CN1033215C - 抗肿瘤生物制剂的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗肿瘤生物制剂的制造方法,由鸡新城病毒、神经氨酸酡核酸酶及其附加剂制备而成。本发明的制剂对多种小鼠移植性肿瘤、Ehrlich腹水癌、小鼠原发性肝癌、S180肉瘤、Lewis肺癌、L1210淋巴细胞白血病、LA-795肺腺癌、MA-737乳腺癌均有较好的抑制和杀伤作用,瘤体生长抑制率、生存时间均优于化疗和其它治疗,对人体无毒付作用。
Description
本发明涉及一种高效、谱广的抗肿瘤生物制剂的制造方法。利用
本发明方法制的抗肿瘤生物制剂对肝癌、恶性淋巴癌、白血病都有明显的治疗效果。
目前尚未发现抗肿瘤效果较高的生物制剂,因此也未发现相应的制造方法。现代采用细胞工程技术生产的的巨噬细胞、细胞毒、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、免疫球蛋白等细胞毒活性细胞和细胞因子,它们的共同作用主要是过继免疫,以达到抗肿瘤的目的。现在国内外承认和使用的抗肿瘤生物制剂为“卡介苗”其制造方法是从结核菌培养、分离而得,用这种方法制造的“卡介苗”对肿瘤虽有抑制作用,但主要增强机体的免疫力、食欲和抵抗力,对肿瘤的治疗作用很小。
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤谱广、治疗作用显著,且无明显毒副作用;又有免疫作用,而且对癌细胞有直接杀伤作用的生物制剂的制造方法。
本发明的制造方法是将鸡新城病毒、神经氨酸酶、唾液酸酶、核酸酶、生物素、磷脂、胆固醇、岩藻糖和糖蛋白G1、糖蛋白G2、尿嘧啶、维生素C、三磷酸腺苷(ATP)、氯化钾、半乳糖、吐温-80,硫酸镁等配制而成。
本发明的设计思想和抗肿瘤生物制剂的主要成份作用机制为:由于鸡新城病毒缺乏自身所需的完整酶系统,增殖时必须靠宿主细胞合成核酸和蛋白质,甚至直接利用宿主细胞的某些成份,这就决定了它在细胞内专性寄生的特性,而人和动物的肿瘤组织恰好为其所寄生的活细胞组织,所以该病毒直接破坏癌细胞。同时,该病毒对肿瘤还有以下四种作用:1、机体产生抗病毒免疫反应时,该病毒能使机体或致敏淋巴结与感染病毒的肿瘤细胞表面抗原起反应,破坏靶细胞:2、该病毒在机体内能产生干扰素,抑制肿瘤细胞增殖、引起细胞行为的改变、影响肿瘤细胞因子的产生、引起恶性变型逆转;3、间接和直接干扰肿瘤病毒;4、增强机体对肿瘤的非特异性免疫力。此外,当病毒进入癌细胞后,溶酶体膜的通透性增高,溶酶体渗出于细胞浆内,引起癌细胞自溶。
癌细胞的DNA聚合酶和RNA聚合酶活性都比正常细胞高,所以癌细胞合成核酸增强。与此相反,癌细胞核酸的分解过程明显降低,具体表现在从核酸降解为核苷核酸,以及由核苷酸分解为最终产物。核酸酶(RNase、DNase)可使核酸(RNA、DNA)降解、对抗DNA和RNA的聚合酶的作用,使癌细胞合成核酸(RNA、DNA)的活性降低,速度减慢,纠正癌细胞代谢失调,停止恶性生长和繁殖。
许多研究工作证实,人体结肠、胃、胰、乳腺、肝、皮肤、淋巴结、肺等实质性肿瘤细胞膜中、唾液酸含量增加。唾液酸存在于细胞膜外表面,带负电荷。其含量增加的生物学作用是减少细胞间粘合,促进细胞增殖。扩散和转移,增高细胞膜通透性,并与细胞的抗原性有关。唾液酸在肿瘤细胞周围起着遮盖和阻挡肿瘤相关移植抗原,逃脱免疫淋巴细胞的攻击作用。神经氨酸酶(NA)能去除肿瘤细胞表面的唾液酸,从而增强淋巴细胞攻击癌细胞的作用。
抗肿瘤生物制剂具有导向作用的依据:1、鸡新城病毒具有对肿瘤细胞的专性寄生;2、病毒粒子的胺基与肿瘤细胞膜中增高的环磷酸鸟甙的磷酸基相结合;3、带正电荷的病毒粒子与带负电荷的肿瘤细胞相吸引,形成静电结合;4、病毒粒子膜中含有脂质体。
所说的抗肿瘤生物制剂的组份为:鸡新城病毒尿囊液1500ml,神经氨酸酶2毫克,核酸酶2毫克,糖蛋白G1.08克,半乳糖10克,生物素1.0毫克,岩藻糖5克,唾液酸酶2.0毫克,磷脂2毫克,尿嘧啶10毫克,VitC5毫克,胆固醇4.0毫克,ATP200毫克,10%KCL22毫升,MgSO4·7H2O3.6克,凝血素10毫克。
本发明的制造方法包括下列步骤:
1、鸡新城病毒的培养和选择
首先选择出呼吸道紊乱,伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡。然后,从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城病毒。
选择健康母鸡孵育的鸡胚,最好为9~11日龄的鸡胚,将上述分离的鸡新城病毒接种于鸡胚的尿囊腔中。置于37~38℃下培养48~72小时,至胚内含大量病毒,呈现较高血凝性。
从鸡胚中抽出尿囊液,利用血凝集抑制试验方法,进行病毒定性。
2、鸡新城病毒的扩大种植,培养和鸡新城病毒尿囊液的收集
先用抗菌素处理病料(即上述鸡新城病毒尿囊液),使病料中的抗菌素浓度分别为每毫升青霉素1000单位和链霉素1000毫克。也可以用静脉滴注金霉素处理,浓度为每毫升1毫克,处理的病料置于4℃中感作1~2小时。
选择10~12日龄的活鸡胚,画出气室和胚位,在气室接近胚位处涂3%的碘酒和75%的酒精消毒,用无菌钢锥穿一小孔,随后将注射器沿小孔插入0.5~1.0厘米处,注入0.1~0.2毫升接种物(即上述采用抗菌素处理过的鸡新城病毒尿囊液)。用石蜡封口,在孵育箱中孵育48~72小时。
将孵育好的鸡胚冻死,用碘酒和酒精消毒后,除去气室端的孵壳或人工卵窗的封盖物,撕去内层壳膜和绒毛尿囊膜,直接吸收尿囊液。
以上各项操作必须在无菌条件下进行。
3、鸡新城病毒尿囊液效价测定及效价调整
利用红细胞凝集法测定效价,然后将测定的鸡新城病毒尿囊液的效价调整到1∶640,方法是:取鸡新城病毒尿囊液10毫升测定其效价,若效价低于1∶640,则滴加无菌高效价1∶1280鸡新城病毒尿囊液,使抽样10毫升的效价达1∶640为止。算出滴加无菌高效价的毫升数。利用公式计算:生产总量中加无菌高效价毫数=总量数(毫升)×高价毫升数÷低价10毫升。
抽样10毫升,测效价高于1∶640,然后滴加无菌生理盐水(0.85%)使效价降至1∶640,算出滴加无菌生理盐水毫升数。利用公式计算:生产总量中需加无菌生理盐水毫升数=总量数(毫升)×生理盐水毫升数÷抽样10ml。
4、鸡新城病毒尿囊液除菌方法:用0.22mμ滤膜过滤。
5、抗肿瘤生物制剂的配制
将鸡新城病毒,神经氨酸酶、核酸酶、附加剂等按一定比例配制,得到抗肿瘤生物制剂。
实施例:
①鸡新城病毒的选择和培养
选用鸡新城病毒,在10~12日龄活鸡胚尿囊液中37~38℃培养48~72小时,然后收取含该病毒的尿囊液。
利用红细胞凝集法测定效价,然后将测定的鸡新城病毒尿囊液的效价调整到1∶640。
经过封闭式双层府绸袋和0.22mμ微孔泸膜的泸菌器除去鸡胚尿囊液的杂质、蛋白、污染的杂菌及部分尿酸盐。
②制剂组分的配制
A:糖蛋白G10.72克 糖蛋白G20.36克
按顺序溶于160毫升0.075N HCL溶液中,置水浴中半小时。
B:生物素1.0毫克
先溶于7.5毫升去离子水中,再加入0.1毫升1NHCl,再加去离子水至10毫升。
C:磷脂2.0毫升 胆固醇4.0毫克
将磷脂溶于4毫升95%酒精中,然后加入胆固醇,用力振荡使之溶化,再加入5%吐温-80水溶液10毫升。
D:唾液酸酶2毫克,溶于10毫升去离子水中。
E:尿嘧啶10毫克
溶于100毫升去离子水中,予先在瓶内加0.35毫升的浓NH4OH。
F:神经氨酸酶2毫克
溶于20毫升去离子水中,4℃冰箱中避光保存备用。
G:VitC5毫克溶于10毫升去离子水中。
H:核酸酶2毫克。
溶于10毫升去离子水中,4℃冰箱中避光保存备用。
K:凝血素10毫克溶于去离子水中,室温保存。
I:95%ATP200毫克溶于10毫升去离子水中。
J:鸡新城病毒尿囊液1500毫升去菌备用。
③合成
在1500毫升鸡新城病毒尿囊液中顺序加入下列物质和溶液。
1、先加160毫升A溶液。
2、加B溶液2毫升。
3、加F溶液20毫升。
4、加10%KCL22毫升。
5、加MgSO4·7H2O3.6克。
6、加半乳糖水溶液25毫升。
7、加岩藻糖水溶液10毫升。
8、加唾液酸酶水溶液10毫升。
9、加C溶液14毫升。
10、加H溶液10毫升。
11、加I溶液10毫升。
12、加E溶液54毫升。
13、加G溶液10毫升。
14、加K溶液20毫升。
配制好的注射液进行灌封,上述操作在室温4℃以下,严格的无菌操作条件下进行。
本发明具有如下的优点和效果:本发明对Ehrlich(EAC)腹水癌,小鼠原发性肝癌,S180肉瘤,Lewis肺癌,L1210淋巴细胞白血病,MA-737乳腺癌,LA-795肺腺癌等均有较好的治疗效果,通过急性和亚急性毒性试验等多项临床前试验表明,本发明是一种毒副作用小,安全可靠的生物制剂。
本发明对动物试验和对人的临床试验结果如下:
(一)对动物试验的结果
实验材料和方法:
1、动物:昆明杂系,NIH杂系及C57、DBA、TA2、739纯系小鼠分别由中国医科院肿瘤研究所、同济医科大学微生物教研室和中国动物中心等提供;
2、瘤种:除小鼠艾氏腹水癌(FAC)由同济医科大学微生物教研室提供外、S180、HAC、Lewis肺癌、L1210白血病、MA-737乳腺癌、LA-795肺腺癌均由中国医科院肿瘤研究所提供;
3、药品:BC369注射液由本室自制,每支为1mg/2ml,批号:88051901、88082201。
4、接种与观察方法:测定生命延长率和瘤重抑制率的接种方法和观察方法按照1973年全国抗癌药物合成及筛选会议规定的方法进行,分别于小鼠腹腔或右侧腋窝皮下接种肿瘤1~8天后给药,观察其生命延长率或称取癌重。
MA-737乳腺癌的接种与观察方法为:在无菌条件下取接种后第10天生长良好的肿瘤,选择新鲜无坏死组织,切成1mm3组织块,将其装入脑血管造影针针管内,分别按种于TA2、739纯系小鼠左右足背皮下,当小鼠足背肿瘤几何直径达到4.8~5.5mm时,开始给药,每天一次,共8次;每天用游标卡尺测肿瘤的三个垂直直径,当肿瘤几何平均直径超过第一天给药时平均直径R+6.5时(即12mm),断颈处死。全部原始资料均输入计算机,按《肿瘤再生长延缓的数据处理绘图程序》进行数据处理与绘图,计算肿瘤生长达到R+5mm所需要的时间。
5、实验分组及给药方法:
对照组:生理盐水(NS)20ml/kg;
治疗组:BC369治疗组及CTX治疗组;
给药剂量:BC369为24~48μg/kg;CTX为25mg/kg
给药途径:皮下、腹腔或肌肉注射;
疗程:6~8次;
给药时间:分别在接种肿瘤后1、8和10天给药;
结果:
一、对动物模型试验结果:
(一)、BC369对昆明杂系小鼠的影响:
BC36924μg/kg、48μg/kg腹腔注射给药后12只小鼠长期存活30天以上,4只死亡小鼠均为30天后意外死亡或处死。而非治疗组则于接种后第16天内全部死亡,平均生存时间为12.7天;
(二)、BC369对和肺癌的抑制作用:
不同剂量的BC369经腹腔给药后对和肺癌有较强的抑制作用(P<0.001):见表1
(三)、BC369对纯系小鼠白血病的影响:
见表2
(四)、BC369对纯系小鼠肺腺癌的影响:
见表3
(五)、BC369、对纯系乳腺癌的影响:
见表4
表1:
瘤种 | 组别 | 动物数 | 剂量与疗程 | 平均瘤重(克) | 抑制率(%) | P值 |
S180 | 对照组CTX组BC369首次治疗组BC369重复治疗组 | 888888 | 20ml/kg×6天25mg/kg×6天24μg/kg×6天48μg/kg×6天24μg/kg×6天48μg/kg×6天 | 2.511.680.500.550.490.49 | -33.180.178.180.580.5 | -<0.025<0.001<0.001<0.001<0.001 |
HAC | 对照组CTA组BC369首次治疗组BC369重复治疗组 | 888888 | 20ml/kg×6天25mg/kg×6天24μg/kg×6天48μg/kg×6天24μg/kg×6天48μg/kg×6天 | 2.461.560.310.310.340.26 | -36.787.487.486.289.4 | -<0.025<0.001<0.001<0.001<0.001 |
Lewis肺癌 | 对照组CTX组BC369组 | 776 | 20ml/kg×8天25mg/kg×8天24μg/kg×8天 | 2.521.020.82 | -59.567.6 | -<0.001<0.001 |
表2:
组别 | 动物数 | 剂量疗程 | 平均存活天数 | 生命延长率 | P值 |
对照组BC369组CTX组 | 91010 | 20ml/kg×8天24ug/kg×8天25mg/kg×8天 | 11.015.411.5 | -40%4.5% | -<0.01>0.05 |
表3:
组别 | 动物数 | 剂量疗程 | R+5天数 | S.E | P值 |
对照组BC369CTX组新命质组 | 6776 | 20ml/kg×8天24μg/kg×8天25mg/kg×8天25mg/kg×8天 | 8.210.412.98.7 | 0.660.760.660.29 | ->0.05<0.05- |
表4:
组别 | 动物数 | 剂量疗程 | R+5天数 | S.E | P值 |
对照组BC369组CTX组 | 10109 | 20ml/kg×8天24ug/kg×8天25mg/kg×8天 | 5.86.66.9 | 0.520.720.65 | ->0.05>0.05 |
二、对人的临床试验结果。BC369抗肿瘤临床初步试验结果:见表5
表5:
组别 | 例数 | 显著 | 疗效有效 | 无变化 | 恶化 | 近期有效率% |
肝癌恶性淋巴瘤宫颈癌白血病乳腺癌肺癌结肠癌胃癌 | 967341025 | 6442111 | 22212311 | 242 | 1121 | 88.810085.91001008010080 |
注释:1、BC369为本发明的抗肿瘤生物制剂的代号:
2、CTX为抗癌化学药环磷酰胺(Cyclophosphamidum)的缩写;
3、新命质为中国医学科学院肿瘤防治研究所做该项动物模型试验中设立的一个生物制剂对照组;
4、Ehrlich(EAC)艾氏腹水癌:一种腹水型癌症;
5、HAC小鼠原发性肝癌:人为使小鼠致癌(属肝细胞型癌症);
6、S180肉瘤:属肉瘤的一种类型;
7、Lewis肺癌:属于肺癌的一种类型:
8、L1210:淋巴细胞白血病:属于白血病的一种类型;
9、MA-737:乳腺癌:属于乳腺癌的一种类型;
10、LA-795肺腺癌:属于肺腺癌的一种类型;
11、NIH杂系:小鼠分类号,属于混种;
12、C57、TA2、739、DBA纯系:为小鼠分类号;
13、R+6.5mm,R代表4.8~5.5mm;
14、P值:概率(统计学处理的一种代号)
15、SE:标准误。
Claims (2)
1、一种抗肿瘤生物制剂的制造方法,其特征在于:该制剂的组成包括鸡新城病毒尿囊液、神经氨酸酶、核酸酶、糖蛋白G、半乳糖、生物素、岩藻糖、唾液酸酶;制造方法包括:选用鸡新城病毒,在10~12日龄活鸡胚尿囊液中37~38℃培养48~72小时,然后收取含该病毒的尿囊液,取出效价为1∶640的鸡新城病毒尿囊液加入下列各种物质及溶液:
A:含糖蛋白(G1+G2)的0.075N的稀盐酸溶液;
B:含生物素的0.1N的盐酸溶液;
C:含神经氨酸酶的水溶液:
D:10%KCL;
E:MgSO4·7H2O;
F:含半乳糖的水溶液;
G:含岩藻糖的水溶液;
H:含唾液酸酶的水溶液;
I:含磷脂、胆固醇、95%酒精和5%吐温-80的混合液;
J:含核酸酶的水溶液;
K:95%ATP的水溶液;
L:含尿嘧啶和0.35毫升的浓NaOH溶液54毫升;
M:含VitC水溶液;
N:含凝血素无离子水液。
将配制好的生物制剂进行灌封,灌封在同一室内进行,间隔不超过6小时,上述操作在严格的无菌条件和室温4℃以下进行。
2、如权利要求1所述的制备方法,其特征在于所说的组份为:效价1∶640的鸡新城病毒尿囊液1500ml,神经氨酸酶2毫克、核酸酶2毫克、糖蛋白G1.08克、半乳糖10克、生物素1.0毫克、岩藻糖5克;唾液酸酶2.0毫克、磷酯2毫克、尿嘧啶10毫克;VitC5毫克、胆固醇4.0毫克、ATP200毫克、10%KCL22毫升、MgsO4·7H2O3.6克、凝血素10毫克。
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