に利用することができない。いくつかの実施形態では、粒子の第１のＰＧＬＡポリマー又はコポリマーに加えて、第２のポリマー若しくはコポリマー界面活性剤又はコーティングを付与することにより、より多くのアルキン基を粒子に導入することができる。好適には、第２のポリマー又はコポリマーは、分岐状又は直線状であり得、複数の末端アルキル基を含むことができ、アルキル基は、炭素及び水素のみを含有し、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有する同族列を形成する。他の実施形態では、シアル酸リガンド又は類似体は、共有結合を介して粒子、例えばポリマーナノ粒子に結合することができる。
他の実施形態では、シアル酸リガンドは、ナノ粒子表面に係留を達成する末端官能基（即ち共役部位）を含む。このような末端官能基としては、アジド、アルキン、アリールエステル、アミド、アミン、アリールアミド、アルデヒド、アセチル、置換アリールエステル、アルキルエステル、アルキルケトン、アリールケトン、置換アリールケトン、ケトン、ハロゲン化アルキル、アムニオキシ、アルコール、アザイリド、カルボン酸、エステル、アミド、ビシクロノニン、ジヒドラジド、ハロカルボニル、ハロスルホニル、ヒドラジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、モノフッ素化及びジフッ素化シクロオクチン、マレイミド、メチルシクロプロペン、イソシアノプロパノエート、ヒドラジン、ニトリル、ニトロ、ホスフィン、ホスファジド、テルタジン、メチルテトラジン、トランスシクロオクテン、歪アルキン、ジベンゾシクロオクチン、ビアリールアザシクロオクチノン、プロパルギル、イソシアニド、アザジベンジルシクロオクチン、ビニル、スルホニルエステル、チオエステル、チオカルボン酸塩、チオエステル、ハロゲン化スルホニル、チオール及びチオレンが挙げられる。このような共役部位は、クリックケミストリー反応の性能を通じて、ナノ粒子の表面へのシアル酸リガンドの結合のための位置を提供する。ナノ粒子への官能基（例えば、アルキン）の連結は、典型的には、コンジュゲートクリックケミストリー官能基（例えばアジド）Ｃ２炭素結合を介したコンジュゲートクリックケミストリーによって行われる。
シアル酸リガンドの官能基は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８又はＣ９位に位置するシアル酸コア分子構造上の異なる位置に存在し得る。従って、ナノ粒子の表面へのシアル酸リガンドの結合は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８又はＣ９位での共役を介して起こり得るが、これは、ナノ粒子表面上に３次元空間内のリガンドの異なる配向をもたらし、目的の免疫細胞へのリガンド提示に影響を与え得る。従って、リガンド提示は、このような様式で、受容体結合を介して免疫細胞に接触したときに所望の細胞応答を誘発するように制御することができる。
シアル酸オリゴマー及びシアル酸ポリマー並びにそれらのシアル酸類似体は、既知の間隔及び／又は密度のリガンドを有し、これらは、シグレック受容体のリガンドとしてナノ粒子の表面に提示しようとするものである。特定のシアル酸類似体リガンドをナノ粒子の表面に係留することにより、ナノ粒子は、特定の生物学的応答を誘発し、それにより炎症を調節するために、シグレック受容体を発現する既知セットの免疫細胞と接触させることができる。ナノ粒子の表面に提示されるシアル酸組成、構造、密度及び構築の多様性は、免疫細胞の応答の調節の程度及び方向を調節するための手段を提供する。
モノマー、ポリマー又はオリゴマーの形態をし、且つ隣接するグリカンを有する複数のシアル酸及び／又はシアル酸類似体を、化学的結合によってナノ粒子の表面に係留することができる。このような化学的結合は、例えば、クリックケミストリー、カルボジイミド化学、還元的アミノ化又は化学吸着を含み得る。
好ましい実施形態では、ナノ粒子表面へのシアル酸リガンドの結合のためにクリックケミストリー反応が使用される。このようなクリックケミストリー反応は、生体共役反応に一般に使用される１クラスの生体適合性低分子反応として特徴付けられ、他の分子、生体分子、ナノ粒子及び他の表面を修飾するための化学ライゲーションに使用される。一般に、クリックケミストリー反応は、以下の特性：モジュール性、溶媒パラメータに対する非感受性、高い化学的収率、酸素及び水に対する非感受性、位置特異性及び立体特異性及び単一の反応産物との反応に有利な大きい熱力学的駆動力（＞２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する。クリックケミストリー反応は、高い反応特異性を提供し、位置特異性と立体特異性の両方の制御を賦与する。反応特異性は、ナノ粒子の表面上でのシアル酸リガンドの所望の提示を達成する上で特に有用であり、それによりナノ粒子の免疫細胞シグレック受容体への最適な結合を可能にする。結合中のクリック反応によって形成される結合は、シアル酸リガンドとナノ粒子との間の極めて安定な共有結合へのアクセス可能性を提供し、これらは再構成又は反応を被らないか、又は生物学的条件下で分解又は加水分解を引き起こさない。
様々な異なるクリックケミストリー反応を使用して、シアル酸リガンドをナノ粒子の表面に連結することができる。このようなクリックケミストリー反応の使用は、所望のシアル酸リガンド密度及び空間配置を備えるナノ粒子を生成するための制御された反応媒体を提供する。ナノ粒子表面上のシアル酸リガンドの密度及び空間的配置は、例えば、ナノ粒子を形成するために使用される官能基を有するポリマーの量、ポリマー分子量、ポリマー密度、ポリマー当たりの官能基の数、溶媒、官能基の種類、リガンドの濃度、使用されるクリックケミストリーの種類及びクリックケミストリーコンジュゲート対の種類を調節することによって制御することができる。リガンドの空間的配置は、リガンド上のシアル酸と他の炭水化物との結合によっても制御することができる。オリゴマー及び／又はポリマーリガンドの長さは、密度及び空間配置を制御することもできる。
様々な実施形態では、ポリマー、例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー又はポリシアル酸の平均分子量は、とりわけ、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、粘度測定などの当技術分野で公知の方法のいずれかによって決定することができる。
ポリマーへのシアル酸リガンドの係留に使用されるクリックケミストリー反応は、当業者に周知であり、例えば、ヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）１，３－双極性環化付加、１，３－置換生成物を生成する銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、１，５－置換トリアゾールを生成するルテニウム触媒アルキン－アジド環化付加（ＲｕＡＡＣ）、１，４－置換生成物を生成する歪み促進型アルキンアジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）、歪み促進型アルキン－ニトロン環化付加、アルケン及びテトラジン逆要請型ディールス－アルダー（Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ）、テトラジントランスシクロオクテンライゲーション、チオール－エン反応、チオール－イン反応、シュタウディンガー反応、［４＋１］環化付加、クアドリシクラン（Ｑｕａｄｒｉｃｙｃｌａｎｅ）ライゲーション［２＋２＋２］環化付加、ノルボルネン環化付加及びアルケンテトラゾールフォトクリック反応が挙げられる。
ナノ粒子の表面へのシアル酸又はシアル酸類似体（モノマー、ポリマー又はオリゴマーの形態）の係留は、免疫細胞の表面に発現されるシグレック受容体又はウイルス粒子の表面に発現されるシアル酸リガンド受容体に対する最大の結合親和性のためのシアル酸リガンドの提示を達成するような方法で行われる。リガンド密度は、免疫細胞に接触する際にシグレック受容体との所望の多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）又は多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）リガンド相互作用を提供するように調節することができる。なぜなら、そのような相互作用は、所望の細胞性免疫応答と相関するためである。多価（Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）又は多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）シアル酸受容体相互作用は、ナノ粒子表面にもたらされるリガンドの密度に基づいて制御することができ、この密度は、接触時に免疫細胞によって誘発される応答に影響を及ぼし得る。
好適には、シアル酸又はその類似体は、ナノ粒子の表面に固定化され得る。シアル酸は、ナノ粒子に直接結合され得るか、又はポリエチレングリコールなどのリンカーを介して結合され得る。ナノ粒子は、シアル酸又は類似体の結合を可能にするために誘導体化又は活性化され得る。代わりに、ナノ粒子は、ナノ粒子へのリンカーの結合を可能にするために誘導体化又は活性化され得、リンカーをシアル酸に結合させ得る。シアル酸又はその類似体をナノ粒子に連結することにより、ナノ粒子は、シグレック受容体を含む細胞を標的にして、シグレック受容体の結合を誘導するように適合させることができ、その結果、細胞内での炎症誘発性サイトカインの産生が阻害されるか、又は抗炎症性サイトカインの産生が増加し、それにより炎症誘発性免疫応答が抑制されるようにする。
開示されているように、クリックケミストリー反応を使用するには、ナノ粒子のポリマーとシアル酸リガンドの両方が官能化されて、ナノ粒子表面へのリガンドの所望の結合を可能にする必要がある。一実施形態では、末端アルキンは、銅（Ｉ）－触媒アジド－アルキン（ＣｕＡＡＣ）反応；銅フリー反応；歪み促進型アジド－アルキン反応（ＳＰＡＡＣ）；テトラジン－アルケンライゲーション反応又はトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）－テトラジン反応の実施を通して、アジド提示シアル酸リガンドとの共有化学結合のためにナノ粒子表面に提示される。例えば、シアリルトランスフェラーゼＳＴ８ＳＩＡ４を用いて、シアル酸リガンドにアジド官能基を付加することができる。
一態様では、リガンド／ナノ粒子コンジュゲート対は、アジドを有するシアル酸リガンドとアルキン官能基を有するナノ粒子又はアルキンを有するシアル酸リガンドとアジド官能基を有するナノ粒子との銅（Ｉ）アジド－アルキン環化付加を用いて調製することができる。ジベンジルシクロオクチン、ジフルオロオクチン又はビアリールアザシクロオクチノンを含むシアル酸リガンドは、ＳＰＡＣＣを介してアジドと反応させることができる。トランスシクロオクテンを有するリガンドは、テトラジン官能基を有するナノ粒子と反応させることができる。
特定の非限定的な実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキン又はＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸ナノ粒子を形成した後、クリックケミストリーを用いて、α２－８ポリマーシアル酸－アジドリガンドをナノ粒子の表面に共有結合的に係留することによりその粒子を修飾する。アルキン官能化ＰＬＧＡナノ粒子は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０１８）により使用されるプロトコルに基づくエマルジョン法によって調製され、コアナノ粒子構築物が得られる。形成されたナノ粒子は、ａＣｕＡＡＣクリックケミストリー反応などのクリックケミストリー法による共有化学結合に利用可能な表面にアルキン官能基を付与する。
特定の非限定的な実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ又はＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸ナノ粒子を形成した後、ＳＰＡＣＣクリックケミストリー反応を用いて、α２－８ポリマーシアル酸－アジドリガンドをナノ粒子の表面に共有結合的に係留することによりその粒子を修飾する。ＤＢＣＯ官能化ＰＬＧＡナノ粒子は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０１８）により使用されるプロトコルに基づくエマルジョン法によって調製され、コアナノ粒子構築物が得られる。形成されたナノ粒子は、ＳＰＡＡＣクリックケミストリー反応などのクリックケミストリー法による共有結合化学結合に利用可能な表面にＤＢＣＯ官能基を付与する。
特定の非限定的な実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ又はＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸ナノ粒子を形成した後、ＳＰＡＣＣクリックケミストリー反応を用いて、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－アジドリガンドをナノ粒子の表面に共有結合的に係留することによりその粒子を修飾する。ＤＢＣＯ官能化ＰＬＧＡナノ粒子は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０１８）により使用されるプロトコルに基づくエマルジョン法によって調製され、コアナノ粒子構築物が得られる。形成されたナノ粒子は、ＳＰＡＡＣクリックケミストリー反応などのクリックケミストリー法による共有結合化学結合に利用可能な表面にＤＢＣＯ官能基を付与する。
特定の非限定的な実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ又はＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸ナノ粒子を形成した後、歪み促進型アジド－アルキン環化付加クリックケミストリーを用いてＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ－アジドリガンドをナノ粒子の表面に共有結合的に係留することによりその粒子を修飾する。ＤＢＣＯ官能化ＰＬＧＡナノ粒子は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０１８）により使用されるプロトコルに基づくエマルジョン法によって調製され、コアナノ粒子構築物が得られる。形成されたナノ粒子は、ＳＰＡＡＣクリックケミストリー反応などのクリックケミストリー法による共有結合化学結合に利用可能な表面にＤＢＣＯ官能基を付与する。
ナノ粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド－ＣＯＯＨ）－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＰＬＧＡ １０，０００Ｄａ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ ５０００Ｄａ）とポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アジド（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキン；１０，０００Ｄａ ＰＬＧＡ：１，０００ＰＥＧ Ｄａ）を７５：２５（ｗ／ｗ）のＰＬＧＡ－ＣＯＯＨ：ＰＬＧＡ－アルキン（ＤＢＣＯ）比で混合することによって調製する。この７５：２５比は、ナノ粒子表面上のアジド官能基の密度の一実施形態である。ナノ粒子調製に使用されるＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキン（ＤＢＣＯ）の他の比は、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０である。ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨとＰＬＧＡ－ＰＥＧ－アルキン（ＤＢＣＯ）の比は、官能基間に十分なスペースを提供して、ポリマーリガンドの効率的な結合を可能にし、所望のリガンド密度を達成できるように設計されている。
それぞれのシアル酸リガンド共役パートナーと対合するための異なるクリックケミストリー官能基を有する１つ以上のポリマーを含むナノ粒子を調製することができ、それにより異なる密度及び／又は空間的配置で１種以上のシアル酸リガンドのナノ粒子表面への提示が可能になる。１つ以上のナノ粒子ポリマー／リガンド対を使用することにより、異なるコンジュゲート対の使用をナノ粒子に設計することができる。
具体的な非限定的実施形態では、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ／／ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－カルボン酸ナノ粒子が形成される。次に、それに続く２段階プロセス反応を使用し、不均一クリックケミストリーを用いて２つの異なるリガンドをナノ粒子の表面に共役させる。第１のステップでは、歪み促進型アジド－アルキン環化付加化学反応を用いて、ＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ－アジドリガンドをナノ粒子の表面に共有結合的に係留することによって修飾した。第２のステップの反応ステップでは、ナノ粒子を洗浄して、不純物を除去した後、ＣｕＡＡＣクリックケミストリーを用いて、α２－８オリゴマーシアル酸アジドを表面に共役することができる。Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２０１８）により使用されるプロトコルに基づくエマルジョン法により、ＤＢＣＯ／アルキン官能化ＰＬＧＡナノ粒子を調製し、コアナノ粒子構築物を取得する。形成されたナノ粒子は、段階的な様式のクリックケミストリー法、ＳＰＡＡＣ、続いてＣｕＡＡＣによる共有結合化学結合に利用可能な表面にＤＢＣＯ及びアルキン官能基を付与する。
ナノ粒子表面に利用可能な異なるクリックケミストリー官能基を備えることにより、異なるタイプのシアル酸リガンドをナノ粒子の表面にコンジュゲートすることができる。異なる官能基の密度は、異なるポリマー同士の比、ポリマーの濃度及びクリックケミストリーコンジュゲート対の種類、クリックケミストリー反応の種類並びにシアル酸リガンドのサイズと形状によって制御することができる。表面に提示することができる異なるリガンドの数は、当業者によって決定することができる。非限定的な実施形態では、ナノ粒子表面上に存在する異なるリガンドの数は、１～２０の範囲である。異なるリガンドの数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０である。別の実施形態では、ナノ粒子表面上に存在する異なるリガンドの数は、２～２０の範囲である。異なるリガンドの数は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０である。別の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも２つの異なるシアル酸リガンドを含むであろう。別の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも３つの異なるシアル酸リガンドを含むであろう。別の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも４つの異なるシアル酸リガンドを含むであろう。別の実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも５つの異なるシアル酸リガンドを含むであろう。
一般に、ナノ粒子表面上の官能基の密度は、クリックケミストリーを介した共有結合的化学結合を介してナノ粒子の表面に係留させることができる最大リガンド密度を決定する。リガンド密度は、表面積１平方ナノメートル当たりの官能基数に関して制御及び定量化することができる。達成される密度は、マッシュルーム確認からブラシ確認への移行へのポリマーシアル酸リガンドの移行を可能にする。ブラシ確認は、ポリマーポリシアル酸の最大密度のパッキングを提供する。ナノ粒子表面上のリガンドの密度の調整は、ナノ粒子によって接触される標的免疫細胞の生物学的応答を調節することができる手段を提供する。ナノ粒子の表面に提示されるリガンドの密度は、総ナノ粒子固体のｍｇ当たりのリガンドのｎｍｏｌとして定量することができる。密度は、ナノ粒子の０．０５ｎｍｏｌ／ｍｇ～５０ｎｍｏｌ／ｍｇであり得る。ナノ粒子の粒径は、２５ｎｍ～２００ｎｍであり得る。
ナノ粒子表面上のリガンドの密度は、化学的結合技術、ポリマー上のリガンド密度、リガンドの種類、溶媒、ｐＨ及びイオン強度を含むいくつかの方法によって制御することができる。ナノ粒子の表面上のリガンド密度は、免疫細胞とそのようなナノ粒子の接触により、抗炎症生物学的応答を含む免疫調節応答が得られるように調整することができる。リガンド密度の制御を用いて、所望の抗炎症反応の大きさを調節することもできる。
いくつかの実施形態では、シアル酸又はその類似体は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０又は少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００又は少なくとも４００の群でナノ粒子上に提示することができる。いくつかの実施形態では、シアル酸又はその類似体は、それら又はナノ粒子が２つ以上のシグレック受容体に結合できるように、ナノ粒子の表面上に間隔をあけて配置することができる。いくつかの実施形態では、シアル酸又はその類似体は、それら又はナノ粒子が個々の細胞型に提示される複数のシグレック受容体に結合できるように、ナノ粒子の表面上に間隔をあけて配置することができ、それらは、その原形質膜上に提示されるシグレック受容体の量が変動し得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子に対して０．０５ｎｍｏｌ／ｍｇのシアル酸からナノ粒子に対して２５０ｎｍｏｌ／ｍｇのシアル酸、好ましくは０．５ｎｍｏｌ／ｍｇ～２５ｎｍｏｌ／ｍｇ、最も好ましくはナノ粒子ｍｇ当たり０．５～１５ｎｍｏｌのシアル酸の範囲の濃度でシアル酸を含有するポリマーを含むことができる。いくつかの実施形態では、このようなナノ粒子で、デバイスをコーティングすることができる。代替的な実施形態では、ポリマーからデバイスを形成することができ、例えば、その場合、デバイスは、微粒子又はナノ粒子であり、シアル酸は、ナノ粒子に対して０．０５ｎｍｏｌ／ｍｇのシアル酸からナノ粒子に対して２５０ｎｍｏｌ／ｍｇのシアル酸、好ましくは１ｎｍｏｌ／ｍｇ～２５μｇ／ｍｇ、最も好ましくはナノ粒子ｍｇ当たり２～１５ｎｍｏｌのシアル酸の範囲の濃度でポリマー中に提供される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、最大断面幅又は粒径が約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満又は約２００ｎｍ未満であり得る。複数の実施形態では、ナノ粒子は、約１ｎｍ超、約１０ｎｍ超、約５０ｎｍ超又は約１００ｎｍ超の幅を有し得る。複数の実施形態では、シアル酸又はシアル酸類似体でコーティングされたナノ粒子は、約１３０ｎｍ～約１７０ｎｍの範囲の最大の断面幅又は直径、より好ましくは約１５０ｎｍの幅を有し得る。いくつかの実施形態では、これらのサイズ範囲は、ナノ粒子の平均幅であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の少なくとも８０％は、開示される範囲内で存在する。
好適には、いくつかの実施形態では、少なくとも８０％前後、より好ましくは少なくとも９０％の粒子は、１３０ｎｍ～１７０ｎｍの最大断面幅を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、１５０ｎｍの平均最大断面幅を有することができ、粒子は、１５０ｎｍの１標準偏差以内にない値より大きい又は小さい幅を有しない。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１０ｎｍ～５００ｎｍ、好適には５０ｎｍ～２５０ｎｍ若しくは１００ｎｍ～２００ｎｍ又は１３０ｎｍ～１７０ｎｍの直径を有する球体に等しい体積を有し得る。
好ましい、非限定的な実施形態では、ナノ粒子は、約１００ｎｍの直径を有する球体に等しい体積を有し得る。
本発明の別の態様において、ナノ粒子とシアル酸リガンドとの連結は、ナノ粒子が免疫系、即ち細網内皮系（ＲＥＳ）を介したオプソニン化及び食作用を回避するための手段を提供する。ナノ粒子のＰＥＧ化、即ちポリエチレングリコールによるナノ粒子のコーティングは、免疫細胞による検出からの保護の障壁を提供することが知られている。しかし、ＰＥＧは、毒性、免疫原性、細胞取込みの低減、結合の低減及び非生分解性又は生体吸収特性という欠点を有する。ナノ粒子のシアル酸コーティングは、ＰＥＧの欠点を解消し、ＲＥＳ及び免疫検出を回避することができる天然の非免疫原性ナノ粒子コーティングを提供する。従って、本明細書で開示されるナノ粒子は、免疫検出を回避し、免疫原性応答を軽減する能力を有する。
本明細書に開示されるナノ粒子若しくは微粒子は、前記ナノ粒子の内部に封入されるか、表面に付着するか又はその構造に組み込まれた生物活性剤をさらに含み得る。例えば、ナノ粒子は、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、サイトカイン、サイトカイン阻害剤、免疫調節剤、免疫毒素、抗血管新生剤、降圧剤、抗浮腫剤、放射線増感剤、ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗癌剤又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つをさらに含むことができる。ナノ粒子の内部に封入されるか、ナノ粒子の表面に付着するか又はその構造に組み込まれた生物活性剤を含むナノ粒子を調製する方法は、当業者に公知である。
本開示はさらに、本明細書に開示されるシアル酸リガンド結合ナノ粒子を含む医薬又は獣医学組成物を提供する。このような医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例として、例えば、静脈内、硝子体内、経口、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、静脈内、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下、肺洗浄、胃洗浄、肝内、皮下及び直腸投与を含む非経口投与方法の両方が挙げられる。
適切には、いくつかの実施形態において、ナノ粒子を非経口投与することができる。非経口投与後、ナノ粒子は、特定の組織又は身体位置に選択的に蓄積することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、治療ペイロードを細胞又は組織に送達することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、増強された透過性及び保持効果によって罹患組織に進入することができる。
一般に、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に有効量のナノ粒子を含む医薬組成物が提供される。このような組成物は、種々のバッファー含量（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば、洗剤及び可溶化剤（例えば、ｔｗｅｅｎ ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）を含む。このような組成物は、ナノ粒子の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、以下を参照されたい：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）１４３５～１７１２頁（これらは、参照により本明細書に援用される）。組成物は、液体形態で調製され得るか、又は凍結乾燥形態などの乾燥粉末に製剤化され得る。
本開示は、限定されないが、乾性及び滲出型黄斑変性、網膜血管疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、関節リウマチ、炎症性関節炎、狼瘡、腎炎、免疫複合腎症、アレルギー性食道炎、アレルギー性胃炎、肝炎、肝臓線維症、特発性肺線維症、急性呼吸窮迫症候群、敗血症、細菌及びウイルス感染症、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ群レンサ球菌感染症、ナイセリア感染症、固形臓器に関与する癌又は血液癌を含め、いずれの場合にも、上記の医薬組成物の投与により、罹患した対象における免疫及び炎症性関連疾患を治療する方法を提供する。本開示は、細胞内の炎症性応答を調節する方法を提供し、この方法は、シアル酸又はその類似体を細胞に提供することを含み、シアル酸若しくはその類似体は、細胞内の炎症誘発性応答が抑制されるか、又は細胞内の抗炎症反応が増大するように、ナノ粒子上に提示される。複数の実施形態では、本方法は、炎症誘発性応答の抑制を提供する。代替的実施形態では、本方法は、抗炎症反応の増大を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、感染症又は癌のような状況における炎症誘発性応答の増強を提供する。
本明細書で使用される用語「治療（処置）」又は「治療（処置）する」は、（１）疾患、障害若しくは状態の発症の遅延又は予防；（２）疾患、障害若しくは状態の１つ以上の症状の進行、重症化又は悪化の緩徐化又は停止；（３）疾患、障害若しくは状態の症状の改善をもたらすこと；（４）疾患、障害若しくは状態の重症度又は発生率の低下；又は（５）病気、障害若しくは状態の治癒を目的とする方法又はプロセスを特徴付けるものである。処置は、予防又は防止作用のために疾患、障害又は状態の発症前に施すことができる。代わりに又は追加的に、治療作用のために疾患、障害又は状態の開始後に処置を実施し得る。
投与経路及び疾患に応じて、有効用量は、治療しようとする対象の体重、体表面積、原発臓器／腫瘍のサイズ並びに／又は転移の数、サイズ及び／若しくは種類に応じて算出することができる。適切な投薬量の最適化は、ヒト臨床試験において観察される薬物動態データを考慮し、当業者によって容易に行うことができる。最終的な投与計画は、薬物の作用を変える様々な要因、例えば、薬剤の比活性、損傷の重症度及び患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、あらゆる既存の感染症の重症度、投与時間、他の治療法の使用（又は不使用）並びに他の臨床的要因を考慮することにより決定されることになる。
一態様において、炎症誘発性反応は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％抑制することができる。代替的実施形態では、抗炎症反応を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％及び少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％増大することができる。他の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、炎症誘発性応答の抑制及び抗炎症性応答の増大を提供することができる。
好適には、炎症誘発性サイトカインを測定して、ナノ粒子薬物治療の有効性を決定することができる。このような測定は、対象の実際の治療中又は代替的に本明細書に開示されるナノ粒子の動物試験中に行うことができる。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、例えば、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６を含み得る。好適には、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０を測定することもできる。そのようなサイトカインを測定するのに好適なアッセイ方法は、当業者に周知であろう。例えば、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い得る。細胞が炎症誘発性サイトカインを産生するか否かを決定するために、使用することができる適切な方法は、細胞を再懸濁し、９６ウェルプレートにウェル当たり２×１０５細胞／ｍｌ及び２００μｌで播種するというものである。その後、細胞をプレートに一晩付着させたままにし、様々な濃度のＬＰＳ及びリガンドで２４時間処理することができる。続いて、上清を取り出し、－７０℃で保存することができる。次に、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によりサイトカインレベルを評価することができる。理解されるように、抗炎症性サイトカインを決定するために類似の方法を適用することができる。
一実施形態では、ＴＮＦ－αレベルは、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＴＮＦ－α捕捉抗体で９６ウェルプレートを一晩コーティングすることにより、適切に決定することができる。全てのステップを室温で実施することができる。１×ＰＢＳ／０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）でウェルを３回洗浄した後、１×ＰＢＳに溶解させた１％ＢＳＡ（ＢＤＨ）で１時間ブロックすることができる。洗浄ステップを繰り返し、５０μｌの処理済み細胞上清又は２０００ｐｇ／ｍｌ～０ｐｇ／ｍｌの範囲の標準物質をウェルに添加し、２時間放置することができる。続いて、上清を吸引して取り出し、ウェルを３回洗浄し、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで希釈したＴＮＦ－α検出抗体５０μｌを２時間かけて添加することができる。再度、ウェルを３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中に１：２００希釈で２０分間かけて添加することができる。この段階で、プレートをアルミホイルで覆うことができる。ウェルを洗浄したら、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を２０分かけて添加し、再度光から保護することができる。１Ｍ塩酸を添加して反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎＭの吸光度を読み取ることができる。次に、ＴＮＦ－α濃度を標準曲線から外挿することができる。理解されるように、ＴＮＦ－α検出抗体の代わりに、適用可能なサイトカインに特異的な検出抗体又は他の薬剤を用い、類似の方法を適用して、他のサイトカインレベルを決定することができる。
一実施形態では、ＩＬ－１０レベルは、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＩＬ－１０捕捉抗体で９６ウェルプレートを一晩コーティングすることにより、適切に決定することができる。全てのステップを室温で実施することができる。１×ＰＢＳ／０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）でウェルを３回洗浄した後、１×ＰＢＳに溶解させた１％ＢＳＡ（ＢＤＨ）で１時間遮断することができる。洗浄ステップを繰り返し、５０μｌの処理済み細胞上清又は２０００ｐｇ／ｍｌ～０ｐｇ／ｍｌの範囲の標準物質をウェルに添加し、２時間放置することができる。続いて、上清を吸引して取り出し、ウェルを３回洗浄し、１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳで希釈したＩＬ－１０検出抗体５０μｌを２時間かけて添加することができる。再度、ウェルを３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を１％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ中に１：２００希釈で２０分かけて添加することができる。この段階で、プレートをアルミホイルで覆うことができる。ウェルを洗浄したら、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を２０分かけて添加し、再度光から保護することができる。１Ｍ塩酸を添加して反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎＭの吸光度を読み取ることができる。次に、ＩＬ－１０濃度を標準曲線から外挿することができる。理解されるように、ＩＬ－１０検出抗体の代わりに、適用可能なサイトカインに特異的な検出抗体又は他の薬剤を用い、類似の方法を適用して、他のサイトカインレベルを決定することができる。
処置対象又は被験動物が、増大又は低減した炎症誘発性応答を生成するか否かを決定するために、使用され得る方法は、血清サイトカインレベルの分析である。例えば、これは、毛細管を用いて、処置対象から５０μｌの血液を採取することにより達成され得る。この血液を室温で３０分間凝固させてから、１３００ｒｐｍで遠心分離して赤血球をペレット化する。血清を清潔なマイクロ遠心チューブにデカントし、ＥＬＩＳＡによって分析する。より詳細な分析のために、より多量の血液（約６００μｌ～１ｍｌ）を直接心臓穿刺によって採取し得、このようにしてＥＬＩＳＡ又はそうした他の技術よりも多量の血清を収集して分析することができる。特にサイトカインを検出及び測定するために、処置対象又は被験動物が、増大又は低減した炎症誘発性応答を生成するか否かを決定するための他の好適な技術は、当技術分野において公知であろう。
ナノ粒子が提供される方法のいくつかの実施形態では、細胞上のシグレック受容体との結合は、細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を阻害し、抗炎症性サイトカインを誘導することができることが判定された。複数の実施形態では、細胞上のシグレック受容体とナノ粒子の結合は、受容体の活性化をもたらすことができ、且つ受容体及びナノ粒子の細胞内への内在化を誘導することができる。ナノ粒子の内在化後、細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することができ、且つ／又は抗炎症性サイトカインの産生を増加することができる。
従って、それを必要とする対象において、炎症性疾患を治療する方法が提供され、前記方法は、シアル酸又はその類似体を対象に投与することを含み、シアル酸又は類似体は、対象において炎症誘発性免疫応答が抑制されるか、又は抗炎症性免疫応答が増大するようにナノ粒子に提示される。
前記方法は、炎症誘発性免疫応答を有し、且つ／又は炎症誘発性免疫応答に関連するか若しくはそれにより引き起こされる障害に罹患しているか、或いは炎症誘発性免疫応答又は炎症誘発性免疫応答に関連するか若しくはそれにより引き起こされる障害を発症するリスクがある対象を識別すること；シアル酸又はその類似体を対象に投与することを含み得、シアル酸又は類似体は、ナノ粒子に提示される。
具体的な実施形態では、本方法は、肺疾患を有する対象を治療するために使用することができ、そうした肺疾患として、肺の炎症性及び非炎症性疾患、限定されないが、結核、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺線維症間質性肺疾患、肺血管疾患、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、細菌性肺炎、アレルギー性気管支炎、非アレルギー性気管支炎、鼻炎、線維性肺胞炎が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、関節リウマチ、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症（強皮症）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、痛風、変形性関節症、感染性関節炎及び若年性特発性関節炎を含むリウマチ性疾患の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、セリアック病、憩室炎、胃食道逆流症、乳糖不耐症、消化性潰瘍、胆嚢炎、胃炎、大腸炎、膵炎、自己免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎及び膵炎を含む胃腸炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、敗血症性ショック、アテローム性動脈硬化症、拡張機能障害、心不全、心線維症、コクサッキー心筋炎、先天性心ブロック、自己免疫性心筋炎、巨細胞性心筋炎及び炎症を含む心血管疾患の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、腎臓移植拒絶反応、糸球体腎炎、急性腎炎、膀胱炎、前立腺炎糖尿病性腎炎、糖尿病性腎疾患及び尿路感染症を含む腎炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、皮膚炎、湿疹、炎症性発疹、強皮症、ケロイド、ざ瘡、サルコイドーシス、股部白癬、体部白癬、足白癬、頭部白癬、爪白癬、酒さ、白斑、苔癬硬化症、自己免疫蕁麻疹、皮膚筋炎及び化膿性汗腺炎を含む皮膚科炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、神経脊髄炎、多発性硬化症、脳炎、神経サルコイドーシス、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症及び舞踏病ハンチントンを含む神経学的炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、糖尿病、ＳＬＥ、多発性硬化症、シェーグレン症候群、アジソン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、セリアック病、悪性貧血、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性内耳疾患、ギランバレー、川崎病、ランバート・イートン症候群、フォークト－小柳－原田症候群、全身性血管炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス、結節性多発動脈炎を含む自己免疫性炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ニューカッスル病（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、カクリウイルス（Ｃａｃｌｉｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ピコロノウイルス（Ｐｉｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）及びコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）を含むウイルス性炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、真菌血症、真菌性膿瘍、真菌角膜炎、カンジダ症、足白癬及び股部白癬を含む真菌性炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、アメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症及びトキソカラを含む寄生性炎症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、特発性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、拡張機能障害及びＣＨＦを伴う心線維症、腎線維症、網膜線維症、皮膚線維症並びに瘢痕化を含む線維症の治療に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、限定されないが、敗血症及びサイトカインストームシアル酸を含む、急性の生命を脅かす炎症の処置に使用することができる。具体的な実施形態では、黄斑変性症、ブドウ膜炎、視神経炎、神経脊髄炎及び眼の感染、薬物及び毒素に対する眼曝露から起こる炎症などの複数の眼炎症性疾患並びに自己免疫疾患を含む一般的な免疫障害を治療する方法が提供される。非限定的な実施形態では、患者における乾性黄斑変性症、滲出型黄斑変性症、地図状萎縮、中度の黄斑変性症及び加齢黄斑変性症などの黄斑変性症を予防、治療又は改善するのに有用な方法が提供される。黄斑変性症を含む眼の炎症を治療、予防又は改善する方法は、黄斑変性症などの眼の炎症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある患者にシアル酸リガンドナノ粒子の組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、眼科用調製物は、点眼剤、眼軟膏又は眼科用注射剤として提供される。眼科用注射剤の場合、ナノ粒子を投与するために、硝子体内又は結膜下注射剤が使用され得る。
黄斑変性を治療、予防又は改善する方法に用途を有する追加化合物の併用投与は、黄斑変性を処置するために使用されるナノ粒子含有医薬組成物と一緒に共投与され得る。例えば、滲出型加齢黄斑変性を治療するための抗血管新生薬剤、例えばペガプタニブナトリウム、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリブレセプト及びブロルシズマブを併用剤として使用することができる。本開示の特定の実施形態が示され、説明されるが、そのより広範な態様において、開示から逸脱することなく変更形態及び修正形態がなされ得ることは、当業者に明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の趣旨及び範囲内に含まれる全ての変更形態及び修正形態をその範囲内に包含するものとする。
従って、第１の実施形態例において、本発明は、以下の構造式：
Ｐ－Ｌ－Ｇ
によって表される分子を含む粒子である。
第１の実施形態例の第１の態様において、Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含む生体適合性ポリマー足場であり；Ｇは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）であり；及びＬは、共有結合リンカー又はその薬学的に許容される塩である。
第１の実施形態例の第２の態様において、ポリマー足場は、ブロックコポリマーＰＬＧＡ－ＰＥＧを含む。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第３の態様において、Ｐは、以下の構造式：
Figure 2023543527000007
 （式中、記号
Figure 2023543527000008
 は、リンカーＬへのポリマーの結合点を表し、さらに、ｘは、０～２０、例えば０～１０の整数であり、ｙは、０～２０、例えば０～１０の整数であり、ｍは、１～１０００、例えば１～５００の整数であり、及びｎは、ｘとｙとが同時に０でないことを条件として、５～４５０の整数である）
によって表される。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第４の態様において、ｎ個のＧは、以下の構造式：
Figure 2023543527000009
 のいずれか１つによって表されるか、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、記号
Figure 2023543527000010
 は、リンカーＬへのＧの結合点を表し、さらに、重合度（ＤＰ）としても知られるｐは、４～１９８の整数である。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第５の態様において、ｐの値は、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０及び５０～６０の範囲のいずれか１つから選択される。例えば、ｐの値は、５～２５又は１０～２０であり得る。例えば、ｐの値は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０であり得る。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第６の態様において、リンカーＬは、以下の構造式のいずれか１つによって表される（式中、記号
Figure 2023543527000011
 は、ＧへのリンカーＬの結合点を表し、記号
Figure 2023543527000012
 は、ＰへのリンカーＬの結合点を表す）：
Figure 2023543527000013
 （式中、Ｒ１１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－又は－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－Ｏ－であり；Ｒ１２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ１１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ１２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ１１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ１２は、Ｈ又はメチルである）；
Figure 2023543527000014
 （式中、Ｒ２１は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－であり；Ｒ２２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ２１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ２２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ２１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ２２は、Ｈ又はメチルである）；
Figure 2023543527000015
 （式中、Ｒ３１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；Ｒ３２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ３１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ３２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ３１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ３２は、Ｈ又はメチルである）；
Figure 2023543527000016
 （式中、Ｒ４１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；Ｒ４２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ４１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ４２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ４１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ４２は、Ｈ又はメチルである）；
Figure 2023543527000017
 （式中、Ｒ５１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；Ｒ５２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ５１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ５２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ５１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ５２は、Ｈ又はメチルである）；
Figure 2023543527000018
 （式中、Ｒ６１は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－であり；Ｒ６２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－ＮＨ－である）；
Figure 2023543527000019
 （式中、Ｒ７１は、－ＮＨＣ（Ｏ）－又は－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－ＣＨ２－であり；及びＲ７２は、－（ＣＨ２）１～１０－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－ＮＨ－である）；
Figure 2023543527000020
 （式中、Ｒ８１及びＲ８２は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－である）；
Figure 2023543527000021
 （式中、Ｒ９１は、－ＮＨＣ（Ｏ）－又は－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－ＣＨ２－であり；及びＲ９２は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－である）；
Figure 2023543527000022
 （式中、Ｒ１０１は、Ｈ又はメチルであり；Ｘ１０は、Ｏ又はＮＨであり；及びＲ１０２は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
Figure 2023543527000023
 （式中、Ｘ１０１、Ｘ１０２及びＸ１０３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
Figure 2023543527000024
 は、カルボニルＡへの結合点を表す）
のいずれか１つによって表される部分である）；
Figure 2023543527000025
 （式中、Ｒ１１１及びＲ１１１Ａは、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１～Ｃ３アルキルであり；且つＸ１１及びＸ１１Ａは、それぞれ独立に、Ｏ又はＮＨであり；Ｒ１１及びＲ１１Ａは、独立に、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
Figure 2023543527000026
 （式中、Ｘ１１１、Ｘ１１２及びＸ１１３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
Figure 2023543527000027
 は、カルボニルＢ又はカルボニルＢ’への結合点を表す）
のいずれか１つによって表される部分である）；
Figure 2023543527000028
 （式中、Ｘ１２は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）１～１０－であり；及びＲ１２は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
Figure 2023543527000029
 （式中、Ｘ１２１、Ｘ１２２及びＸ１２３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
Figure 2023543527000030
 は、カルボニルＣへの結合点を表す）
のいずれか１つによって表される部分である）；
Figure 2023543527000031
 （式中、Ｘ１３は、－Ｐｈ－又は－ＣＨ２－Ｐｈ－ＣＨ２－であり、Ｐｈは、フェニルであり；及びＲ１３は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
Figure 2023543527000032
 （式中、Ｘ１３１、Ｘ１３２及びＸ１３３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０－であり、記号
Figure 2023543527000033
 は、カルボニルＤへの結合点を表す）
のいずれか１つによって表される部分である）；
Figure 2023543527000034
 （式中、Ｘ１４及びＸ１５は、それぞれ独立に、Ｈ又はメチルであり、Ａ１４及びＡ１５は、それぞれ独立に、ＮＲＡ、ＮＲＡＮＲＢ、Ｏ又はＳであり、ＲＡ及びＲＢは、出現毎に独立に、Ｈ、Ｃ１～４アルキル及びＣ６～Ｃ１８アリールから選択され；且つＲ１４及びＲ１５は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０－である）。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第８の態様において、リンカーＬは、以下の構造式：
Figure 2023543527000035
 （式中、ａは、２～６の整数であり；及びＲＡは、存在しないか、又は－（ＣＨ２）１～２－Ｏ－（ＣＨ２）１～２－ＮＨ－である）
によって表される。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第９の態様において、Ｐは、ＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）である。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１の実施形態例の第１０の態様において、Ｐの単位重量当たりのＧの重量（リガンド密度）は、０．５μｇ／ｍｇ～１００μｇ／ｍｇである。例えば、リガンド密度は、１０～７５μｇ／ｍｇ又は１０～７５μｇ／ｍｇであり得る。別の例では、リガンド密度は、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００μｇ／ｍｇであり得る。第１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第２の実施形態例において、本発明は、眼科疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例の態様のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
第２の実施形態例の第１の態様において、眼科疾患は、乾性加齢黄斑変性症、滲出型加齢黄斑変性症、非増殖性糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ドライアイ、結膜炎、甲状腺眼症、眼内炎、網膜変性症、緑内障、網膜静脈閉塞症、眼瞼炎、角膜炎、眼感染症又は白内障である。第２の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第２の実施形態例の第２の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアンタゴニストである。第２の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第３の実施形態において、本発明は、炎症性疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
第３の実施形態例の第１の態様において、投与経路は、静脈内、硝子体内、経口、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下洗浄、肺洗浄、胃洗浄及び肝内、皮下又は直腸の１つ以上である。
第３の実施形態例の第２の態様において、炎症性疾患は、結核、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺線維症間質性肺疾患、肺血管疾患、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、細菌性肺炎、アレルギー性気管支炎、非アレルギー性気管支炎、鼻炎又は線維化性肺胞炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第３の態様において、炎症性疾患は、関節リウマチ、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症（強皮症）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、痛風、変形性関節症、感染性関節炎又は若年性特発性関節炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第４の態様において、炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、セリアック病、憩室炎、胃食道逆流症、乳糖不耐症、消化性潰瘍、胆嚢炎、胃炎、大腸炎、膵炎、自己免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎又は膵炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第５の態様において、炎症性疾患は、敗血症性ショック、アテローム性動脈硬化症、拡張機能障害、心不全、心線維症、コクサッキー心筋炎、先天性心ブロック、自己免疫性心筋炎又は巨細胞性心筋炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第６の態様において、炎症性疾患は、腎移植拒絶反応、糸球体腎炎、急性腎炎、膀胱炎、前立腺炎、糖尿病性腎炎又は糖尿病性腎疾患である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第７の態様において、炎症性疾患は、皮膚炎、湿疹、炎症性発疹、強皮症、ケロイド、ざ瘡、サルコイドーシス、股部白癬、体部白癬、足白癬、頭部白癬、爪白癬、酒さ、白斑、苔癬硬化症、自己免疫蕁麻疹、皮膚筋炎又は化膿性汗腺炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第８の態様において、前記炎症性疾患は、糖尿病、ＳＬＥ、多発性硬化症、シェーグレン症候群、アジソン病、バセドウ病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、セリアック病、悪性貧血、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性内耳疾患、ギランバレー、川崎病、ランバート・イートン症候群、フォークト－小柳－原田症候群、全身性血管炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス又は結節性多発動脈炎である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第９の態様において、炎症性疾患は、神経脊髄炎、多発性硬化症、脳炎、神経サルコイドーシス、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症又はハンチントン舞踏病、横断性脊髄炎、ギランバレー症候群、パーキンソン病又は良性本態性振戦である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１０の態様において、炎症性疾患は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、カクリウイルス（Ｃａｃｌｉｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ピコロノウイルス（Ｐｉｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）又はコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）によって引き起こされるウイルス性疾患である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１１の態様において、炎症性疾患は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、好気性細菌、嫌気性細菌又は抗生物質耐性菌によって引き起こされる細菌性疾患である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１２の態様において、炎症性疾患は、真菌血症、真菌性角膜炎、カンジダ症、足白癬又は股部白癬である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態の第１３の態様において、炎症性疾患は、アメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症又はトキソカラである。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１４の態様において、炎症性疾患は、特発性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、拡張機能障害及びＣＨＦを伴う心線維症、腎線維症、網膜線維症、皮膚線維症並びに瘢痕化である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１５の態様において、前記炎症性疾患は、敗血症、サイトカインストーム又は鎌状赤血球症である。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第３の実施形態例の第１６の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである。第３の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第４の実施形態例において、本発明は、癌に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
第４の実施形態例の第１の態様において、癌は、原発性肺癌、転移性肺癌、乳癌、結腸癌、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、脊椎癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、眼の癌、鼻咽頭癌又は皮膚癌である。
第４の実施形態例の第２の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである。第４の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第４の実施形態例の第３の態様において、本方法は、治療有効量の、イピリムマブ、ニボリムマブ、ペブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又はセミプリマブから選択されるチェックポイント阻害剤を対象に投与することをさらに含む。第４の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第４の実施形態例の第４の態様において、粒子の投与は、放射線療法と同時であるか又はそれに続くものである。第４の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第４の実施形態例の第５の態様において、本方法は、治療有効量の、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ブレオマイシン、ダカルバジン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エピルビシン、シスプラチン、タモキシフェン、タキソテール、Ｈｅｒ２ｎｅｕ阻害剤、抗ＶＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ソラフェニブ又はｍＴＯＲ阻害剤から選択される第２の治療薬を対象に投与することをさらに含む。第４の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第５の実施形態例において、本発明は、癌に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。第５の実施形態例の第１の態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である。
第５の実施形態例の第１の態様において、本方法は、治療有効量のダウノルビシン、シタラビン又はイマチニブを対象に投与することをさらに含む。
第５の実施形態例の第２の態様において、粒子の投与は、幹細胞移植又は骨髄移植と同時であるか又はそれに続くものである。第５の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第６の実施形態において、本発明は、感染症に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態のいずれかの態様に記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。第６の実施形態例の第１の態様において、感染症は、Ｂ群レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クルーズ・チルパノソーマ（Ｔｙｒｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ＨＩＶ、インフルエンザＡ、Ｂ若しくはＣ、Ｓａｒｓ ＣｏＶ１、Ｓａｒｓ ＣｏＶ２又はヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる。
第６の実施形態例の第２の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニストである。第６の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第６の実施形態の第３の態様において、本方法は、治療有効量の、ザナミビル、オセルタミビル、バルシクロビル、アシクロビル又はジドブジンの１つ以上を対象に投与することをさらに含む。第５の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第６の実施形態例の第４の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック１１と同族である。第６の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第６の実施形態例の第５の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック９と同族である。第６の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第６の実施形態例の第６の態様において、シアル酸リガンドは、シグレック７と同族である。第６の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第６の実施形態例の第７の態様では、シアル酸リガンドは、シグレック５と同族である。第６の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第７の実施形態例において、本発明は、免疫細胞における細胞媒介性炎症反応を調節する方法であって、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子と免疫細胞とを接触させることを含む方法である。
第８の実施形態例において、本発明は、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。第８の実施形態例の第１の態様において、薬学的に許容される担体は、ＰＢＳバッファー又は生理食塩水を含む。
第８の実施形態例の第２の態様において、担体中の粒子の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌである。第８の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第９の実施形態例において、本発明は、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）又は凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）粒子を含む組成物である。
第１０の実施形態例において、本発明は、粒子を製造する方法であって、第１の不安定部分を含む生体適合性ポリマー足場Ｐと、第２の不安定部分を含むグリカンＧとを、第１の不安定部分及び第２の不安定部分の付加物Ｌを生成するのに十分な条件下で反応させ、それにより、以下の構造式：
Ｐ－Ｌ－Ｇ
（式中、Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含み；及びＧは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）である）
によって表される分子を生成することを含む方法である。
第１０の実施形態例の第１の態様において、第１及び第２の不安定部分は、アミン、カルボン酸、アジド、アルキン、ＴＣＯ、テトラジン、ＤＣＢＯ及びジヒドラジドから選択される。
第１０の実施形態例の第１の態様において、第１及び第２の不安定部分は、アジド、アルキン又はテトラジンから選択され、付加物Ｌは、アルキン－アジド付加物又はアルキン－アジド付加物を含み、付加物を生成するのに十分な条件は、銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン反応（ＣｕＡＡＣ）；銅フリーアジド－アルキン反応；歪み促進型アジド－アルキン反応（ＳＰＡＡＣ）；テトラジン－アルケンライゲーション反応；ＴＣＯ－テトラジン反応のための条件である。第１０の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１０の実施形態例の第２の態様において、Ｐは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧコポリマーを含む。第１０の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義されている通りである。
第１１の実施形態において、本発明は、対象における補体活性化を阻害する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例の態様のいずれかに記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
第１１の実施形態例の第１の態様において、対象は、過剰な補体成分Ｃ３、Ｃ３ｂを産生する。
第１１の実施形態例の第２の態様において、粒子は、シグレック１１のアゴニストである。第１１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第１１の実施形態例の第３の態様において、粒子は、補体因子Ｈと結合する。第１１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
第１２の実施形態において、本発明は、補体過剰活性化疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、第１の実施形態例のいずれかの態様に記載の粒子を対象に投与することを含む方法である。
第１２の実施形態例の第１の態様において、投与経路は、静脈内、硝子体内、経口、口内リンス、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下洗浄、肺洗浄、胃洗浄及び肝内、皮下、直腸、関節内の１つ以上である。
第１２の実施形態例の第２の態様において、補体過剰活性化疾患は、乾性及び滲出型黄斑変性症、発作性夜間血尿、全身性エリテマトーデス、敗血症、抗リン脂質症候群、アルツハイマー、脳卒中、心筋梗塞、ショック、臓器移植拒絶反応、バイオマテリアルインプラント拒絶反応、ＣＯＰＤ増悪、歯肉炎／歯周病、全身性炎症反応症候群である。第１１の実施形態例の残りの特徴及び特徴例は、その様々な態様に関して定義される通りである。
合成スキーム
合成例１
スキーム１
Figure 2023543527000036
 条件：ｉ）化合物２（２０当量）、酢酸ナトリウム緩衝液、ｒ．ｔ．１時間；ｉｉ）化合物４（２当量）、トリエチルアミン（３当量）、ＤＭＦ、ｒ．ｔ．１時間；ｉｉｉ）化合物６（２０当量）、Ｈ２Ｏ、ｒ．ｔ．２４時間。
化合物３：フラスコに、化合物１（１当量）、リンカー２（２０当量）及び酢酸ナトリウム緩衝液を添加し、室温で１時間撹拌した。溶離液として０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを用いるＰ２バイオゲル濾過によって混合物を精製し、化合物３を得た。
化合物５：化合物３（１当量）、ＢＣＮ－ＰＮＰ４（２当量）、トリエチルアミン（３当量）及びＤＭＦをフラスコに添加し、室温で１時間撹拌した。Ｃ１８カラムクロマトグラフィーによる生成物の精製によって化合物５が得られる。
化合物７：化合物５（１当量）、Ｈ２Ｏ、アジドポリマー６（２０当量）をフラスコに添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。生成物をサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、化合物７を得た。
合成例２
スキーム２
Figure 2023543527000037
 条件：ｉ）化合物２（２０当量）、酢酸ナトリウム緩衝液、ｒ．ｔ．１時間；ｉｉ）化合物４（２当量）、トリエチルアミン（３当量）、ＤＭＦ、ｒ．ｔ．１時間；ｉｉｉ）化合物６（２０当量）、Ｈ２Ｏ、ｒ．ｔ．２４時間。
化合物３：フラスコに、化合物１（１当量）、リンカー２（２０当量）及び酢酸ナトリウム緩衝液を添加し、室温で１時間撹拌した。溶離液として０．１Ｍ重炭酸アンモニウムを用いるＰ２バイオゲル濾過によって混合物を精製し、化合物３を得た。
化合物５：化合物３（１当量）、ＢＣＮ－ＰＮＰ４（２当量）、トリエチルアミン（３当量）及びＤＭＦをフラスコに添加し、室温で１時間撹拌した。Ｃ１８カラムクロマトグラフィーによる生成物の精製によって化合物５が得られる。
化合物７：化合物５（１当量）、Ｈ２Ｏ、アジドポリマー６（２０当量）をフラスコに添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。生成物をサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、化合物７を得た。
合成例３
アミノアルキル又はアミノオリゴエチレングリコールなどの種々の適切なリンカーで修飾されたラクトースは、化学的方法によって調製することができる（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．１，６１１－６２２，２００９）。得られた化合物は、微生物又は哺乳類シアリルトランスフェラーゼを使用するポリシアル酸（ＰＳＡ）によって伸長することができる（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８，１７７－１８６，２００８）。このような修飾ラクトースの例は、以下の構造式によって表されるものである。
Figure 2023543527000038
リンカーのアミンは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの活性化エステルを有するポリマーとの結合のための官能基を提供する（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１６，１１６，３，１４３４－１４９５）。適切に官能化されたポリマーとの結合のための様々な官能基に、アミンを変換することができる。例えば、アミンは、アジド転移反応によってアジドに変換することができ（ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１３，１５，７，３３１－３３４）、次に、これをＢＣＮ又はＤＢＣＯなどのシクロオクチンで修飾されたポリマーと共役させることができる（Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，８０５－８１５，２０１１）。代わりに、アミンを使用して、これらの試薬の活性化エステル又はカルバメートを利用することにより、ＢＣＮ又はＤＢＣＯ部分を設置することができる。得られたものを、アジド部分で修飾されたポリマーに連結させることができる。チオールは、アミンとＳ－（２－ブロモ－２－オキソエチル）エタンチオエートとの反応、それに続く弱塩基での処理によって設置することができる。次に、チオールを、標準条件を用いて、マレイミド修飾ポリマーと反応させることができる。
微生物は、ラクトース部分に連結したＰＳＡを生合成できることが記載されている（Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，ｖｏｌ．２６，ｎｏ．７，７２３－７３１）。この場合、適切に官能化されたポリマーとの共役のために、適切なリンカーを結合させる必要がある。これは、還元的アミノ化又は適切に官能化されたヒドロキシルアミンを用いた処理によって達成することができる（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６；１６：２１Ｃ－２７Ｃ及びＣｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１４，５０，７１３２－７１３５）。このようにして、活性エステル官能化ポリマーとの直接共役のために使用することができるアミノ基を設置するか、又は前述のように誘導体化することができる。合成スキームの例を以下に示す。
Figure 2023543527000039
アミノ基は、米国特許出願公開第２０１５／０１５０９９７号明細書に記載されているように非還元末端に設置することもでき、その教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許出願公開第２０１５／０１５０９９７号明細書に記載されている過ヨウ素酸ナトリウムによるＰＳＡの処理は、還元的アミノ化（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００８；１９（７）：１４８５－１４９０）又はオキシム若しくはヒドラゾンライゲーション反応（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１７，１１７，１５，１０３５８－１０３７６，及びＮａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６（３）：２０７－２０９）を介して、様々な官能基（即ちアミン、スキーム１を参照）を設置するために使用することができるアルデヒドを非還元末端に設置する。例えば、ＰＳＡの非還元末端修飾については、以下の合成スキーム３を参照されたい。
スキーム３
Figure 2023543527000040
ＰＳＡは、フェニレンジアミン誘導体との反応により、アミノ含有リンカーでアノマー中心を修飾して（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，ｖｏｌ．２６，ｎｏ．７，７２３－７３１）、アミノ末端を有する蛍光キノキサリノンを得ることができ、これは前述の化学を用いてさらに伸長することもできる。以下のスキーム４を参照されたい：ＰＳＡ化合物１は、アミノ末端で官能化されたフェニレンジアミン２誘導体と反応して、蛍光３を形成することができ、これは、ＮＨＳ官能化ポリマーなどの様々な官能基によって修飾され得る。
スキーム４：ＰＳＡの還元末端のフェニレンジアミン修飾
Figure 2023543527000041
合成例４
以下の反応を用いて、ＰＳＡとポリマーを、トリアゾール連結を介して共役させることができる。
スキーム５Ａ
Figure 2023543527000042
 スキーム５Ｂ
Figure 2023543527000043
 スキーム５Ｃ
Figure 2023543527000044
 スキーム５Ａ～５Ｃに示す反応の各々についての条件は、以下の通りである：ＣｕＳＯ４、ＴＨＰＴＡ、アスコルビン酸。
合成例５
以下の反応を用いて、ＰＳＡとポリマーを、ＤＢＣＯ連結を介して共役させることができる。
スキーム６Ａ
Figure 2023543527000045
 スキーム６Ｂ
Figure 2023543527000046
 スキーム６Ａ及びＢに示す反応の各々についての条件は、以下の通りである：Ｈ２Ｏ、ｒ．ｔ．２４時間。
合成例６
以下の反応を用いて、ＰＳＡとポリマーを、チオ－マレイミド連結を介して共役させることができる。
スキーム７
Figure 2023543527000047
追加の実施形態
特定の実施形態では、本発明は、以下の番号付けされた実施形態例により定義される。
１．生体適合性ポリマー足場と、足場に共有結合したグリカンとを含む粒子であって、グリカンは、少なくとも１つのシアル酸リガンドを含み、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、５つ以上の炭水化物残基を含む、粒子。
２．糖鎖の平均分子量は、９００Ｄａ～１００，０００Ｄａである、請求項１に記載の粒子。
３．ナノ粒子である、請求項１に記載の粒子。
４．少なくとも１つの第１のシアル酸リガンドと、第１のシアル酸リガンドと異なる少なくとも１つの第２のシアル酸リガンドとを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の粒子。
５．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック１、シグレック２、シグレック３、シグレック４、シグレック５、シグレック６、シグレック７、シグレック８、シグレック９、シグレック１０、シグレック１１、シグレック１２、シグレック１３、シグレック１４、シグレック１５、シグレック１６、シグレック１７、シグレックＥ、シグレックＦ又はシグレックＨから選択されるシグレック受容体と同族である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
６．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、血小板免疫グロブリン様２型受容体（ＰＩＬＲ－α又はＰＩＬＲ－β）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）及びベイシジン（ＣＤ１４７）から選択される受容体と同族である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
７．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、感染因子由来の受容体と同族である、請求項１～４のいずれか一項記載の粒子。
８．足場の生体適合性ポリマーは、生分解性ポリマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
９．生分解性ポリマーは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン及びポリ（３－ヒドロキシ酪酸）からなる群から選択される、請求項８に記載の粒子。
１０．足場は、非生分解性ポリマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
１１．足場は、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
１２．足場は、ブロックコポリマーＰＬＧＡ－ＰＥＧを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
１３．ＰＥＧブロックの平均分子量は、９００～５０，０００Ｄａである、請求項１２に記載の粒子。
１４．ＰＥＧの平均分子量は、１，０００Ｄａ～５０００Ｄａである、請求項１３に記載の粒子。
１５．非球状であり、少なくとも５０ｎｍ且つ７５０ｎｍ以下の平均断面幅を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の粒子。
１６．球状であり、２０～２０００ｎｍの粒径を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の粒子。
１７．非球状であり、粒子の平均最大断面幅は、１ミクロン～５ミクロンである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の粒子。
１８．シアル酸リガンドは、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃの１つ以上を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の粒子。
１９．シアル酸リガンドは、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃの一方又は両方のシアル酸ポリマーである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の粒子。
２０．シアル酸リガンドは、グリコシドα２－３、α２－６、α２－８又はα２－９結合によって生体適合性ポリマーに共有結合している、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の粒子。
２１．シアル酸リガンドは、ＤＰ５～ＤＰ２００の重合度を有する多糖である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
２２．シアル酸リガンドは、直鎖状又は分岐鎖状多糖である、請求項１～４のいずれか一項記載の粒子。
２３．シアル酸リガンドは、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｕＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＭａｎＡｃ、フコースの２種以上の多糖であり、多糖は、シアル酸で終了することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
２４．少なくとも１種の第２の治療薬をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
２５．第２の治療薬は、抗体、ポリペプチド、脂質、小分子又はシアル酸修飾細胞から選択される、請求項２７も記載の粒子。
２６．シアル酸リガンドは、粒子ｎｍ２当たり０．０００１～１０分子の密度で存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
２７．シアル酸リガンドは、シグレック３～１６と同族である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
２８．シグレック３～１６は、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞、ＮＫ細胞、好中球、多形核細胞、Ｔ細胞ＣＤ８、Ｔ細胞ＣＤ３４、好塩基球、肥満細胞及び好酸球からなる群から選択される免疫細胞上に存在する、請求項２７に記載の粒子。
２９．免疫細胞は、活性化マクロファージであり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、９、１１、１２、１５又は１６と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３０．免疫細胞は、活性化単球であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、９、１０、１３又は１４と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３１．免疫細胞は、活性化樹状細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、７又は９と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３２．免疫細胞は、活性化好中球であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、９又は１４と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３３．免疫細胞は、活性化ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック７と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３４．免疫細胞は、活性化Ｂ細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック５又は１０と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３５．免疫細胞は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック７又は９と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３６．免疫細胞は、活性化ＣＤ３４＋Ｔ細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、９又は１０と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３７．免疫細胞は、好酸球であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック７、８又は１０と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３８．免疫細胞は、活性化肥満細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、６又は８と同族である、請求項２８に記載の粒子。
３９．免疫細胞は、活性化好塩基球であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック３、５、６、８又は１４と同族である、請求項２８に記載の粒子。
４０．免疫細胞は、ミクログリア細胞であり、少なくとも１つのシアル酸リガンドは、シグレック１１と同族である、請求項２８に記載の粒子。
４１．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）領域４～６及び１９～２０の補体因子Ｈと同族である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
４２．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、ノイラミニダーゼ又はシアリダーゼの阻害剤を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
４３．ノイラミニダーゼ又はシアリダーゼは、インフルエンザＡ、Ｂ若しくはＣウイルスノイラミニダーゼ又はシアリダーゼである、請求項４２に記載の粒子。
４４．ノイラミニダーゼ又はシアリダーゼは、気道上皮細胞中で発現されるノイラミニダーゼ又はシアリダーゼである、請求項４２に記載の粒子。
４５．少なくとも１つのシアル酸リガンドは、ウイルスキャプシドシアル酸結合部位と同族であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項記載の粒子。
４６．ウイルスキャプシドシアル酸結合部位は、インフルエンザＡ、Ｂ又はＣウイルス上のヘマグルチニンエステラーゼである、請求項４５に記載の粒子。
４７．ウイルスキャプシドシアル酸結合部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質の宿主付着／感染性部位である、請求項４５に記載の粒子。
４８．前記生体適合性ポリマーは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧコポリマーであり；シアル酸リガンドは、以下の構造式：
Figure 2023543527000048
 （式中、ｘは、０～１０の整数であり、ｙは、０～１０の整数であり、ｍは、１～５００の整数であり、ｎは、５～４５０の整数であり、及びｐは、ｘとｙとが同時に０でないことを条件として、１～２００の整数である）
によって表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
４９．免疫細胞における細胞媒介性炎症反応を調節する方法であって、免疫細胞を、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子と接触させることを含む方法。
５０．炎症性疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子を対象に投与することを含む方法。
５１．投与経路は、静脈内、硝子体内、経口、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下、肺洗浄、胃洗浄並びに肝内、皮下又は直腸の１つ以上である、請求項５０に記載の方法。
５２．炎症性疾患は、結核、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺線維症間質性肺疾患、肺血管疾患、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、細菌性肺炎、アレルギー性気管支炎、非アレルギー性気管支炎、鼻炎又は線維化性肺胞炎である、請求項５０に記載の方法。
５３．炎症性疾患は、関節リウマチ、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症（強皮症）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、痛風、変形性関節症、感染性関節炎又は若年性特発性関節炎である、請求項５０に記載の方法。
５４．炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、セリアック病、憩室炎、胃食道逆流、乳糖不耐症、消化性潰瘍、胆嚢炎、胃炎、大腸炎、膵炎、自己免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎又は膵炎である、請求項５０に記載の方法。
５５．炎症性疾患は、敗血症性ショック、アテローム性動脈硬化症、拡張機能障害、心不全、心線維症、コクサッキー心筋炎、先天性心ブロック、自己免疫性心筋炎又は巨細胞性心筋炎である、請求項５０に記載の方法。
５６．炎症性疾患は、腎移植拒絶反応、糸球体腎炎、急性腎炎、膀胱炎、前立腺炎、糖尿病性腎炎又は糖尿病性腎疾患である、請求項５０に記載の方法。
５７．炎症性疾患は、皮膚炎、湿疹、炎症性発疹、強皮症、ケロイド、ざ瘡、サルコイドーシス、股部白癬、体部白癬、足白癬、頭部白癬、爪白癬、酒さ、白斑、苔癬硬化症、自己免疫蕁麻疹、皮膚筋炎又は化膿性汗腺炎である、請求項５０に記載の方法。
５８．炎症性疾患は、糖尿病、ＳＬＥ、多発性硬化症、シェーグレン症候群、アジソン病、バセドウ病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、セリアック病、悪性貧血、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫内耳疾患、ギランバレー、川崎病、ランバート・イートン症候群、フォークト－小柳－原田症候群、全身性血管炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス又は結節性多発動脈炎である、請求項５０に記載の方法。
５９．炎症性疾患は、神経脊髄炎、多発性硬化症、脳炎、神経サルコイドーシス、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症又はハンチントン舞踏病、横断性脊髄炎、ギランバレー症候群、パーキンソン病又は良性本態性振戦である、請求項５０に記載の方法。
６０．炎症性疾患は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、カクリウイルス（Ｃａｃｌｉｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ピコロノウイルス（Ｐｉｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）又はコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）によって引き起こされるウイルス性疾患である、請求項５０に記載の方法。
６１．炎症性疾患は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、好気性細菌、嫌気性細菌又は抗生物質耐性菌によって引き起こされる細菌性疾患である、請求項５０に記載の方法。
６２．炎症性疾患は、真菌血症、真菌性角膜炎、カンジダ症、足白癬又は股部白癬である、請求項５０に記載の方法。
６３．炎症性疾患は、アメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症又はトキソカラである、請求項５０に記載の方法。
６４．炎症性疾患は、特発性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、拡張機能障害及びＣＨＦを伴う心線維症、腎線維症、網膜線維症、皮膚線維症並びに瘢痕化である、請求項５０に記載の方法。
６５．炎症性疾患は、敗血症、サイトカインストーム又は鎌状赤血球症である、請求項５０に記載の方法。
６６．シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである、請求項５０に記載の方法。
６７．癌に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子を対象に投与することを含み、癌は、原発性肺癌、転移性肺癌、乳癌、結腸癌、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、脊椎癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、眼癌、鼻食道癌又は皮膚癌である、方法。
６８．前記シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである、請求項６７に記載の方法。
６９．治療有効量の、イピリムマブ、ニボリムマブ、ペブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又はセミプリマブから選択されるチェックポイント阻害剤を対象に投与することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
７０．粒子の投与は、放射線療法と同時であるか又はそれに続くものである、請求項６７に記載の方法。
７１．治療有効量の、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ブレオマイシン、ダカルバジン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エピルビシン、シスプラチン、タモキシフェン、タキソテール、Ｈｅｒ２ｎｅｕ阻害剤、抗ＶＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ソラフェニブ又はｍＴＯＲ阻害剤から選択される第２の治療薬を対象に投与することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
７２．癌に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子を対象に投与することを含み、癌は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である、方法。
７３．治療有効量のダウノルビシン、シタラビン又はイマチニブを対象に投与することをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
７４．粒子の投与は、幹細胞移植又は骨髄移植と同時であるか又はそれに続くものである、請求項７２記載の方法。
７５．感染症に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子を対象に投与することを含み、感染症は、Ｂ群レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クルーズ・チルパノソーマ（Ｔｙｒｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ＨＩＶ、インフルエンザＡ、Ｂ若しくはＣ、Ｓａｒｓ ＣｏＶ１、Ｓａｒｓ ＣｏＶ２又はヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる、方法。
７６．シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニストである、請求項７５に記載の方法。
７７．治療有効量の、ザナミビル、オセルタミビル、バルシクロビル、アシクロビル又はジドブジンの１つ以上を対象に投与することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
７８．シアル酸リガンドは、シグレック１１と同族である、請求項７７に記載の方法。
７９．シアル酸リガンドは、シグレック９と同族である、請求項７７に記載の方法。
８０．シアル酸リガンドは、シグレック７と同族である、請求項７７に記載の方法。
８１．シアル酸リガンドは、シグレック５と同族である、請求項７７に記載の方法。
８２．眼科疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子を対象に投与することを含む方法。
８３．眼科疾患は、乾性加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、非増殖性糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ドライアイ、結膜炎、甲状腺眼症、眼内炎、網膜変性症、緑内障、網膜静脈閉塞症、眼瞼炎、角膜炎、眼感染症又は白内障である、請求項８２に記載の方法。
８４．シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアンタゴニストである、請求項８２に記載の方法。
８５．請求項１～４８のいずれか一項に記載の粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
８６．薬学的に許容される担体は、ＰＢＳ緩衝液又は生理食塩水を含む、請求項８５に記載の医薬組成物。
８７．担体中の粒子の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌである、請求項８５に記載の医薬組成物。
８８．請求項１～４８のいずれか一項に記載の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）又は凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）粒子を含む組成物。
８９．粒子を製造する方法であって、
第１の不安定部分を含む生体適合性ポリマー足場と、
第２の不安定部分を含むグリカンと
を、第１の不安定部分及び第２の不安定部分の付加物を生成するのに十分な条件下で反応させることを含み、シアル酸リガンドは、少なくとも３種のシアル酸誘導体を含む、方法。
９０．第１及び第２の不安定部分は、アミン、カルボン酸、アジド、アルキン、ＴＣＯ、テトラジン、ＤＣＢＯ及びジヒドラジドから選択される、請求項８９に記載の方法。
９１．第１及び第２の不安定部分は、アジド、アルキン又はテトラジンから選択され、付加物は、アルキン－アジド付加物又はアルキン－アジド付加物から選択され、付加物を生成するのに十分な条件は、
銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン反応（ＣｕＡＡＣ）；
銅フリーアジド－アルキン反応；
歪み促進型アジド－アルキン反応（ＳＰＡＡＣ）；
テトラジン－アルケンライゲーション反応；及び
ＴＣＯテトラジン反応
のための条件である、請求項８９に記載の方法。
９２．足場は、ＰＥＧポリマーを含む、請求項８９～９１のいずれか一項に記載の方法。
書籍、雑誌記事、マニュアル、公開特許出願及び特許を含め、本明細書で参照されるあらゆる文献、論文及び公開資料は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
試薬の表：
Figure 2023543527000049
Figure 2023543527000050
Figure 2023543527000051
Figure 2023543527000052
Figure 2023543527000053
Figure 2023543527000054
一般的な方法：
１．ポリシアル酸リガンドを有するナノ粒子を製造する方法
１Ａ．ナノ粒子との結合のためのポリシアル酸－アジドリガンドの調製
ポリシアル酸－アジドリガンド（ポリシア－Ｎ３、本明細書ではＰＳＡ－Ｎ３とも称する）は、末端ＣＭＰ－アジド－シアル酸部分（ＣＭＰ－アジド－シアル酸；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とポリシアル酸のＣ２アノマー水酸基（α２－８ Ｎｅｕ５Ａｃ；コロミン酸ＤＰ～１５０）との共役により調製することができる。この共役は、精製ヒト組換えシアリルトランスフェラーゼＳＴ８ＳＩＡ４（ＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミネート－ポリ－α－２，８－シアリルトランスフェラーゼ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。その後のポリシア－Ｎ３は、ポリシアル酸ポリマー分子毎に単一のクリックケミストリー活性化アジド官能基を提供できるため、ＰＬＧＡ－アルキンナノ粒子表面への高度に特異的な共役を可能にすることができる。標的化クリックケミストリーを使用すれば、シグレック発現細胞への提示に最適なポリシアリガンドの最適な３Ｄ配向を取得することができ、カルボジイミド化学（即ちＥＤＣ－ＮＨＳ）と比較して有意に優れた合成経路が得られる。図３は、ポリシアル酸－アジドリガンド（ポリシア－Ｎ３）の調製のための合成スキームを示す。
１Ｂ．ＤＢＣＯ官能化ＰＬＧＡナノ粒子の調製
ポリシアル酸リガンドが結合するコアナノ粒子を形成するＤＢＣＯ官能化ＰＬＧＡナノ粒子は、エマルジョン法により調製することができる。コアＰＬＧＡナノ粒子は、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－カルボン酸（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ；Ｎａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；ＭＷ約１０，０００：５，０００Ｄａ）とポリ（ラクチド－コ－グリコリド）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－アジド（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－－ジベンゾ－ビシクロ－オクチン（ＤＢＣＯ）；Ｎａｎｏｓｏｆｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；ＭＷ約１０，０００：５，０００Ｄａ）を７５：２５（ｗ／ｗ）比の（ＰＬＧＡ－Ｈ）：（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ＋ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯ）でブレンドすることにより、調製することができる。７５：２５比は、５０：５０又は２５：７５に変更することもできる。ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ：ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯの比を変動させて、ナノ粒子表面上のＤＢＣＯ基の濃度を増減させることができる。選択された比は、ナノ粒子表面に適度に高密度のアジド官能基を提供すると同時に、ポリマーリガンドの効率的な共役が達成できるように官能基間に十分なスペースを付与する。
ナノ粒子に蛍光部分を導入するために、ポリマー、フルオレセイン－ＰＬＡ又はフルオレセイン－ＰＬＧＡを使用した。ナノ粒子の調製に用いた総ポリマー中のフルオレセインポリマーの合計割合は１重量％であった。ブランクナノ粒子は、その後の実験に対照として使用した。これらのブランクナノ粒子は、上記と同じナノ粒子のバッチ由来であったが、ＰＳＡリガンド共役を全く被らなかった。
１Ｃ．ナノ粒子表面上の遊離ＤＢＣＯ基を定量する方法
分光蛍光アッセイ法を使用して、ナノ粒子表面上の遊離ＤＢＣＯ基を定量することができる。この方法は、表面にＤＢＣＯ基を有する調製ナノ粒子に、アジド官能化フルオロフォア（例えば、Ｃｙ３－Ｎ３）を共役させることを含む。共役後、ナノ粒子溶液を洗浄して未反応物質を除去し、溶液の蛍光を測定する。ナノ粒子表面上の利用可能なＤＢＣＯ基の濃度は、Ｃｙ－３を用いて作成した標準曲線から決定する。
１Ｄ－１．ＤＢＣＯ官能化ナノ粒子へのＰＳＡ－Ｎ３リガンドの結合
精製済ＰＳＡ－Ｎ３リガンドを、ＳＰＡＡＣ銅フリークリックケミストリープロトコルを用いて、精製済ＰＬＧＡ－ＤＢＣＯナノ粒子の表面に共役させることができる。簡単に説明すると、ＤＢＣＯを含むナノ粒子をＰＳＡ－アジドと一緒に４℃又は室温若しくは３７℃で一晩インキュベートする。共役反応が完了したら、ＴＦＦを用いてナノ粒子を洗浄して、未反応成分を除去し、ＭＥＳバッファーをＰＢＳ又は１０％スクロースなどの適切な等張溶液と交換する。次いで、ナノ粒子溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過する。最終ＰＳＡ結合ＰＬＧＡナノ粒子（ＰＳＡ－ＰＬＧＡ ＮＰ）のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定する。ＰＳＡ－ＰＬＧＡナノ粒子は、シアル酸部分の強い負電荷及びＰＥＧ－ＣＯＯＨ鎖の存在のために安定化されるが、それは、ゼータ電位測定により確認することができる。最終ポリシア－ＰＬＧＡナノ粒子生成物は、その後の使用のために、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＢＳ中に４℃で又は１０％スクロース中に－２０℃で保存することができる。最終生成物、即ちＰＳＡ－ＰＬＧＡナノ粒子は、サイズ（ＤＬＳ）及び表面電荷（ゼータ電位測定）について特性決定することができる。
１Ｄ－２．ＰＳＡ－Ｎ３リガンドとＤＢＣＯ官能化ナノ粒子への結合
ナノ粒子の調製に使用したＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡポリマーの画分を使用して、ナノ粒子の総固体の１ｍｇ当たりで存在するこのポリマーの量を決定した。精製済ＰＳＡ－Ｎ３リガンドを、ＳＰＡＡＣ銅フリークリックケミストリープロトコルを用いて、精製済ＰＬＧＡ－ＤＢＣＯナノ粒子の表面に共役させた。簡単に説明すると、ＤＢＣＯを含むナノ粒子をＰＳＡ－アジドと一緒に４℃又は室温若しくは３７℃で一晩インキュベートした。ナノ粒子中に存在するＰＳＡ－アジドとＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡの比は、０．７５：１．０～１：１重量の範囲であった。共役反応が完了したら、ＴＦＦを用いてナノ粒子を洗浄して、未反応成分を除去し、ＭＥＳバッファーをＰＢＳ又は１０％スクロースなどの適切な等張溶液と交換した。次いで、ナノ粒子溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。最終ＰＳＡ結合ＰＬＧＡナノ粒子（ＰＳＡ－ＰＬＧＡ ＮＰ）のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＰＳＡ－ＰＬＧＡナノ粒子は、シアル酸部分の強い負電荷及びＰＥＧ－ＣＯＯＨ鎖の存在のために安定化されるが、それは、ゼータ電位測定により確認することができる。最終ＰＳＡ－ＰＬＧＡナノ粒子生成物は、その後の使用のために、１ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＢＳ中に４℃で又は１０％スクロース中に－２０℃で保存した。最終生成物、即ちＰＳＡ－ＰＬＧＡナノ粒子は、サイズ（ＤＬＳ）及び表面電荷（ゼータ電位測定）について特性決定することができる。
１Ｅ．ナノ粒子に対するポリシアル酸（ＰＳＡ）含有リガンドの共役効率の決定
ナノ粒子表面に共役したＰＳＡ酸リガンドの密度の決定及びクリックケミストリー反応共役効率は、本明細書に記載のナノ粒子を最適化する上で重要である。アルキン表面官能基の密度は、ナノ粒子の表面にコンジュゲートすることができるポリマーリガンドの最大密度を規定する傾向がある。共役ポリシアリガンドの実際の密度は、ポリシアル酸（ポリシア）の重合度（ＤＰ；シアル酸単位の数）にも左右される。しかし、負荷電シアル酸の立体効果及び反発力は、表面官能基の完全な共役を妨げる可能性がある。共役前のナノ粒子表面アルキン官能基の密度を決定する必要があるが、これは、フルオロフォア－アジド共役によって達成され、分光蛍光計を用いて標準曲線から定量することができる。さらに、アルキン官能基密度は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）マッピングによって検証することができ、これは、おそらくより正確であろう。リガンド共役前のアルキン基の密度を定量し、次に、共役ステップ後の非共役リガンドの量を定量することにより、ＰＬＧＡポリシアル酸系のクリックケミストリー反応の共役効率を計算することができる。
加えて、ナノ粒子の表面へのリガンド共役の密度を決定する必要があるであろう。リガンド密度は、窒素脱着法によりｍｇ毎の非共役ナノ粒子の総表面（ｍ２又はｎｍ２として表される）を定量することによって決定することができる。ナノ粒子とポリシアル酸リガンドの共役後、ポリシアル酸の質量を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及び／又は熱重量分析（ＴＧＡ）によって定量することができる。ポリシアル酸の質量を分子数に変換し（共役ポリシアル酸の平均分子量を使用）、分子数をナノ粒子の所与の質量のサンプルの総表面積で割ることにより、ポリシアル酸リガンド密度が分子／ｎｍ２の単位で得られる。特定の実施形態では、粒子上のポリシアル酸リガンドの密度は、０．１分子／ｎｍ２～５分子／ｎｍ２である。
１Ｆ．ナノ粒子上のポリシアル酸（ＰＳＡ）含有リガンドの濃度の測定
ナノ粒子の表面に共役したポリシアの濃度を、利用可能なシアル酸アッセイキットにより決定した。シアル酸アッセイキットは、様々なサンプル中の遊離シアル酸（主にＮ－アセチルノイラミン酸又はＮＡＮＡ）を測定する。検出は、酵素共役反応に基づくものであり、この場合、遊離シアル酸の酸化により、プローブと化学量論的に反応して、吸光度（ＯＤ＝５７０ｎｍ）又は蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）により検出することができる産物を生じる中間体が生成される。このキットは、検出感度約１μＭの濃度で０．１～１０ｎｍｏｌの直線範囲のシアル酸を測定する。（参照：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｓｉａｌｉｃ－ａｃｉｄ－ｎａｎａ－ａｓｓａｙｋｉｔ－ａｂ８３３７５．ｈｔｍｌ）。ＰＳＡの濃度をナノ粒子の総重量又はナノ粒子のＰＳＡ／ｍｇのｎｍｏｌに正規化した。
ＩＩ．実施例１：例示的ナノ粒子の製造。
ナノ粒子の９つのバッチを調製した。表２は、調製されたバッチの各々を識別し、各バッチの生産の詳細を提供する。
バッチＡＴ－００７ ＮＰ０６を除き、エマルジョン法によってナノ粒子を調製した。代表的なナノ粒子製造例は、以下を含んだ：ＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）－ＣＯＯＨとＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）－ＤＢＣＯを３：１の重量比で計量し、有機溶媒の混合物に溶解させた。ポリマーの濃度は、有機溶媒（５９．５％の酢酸エチル、４０．５％のベンジルアルコール）中３７ｍｇ／ｍＬであった。１０ｍＬのポリマー溶液を、水中０又は０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０からなる水相４０ｍＬに添加し、Ｒｏｔａｓｔａｔｏｒを用いてホモジナイズすることにより、粗エマルジョンを形成した。粗エマルジョンを、マイクロフルイダイザーを用い、３回通過させて微細ナノエマルジョンにさらにホモジナイズした。次に、ナノエマルジョンを４５０ｍＬの冷水に添加することにより急冷して、ナノ粒子を硬化させた。次いで、急冷したナノ粒子溶液を濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過により洗浄して、有機溶媒を除去した。ポリマーナノ粒子の濃度は、既知体積のナノ粒子溶液から水を蒸発させることによって決定した。続いて、ナノ粒子溶液中の水を、ＴＦＦを用いたｐＨ５の５０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）水和物バッファーと交換するか、又は濃縮ＭＥＳ緩衝液の添加により交換した。次に、シアル酸（ＰＳＡ－Ｎ３）リガンドとの共役のためにナノ粒子溶液を調製した。
ナノ粒子組成物の詳細な説明を表３に提供する。ナノ粒子を特性決定し、その結果を表４に示す。
Figure 2023543527000055
Figure 2023543527000056
ＩＩＩ．実施例２：コロミン酸（ＰＳＡ－Ｎ３）へのＣＭＰ－アジド－シアル酸の酵素添加
Figure 2023543527000057
ＩＶ．実施例３：ＳＰＡＡＣ化学によるコアＤＢＣＯナノ粒子表面へのＰＳＡ－アジド共役
前述のように調製された精製ＰＳＡ－Ｎ３リガンドを、ＳＰＡＡＣ銅フリークリックケミストリープロトコルを用いて精製ＰＬＧＡ－ＤＢＣＯナノ粒子の表面にコンジュゲートした。簡単に説明すると、ＤＢＣＯを含むナノ粒子をＰＳＡ－アジドと一緒に４℃又は室温若しくは３７℃で一晩インキュベートした。共役反応が完了したら、ＴＦＦを用いてナノ粒子を洗浄して未反応成分を除去し、ＭＥＳバッファーをＰＢＳ又は１０％スクロースなどの適切な等張溶液と交換した。次に、ナノ粒子溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
Figure 2023543527000058
Figure 2023543527000059
Figure 2023543527000060
Figure 2023543527000061
具体的には、ＰＳＡ－ＮＰ中のシアル酸含量を、ＮＡＮＡアッセイ（ＮＡＮＡアッセイキット、Ａｂｃａｍ製のａｂ８３３７５）により測定した。ＮＡＮＡアッセイは、遊離シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸又はＮＡＮＡ）を測定するための単純で好都合な方法である。検出は、酵素カップリング反応に基づくものであり、遊離シアル酸の酸化により、吸光度（ＯＤ＝５７０ｎｍ）又は蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）により検出することができる中間生成物が生成される。蛍光検出は、より高い感度を確実にするために、ナノ粒子製剤中のシアル酸含量を定量する目的で選択された。ＮＡＮＡアッセイのステップ毎の説明を以下の表に提供する。
Figure 2023543527000062
以下の式を使用して、試験サンプル中のシアル酸の濃度（ｎｍｏｌ／μＬ）を計算した。
Figure 2023543527000063
 式中、
ＣＳＡ＝シアル酸の濃度（ｎｍｏｌ／μＬ）であり、
Ａ＝サンプルウェル中のシアル酸の量（ｎｍｏｌ）であり、
Ｖ＝ウェル中のサンプルの量（μＬ）であり、
Ｄ＝サンプル希釈係数である。
Figure 2023543527000064
実施例４：例示的ナノ粒子のさらなる製造
エマルジョン法によりナノ粒子を調製した。代表的なナノ粒子製造例を以下に記載する。ＰＳＡ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ製のコロミン酸）の非還元末端をアジド基で修飾した（図１７参照）。非還元末端にアジド基を有する１０ｍｇのＰＳＡを０．６ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。ＰＳＡ－アジド溶液を１５ｍｇのＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）－ＤＢＣＯ（酢酸エチル：ベンジルアルコールの有機溶媒混合物に溶解させた）に添加した。混合物を撹拌し、一晩混合して、アジド－ＤＢＣＯクリックケミストリーカップリングにより、ＰＳＡ－アジドをＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＤＢＣＯと共役させた。一晩混合した後、２８５ＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）－ＣＯＯＨをこの反応混合物に添加し、溶液が目視により透明になるまで、混合／攪拌した。
有機溶媒の最終容量は、容量比６０：４０の酢酸エチル：ベンジルアルコール２．４３ｍＬと、０．６ｍＬのＤＭＳＯとを含む３．０３ｍＬであった。ナノ粒子に蛍光部分を導入するために、ポリマー、フルオレセイン－ＰＬＧＡを使用した。ナノ粒子の調製に使用した総ポリマー中のフルオレセインポリマーの合計割合は１重量％であった。即ち、３ｍｇのＰＬＧＡ－フルオレセインもポリマー溶液に添加された。
このポリマー溶液を２７ｍＬの冷水（酢酸エチルで飽和）に添加し、ＩＫＡ Ｔ－１８ Ｒｏｔａｓｔａｔｏｒを用いてホモジナイズし、粗エマルジョンを形成した。粗エマルジョンをさらに、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ＬＭ１０）を用い、３回通過させて微細ナノエマルジョンにホモジナイズした。次に、ナノエマルジョンを２７０ｍＬの冷水に添加することにより急冷して、ナノ粒子を硬化させた。次いで、急冷したナノ粒子溶液を濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過（ＫＲ２ｉ ＴＦＦ，Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）により冷水で洗浄して、有機溶媒及び未反応ＰＳＡ－アジドを除去した。ポリマーナノ粒子の濃度は、既知体積のナノ粒子溶液から水を蒸発させることによって決定した。スクロースをナノ粒子溶液に１０％ｗｔ／ｗｔで添加し、０．２μｍ Ｍｉｌｉｐｏｒｅシリンジフィルターを用いて濾過した。ナノ粒子溶液を－２０℃で凍結した。
ナノ粒子のサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いた動的光散乱を用いて測定した。動的光散乱技術は、ブラウン運動と呼ばれる粒子及び分子の一定のランダムな熱運動を利用して、サイズを測定する。粒子は、そのサイズに関連する速度で拡散し、小さい粒子は、大きい粒子よりも速く拡散する。拡散速度は、粒子をレーザーで照射することによって生成されるスペックルパターンから測定される。特定の角度での散乱強度の変動は、高感度フォトダイオード検出器を用いて検出される。強度の変化がデジタルオートコリレーターで解析され、相関関数が生成される。この曲線を分析して、粒子の粒径及び粒度分布が得られる。清浄水を用いて、ナノ粒子を約０．１～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）で測定した。得られた各値は、３つの読み取り値の平均であった。ＮＡＮＡアッセイを使用して、ＰＳＡリガンドの濃度を測定した。コロミン酸又はＰＳＡ鎖を、酸加水分解酵素又はシアリダーゼ酵素のいずれかを用いて加水分解して、シアル酸モノマーとした。遊離シアル酸を放出させ、遊離ＰＳＡ又はこの処理を用いてナノ粒子に共役したＰＳＡから加水分解した。ＰＳＡからの遊離シアル酸（主にＮ－アセチルノイラミン酸又はＮＡＮＡ）を測定するために、シアル酸アッセイキット（ａｂ８３３７５）を使用した。検出は、酵素共役反応に基づくものであり、この場合、遊離シアル酸の酸化により、シアル酸プローブと化学量論的に反応して、吸光度（ＯＤ＝５７０ｎｍ）又は蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）で検出され得る産物を産生する中間体が生成される。検出されるシアル酸の最終濃度は、シアル酸標準からの検量線を用いて決定される。
ナノ粒子の総固体濃度は、既知量のナノ粒子溶液を計量して１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに導入することにより決定した。次に、溶液を凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥ナノ粒子粉末の重量を溶液の重量に対し正規化して、水中のナノ粒子のｗｔ／ｗｔ濃度を得た。製造されたナノ粒子製剤は、ＰＳＡのｕｇ／総固体のｍｇを算出することによって特性決定した。上記の実施例２に記載した手順により調製されたナノ粒子の場合、共役効率を以下のように決定した。有機相を作製するのに使用したＰＳＡと総固体（ポリマー＋ＰＳＡ）の比を計算した。総固体に対するＰＳＡの最終比は、ナノ粒子溶液のＮＡＮＡアッセイ及び凍結乾燥（上記）を用いて決定した。全体的共役効率は、以下のように算出した。
Figure 2023543527000065
ＶＩ．実施例５：オキシムライゲーション及び熱加水分解によるポリシアル酸の化学修飾
１．ＰＳＡに対するオキシムライゲーション
一般的手順
６００ＭＨｚ Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２で１Ｈスペクトルを記録した。化学シフトキャリブレーションは、４．７９ｐｐｍの水残留ピークを基準として使用した。ＮＭＲデータは、以下の通りである：化学シフト、多重度（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｄｄ＝ダブルダブレット、ｍ＝マルチプレット及び／又は多重共鳴、ｂｒ．＝ブロードシグナル）、Ｊカップリング、積分及びピーク同一性。３ｂのＮＭＲシグナルは、１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、ｇＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ及びＨＭＢＣ実験に基づいて割り当てた。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５）は、１Ｍ ａｑ．ＨＣｌを用い、脱気ＭｉｌｌｉＱ水に酢酸ナトリウムを溶解させてｐＨを調整することにより調製した。シアル酸オリゴマーは、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ Ｉｎｃ．から購入した。
オキシムライゲーションの一般的な手順
合成手順をスキーム１に示す。
スキーム１
Figure 2023543527000066
 スキーム１．アミノリンカー官能化Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｎ－アセチルノイラミン酸）オリゴマー３ａ～ｆのオキシムライゲーション化学による合成。
化合物１ａ～ｆ（１当量）及び化合物２（２０当量）を０．２ｍＬのＮａＯＡｃバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝５）に溶解させ、室温で１時間撹拌した。溶離液として０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いたＰ２バイオゲルクロマトグラフィーにより反応混合物を精製した。画分をＥＳＩ及びＴＬＣにより分析した。純粋な画分を合わせ、減圧下、４０℃で濃縮し、凍結乾燥して、白色固体として３ａ～ｆを得た。
合成した化合物の１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル（利用可能な場合）を以下に示す。
化合物３ａ（１．１０ｍｇ、３．００μｍｏｌ、定量的収率）は、化合物１ａ（１．００ｍｇ、３．２４μｍｏｌ）及び化合物２（４．９２ｍｇ、６４．８０μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝９．２，４．３，１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４），４．４３－４．３４（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．９８－３．８８（ｍ，２Ｈ，Ｈ５，Ｈ６），３．８８－３．８１（ｍ，１Ｈ，Ｈ９），３．７４（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．８，６．２，２．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ８），３．６７－３．６０（ｍ，１Ｈ，Ｈ９），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝９．０，１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ７），３．３６（ｔｄ，Ｊ＝４．６，３．０Ｈｚ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．９２－２．８１（ｍ，１Ｈ，Ｈ３），２．７９－２．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ３），２．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ）．
化合物３ｂ（１．１０ｍｇ、１．５９μｍｏｌ、定量的収率）は、化合物１ｂ（１．００ｍｇ、１．５５μｍｏｌ）及び化合物２（２．３６ｍｇ、３１．００μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．５０－４．３８（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．０４－３．７６（ｍ，８Ｈ），３．７４－３．６０（ｍ，４Ｈ），３．６０－３．５２（ｍ，１Ｈ），３．４１－３．２６（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．８６（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，９．５Ｈｚ，０．６Ｈ，Ｈ３，Ａ），２．７８－２．６５（ｍ，１．６０Ｈ，Ｈ３，Ａ＋Ｂ），２．５０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，０．８０Ｈ，Ｈ３，Ａ），２．０９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），２．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），１．７９（ｔｄ，Ｊ＝１２．２，２．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３，Ｂ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １７４．９３，１７４．４３，１７４．３５（Ｃ＝Ｏ Ａｃ），１７３．５６（ＣＯＯＨ Ｂ），１７０．２９（ＣＯＯＨ Ａ），１６９．２７（ＣＯＯＨ Ａ），１５８．５９（Ｃ＝Ｎ Ａ），１５６．７２（Ｃ＝Ｎ Ａ），１０１．７９，１０１．７６（Ｃ２ Ｂ），７４．２５，７４．２０，７２．７４，７２．７２，７１．８１，７１．７９，６９．９４，６９．０４，６８．２３，６８．０２，６７．６５，６７．４５，６７．４０，６６．２６，６５．５７，６２．６５，６１．１０，５３．５９，５３．０４，５１．６１，４０．０１（Ｃ３ Ｂ），３８．８９（ＮＨ２ＣＨ２），３８．７６（ＮＨ２ＣＨ２），３５．４９（Ｃ３，Ａ），３０．７９（Ｃ３ Ａ），２１．９５，２１．９２，２１．８８（ＣＨ３ Ａｃ，Ａ＆Ｂ）．
化合物３ｃ（０．９０ｍｇ、０．９２μｍｏｌ、８８％収率）は、化合物１ｃ（１．００ｍｇ、１．０４μｍｏｌ）及び化合物２（１．５８ｍｇ、２０．８０μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．５０－４．３９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２７（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．０８（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．０６－３．９８（ｍ，２Ｈ），３．９７－３．７７（ｍ，９Ｈ），３．７７－３．６１（ｍ，７Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），３．４１－３．３４（ｍ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），３．３１（ｑ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．９１－２．７６（ｍ，１．５０Ｈ，Ｈ３），２．７４－２．６２（ｍ，１．５０Ｈ，Ｈ３），２．５０（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３），２．１５－２．００（ｍ，９Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），１．８７－１．７１（ｍ，２Ｈ，Ｈ３）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ １７４．８８，１７４．４０，１７４．３３（Ｃ＝Ｏ Ａｃ），１７２．８５，１７０．２８（ＣＯＯＨ），１５８．５４（Ｃ＝Ｎ），１０１．５２，１００．７９（Ｃ２），７７．２０，７４．００，７３．９５，７３．３３，７２．７０，７１．６０，７０．１１，６９．０２，６８．２３，６８．０５，６７．８７，６７．８０，６７．６７，６７．５５，６７．５０，６６．１１，６５．５０，６２．５８，６１．２６，６０．６９，５３．６２，５３．０８，５２．１３，５１．６３，４０．２７，３９．３４（Ｃ３），３８．８６，３８．７７（ＮＨ２ＣＨ２），３５．５４，３０．８５（Ｃ３），２２．１９，２１．９４，２１．９０（ＣＨ３ Ａｃ）．
化合物３ｄ（０．９０ｍｇ、０．９２μｍｏｌ、５９％収率）は、化合物１ｄ（２．００ｍｇ、１．５７μｍｏｌ）及び化合物２（２．３９ｍｇ、３１．４０μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．５５－４．３４（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２８（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２１－３．５４（ｍ，２８Ｈ），３．４３－３．２７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．９５－２．５９（ｍ，４Ｈ，Ｈ３），２．５１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３），２．１９－２．００（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），１．８８－１．６９（ｍ，３Ｈ，Ｈ３）．
化合物３ｅ（０．９０ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、８９％収率）は、化合物１ｅ（１．００ｍｇ、０．６３μｍｏｌ）及び化合物２（０．９６ｍｇ、１２．６０μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．５２－４．３６（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝６．７，３．２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．１９－３．５３（ｍ，３７Ｈ），３．４３－３．２７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．９０－２．５９（ｍ，５Ｈ，Ｈ３），２．４９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３），２．１５－１．９７（ｍ，１５Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），１．７６（ｑ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，４Ｈ，Ｈ３）．
化合物３ｆ（３．６０ｍｇ、１．８９μｍｏｌ、９０％収率）は、化合物１ｆ（４．００ｍｇ、２．１１μｍｏｌ）及び化合物２（３．２１ｍｇ、４２．２０μｍｏｌ）を用いて、一般的な手順に従って合成した。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｄ２ｏ）δ ４．５３－４．３７（ｍ，２Ｈ，Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２８（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ），４．２０－３．５４（ｍ，４１Ｈ），３．４４－３．２７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ２ＣＨ２），２．９３－２．６１（ｍ，６Ｈ，Ｈ３），２．５０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３），２．２３－１．９５（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ３ Ａｃ），１．９０－１．６５（ｍ，５Ｈ，Ｈ３）．
２．ＰＳＡの熱加水分解及びその精製
コロミン酸（２０ｍｇ）をＨ２Ｏ（２ｍＬ）に溶解させ、溶液を８０℃で２．５時間撹拌した後、１０Ｋスピンフィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ遠心装置、４回）を用いた限外濾過により精製した。上部残渣を回収し、「ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング」とラベル付けした。（図１８．）。１０Ｋスピンフィルターの濾液を減圧濃縮して、溶媒の大部分を除去し、３Ｋスピンフィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ遠心装置、４回）を用いた限外濾過によりさらに精製した。上部残渣を回収し、「ＰＳＡ－２．５ｈ－ミディアム」とラベル付けした。同様に、３Ｋスピンフィルターの濾過物を減圧濃縮して、溶媒の大部分を除去し、「ＰＳＡ－２．５ｈ－ショート」とラベル付けした。３つの画分を凍結乾燥し、Ｄ２Ｏ中での１Ｈ－ＮＭＲにより分析して、重合度（ＤＰ）を求めた（図１９．）。
ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング：８．７ｍｇ、４３．５％収率（コロミン酸から）、平均ＤＰ＝２０．１、平均Ｍｗ＝５８８４（ＤＰ値により計算）；ＰＳＡ－２．５ｈ－ミディアム：３．７ｍｇ、１８．５％収率（コロミン酸から）、平均ＤＰ＝１２．８、平均Ｍｗ＝３７５７（ＤＰ値により計算）；ＰＳＡ－２．５ｈ－ショート：７．６ｍｇ、３８．０％収率（コロミン酸から）、平均ＤＰ＝６．８、平均Ｍｗ＝２０１１（ＤＰ値により計算）。
３．リンカーによるＰＳＡの修正
図１８を参照して、ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング／ミディアム／ショート（１当量）、０．２ｍＬのＮａＯＡｃバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ＝５）中の化合物２（２０当量）を室温で２時間撹拌した。溶離液として０．１Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いたＰ２／Ｐ４バイオゲルクロマトグラフィーにより反応混合物を精製した。ＥＳＩ及びＴＬＣにより画分を分析した。生成物を含む画分を合わせ、減圧下、４０℃で濃縮し、凍結乾燥して、ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング／ミディアム／ショートリンカーを白色固体として得た。
リンカーライゲーション前後の化合物の１Ｈ－ＮＭＲ試験を行った。主要なプロトンシグナルの化学シフトを割り当てることにより、リンカーの導入が成功したことを確認し、シアル酸のリンカー「ＣＨ２」とアセチル「ＣＨ３」の組込みの比によりＤＰを算出した。
以下のリンカー共役ＰＳＡ化合物を取得した：ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング（５ｍｇ）を出発物質として使用し、Ｐ４バイオゲルクロマトグラフィーにより生成物を精製して、ＰＳＡ－２．５ｈ－ロング－リンカーを取得した。（０．９ｍｇ、１８．０％収率、平均ＤＰ＝１６．６１、平均Ｍｗ＝４９１０）；ＰＳＡ－２．５ｈ－培地（３．７ｍｇ）を出発物質として使用し、Ｐ４バイオゲルクロマトグラフィーにより生成物を精製して、ＰＳＡ－２．５ｈ－ミディアム－リンカーを取得した。（１．６ｍｇ、４３．２％収率、平均ＤＰ＝１３．３３、平均Ｍｗ＝３９５５）；２．０ｍｇ ＰＳＡ－２．５ｈ－ショートを出発物質として使用し、Ｐ２バイオゲルクロマトグラフィーにより生成物を精製して、ＰＳＡ－２．５ｈ－ショート－リンカーを得た。（１．３ｍｇ、６５％収率、平均ＤＰ＝５．１７、平均Ｍｗ＝１５８０）
生物学的実験及び方法
微粒子のバッチは、表４に見出される同定に基づいて、本明細書で表記される。
Ｉ．実施例６：選択された標的に対する例示的ナノ粒子の親和性。
Ｏｃｔｅｔアッセイは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）と呼ばれる技術を使用する。バイオレイヤー干渉法は、生体分子相互作用を測定するためのラベルフリー技術である。これは、バイオセンサー先端に固定化されたタンパク質の層と、内部標準層の２つの表面から反射した白色光の干渉パターンを解析する光解析技術である（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ）。バイオセンサーチップに結合した分子の数が変化すると、干渉パターンにシフトが生じ、これをリアルタイムで測定することができる。バイオセンサーに結合するか、又はバイオセンサーから解離する分子のみが干渉パターンをシフトし、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ上で応答プロファイルを生成することができる。非結合分子、周囲媒体の屈折率の変化又は流量の変化は、干渉パターンに影響を与えない。これは、ＢＬＩ特有の特徴であり、タンパク質の用途：タンパク質結合、定量、親和性及び反応速度論に使用される粗サンプルで実施するその能力を拡大する。
例示的ナノ粒子及び異なるシグレック受容体の親和性を、以下のようにＯｃｔｅｔアッセイを用いて測定した：プローブセンサーをＰＢＳ＋１％ＢＳＡでブロックした。ＰＢＳ中の２５μｇ／ｍＬの濃度のシグレック１１、９、７及び５に特異的な様々なシグレックＦｃ融合タンパク質を、抗ヒトＦｃ捕捉抗体コーティング（ＡＨＣ）ディップ及びリードバイオセンサーを用いて捕捉した。異なる希釈度で分析物を含むウェルに、プローブを浸したとき、会合曲線が生成された。分析物は、ＰＢＳ中に１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０の比で希釈された例示的ナノ粒子又はリガンドのないナノ粒子であった。プローブをＰＢＳに浸したとき、解離速度（オフ速度）を測定した。抗ヒトＦｃ融合タンパク質及びシグレック１１、９、７及び５を含むアッセイバッファー（１×ＰＢＳ）中の様々な濃度の例示的ナノ粒子間の結合反応を２５μｇ／ｍＬの濃度で測定した。グラフは、時間（秒）に対してＢＬＩプラットフォームでの結合量に正比例したナノメートルシフトによる結合反応を表示する。標準として、バッファーのみをロードしたセンサーを使用した。図１１ａは、例示的ナノ粒子とシグレック１１との間の結合親和性を示し、図１１ｂは、例示的ナノ粒子とシグレック９との間の結合親和性を示し、図１１ｃは、例示的ナノ粒子とシグレック７との間の結合親和性を示し、図１１ｄは、例示的ナノ粒子とシグレック５との間の結合親和性を示す。結合親和性は、以下の表にも表示する。
Figure 2023543527000067
Figure 2023543527000068
ＩＩ．実施例７：末梢血単球（ＰＢＭＣ）に対する例示的ナノ粒子の非毒性プロファイル
例示的ナノ粒子の非毒性プロファイルを評価するために、ＰＢＭＣ由来のマクロファージに対するＭＴＴアッセイによる細胞生存率の分析を実施した。ＦＩＴＣで標識された例示的ナノ粒子の細胞毒性をＰＢＭＣ細胞上で評価した。ＰＢＭＣは、健康なドナーから取得し、Ｍ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌを使用）及びＭ２表現型（ｈｕ ＩＬ－４－１０ｎｇ／ｍｌを使用）に対して４８時間にわたり活性化した。次いで、細胞を５０～７５０μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子で２４時間処理した。ＭＴＴ［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイを用いて、細胞生存を決定した。９６ウェルプレートに、マクロファージ細胞（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２）を１００×１０３細胞／２００μｌ培地の密度で各ウェルに播種した。細胞を、５０～７５０μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子及びリガンドのない対照ナノ粒子と一緒に２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、１ｍｇ／ｍＬの１ ＭＴＴと一緒に３７℃で３～４時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を１００μｌのＭＴＴ可溶化バッファーに溶解させ、Ｓｐｅｃｔｒａ ｉＭａｘ－プレートリーダーを用いて、５７０ｎｍで吸光度を測定し、その値を対照細胞と比較した。グラフは、対照未処理細胞と比較した場合の細胞生存率を表す。図１２（ａ）は、ＭＴＴアッセイによって実証されるように、例示的ナノ粒子が、末梢血単球に対して非毒性であることを表している。
ＩＩＩ．実施例８：マクロファージに対する例示的ナノ粒子の非毒性プロファイル
例示的ナノ粒子の非毒性プロファイルを決定するために、ＴＨＰ－１単球由来のマクロファージに対するインビトロ細胞毒性アッセイを実施した。９６ウェルプレートにＴＨＰ－１細胞を１００×１０３細胞／２００ｕｌの密度で各ウェルに播種した。ＴＨＰ－１単球分化マクロファージを５０～７５０μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子で２４時間処理した。細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）を用いて分化させ、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて１μｇ／ｍＬで活性化した。細胞を、５０～７５０μｇ／ｍＬ用量の例示的ナノ粒子及びリガンドのない対照ナノ粒子と一緒に２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴと一緒に３７℃で３～４時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を１００μｌのＭＴＴ可溶化バッファーに溶解させ、Ｓｐｅｃｔｒａ ｉＭａｘプレートリーダーを用いて、吸光度を５７０ｎｍで測定し、その値を対照細胞と比較した。グラフは、対照未処理細胞と比較した場合の細胞生存率を表す。図１２（ｂ）は、例示的ナノ粒子が、ＴＨＰ－１由来のマクロファージに対して非毒性であることを実証する。
ＩＶ．実施例９：活性化マクロファージにおけるＩＬ－１０に対する例示的ナノ粒子の効果
例示的ナノ粒子が、ヒトＰＢＭＣ由来マクロファージにおけるＩＬ－１０産生を上方制御する能力は、以下のように実証された：健康なドナーからのＰＢＭＣをＭ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍＬを使用）及びＭ２表現型（ｈｕ ＩＬ－４－１０ｎｇ／ｍｌを使用）に対して４８時間活性化させた後、７５μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子及び対照ナノ粒子で２４時間処理した。ウェルから上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）によりＩＬ－１０についてアッセイした。グラフは、ＩＬ－１０タンパク質レベルを表すが、これは、リガンドを含まない対照ナノ粒子及び非処理対照群と比較して、例示的ナノ粒子による処理から２４時間後のＩＬ－１０の上方制御を示している。シダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定：Ｍ１対Ｍ１－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ ＊＊ｐ＝０．０００２、Ｍ１－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ対Ｍ１－ブランク－ＰＬＧＡ ＊＊＊ｐ＝０．０００８。これらの結果を図２４に示す。
Ｖ．実施例１０：ＣＦＨ産生に対する例示的ナノ粒子の効果
例示的ナノ粒子が、ヒトＰＢＭＣ由来マクロファージにおける補体因子Ｈ（ＣＦＨ）産生を上方制御する能力は、以下のように実証された：健康なドナーからのＰＢＭＣをＭ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍＬ）及びＭ２表現型（ｈｕ ＩＬ－４－１０ｎｇ／ｍＬ）に対して４８時間にわたり活性化した後、７５μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子及びリガンドのない対照ナノ粒子で２４時間処理した。ウェルから収集した上清を、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）によりＣＦＨについてアッセイした。図１４（ａ）グラフは、ＣＦＨタンパク質レベルを表すが、これは、リガンドのない対照ナノ粒子及び非処理群と比較して、例示的ナノ粒子による処理から２４時間後のＣＦＨの上方制御を示している。シダックの多重比較により以下を検定する：Ｍ１対Ｍ１－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｍ２対Ｍ２－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ ＊＊ｐ＝０．００３２ Ｍ１－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ対Ｍ１－ブランク－ＰＬＧＡ ＊＊＊ｐ＝０．０００１ Ｍ２－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ対Ｍ２－ブランク－ＰＬＧＡ ＊＊ｐ＝０．００４。
ＶＩ．実施例１１：例示的ナノ粒子が、ヒトＰＢＭＣ由来マクロファージにおける補体Ｃ３レベルを低下させる能力
健康なドナーからのＰＢＭＣをＭ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍＬ）及びＭ２表現型（ｈｕ ＩＬ－４－１０ｎｇ／ｍｌ）に対して４８時間にわたり活性化した後、リガンドのない７５μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子又は対照ナノ粒子で２４時間処理した。回収した上清をＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）によりＣ３レベルについて検定した。図１４（ｂ）は、その結果を示し、補体Ｃ３タンパク質レベルを表すが、これは、リガンドのない対照ナノ粒子及び非処理群と比較して、Ｍ０及びＭ１マクロファージに対する例示的ナノ粒子の処理から２４時間後の補体Ｃ３レベルの明らかな抑制を示している。シダック多重比較により以下を検定する：Ｍ１－ＰＳＡ－ＰＬＧＡ対Ｍ１－ブランクＰＬＧＡ ＊＊ｐ＝０．００７。
ＶＩＩ．実施例１２：ＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子によって媒介される補体調節
補体経路は、自然免疫系の重要な構成要素であり、エフェクター膜攻撃複合体を介して細胞膜の非特異的細胞溶解をもたらす。カスケードは、古典的経路、代替経路及びレクチン経路の３つの別々の経路を介して進行し得る。古典的経路は、抗体又は抗体複合体によってトリガーされる。代替経路は、構成的に活性化され、非宿主細胞又は分子パターンに遭遇すると増幅される。レクチン経路は、病原体の細胞壁に見られるような非自己関連糖残基に遭遇すると活性化される。
これらの経路は、Ｃ３転換酵素（Ｃ３ｂＢｂ）の形成である律速段階を共有している。オフターゲット細胞溶解の可能性があるため、Ｃ３転換酵素の形成は、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）によって厳密に制御される。次に、ＣＦＨは、自己関連分子パターン（ＳＡＭＰ、シアル酸）に結合する能力によって調節され、ＣＦＨはＣ３ｂに結合し、Ｂｂに結合する能力を低下させる。ＣＦＨがＳＡＭＰに結合しない場合、Ｃ３ｂは、高い親和性でＢｂに結合して、宿主細胞及び病原体細胞のいずれについても同様に増殖及び増幅膜攻撃複合体形成及び細胞溶解を引き起こす（図２８）。本発明の本質は、自己関連分子パターンを模倣するために、シアル酸リガンドを提示することである。以下に、本発明者らのＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子が、いかにしてＣＦＨに結合し、これを活性化し、次にＣＦＨが、より高い親和性でＣ３ｂに結合して、Ｃ３ｂの形成を低減するかを説明する（図２９）。
１．ＡＴ－００７－ＮＰ０４がＣ３Ｂに対するＣＦＨの結合を増強する能力
Ｃ３ｂへのＣＦＨ結合を増強するために、ＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子がＣＦＨに結合することができるかどうかを決定する目的で、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを実施した。この実施例では、１６００ＲＵでＦｃ２に、１４５０ＲＵ、９５０ＲＵでＦｃ３に、Ｃ３ｂを固定化した。アッセイは、バッファーのみ、２００ｎｍ（図３０Ａ）及び１００ｎＭ（図３０Ｂ）のヒト補体因子Ｈ並びに１：２０希釈のヒト補体因子Ｈ＋ＡＴ－００７－ＮＰ０４を用いて実施した（室温で１０分間インキュベーション）。ＡＴ－００７－ＮＰ０４をＣＦＨと一緒にインキュベートすると、Ｃ３ＢへのＣＦＨの結合が増加した。ＣＦＨによるＣ３Ｂへの結合は、ＣＦＨが立体構造的に変化したときに起こる。インビボでは、ＣＦＨの立体構造を変化させ、Ｃ３Ｂ結合を増強するために、ＣＦＨは、宿主細胞によって提示される自己関連分子パターンに結合しなければならない。この実施例は、宿主細胞の非存在下でＡＴ－００７－ＮＰ０４が自己関連分子パターンとしてふるまう能力を実証する。これは、ＡＴ－００７－ＮＰ０４が、ＣＦＨを活性化することによって補体カスケードを下方制御することができるという直接的なエビデンスを提供する。ＡＴ－００７－ＮＰ０４がなければ、ＣＦＨは活性化されないため、Ｃ３Ｂに結合しない。
第１の実験のセットアップを以下の表に示す。
Figure 2023543527000069
この実験では、Ｃ３ｂをＢｉａｃｏｒｅプレートに固定化し、ＡＴ－００７－ＮＰ０４と一緒に又はなしで補体因子Ｈを溶液中に流し、屈折率の変化をリアルタイムで測定した。図３０Ａのグラフは、時間（センサーグラム）に対する共鳴応答ユニット（ＲＵ）としてプロットされる。
第２の実験のセットアップを以下の表に示す。
Figure 2023543527000070
この実験では、Ｃ３ｂをＢｉａｃｏｒｅプレートに固定化し、ＡＴ－００７－ＮＰ０４と一緒に又はなしで補体因子Ｈを溶液中に流し、屈折率の変化をリアルタイムで測定した。図３０Ｂのグラフは、時間（センサーグラム）に対する共鳴応答ユニット（ＲＵ）としてプロットされる。
２．ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子が、代替経路又は古典的経路を介して補体の活性化を直接防止する能力
ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子が、代替及び古典的経路を阻害できるかどうかを判断するために、脱線維血清を用いる補体活性化アッセイでは、ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子を含めて又は含まずに、ＩｇＭ（古典的補体活性化剤）、チモーゲン及びＬＰＳ（いずれも代替補体活性化剤）と一緒にインキュベートした。このアッセイを実施するために、プレートを１％ＢＳＡでブロックした後、脱線維血清、チモーゲン、ＬＰＳ又はＩｇＭ、＋／－ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子又はスクロースと一緒にインキュベートした。３時間のインキュベーション後、抗Ｃ３ｂ抗体を添加し、１時間後にＳｔｒｅｐ ＨＲＰを添加し、２０分後にプレートリーダーで読み取った。
このアッセイの結果は、チモーゲン及びＬＰＳの添加が、ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子並びにチモーゲン及びＩｇＭと一緒にインキュベートした場合、Ｃ３ｂ形成の統計的に有意な減少を示したことを実証し、ＬＰＳ処理血清は幾分の傾向を示したものの、主にＬＰＳスクロースアームが、補体及びＣ３ｂ上方制御を有意に活性化することができなかったため、統計的に有意ではなかった。
この特定の実施例は、ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子が、Ｃ３ｂの形成の防止により、古典的経路及び代替経路の両方に対する補体増幅を阻害することができることを示している。Ｃ３ｂ形成は、ＣＦＨの直接結合標的である。
実験のセットアップを図３１Ａ（コーティング済プレート上へのＣ３ｂ沈着のための脱線維血清）に示し、結果を図３１Ｂに示す。
前の実施例から、ＣＦＨを有するＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子は、Ｃ３ｂへのＣＦＨの結合を増加させた。これら２つの実施例の組合せは、ＡＴ－００７－ＮＰ０６ナノ粒子が、Ｃ３ｂへのＣＦＨの結合を増大させ、それにより代替又は古典的補体経路のいずれかによって引き起こされるｃ３ｂの減少をもたらす能力を実証するものである。
３．ＣＦＨに対するＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子の直接結合の実証。
ＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子がＣＦＨに直接結合できるかどうかを判断するために、プレートをＨｉｓでプレコートし、ＣＦＨをプレートに固定するヒトＣＦＨ ｈｉｓタグタンパク質と一緒にインキュベートした。次に、ＩＣ５０と用量動態結合関係を計算することができるかどうかを決定するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを異なる濃度で含むＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子と一緒にプレートをインキュベートした。次に、プレートを抗ＰＥＧビオチンと共にインキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を読み取った。
このアッセイは、約２ｍｇ／ｍｌのＩＣ５０でのＳ結合曲線を実証した。これらの結果から、本発明のＡＴ－００７－ＮＰ０４ナノ粒子が、用量依存的にヒトＣＦＨに結合し、有望な薬学的及び治療的特性を提供する能力が確認される。
ＥＬＩＳＡに基づく、ＣＦＨタンパク質に対するＡＴ－００７－ＮＰ０４及びＡＴ－００７－ＮＰ０６の結合親和性。
ＨｉｓタグヒトＣＦＨタンパク質（１ｕｇ／ｍｌ濃度）（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｌｏｎｅ－カタログ番号－ＡＢＩＮ１０７９２６９）を、ニッケルコートプレートＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ １５１４２ Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｃｌｅａｒ Ｐｌａｔｅｓ）にＲＴで一晩プレコートした。これらは、ＥＬＩＳＡに基づく方法によるポリヒスチジンタグ付き融合タンパク質（Ｈｉｓタグ）の分析に最適である。アミノ末端又はカルボキシル末端に連続した数個のヒスチジン残基を含むタンパク質は、金属に対して強力な結合親和性を有する。ポリヒスチジンタグ付き融合タンパク質を含むタンパク質は、プレートに直接添加することができる。
標準的な製造者のＥＬＩＳＡプロトコル及びＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの試薬に従って、Ｈｉｓタグ－ＣＦＨプレートを洗浄し、ナノ粒子（ＮＰ）の総固体のＡＴ－００７－ＮＰ０４（１０ｍｇ／ｍｌ～０．００１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度）及びＡＴ－００４－ＮＰ０６（０．１ｍｇ／ｍｌ～０．００１ｍｇ／ｍｌ）を室温で３時間添加した。ナノ粒子中のＰＥＧを、室温で１時間インキュベートした抗ＰＥＧビオチン（組換えビオチン抗ポリエチレングリコール抗体－Ａｂｃａｍ ａｂ５３４４９）を用いて検出した。ストレプトアビジンＨＲＰ（１：４０）を用いて、ビオチンに結合させ、発色試薬（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して発色させた。４９０ｎｍで吸光度を測定した。グラフは、ＡＴ－００７－ＮＰ０４が、ブランクナノ粒子対照と比較して、ＣＦＨタンパク質に対してより高い結合親和性を示すことを示唆している。
この実験の結果を図３２Ａ、３２Ｂ及び３２Ｃに示す。図からわかるように、ＡＴ－００７－ＮＰ０６及びＡＴ－００７－ＮＰ０４の最大濃度１００ｕｇ／ｍｌ（Ａ）は、ブランクナノ粒子と比較してＣＦＨタンパク質に対する結合親和性に差を示さなかった。最大濃度１ｍｇ／ｍｌ（Ｂ）は、高濃度のブランクナノ粒子と比較して、ＣＦＨタンパク質に対する結合親和性に有意差を示した。ＡＴ－００７－ＮＰ０６の最大濃度１０ｍｇ／ｍｌ（Ｃ）は、ブランクナノ粒子と比較すると、ＣＦＨタンパク質に対する結合親和性に有意な差を有するシグモイドＳ字状結合曲線を示した。
ＶＩＩＩ．実施例１３：ＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＴＮＦ－αに対する例示的ナノ粒子の効果
ＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＴＮＦ－αに対する例示的ナノ粒子の効果の効果を以下のように評価した：ＴＨＰ－１細胞を、各ウェル中５００，０００細胞／５００ｕｌ培地の密度で２４ウェルプレートに播種した。１０ｎｇ／ｍｌのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）を用いて、細胞を分化させ、１μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて活性化した。細胞を７５μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子、リガンドのない対照ナノ粒子と一緒に２４時間インキュベートし、２４時間後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）によりＨｕ ＴＮＦ－αについてアッセイした。図２６は、結果を表し、グラフは、シダックの多重比較検定を用いて、ＬＰＳ単独の＊＊ｐ＝０．００６及びＰＬＧＡ ＬＰＳ処理とブランク－ＰＬＧＡ ＬＰＳとの間の＊ｐ＝．０１を比較すると、ＰＳＡ－ＰＬＧＡによる処理から２４時間後のＬＰＳ活性化細胞にＴＮＦ－αタンパク質レベルの有意な阻害を示す。
ＩＸ．実施例１４：ＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＶＥＧＦ分泌に対する例示的ナノ粒子の効果
ＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＶＥＧＦ分泌に対する例示的ナノ粒子の効果を以下のように評価した：ＴＨＰ－１細胞を、各ウェル中の５００，０００細胞／５００μＬ培地の密度で２４ウェルプレートに播種した。１０ｎｇ／ｍＬのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）を用いて、細胞を分化させ、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて１μｇ／ｍＬで活性化した。細胞を７５μｇ／ｍＬの例示的ナノ粒子、リガンドのない対照ナノ粒子と一緒に２４時間インキュベートし、２４時間後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）によりＨｕ ＶＥＧＦレベルについてアッセイした。グラフは、シダックの多重比較検定を用いて、ＬＰＳ単独の＊＊ｐ＝０．０１及びＰＬＧＡ ＬＰＳ処理とブランク－ＰＬＧＡ ＬＰＳとの間の＊ｐ＝．０６を比較すると、ＰＳＡ－ＰＬＧＡによる処理から２４時間後のＬＰＳ活性化細胞にＶＥＧＦタンパク質レベルの有意な阻害を示す。図１５は、例示的ナノ粒子がＬＰＳ活性化マクロファージにおけるＶＥＧＦレベルを阻害することを反映している。
薬理学的実験及び方法
ＨＡＬＯＳ（シグレック用高親和性リガンド）プラットフォームは、表面に天然及び合成修飾シアル酸で修飾されたポリエチレン－グリコール／ポリ乳酸－グリコール酸コアで構成されるナノ粒子からなる。この化学構造の背後の推論は幾重にも及ぶ。第１に、ナノ粒子コアは、免疫細胞上に存在するシグレック受容体に対する天然及び合成的に修飾されたシアル酸の提示のための、安定しているが、生分解性の足場を提供する。第２に、免疫細胞に対するこれらのリガンドの比較的高密度の提示は、結合活性の増強、即ち非常に多数の弱い相互作用による強い細胞結合を通じて、抗炎症シグナル伝達の効力を増強すると考えられる。シアル酸の天然及び合成修飾は、標的シグレック受容体に対する個々のリガンドの親和性を高めて、抗炎症シグナル伝達に対するナノ粒子の効力も増大することを目的とする。
本明細書で論じる戦略は、眼の重度の慢性「非消散性」炎症及び全ての炎症性疾患に対処する。炎症細胞又は所与の細胞内の１つの炎症経路によって産生されるサイトカインをブロックするのではなく、本発明者らのナノ粒子製剤は、活性化された免疫細胞の自然なシャットダウンメカニズムを利用する。このシャットダウンメカニズムは、自己関連分子パターン（ＳＡＭＰ）の自己関連パターン認識受容体（ＳＰＲＲ）への結合を含み、これが今度は、免疫細胞の表現型を炎症誘発性から抗炎症性に変換する。シアル酸免疫グロブリン様レクチン（シグレック）によるＳＰＲＲのアゴニズムは、免疫系の自然炎症消散メカニズムである。
他者により研究された動物系では、短鎖シアル酸ポリマーは、免疫グロブリン様レクチン１１（シグレック１１）受容体（Ｋａｒｌｓｌｅｔｔｅｒ、２０１７）に結合し、ＩＬ－１０のような抗炎症性サイトカインを上方制御し、活性酸素種（ＲＯＳ）及びサイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－１２及びＶＥＧＦなどの炎症誘発シグナルを下方制御する生物学的反応を誘導することによって炎症を軽減すると思われる。シグレックシグナル伝達の活性化は、最終的に補体代替経路と交差する（Ｇａｏ，２０１５；Ａｋｈｔａｒ－Ｓｃｈａｆｅｒ，２０１８；Ｃａｓｃｅｌｌａ，２０１４；Ｃｈａｎ，２０１４；Ｊａｇｅｒ，２００７；Ｋｉｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，１９９０；Ｋｅｌｌｙ，２００７；Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，２０２０；Ｚｈｏｕ，２０１７；Ｚｈａｏ，２０１３）。
本明細書に記載されるアプローチは、疾患中に網膜中の光受容体外側セグメントを貪食するＭ１型マクロファージを、それらを「分解能マクロファージ」としても知られるＭ２ｃ型マクロファージに変換することによって選択的に再分極することである（Ｌｕｒｉｅｒ，２０１７）。本発明者らのナノ粒子製剤の投与経路は、いくつかの炎症性疾患における重度の慢性／急性「非消散性」炎症を有する患者に対する、静脈内、硝子体内、経口、眼内、網膜下、皮下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、経気管、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下洗浄、胃洗浄及び肝臓内、皮下又は直腸の１つ以上である。粒子は、（１）補体媒介性炎症経路の下方制御、及び（２）疾患に寄与する炎症性マクロファージの再プログラミングの２つの方法で機能することができる。他者からの臨床的及び実験的エビデンスは、これらの２つの経路が、加齢黄斑変性症及び他の炎症性疾患を有する患者で混乱することから、治療に適している可能性があることを示している。Ｎｅｕｍａｎｎ ｇｒｏｕｐ（Ｋａｒｌｓｌｅｔｔｅｒ ２０１７）は、ポリシアが、ａ２－８結合を有するシアル酸ポリマーであることを明らかにした。これは、マクロファージ上のシグレック１１に結合することが知られている。シグレック１１のこの結合は、眼におけるマクロファージ、単球及びミクログリア細胞に対する抗炎症効果を提供し、これは、レーザーＣＮＶモデルにおいてポリジアで処置した眼で実証された。この同じモデルでは、血管漏出も、抗ＶＥＧＦ剤を使用した場合と同じレベルで軽減した。
ＴＨＰ－１細胞株に由来するマクロファージ及び正常ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、線維細胞及び好中球に由来するマクロファージ（Ｍ１及びＭ２）において、異なる製剤バッチ（ＡＴ－００７－ＮＰ０１－０６など）中の本明細書に記載の粒子の作用機序を確認するために、インビトロ薬理学研究が行われている。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるこれらの細胞の発現パターンの分析は、ＡＴ－００７－ＮＰ０１－０６が、サイトカインの産生、細胞死、線維細胞分化及び補体因子経路の構成要素を調節することを示唆している。
２つの細胞型に由来するマクロファージにおけるＡＴ－００７－ＮＰ０１から０６の抗炎症特性を実証するための一連のインビトロ研究、（１）ＬＰＳ活性化ＴＨＰ－１細胞株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０２（商標），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及び（２）初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ－７０５００．２）、（３）ＰＢＭＣ由来の好中球、（４）単球分化線維細胞は、製剤番号として同定された１つ以上のＡＴ－００７－ＮＰ０１～０６ナノ粒子調製物を用いて行った（上記の表４及び８を参照）。
表９は、実施された実験を示す
Figure 2023543527000071
Figure 2023543527000072
ＩＸ．実施例１５：エクスビボ薬理学試験
ここに提示される裏付けとなる試験は、８５±１０歳の３つの滲出性及び非滲出性のＡＭＤ眼（１人の女性及び２人の男性ドナー）から得られた網膜－ＲＰＥ－脈絡膜複合体におけるシグレック７、９及び１１の遺伝子発現（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の増大を示している。滲出性ＡＭＤドナーは、正常なドナーと比較して、シグレック７、９及び１１遺伝子発現のそれぞれ９０倍、６４倍及び５８倍の増加を示した。同様に、非滲出性ＡＭＤドナーは、正常なドナーと比較して、それぞれ７７倍、３２倍及び２７倍のシグレック７、９及び１１遺伝子発現の増大を示した。ＡＭＤ有及びなしの健康な対象から単離された網膜－ＲＰＥ－脈絡膜複合体からの本発明者らの遺伝子発現及びタンパク質レベルのデータは、疾患状態で上方制御を示し、非滲出性ＡＭＤ患者を治療するための標的としての本発明者らのシグレック受容体の選択をさらに支持している。表１０に、知見をまとめる。
Figure 2023543527000073
１．ＥＬＩＳＡに基づく、ＡＴ－００７－ＮＰ０４の結合親和性
シグレックＦｃ ７、９、１１をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、抗ＰＥＧビオチン／ＨＲＰ標準製造者のＥＬＩＳＡプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。４９０ｎｍで吸光度を測定した。グラフは、ＡＴ－００７－ＮＰ０４が、ブランクＮＰ対照と比較して、シグレック７、９及び１１に対してより高い結合親和性を示すことを示唆している。図３３を参照されたい。
ＴＨＰ－１ ＬＰＳ活性化マクロファージの誘導
これらの実験で使用されるＴＨＰ－１細胞は、白血病を有する１歳男児に由来する「単球様」細胞株である（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，１９８０）。細胞は、補体３（Ｃ３）及びＦｃ受容体を発現する。それらは、食作用性（ラテックスビーズ及び感作赤血球及びその他の両方）であるが、表面及び細胞質免疫グロブリンを欠いている。細胞は、未分化状態ではトール様受容体アゴニストに対して弱く応答するが、分化後はより応答性になる。２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ，１０４３８０２６）を補充しておいたロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）培地中で細胞を増殖させた。最初の播種及びインキュベーションは、Ｔ－２５フラスコ中で２～３日間行った。使用の４８時間前に、ＴＨＰ－１細胞の単球への分化を、無血清ＲＰＭＩ中の１０ｎｇ／ｍＬ、ホルボール１２－ミリステート１２－アセテート（ＰＭＡ）で誘導した。ＰＭＡの正確な機能は不明だが、原形質膜の内面に挿入されるシグナル伝達分子を模倣し、プロテインキナーゼＣ経路を刺激すると考えられる。従って、一度添加すると、洗い流すことができず、分化は最終分化である。さらに４８時間後、分化した細胞は、接着細胞となり、１μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）による活性化のための準備が整った。細胞は、生理活性についてはＳＨＰ－１リン酸化のためのウェスタンブロットを用いて、細胞結合についてはＩＨＣを用いて評価し、またＥＬＩＳＡに基づくサイトカイン放出アッセイのために上清を使用した。（使用される略語：ＰＭＡ＝ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート；ＬＰＳ＝リポ多糖類）。
ＰＢＭＣからのＭ１及びＭ２マクロファージの誘導
ＴＨＰ－１細胞株由来のマクロファージに加えて、新鮮なパックＬｅｕｋｏｐａｋＲ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から初代ヒトマクロファージを単離した。初代マクロファージは、組織から十分な量で単離することが困難であり、培地中で増殖しない。そのため、“Ｅａｓｙ ５０” ＥａｓｙＳｅｐ ｍａｇｎｅｔ（商標）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）細胞分離法を用いて、単一ドナー由来のロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｋ）から単球を単離し、濃縮した。目的の単球をＣＤ１４＋磁気ビーズで濃縮し、フローサイトメトリーを用いて集団の均一性を確認した。ＣＤ１４＋濃縮細胞を凍結した。
使用の約６日前に、凍結保存された単球を解凍し、５０ｎｇ／ｍＬマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を含む無血清ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＳＦ（商標）マクロファージ分化培地を用いて、２５０，０００細胞／２５０μＬで２４ウェルプレート中に培養した。培地を使用して、単球をＭ１（古典的に活性化される）及びＭ２ａ（代替的に活性化される）マクロファージに分化させた。ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ；５０ｎｇ／ｍＬ）の添加により、Ｍ１細胞を活性化した。
Ｍ２細胞は、ＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加により活性化した。Ｍ０細胞は、いずれの活性化剤も添加せずに培地から取得した。細胞は、生理活性についてはＳＨＰ－１リン酸化のためのウェスタンブロットを用いて、細胞結合についてはＩＨＣを用いて評価し、またＥＬＩＳＡに基づくサイトカイン放出アッセイのために上清を使用し、サイトカイン放出についてブランクナノ粒子対照を評価した。
２．シグレックエフェクターの活性化：ＳＨＰ１
インビトロ薬理学試験の最初のシリーズは、ＡＴ－００７－ＮＰ０１から０６の異なるバッチが、活性化マクロファージにおけるサイトカイン放出によって測定される生物学的活性を媒介することができることを実証した。活性化マクロファージの表面に結合するＡＴ－００７－ＮＰ０１～０６の異なるバッチが、シグレック結合と一致する細胞内エフェクターを刺激できるかどうかを決定するために、より高度な研究を設計した。シグレックは、阻害性又は活性化性いずれかである細胞内シグナル伝達ドメインを有する。
阻害ドメインは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）として知られているのに対し、活性化ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られている。シグレックは、非常に多様で、ヒトと非ヒト霊長類の間で最も相同性があるが、ＩＴＩＭ及びＩＴＡＭモチーフは種を超えて保存されており、免疫細胞のために共通の全体的な活性化及び不活性化スイッチを備える免疫系を呈示する。リガンドが、シグレックスに結合すると、ＩＴＩＭが活性化され、この変化によってＳｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１、２（ＳＨＰ１、ＳＨＰ２）が動員される。
ＳＨＰ１及びＳＨＰ２は、細胞シグナル伝達、成長及び分化、発癌性形質転換などの様々な細胞プロセスを調節するタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。ＳＨＰ１及びＳＨＰ２が動員されると、それらは活性チロシンキナーゼ、特にＩＴＡＭ上に存在するものを脱リン酸化する。
ＡＴ－００７－ＮＰ０２が、マクロファージ上のシグレックを刺激し、次にＳＨＰ１の動員、さらに骨髄系細胞中のＳＨＰ１によって調節される重要なシグナル伝達経路を媒介するかどうかを評価するために、一連のウェスタンブロット実験を設計した。マクロファージ及び単球中のＳＨＰ１の影響を受けるシグナル伝達経路のいくつかは、ＩＴＡＭ受容体媒介性シグナル伝達を弱めるためのＩＴＩＭ含有タンパク質によるＳＨＰ１の動員並びにＴＬＲ及びサイトカイン受容体を介したシグナル伝達の負の調節を含む（Ａｂｒａｍ，２０１７）。ゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、ブロットした後、内部対照として、ＳＨＰ－１及びベータアクチンで染色した。結果は、Ｍ１活性化マクロファージにおけるＡＴ－００７－ＮＰ０２による処理後、ＳＨＰ－１を動員することを示し、これは、ＡＴ－００７－ＮＰ０２が、炎症反応の阻害においてアゴニストの役割を果たすことを示す。これらのデータから、ＡＴ－００７－ＮＰ０２構築物が、ＴＨＰ－１細胞株由来の初代ＰＢＭＣ由来Ｍ１型及びＬＰＳ活性化マクロファージにおけるシグレック経路のアゴニストであるという確信が得られる。
細胞結合
ＡＴ－００７－ＮＰ－０３を使用して、活性化ＴＨＰ－１ヒト単球細胞株（ＴＨＰ－１）細胞株及びＰＢＭＣ初代細胞に由来するマクロファージにおける結合を調べた。チャンバースライドにおいて、ＲＰＭＩ無血清分化培地（ＴＨＰ－１細胞の場合）又はＰＢＭＣ由来マクロファージ用のマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＳＦマクロファージ脱分化培地のいずれかでマクロファージを２４時間平板培養した。次に、細胞をＡＴ－００７－ＮＰ－０３（７５μｇ／ｍＬ）又はＦＩＴＣ共役ブランク－ＮＰのいずれかで、５％ＣＯ２、３７℃で最大２４時間処理した。結果は、ＡＴ－００７－ＮＰ０３で処理した細胞が、活性化細胞の表面上のクラスターにおけるＡＴ－００７－ＮＰ０３結合及び共局在を示す明るい緑色の点状蛍光染色を示したのに対し、ブランクＮＰは全てのマクロファージ細胞に非特異的結合を有するように見えたことを示唆するものであった。これらのデータは、ＦＩＴＣ結合ＡＴ－００７－ＮＰ０３ナノ粒子が細胞に取り込まれず、外膜に接着することを示唆した。ＡＴ－００７－ＮＰ０３とマクロファージとの明らかな結合は特異的であると思われた。リガンドを含まないＢｌａｎｋ－ＮＰは、細胞と結合しなかった。この結果は、ＡＴ－００７－ＮＰ０３によって提示されたＡＴ－００７リガンドＰＳＡのみがこれらの活性化マクロファージの膜上の要素と会合することと一致している。
サイトカイン放出に対するＡＴ－００７－ＮＰの効果
マクロファージへのシグレック結合を介したＡＴ－００７－ＮＰの様々な製剤の生物活性を、活性化マクロファージからのサイトカイン放出を測定することにより調べた。
３．ナノ粒子とＡＴ－００７の共役により、炎症誘発性サイトカイン応答が抑制される
１０ｎｇ／ｍＬのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）を用いて、ＴＨＰ－１細胞を分化させ、１μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて活性化した。細胞を７５μｇ／ｍｌ用量のＡＴ－００７－ＮＰ０２及びＡＴ－００７並びにブランクＮＰで２４時間インキュベートした。２４時間後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によりＨｕ ＴＮＦ－αについてアッセイした。図２０に示すグラフは、ＡＴ－００７単独＊ｐ＝０．０５と比較した場合、ＡＴ－００７－ＮＰ０２による処理の２４時間後のＬＰＳ活性化細胞中にＴＮＦ－αタンパク質レベルの有意な阻害を示している。以下のグラフは、ＡＴ－００７（ＰＳＡ単独の存在は、マクロファージに対するＬＰＳ処理後のＴＮＦ－ａ応答を抑制するのに十分ではないことを示しており、これは、これら細胞の生物学的応答を増大するためのＮＰに対するリガンドの共役に関して裏付けとなるエビデンスを追加するものである。
４．ＡＴ－００７－ＮＰ０４は、活性化Ｍ１マクロファージにおける抗炎症メディエーターＩＬ－１０の有意な上方制御を示した
ＰＢＭＣを健康なドナーから取得し、Ｍ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍＬ）に活性化した。一続きの様々な用量のＡＴ－００７－ＮＰ０４、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むスクロース（ビヒクル対照）で細胞を一晩処理した。処理後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（製造指示書に従うＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）によりＩＬ－１０についてアッセイする。図２１に示すグラフは、ＬＰＳ処理と比較して、ＡＴ－００７－ＮＰ０４による処置から１６時間後の抗炎症メディエーターＩＬ－１０の用量依存的増加を示すタンパク質レベルを示している。
５．ＡＴ－００７－ＮＰ０６は、活性化Ｍ１マクロファージにおける炎症誘発性メディエーターＩＬ－６、ＴＮＦ－ａの有意な下方制御を示した
ＰＢＭＣを健康なドナーから取得し、Ｍ１表現型（Ｈｕ ＩＦＮ－ｙ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍＬ）に活性化した。一続きの様々な用量のＡＴ－００７－ＮＰ０６、ブランクＮＰ及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で細胞を一晩処理した。処理後、上清を収集し、（Ａ）ＴＮＦ－ａ及び（Ｂ）ＩＬ－６について、またＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によりアッセイした。図２２Ａ及び図２２Ｂに示すグラフは、タンパク質レベルを表すが、これは、ブランクＮＰと比較した場合、ＡＴ－００７－ＮＰ０６による処置の１６時間後、０．４ｍｇ／ｍｌ～２．１ｍｇ／ｍｌの用量で、炎症誘発性メディエーターＩＬ－６及びＴＮＦ－ａの下方制御を示す。テューキーの多重比較を使用する ＊＊＊＊ｐ＝．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０３。
ヒトＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６の放出をＥＬＩＳＡにより定量した。全てのアッセイは、細胞を活性化培地中で一晩インキュベートし、様々な濃度のＡＴ－００７－ＮＰ０６及びＡＴ－００７－ＮＰ０４に曝露した後に実施した。データには、ナノ粒子の生物学的活性を検証するための様々なＡＴ－００７－ＮＰ０６製剤及び用量が含まれる。データは、製剤ＡＴ－００７－ＮＰ０６（ＰＳＡの還元末端が分化したＭ１マクロファージに提示される）が、インビボで再生マクロファージに特徴的な応答を誘発し、疾患の炎症カスケードを抑制し、抗炎症応答を増大する上で役立つ可能性があることを示している。
補体成分は、数字（Ｃ１～Ｃ９）又は文字記号（例えば、補体因子Ｈ、ＦＨ）で呼称される約３０のプラズマ及び膜関連血清タンパク質の複雑なネットワークを構成し、これらは、階層的タンパク質分解性カスケードに編成される。補体系の活性化は、３つのタンパク質分解カスケード、即ち古典的経路、レクチン経路及び代替経路に関与し、これらは、全ての補体経路の収束点である、Ｃ３転換酵素の活性化を招く。補数係数Ｈは、ＲＰＥによっても局所的に産生され、Ｃ３転換酵素崩壊に寄与し、Ｃ３ｂ付着の増幅を防止する（Ｇｅｅｒｌｉｎｇｓ、２０１６）。複数のエビデンスは、補体調節不全、特に代替経路がＡＭＤの病因に関与していることを実証している。補体系の過剰活性化は、加齢、喫煙、酸化ストレスなど、ＡＭＤの病因に寄与する複数の要因に関連している。Ｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、補体経路の局所活性化を示唆する、補体成分をドルーゼンの構成成分として同定した免疫組織学的及びプロテオミクス研究によってこの事実を支持した。Ｓｃｈｏｌｌ及び他の多くの者が、ＡＭＤ患者の末梢血中に、補体活性化の最中に放出される活性化補体成分のレベルに有意な増加があることを証明した（Ｓｃｈｏｌｌ，２００８）。
Ｃ３ｂをＢｉａｃｏｒｅプレートに固定化し、ＡＴ－００７－ＮＰ０６の有無にかかわらず補体因子Ｈを溶液中に流し、屈折率の変化をリアルタイムで測定した。図３２Ｂに示すグラフは、時間（センサーグラム）に対する共鳴応答ユニット（ＲＵ）としてプロットされる。結果は、Ｃ３ｂへの補体因子Ｈ結合に対するＡＴ－００７－ＮＰ０４の効果増強を示している。
表１１に実験セットアップを示す。
Figure 2023543527000074
スクロース対照と比較して、ＡＴ－００７－ＮＰ０６で同時処理されたプレートに対するＣ３ｂ沈着の減少
多くの補体タンパク質は、タンパク質分解切断によって活性化されるプロテアーゼである。これらのタンパク質は、チモーゲンと呼ばれる。前駆体チモーゲンは、体全体に分布し、これらは、感染部位で活性化される。これらのチモーゲンは、完全な補体系を活性化する。本明細書に記載の試験では、補体活性化は、古典的経路活性化の場合、免疫グロブリンＩｇＭ、代替補体活性化の場合、ＬＰＳ及び補体活性化の陽性対照としてのチモーゲンによって脱線維血液血清中に誘導され、また対照としてＰＢＳが使用された。さらにＣ３ｂ付着を酵素結合免疫吸着アッセイによって分析し、補体の活性化を定量化した（Ｋａｒｌｓｔｅｔｔｅｒ，２０１７）。テューキーの多重比較試験は、アクチベーター補体経路チモーゲン及びＩｇＭのいずれについても、スクロースとＡＴ－００７－ＮＰ０６との間の有意性＊＊＊＊ｐ－＜０．０００１を示した。
図３３Ａは、実験セットアップの概略を示す。図３３Ｂは、スクロース対照と比較して、ＡＴ－００７－ＮＰ０６で同時処理したプレート上のＣ３ｂ付着の減少を示す棒グラフを示す。
Ｘ．実施例１６：インビボ薬理学
光受容体損傷マウスモデルでインビボ薬理学試験を実施した。ブライトライト損傷（ＢＬＤ）モデルは、活性酸素種（ＲＯＳ）の上方制御及び代替補体系の調節不全により、光受容体に損傷を引き起こす。短時間の曝露後、これらのマウスは、その光受容体の８０％を失うと予想される。加えて、インターロイキン１β、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２、シクロオキシゲナーゼ－２及びＴＮＦα遺伝子を含め、いくつかの炎症性及び走化性サイトカインの眼球発現がある（Ｂｉａｎ、２０１６）。光受容体細胞死により、網膜色素変性症、スターガルト病及び非滲出性ＡＭＤなどの眼の症状が特性決定される（Ｂｉａｎ、２０１６）。本明細書では、光受容体変性の予防におけるＡＴ－００７－ＮＰ－０２の有効性を検証するためのマウスＢＬＤモデルの使用について説明する。
１．マウスの眼忍容性試験
本研究の目的は、マウスにＩＶＴ注射により投与されたＡＴ－００７－ＮＰ０３、ＡＴ－００７－ＮＰ０２の眼忍容性を評価することであった。コホート１では、健康な１５～１６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウス３匹（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右眼にＦＩＴＣ－ブランク－ＮＰのＩＶＴ注射（２μＬ）を投与した。注射の直後及び３日後に眼底鏡検査を実施した。両方の網膜（６眼）を調製し、Ｉｂａ１について染色した。組織病理学的及び免疫組織化学的分析のために、３匹の両眼を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドに４時間後固定し、脈絡膜及び網膜フラットマウントの調製に用いた。フラットマウントをウサギの抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ．＃０１９－１９７４１）で標識した。
蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ６Ｂ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、サンプルを画像化し、画像処理ソフトウェアＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪを用いて免疫陽性面積（ｍｍ２）を測定することにより、免疫反応性を定量化した。定性的観察では、注射された眼にミクログリア活性化や血管の異常は認められなかった。ＦＩＴＣ－ブランク－ＮＰを注射した眼は、強い蛍光シグナルを示し、それは、ＩＶＴ注射直後に検出された。しかし、３日目には蛍光が減少し、異常は観察されなかった。コホート２では、マウスは、注射の５日前に（眼の検査）を受けた。－２日目に、動物は、ｆＥＲＧ ａ波振幅に基づいて治療群にランダム化された。注射日に、マウスは、（ａ）ＡＴ－００７－ＮＰ０２；３．４μｇ／μＬの総固体を含有する１．３μｇ／μＬのＡＴ－００７）、（ｂ）ブランク－ＮＰ（対照）又は（ｃ）ＡＴ－００７（ＡＴ－００７；１．３μｇ／μＬ）のいずれかの単回両側ＩＶＴ注射（２μＬ）を受けた。
眼の忍容性は、投与から４、２４、４８及び７２時間；並びに１週間及び２週間後の肉眼によるＯＥ及びＩＯＰ測定によって評価した。２週間後、犠牲にする直前に、ｆＥＲＧ、ＳＤ－ＯＣＴ及び詳細な眼底鏡ＯＥを実施した。眼組織を採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理した。右眼後方カップ（ＯＤ）をパラフィンに包埋し、厚さ５μｍの垂直切片（上から下に）として切断した。これらの群の各々におけるヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色眼切片を用いて、総網膜厚さを測定した。内網膜の内層の厚さは、ＲＧＣ層から内顆粒層の上部までの厚さとして測定し、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さは、外網状層の下部から外境界膜までの厚さとして測定した。ＲＧＣ－網膜神経節細胞、ＩＰＬ－内網状層、ＩＮＬ－内顆粒層、ＯＰＬ－外網状層、ＯＮＬ－外顆粒層、ＲＰＥ－網膜色素上皮。処置群のいずれにも目に見える肉眼的形態学的変化は見られなかった。
さらに、マウスにＩＶＴ注射により投与したＡＴ－００７－ＮＰ０３の眼忍容性を評価した。この場合、眼科検査中、目に見える変化は、観察されなかった。瞳孔は、全て光に対して正常な反応を示した。角膜浮腫、白内障又は出血の兆候は、検出されなかった。Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ＯＣＴスキャンを注射後０日目から２週間まで比較した。
２．ダッチベルトウサギのＰＫと忍容性試験（生体内分布）
この試験の目的は、ダッチベルトウサギ（Ｋａｎｉｎｆａｒｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）への単回ＩＶＴ注射後の血清、眼組織、肝臓、脾臓及び腎臓におけるＦＩＴＣ共役ＡＶＤ－１０４の生体分布を評価することであった。
この試験には２つのアームがあった。１つのアームでは、ウサギのＡＴ－００７－ＮＰ－０３（０．４１２ｍｇ／ｍＬのＡＴ－００７及び２．１ｍｇ／ｍＬの総固体）の単回ＩＶＴ用量注射による処置後の組織学的分析により、組織（血清、眼組織）における生体分布を評価した。第２のアームでは、非共役ＡＴ－００７－ＮＰ－０３（０．４１２ｍｇ／ｍＬのＡＴ－００７及び２．１ｍｇ／ｍＬの総固体）の単回ＩＶＴ投与後、生体分析のために組織を採取した。両アームで最大２８日間、眼底鏡検査及び眼圧により、眼の忍容性を評価した。
薬物投与の３日前に、１２ヶ月齢の雄ウサギからの５つの眼について眼圧測定及び採血が完了した。０日目にＡＴ－００７－ＮＰ－０３（５０μＬ）を両眼にＩＶＴ注射した。７、１４、２１及び２８日目に眼圧（ＩＯＰ）を測定した。試験終了時に、血清、両眼、肝臓、腎臓及び脾臓を採取し、組織を４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定した。Ｈ＆Ｅ染色及びフルオレセイン顕微鏡用に、切片（５μｍ）スライドを作製した。ウサギの１つのコホートは、ＦＩＴＣ共役を含まないＡＶＤ－１０４で処置した。０日目及び２８日目の試験時に血清を採取した後、犠牲にした。獣眼科医が動物を検査した。結果は、ＡＴ－００７－ＮＰ－０３の単回ＩＶＴ注射が良好な忍容性を示したことを示す。眼科検査中、目に見える変化は観察されなかった。結膜は腫脹、排出又は充血の徴候を示さなかった。虹彩は光に反応し、異常な襞は認められなかった。角膜及び水晶体は透明であった。房水に前房フレアの兆候も、水晶体にも濁りの兆候もなかった。硝子体内部に炎症細胞はなかった。網膜に特に問題はなく、網膜剥離や出血は認められなかった。注射直後の眼底に、ＩＶＴ注入ＡＶＤ－１０４からの蛍光シグナルが観察された。試験３日目及び７日目には、おそらく拡散した蛍光性ナノ粒子のために、硝子体全体が明るく見えた。それ以降の時点（１４日目又は２８日目）では、硝子体に蛍光シグナルは検出されなかった。７、１４、２１及び２８日目のＩＯＰでは、治療群間に差はなかった。全ての値は、試験３日目に取得されたベースライン測定値と同様であった。ヘマトキシリン及びエオシンで染色したウサギ網膜の定性検査に変化は見られなかった。
ＡＴ－００７－ＮＰ－０３は、忍容性が良好であった。ＡＴ－００７－ＮＰ－０３をＩＶＴ注射したウサギの眼は、炎症、腫脹又は異常な出血の兆候を示さなかった。ＦＩＴＣ標識ナノ粒子は、硝子体内注射直後に明確に見ることができた。３日目及び７日目のいくつかの症例では、おそらく拡散した蛍光ＮＰのために硝子体全体が明るく見えた。１４日目及び２８日目の画像化中、ＮＰ由来の自家蛍光は、検出されなかった。２８日目に採取した網膜の垂直切片から自家蛍光画像を取得したところ、蛍光ＮＰは、検出されなかった。
眼科検査により、結膜に腫脹、排出、充血の徴候は見られず、虹彩は、光に反応し、異常襞は認められず、角膜は、透明であり、前房フレアは観察されなかった。硝子体内部に炎症細胞はなく、網膜剥離や出血は観察されなかった。ヘマトキシリン及びエオシン染色で染色されたウサギ網膜の別の代表的な画像は、２８日目にいずれの細胞層の喪失も示さず、且つ忍容性が良好な薬物を示している。
３．マウスブライトライト損傷モデルの概念実証
本研究の目的は、マウスのブライトライト誘発性光受容体損傷モデルに対するＡＴ－００７－ＮＰ－０２の薬理学的有効性を評価することであった。８週齢の雄のブライトライト損傷モデルＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を以下の４つの群にランダム化した。
・群１：非注入対照（ｎ＝５）
・群２：ブライトライト損傷＋ブランクＮＰ対照（３．４μｇ／μＬの総固体を含む１μＬ）（ｎ＝１１）
・群３：ブライトライト損傷＋ＡＴ－００７－ＮＰ－０２（３．４μｇ／μＬの総固体を含む１μＬ中１．３μｇのＡＴ－００７）（ｎ＝１１）
・群４：ブライトライト損傷＋ＡＴ－００７（１μＬ中１．３μｇのＡＴ－００７）（ｎ＝１１）
＊総固体：ＡＴ－００７、ＰＥＧ及びＰＬＧＡを含む
フラッシュ網膜電図（ｆＥＲＧ）及び高解像度ＳＤ－ＯＣＴのベースライン値をブライトライト損傷誘導の５日前に取得した。－１日目に試験品を投与（２μＬ）ＩＶＴ ＯＤし、マウスを暗所に適応させた。０日目の午前中に０．５％トロピカミド（Ｏｆｔａｎ Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄ．Ｓａｎｔｅｎ Ｏｙ）を滴下して、瞳孔を完全に散大させた。動物を透明なプラスチックケージに移し、ブライトライト刺激（１０，０００ルクス）に４時間曝露した。連続的なブライトライトに曝露した後、マウスを通常の明暗サイクル（１０ルクス；１２時間オン／１２時間オフ）に戻した。７日目に動物をｆＥＲＧ及びＳＤ－ＯＣＴで再検査した。実験の最終日に動物を０．９％ＮａＣｌ溶液で経心的に灌流した。両眼を採取し、固定しないまま液体窒素で凍結した。組織は、組織学／免疫組織化学のために使用するまで、８０℃の最適切削温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＯＴＣ）コンパウンド中に保存した。眼はスライド用に厚さ５μｍの切片に切断した。１組のスライドをヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織学的染色のために使用した。第２のスライドセットを用いて、マクロファージ細胞マーカーＦ４／８０に対して染色した。
定量的データをグラフ化し、分析し、平均標準偏差（ＳＤ）として提示した。外れ値データポイントは、ＲＯＵＴのテストを用いて１％の偽検出率で識別した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ８．０．１ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．ＵＳＡ）を使用して解析した。内部投影（ＶＩＰ）ＳＤ－ＯＣＴ Ｂ－スキャンデータを表示する。組織学的分析の結果は、ペンディング中である。ＳＤ－ＯＣＴ Ｂ－スキャンは、視神経乳頭（ＯＮＨ）を中心とするＶＩＰから取得し、ＯＮＨより－０．４ｍｍ下、ＯＮ地点Ｈ、ＯＮＨより＋０．４ｍｍ上に位置付けした。ＯＮＨを中心とするＳＤ－ＯＣＴ ＶＩＰスキャンに２５点グリッドを配置し、ソフトウェアを使用し、各地点について網膜層（網膜内外顆粒層－ＩＳ／ＯＳ／ＲＰＥ）の厚さを測定した。
等量のＡＴ－００７を有するリガンド単独群におけるＯＮＬの保存は、ブランク－ＮＰ処理マウスに対して統計的有意性に達しなかった。これは、リガンドのみでは光損傷条件下で網膜を保護するのに十分でなかったことを示唆している。ヒートマップ相関（図示していない）は、眼の３つの異なる領域を中心としたＯＣＴによって測定された網膜層の厚さの相対的な変化を示す。予想した通り、網膜の一部の領域は、他の領域よりも光損傷に対して感受性が高い。ＡＴ－００７－ＮＰ０２処置マウスにおける上鼻方位（ＳＮ）での濃紺の四角のより暗い強度は、ＡＴ－００７のみ又はブランク－ＮＰで処置されたマウスと比較して、その領域における外顆粒層（ＯＮＬ）の有意な維持を示す。その結果を、図２３に示すが、これらの結果は、強度ブライトライトという上記の極端な条件下でＡＴ－００７－ＮＰ０２予防処置がＯＮＬの維持に寄与し、ＡＴ－００７又はブランク－ＮＰ単独のいずれかによる予防的処置と比較して網膜を菲薄化から保護し得ることを示唆している。このデータは、抗炎症／防御応答を誘発するために、シグレック受容体結合をより効率的に標的化して、結合するＡＴ－００７リガンドの活性を高めるためのナノ粒子足場の存在の必要性を強く支持するものである。
図２３は、ブランク－ＮＰ、ＡＴ－００７及びＡＴ－００７－ＮＰ０２を注射した動物からの外顆粒層の厚さ（μＭ）を示す。データは、１群当たり１１匹のマウスからのＳＥＭ±平均値として表示される。シダック多重比較有意性ブランク－ＮＰ対ＡＴ－００７－ＮＰ０２ ＊ｐ＝０．０３１８によってデータを解析した。
スペクトルドメイン光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）網膜スキャンを使用して、網膜構造を評価し、外顆粒層（ＯＮＬ）を解析した。ＯＮＬの厚さは、ブランク－ＮＰで処置した眼と比較して、ＡＴ－００７－ＮＰ０２を投与された眼の全ての解析グリッドポイントで有意に大きかった。この差は、データが眼のいくつかの解剖学的領域に分割されたときにも明確に反映され、上鼻領域は、側頭領域と比較してより高い防御を有した。
４．線維細胞分化に対するＡＴ－００７－ＮＰ０４の効果
ＰＢＭＣを健康なドナーから取得し、ＣＤ１４＋単球細胞を単離し、（２×１０＾５／ｍｌ）を無血清線維細胞分化培地中に再懸濁させ、５日間培養した。４日目に非接着細胞を洗い流し、培地の半分を除去して、新鮮な培地と交換する。細胞は、明視野イメージングと細胞計数のために、ＡＴ－００７－ＮＰ０４／ＳＡＰを含有及び非含有の２４ウェルプレートに平板培養した。細胞は、ＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ３０００設定を用いるＯｌｙｍｐｕｓを使用して、１０×倍率で画像化した。スケール－１００μＭ。線維細胞の数は、ウェル当たり３つの実視野を用いて、ウェルを３回反復で計数することにより決定した。血清アルブミンタンパク質（１μｇ／ｍｌ）（ＳＡＰ）を陽性対照として使用した。ＡＴ－００７－ＮＰ０６を５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。図２４は、実験セットアップの概略を示す。代表的な明視野画像は、ＡＴ－００７－ＮＰ０４処理後の線維細胞分化を減少させる傾向を示した。
顕微鏡画像は、ＡＴ－００７－ＮＰ０６で処理すると、単球から線維細胞への分化を低減することができるというエビデンスを明確に示した。線維細胞数の変化は、さらなる病的線維症の予防と相関し得るか、又はさらにその解消に寄与し得る。
結果を図２５に線維細胞への分化率（％）としてグラフで表すが、これは、上記の画像からの細胞数に基づいて、線維細胞分化の低減の傾向を示している。
５．Ｓｙｔｏｘオレンジ色素を用いて測定する、ＮＥＴ形成の遅延及び細胞死の遅延におけるＡＴ－００７－ＮＰ０６の効果
ＥａｓｙＳｅｐヒト好中球分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ ＃１９３５９）を用いて健康な対照の血液から、好中球を単離した。細胞。ヒトＰＭＮを１時間静置した後、製造元の指示に従って、膜不透過性ＤＮＡ結合色素ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ Ｓｙｔｏｘオレンジ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃－Ｓ１１３６８）の存在下、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（１００ｎＭ）及び５０μｇ／ｍｌのＡＴ－００７－ＮＰ０６で処理した。細胞外ＤＮＡとＮＥＴ形成とを経時的に観察した。これらの画像から得られた平均ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ強度の値を使用して、陽性対照としての１００ｎＭ ＰＭＡ及びナノ粒子でＰＭＮが刺激されたウェル内の細胞外ＤＮＡの総放出を定量化した。これらのデータは、ＰＭＡ対照と比較して、ＡＴ－００７－ＮＰ０６の存在下でＮＥＴ形成に遅延があったことを示している。実験セットアップの概略を図２６に示す。結果を図２７にグラフで表し、これは、経時的な動態曲線を示す。
Ｓｙｔｏｘ陽性は好中球細胞死を示す。ＰＭＡに対するＳｙｔｏｘ陽性染色のパーセンテージが高いことは、細胞が処理後にアポトーシスを被ることを示唆している。本発明者らのデータは、ＰＭＡ処理と併用したＡＴ－００７－ＮＰ０６が経時的な好中球細胞死を遅らせることを示唆している。処理から２時間～４時間後付近の曲線にシフトがあり、これは、好中球細胞死の３０～５０％近くの減少を示している。この細胞死の遅延は、ＡＴ－００７－ＮＰ０６がＮＥＴｏｓｉｓを予防できるという強力なエビデンスである。
ＸＩ．実施例１７：シグレック７、９及び１１へのコルミン酸（ＰＳＡ）の結合
異なる重合度（ＤＰ）のポリシアル酸（ＰＳＡ）分子のシグレック７、９及び１１への結合を、表面プラズモン共鳴効果（ＢＩＡＣｏｒｅ（商標）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて調べた。
ＤＰの値は、分子の集合体におけるポリマー分子の平均長さを指すことが理解されよう。従って、ＤＰ１３のＰＳＡは、１３シアル酸残基の平均長さを有するＰＳＡ分子の集合体を指す。この実験では、市販のシアル酸二量体（ＰＳＡ ＤＰ２）を対照として用いた。この二量体を含むこの組成物は均質であり、長さ分布がなかった。
結果は、ＤＰ１３のＰＳＡが、シグレック７、９及び１１に強く結合するのに対し、シアル酸の二量体（ＤＰ２のＰＳＡ）には結合が観察されなかったことを示す。
簡単に説明すると、コロミン酸を８０℃の水中で２．５時間加熱することによって部分的に解重合し、限外濾過によって分画して、平均ＤＰが１３のＰＳＡ画分を得た。化合物をオキシムライゲーションにより修飾し、ビオチンにより修飾された（後述の通り）化合物３
Figure 2023543527000075
 を得た。波線は、ＰＳＡ分子への結合点を表す。
ビオチン化
オキシム修飾ＰＳＡのビオチン化は、以下の合成スキームに従って行った。
スキーム８：ビオチン化オリゴシアル酸の合成
Figure 2023543527000076
 簡単に説明すると、反応チューブに、１ａ／１ｂ（１当量）、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３（１．５当量）及び化合物２（１．２当量）を添加し、室温で一晩撹拌した。反応物をＰ２バイオゲルクロマトグラフィー（３ａ）又は１０Ｋスピンフィルター（３ｂ）を用いた限外濾過により精製し、化合物３ａ又は３ｂを得た。
修飾されたＰＳＡは、ストレプトアビジンにより修飾したＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲチップに固定化し、シグレックへの結合について試験した。
ジ及びポリシアロシドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
表面／サンプル共役
全ての分析は、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ ｍａｃｈｉｎｅで実施した。シリーズＳ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｎｏ．２９１４９６０３）に、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳアミド結合化学（フローセル１、２、３及び４）を用いて、ストレプトアビジン（２，０００応答単位、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎｏ．４３４３０１）をコーティングする。次に、エタノールアミンを用いて、全てのフローセルをブロックし、ＰＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ及び０．５％界面活性剤Ｐ２０（Ｃｙｔｉｖａ Ｎｏ．ＢＲ１０００５４）、ｐＨ７．４）の脱気溶液を流すことにより、チップ表面を安定化させる（１０μＬ／分）。
安定化ベースラインには、ビオチン化ジシアロシドと、平均重合度１３（ＤＰ１３）のビオチン化ポリシアロシドを導入する。ジシアオロシドをＤＩ水に５０μｇ／ｍＬの濃度まで溶解させる（体積合計＝２００μＬ）。手動モードでＴ１００ソフトウェアを用いて、ビオチン化ジシアロシドの５０μｇ／ｍＬ溶液を３０μＬ／分の流量で９０秒間フローセル２に導入した後、ＰＢＳ－Ｐを３０μＬ／分の流量で９０秒間導入する。このプロセスは３回反復され、その後、追加のビオチン結合は観察されない。ビオチン化ポリシアロシド（ＤＰ１３）の安定化は、ビオチン化ＤＰ１３構造がフローセル４に導入されること以外は、ジシアロシドと同じプロトコルに従う。
シグレック－１１スクリーニング
凍結乾燥したｈＦｃ－シグレック－１１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｏ．３２５８－ＳＬ－０５０）をＰＢＳ－Ｐバッファー中で２００μｇ／ｍＬの濃度に再構成し、分析前に氷上で３０分間平衡化させる。並行結合アッセイは、フローセル２及び１並びにフローセル４及び３からそれぞれ測定された応答単位を差し引くことにより、シグレック－１１とビオチン化ジシアロシド及びポリシアロシドとの間の相互作用を測定するようにセットアップする。この分析は、以下のパラメータ：
ａ．流量＝３０μＬ／分
ｂ．接触時間＝６０秒
ｃ．解離時間 ９０秒
ｄ．安定化時間＝３０秒
を使用し、３つの異なる濃度：２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのシグレック－１１を導入することにより達成される。
シグレック－９スクリーニング
凍結乾燥したｈＦｃ－シグレック－９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｏ．１１３９－ＳＬ－０５０）をＰＢＳ－Ｐバッファー中で２００μｇ／ｍＬの濃度に再構成し、分析前に氷上で３０分間平衡化させる。並行結合アッセイは、フローセル２及び１並びにフローセル４及び３からそれぞれ測定された応答単位を差し引くことにより、シグレック－９とビオチン化ジシアロシド及びポリシアロシドとの間の相互作用を測定するようにセットアップする。この分析は、以下のパラメータ：
ａ．流量＝３０μＬ／分
ｂ．接触時間＝６０秒
ｃ．解離時間 ９０秒
ｄ．安定化時間＝３０秒
を使用して、１００μｇ／ｍＬの濃度でシグレック－９を導入することにより達成される。
シグレック－７スクリーニング
凍結乾燥したｈＦｃ－シグレック－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｎｏ．１１３８－ＳＬ－０５０）をＰＢＳ－Ｐバッファー中で２００μｇ／ｍＬの濃度に再構成し、分析前に氷上で３０分間平衡化させる。並行結合アッセイは、フローセル２及び１並びにフローセル４及び３からそれぞれ測定された応答単位を差し引くことにより、シグレック－７とビオチン化ジシアロシド及びポリシアロシドとの間の相互作用を測定するようにセットアップする。この分析は、以下のパラメータ：
ａ．流量＝３０μＬ／分
ｂ．接触時間＝６０秒
ｃ．解離時間 ９０秒
ｄ．安定化時間＝３０秒
を使用して、１００μｇ／ｍＬの濃度でシグレック－７を導入することにより達成される。それらの結果を図３４Ａ～図３４Ｄに示すセンサグラムで示す。見てわかるように、ＤＰ１３のＰＳＡは、シグレック７、９及び１３に結合するが、ジシアリル二量体に対する結合は検出されない。これらの結果は、シグレックに対する結合の機能が、ＰＳＡの長さに依存することを示唆している。
本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
本発明を特にその実施形態の例を参照して示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更形態がなされ得ることが当業者に理解されるであろう。

Claims (63)

  1. 以下の構造式：
    Ｐ－Ｌ－Ｇ
    （式中、
    Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含む生体適合性ポリマー足場であり；
    Ｇは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）であり；及び
    Ｌは、共有結合リンカーである）
    によって表される分子又はその薬学的に許容される塩を含む粒子。
  2. 前記ポリマー足場は、ブロックコポリマーＰＬＧＡ－ＰＥＧを含む、請求項１に記載の粒子。
  3. Ｐは、以下の構造式：
    Figure 2023543527000077
     （式中、記号
    Figure 2023543527000078
     は、前記リンカーＬへの前記ポリマーの結合点を表し、さらに、
    ｘは、０～２０の整数であり、ｙは、０～２０の整数であり、ｍは、１～１０００の整数であり、及びｎは、ｘとｙとが同時に０でないことを条件として、５～４５０の整数である）
    によって表される、請求項１又は２に記載の粒子。
  4. ｘは、０～１０の整数であり、ｙは、０～１０の整数であり、ｍは、１～５００の整数であり、ｎは、５～４５０の整数である、請求項３に記載の粒子。
  5. Ｇは、以下の構造式：
    Figure 2023543527000079
     （式中、記号
    Figure 2023543527000080
     は、前記リンカーＬへのＧの結合点を表し、さらに、ｐは、４～１９８の整数である）
    のいずれか１つによって表されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１～４のいずれか一項に記載の粒子。
  6. ｐの値は、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０及び５０～６０の範囲のいずれか１つから選択される、請求項５に記載の粒子。
  7. ｐは、５～２５である、請求項５に記載の粒子。
  8. ｐは、１０～２０である、請求項５に記載の粒子。
  9. 前記リンカーＬは、以下の構造式（式中、記号
    Figure 2023543527000081
     は、Ｇへの前記リンカーＬの結合点を表し、及び記号
    Figure 2023543527000082
     は、Ｐへの前記リンカーＬの結合点を表す）：
    Figure 2023543527000083
     （式中、
    Ｒ１１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－又は－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－Ｏ－であり；及び
    Ｒ１２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ１１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ１２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ１１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ１２は、Ｈ又はメチルである）；
    Figure 2023543527000084
     （式中、
    Ｒ２１は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－であり；及び
    Ｒ２２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ２１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ２２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ２１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ２２は、Ｈ又はメチルである）；
    Figure 2023543527000085
     （式中、
    Ｒ３１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；及び
    Ｒ３２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ３１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ３２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ３１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ３２は、Ｈ又はメチルである）；
    Figure 2023543527000086
     （式中、
    Ｒ４１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；及び
    Ｒ４２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ４１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ４２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ４１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ４２は、Ｈ又はメチルである）；
    Figure 2023543527000087
     （式中、
    Ｒ５１は、－（ＣＨ２）１～１０－であり；及び
    Ｒ５２は、存在しないか、又は－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－、－（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ５１）－（ＣＨ２）１～１０－、－Ｎ（Ｘ５２）－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－ＮＨＮＨ－（ＣＨ２）１～１０－のいずれか１つであり、Ｘ５１は、Ｈ又はアセチルであり、及びＸ５２は、Ｈ又はメチルである）；
    Figure 2023543527000088
     （式中、
    Ｒ６１は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－であり；
    Ｒ６２は、存在しないか、又は－（ＣＨ２）１～１０－若しくは－（ＣＨ２）１～１０－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－ＮＨ－である）；
    Figure 2023543527000089
     （式中、
    Ｒ７１は、－ＮＨＣ（Ｏ）－又は－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－ＣＨ２－であり；及び
    Ｒ７２は、－（ＣＨ２）１～１０－Ｏ－（ＣＨ２）１～１０－ＮＨ－である）；
    Figure 2023543527000090
     （式中、
    Ｒ８１及びＲ８２は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－である）；
    Figure 2023543527000091
     （式中、
    Ｒ９１は、－ＮＨＣ（Ｏ）－又は－ＯＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－ＣＨ２－であり；及び
    Ｒ９２は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）１～１０－（ＣＨ２）１～１０－である）；
    Figure 2023543527000092
     （式中、
    Ｒ１０１は、Ｈ又はメチルであり；
    Ｘ１０は、Ｏ又はＮＨであり；及び
    Ｒ１０２は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
    Figure 2023543527000093
     （式中、Ｘ１０１、Ｘ１０２及びＸ１０３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
    Figure 2023543527000094
     は、前記カルボニルＡへの結合点を表す）
    のいずれか１つによって表される部分である）；
    Figure 2023543527000095
     （式中、
    Ｒ１１１及びＲ１１１Ａは、それぞれ独立に、Ｈ又はＣ１～Ｃ３アルキルであり；
    Ｘ１１及びＸ１１Ａは、それぞれ独立に、Ｏ又はＮＨであり；及び
    Ｒ１１及びＲ１１Ａは、独立に、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
    Figure 2023543527000096
     （式中、Ｘ１１１、Ｘ１１２及びＸ１１３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
    Figure 2023543527000097
     は、前記カルボニルＢ又は前記カルボニルＢ’への結合点を表す）
    のいずれか１つによって表される部分である）；
    Figure 2023543527000098
     （式中、
    Ｘ１２は、－（ＣＨ２）１～１０－又は－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）１～１０－であり；及び
    Ｒ１２は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
    Figure 2023543527000099
     （式中、Ｘ１２１、Ｘ１２２及びＸ１２３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０であり、記号
    Figure 2023543527000100
     は、前記カルボニルＣへの結合点を表す）
    のいずれか１つによって表される部分である）；及び
    Figure 2023543527000101
     （式中、
    Ｘ１３は、－Ｐｈ－又は－ＣＨ２－Ｐｈ－ＣＨ２－であり、Ｐｈは、フェニルであり；及び
    Ｒ１３は、－ＣＨ２Ｏ－又は以下の構造式：
    Figure 2023543527000102
     （式中、Ｘ１３１、Ｘ１３２及びＸ１３３は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０－であり、記号
    Figure 2023543527000103
     は、前記カルボニルＤへの結合点を表す）
    のいずれか１つによって表される部分である）；
    Figure 2023543527000104
     （式中、Ｘ１４及びＸ１５は、それぞれ独立に、Ｈ又はメチルであり、Ａ１４及びＡ１５は、それぞれ独立に、ＮＲＡ、ＮＲＡＮＲＢ、Ｏ又はＳであり、ＲＡ及びＲＢは、出現毎に独立に、Ｈ、Ｃ１～４アルキル及びＣ６～Ｃ１８アリールから選択され；且つＲ１４及びＲ１５は、それぞれ独立に、－（ＣＨ２）１～１０－又は－ＣＨ２ＣＨ２－（ＯＣＨ２ＣＨ２）１～１０－である）
    のいずれか１つによって表される、請求項１～８のいずれか一項に記載の粒子。
  10. 前記リンカーＬは、以下の構造式：
    Figure 2023543527000105
     （式中、
    ａは、２～６の整数であり；及び
    ＲＡは、存在しないか、又は－（ＣＨ２）１～２－Ｏ－（ＣＨ２）１～２－ＮＨ－である）
    によって表される、請求項９に記載の粒子。
  11. 前記Ｐは、ＰＬＧＡ（１０ｋ）－ＰＥＧ（５ｋ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の粒子。
  12. Ｐの単位重量当たりのＧの重量（リガンド密度）は、１０～７５μｇ／ｍｇである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の粒子。
  13. 眼科疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与することを含む方法。
  14. 前記眼科疾患は、乾性加齢黄斑変性症、滲出型加齢黄斑変性症、非増殖性糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、黄斑浮腫、ブドウ膜炎、ドライアイ、結膜炎、甲状腺眼症、眼内炎、網膜変性症、緑内障、網膜静脈閉塞症、眼瞼炎、角膜炎、眼感染症又は白内障である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアンタゴニストである、請求項１３に記載の方法。
  16. 炎症性疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与することを含む方法。
  17. 投与経路は、静脈内、硝子体内、経口、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下洗浄、肺洗浄、胃洗浄及び肝内、皮下又は直腸の１つ以上である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記炎症性疾患は、結核、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、気管支拡張症、肺線維症間質性肺疾患、肺血管疾患、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、細菌性肺炎、アレルギー性気管支炎、非アレルギー性気管支炎、鼻炎又は線維化性肺胞炎である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記炎症性疾患は、関節リウマチ、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症（強皮症）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、痛風、変形性関節症、感染性関節炎又は若年性特発性関節炎である、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、セリアック病、憩室炎、胃食道逆流症、乳糖不耐症、消化性潰瘍、胆嚢炎、胃炎、大腸炎、膵炎、自己免疫性肝炎、肝炎、感染性肝炎又は膵炎である、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記炎症性疾患は、敗血症性ショック、アテローム性動脈硬化症、拡張機能障害、心不全、心線維症、コクサッキー心筋炎、先天性心ブロック、自己免疫性心筋炎又は巨細胞性心筋炎である、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記炎症性疾患は、腎移植拒絶反応、糸球体腎炎、急性腎炎、膀胱炎、前立腺炎、糖尿病性腎炎又は糖尿病性腎疾患である、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記炎症性疾患は、皮膚炎、湿疹、炎症性発疹、強皮症、ケロイド、ざ瘡、サルコイドーシス、股部白癬、体部白癬、足白癬、頭部白癬、爪白癬、酒さ、白斑、苔癬硬化症、自己免疫蕁麻疹、皮膚筋炎又は化膿性汗腺炎である、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記炎症性疾患は、糖尿病、ＳＬＥ、多発性硬化症、シェーグレン症候群、アジソン病、バセドウ病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、セリアック病、悪性貧血、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性内耳疾患、ギランバレー、川崎病、ランバート・イートン症候群、フォークト－小柳－原田症候群、全身性血管炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス又は結節性多発動脈炎である、請求項１６に記載の方法。
  25. 前記炎症性疾患は、神経脊髄炎、多発性硬化症、脳炎、神経サルコイドーシス、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症又はハンチントン舞踏病、横断性脊髄炎、ギランバレー症候群、パーキンソン病又は良性本態性振戦である、請求項１６に記載の方法。
  26. 前記炎症性疾患は、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ニューカッスル病ウイルス、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、カクリウイルス（Ｃａｃｌｉｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ピコロノウイルス（Ｐｉｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）又はコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）によって引き起こされるウイルス性疾患である、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記炎症性疾患は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、好気性細菌、嫌気性細菌又は抗生物質耐性菌によって引き起こされる細菌性疾患である、請求項１６に記載の方法。
  28. 前記炎症性疾患は、真菌血症、真菌性角膜炎、カンジダ症、足白癬又は股部白癬である、請求項１６に記載の方法。
  29. 前記炎症性疾患は、アメーバ症、ジアルジア症、トキソプラズマ症又はトキソカラである、請求項１６に記載の方法。
  30. 前記炎症性疾患は、特発性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、拡張機能障害及びＣＨＦを伴う心線維症、腎線維症、網膜線維症、皮膚線維症並びに瘢痕化である、請求項１６に記載の方法。
  31. 前記炎症性疾患は、敗血症、サイトカインストーム又は鎌状赤血球症である、請求項１６に記載の方法。
  32. 前記シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである、請求項１６に記載の方法。
  33. 癌に罹患している対象を治療する方法であって、
    治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与すること
    を含み、前記癌は、原発性肺癌、転移性肺癌、乳癌、結腸癌、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃癌、胆道癌、肝癌、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、脊椎癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、眼の癌、鼻咽頭癌又は皮膚癌である、方法。
  34. 前記シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニストである、請求項３３に記載の方法。
  35. 治療有効量の、イピリムマブ、ニボリムマブ、ペブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ又はセミプリマブから選択されるチェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記粒子の投与は、放射線療法と同時であるか又はそれに続くものである、請求項３３に記載の方法。
  37. 治療有効量の、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ブレオマイシン、ダカルバジン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エピルビシン、シスプラチン、タモキシフェン、タキソテール、Ｈｅｒ２ｎｅｕ阻害剤、抗ＶＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ソラフェニブ又はｍＴＯＲ阻害剤から選択される第２の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  38. 癌に罹患している対象を治療する方法であって、
    治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与すること
    を含み、前記癌は、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫である、方法。
  39. 治療有効量のダウノルビシン、シタラビン又はイマチニブを前記対象に投与することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記粒子の投与は、幹細胞移植又は骨髄移植と同時であるか又はそれに続くものである、請求項３８に記載の方法。
  41. 感染症に罹患している対象を治療する方法であって、
    治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与すること
    を含み、前記感染症は、Ｂ群レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クルーズ・チルパノソーマ（Ｔｙｒｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ＨＩＶ、インフルエンザＡ、Ｂ若しくはＣ、Ｓａｒｓ ＣｏＶ１、Ｓａｒｓ Ｃｏ Ｖ２又はヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる、方法。
  42. 前記シアル酸リガンドは、シグレック３、５、７、８、９、１０、１１又は１５の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニスト及びシグレック１４又は１６の１つ以上のアゴニスト又はアンタゴニストである、請求項４１に記載の方法。
  43. 治療有効量の、ザナミビル、オセルタミビル、バルシクロビル、アシクロビル又はジドブジンの１つ以上を前記対象に投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記シアル酸リガンドは、シグレック１１と同族である、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記シアル酸リガンドは、シグレック９と同族である、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記シアル酸リガンドは、シグレック７と同族である、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記シアル酸リガンドは、シグレック５と同族である、請求項４１に記載の方法。
  48. 免疫細胞における細胞媒介性炎症反応を調節する方法であって、前記免疫細胞を、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子と接触させることを含む方法。
  49. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  50. 前記薬学的に許容される担体は、ＰＢＳバッファー又は生理食塩水を含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 前記担体中の前記粒子の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌである、請求項４９に記載の医薬組成物。
  52. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の凍結乾燥又は凍結乾燥粒子を含む組成物。
  53. 粒子を製造する方法であって、第１の不安定部分を含む生体適合性ポリマー足場Ｐと、第２の不安定部分を含むグリカンＧとを、前記第１の不安定部分及び第２の不安定部分の付加物Ｌを生成するのに十分な条件下で反応させ、それにより、以下の構造式：
    Ｐ－Ｌ－Ｇ
    （式中、
    Ｐは、ポリグリコール酸、ポリ（Ｌ－乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、プルロニックＦ１２７、プルロニックＦ６８、ポロキサマー、ポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、シアル酸及びキトサンからなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性ポリマーを含み；及び
    Ｇは、シアル酸の５～２００反復単位を含むポリシアル酸（ＰＳＡ）である）
    によって表される分子を生成することを含む方法。
  54. 前記第１及び第２の不安定部分は、アミン、カルボン酸、アジド、アルキン、ＴＣＯ、テトラジン、ＤＣＢＯ及びジヒドラジドから選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記第１及び第２の不安定部分は、アジド、アルキン又はテトラジンから選択され、前記付加物Ｌは、アルキン－アジド付加物又はアルキン－アジド付加物を含み、前記付加物を生成するのに十分な前記条件は、
    銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン反応（ＣｕＡＡＣ）；
    銅フリーアジド－アルキン反応；
    歪み促進型アジド－アルキン反応（ＳＰＡＡＣ）；
    テトラジン－アルケンライゲーション反応；及び
    ＴＣＯ－テトラジン反応
    のための条件である、請求項５３に記載の方法。
  56. Ｐは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧコポリマーを含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 対象における補体活性化を阻害する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与することを含む方法。
  58. 前記対象は、過剰な補体成分Ｃ３、Ｃ３ｂを産生する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記粒子は、シグレック１１のアゴニストである、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. 前記粒子は、補体因子Ｈと結合する、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 補体過剰活性化疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の粒子を前記対象に投与することを含む方法。
  62. 投与経路は、静脈内、硝子体内、経口、口内リンス、眼内、網膜下、テノン下、強膜内、眼周囲、経鼻及び経口吸入、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、頭蓋内、皮内、経皮（局所）、経粘膜、皮下洗浄、肺洗浄、胃洗浄及び肝内、皮下、直腸、関節内の１つ以上である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記補体過剰活性化疾患は、乾性及び滲出型黄斑変性症、発作性夜間血尿、全身性エリテマトーデス、敗血症、抗リン脂質症候群、アルツハイマー、脳卒中、心筋梗塞、ショック、臓器移植拒絶反応、バイオマテリアルインプラント拒絶反応、ＣＯＰＤ増悪、歯肉炎／歯周病、全身性炎症反応症候群である、請求項６１に記載の方法。
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