CN1281593C - 苯并异硒唑衍生物的免疫调节和生物治疗作用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以下通式(I)、(II)或(III)的苯并异硒唑衍生物及其药物学上可接受的盐。该衍生物可用于免疫调节和生物治疗作用或具有免疫调节功能的保健组合物。
Description
发明领域
本发明涉及一类能够增强人体内细胞免疫系统NK细胞和LAK细胞活性的苯并异硒唑衍生物的应用。本发明还涉及包含该苯并异硒唑衍生物及其组合物作为免疫调节和生物治疗的药物、药物应用的技术方案、实施领域以及相关治疗时的药物组合物;以及该衍生物在制备具有免疫调节或生物调节功能的保健组合物所形成的技术方案和应用方法。
背景技术
生物治疗技术或生物调节疗法是与本发明申请所涉及的化合物有重要关系的背景技术。生物治疗技术是近年来发展迅猛,与化疗和放疗相对应的生物医药技术。主要的生物治疗技术有细胞因子(素)疗法、免疫细胞疗法和基因疗法。用于生物治疗技术的物质统称生物学反应调节剂,包括细胞调节因子或细胞素(干扰素、白细胞介素等)、细胞免疫调节剂(生物应答调节剂)等。
生物学反应调节剂可以调整机体内部的自身潜力以增强对肿瘤、感染一类病灶的生物学反应。例如白细胞介素2(IL-2)可促进B细胞、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞的分化增殖,在免疫缺陷病和自身免疫性疾病的治疗和诊断以及抗恶性肿瘤方面有重要意义。
免疫增强剂是一种全新的生物学反应调节剂,也称作免疫调节药,在机体免疫系统中起着非常重要的调控作用,能使过高的或过低的免疫功能调节到正常水平。临床与实验免疫学研究表明,肿瘤、感染、变态反应性疾病、自身免疫病、以及获得性免疫缺陷综合症(AIDS)等均伴有免疫损伤。免疫调节在上述相关治疗中起重要的作用,具有非常广阔的应用前景。特别是近年来肿瘤免疫学迅速发展,肿瘤生物学反应调节剂(Biological Rer Spense Modifier BRSM)疗法已进入了一个新阶段。
除此以外,目前报导的其他疾病,如发病率极高的病毒性肝炎、危害极大的AIDS等,使用或联合使用免疫调节剂也能使病情显著改善。
有文献报导病毒性肝炎(HBV)感染引起的肝损害与机体的免疫反应密切相关,其中包括病毒复制、感染肝细胞表面抗原性改变以及对HBV感染细胞和正常细胞的细胞毒免疫反应。HBV不能直接杀伤肝细胞,肝的损害主要通过宿主的免疫反应。宿主的免疫反应包括了特异性免疫反应(抗体和细胞免疫)和非特异性免疫反应(NK细胞),它们对是否造成慢性HBV感染占有重要的地位。
AIDS病人表现免疫功能缺乏,一般为IL-2水平下降,目前增强病人的免疫功能的药物和措施包括了干扰素和IL-2利用,IL-2由成熟的T细胞产生,重要的功能之一是提高NK细胞活性、促进T细胞分化增殖、促进B细胞增殖等,临床报导,体外应用IL-210U/ml,使病人的外周血MΦ分泌IFN-γ和淋巴细胞表达IL-2受体明显增多,可使病人免疫功能得到恢复。此外免疫诱导剂双乙硫氨甲双酯钠应用于临床,能使42%的病人好转,体重增加,体质恢复;而异丙肌苷能使机体IL-2升高,改善病人的AIDS病情。
与本发明申请所涉及化合物的应用有重要关系的免疫细胞是一些非特异性免疫反应细胞,包括NK细胞和Lak细胞,在生物治疗技术中占有重要地位。NK细胞即自然杀伤细胞(natural killer cell,NK),是重要的免疫淋巴细胞和机体天然免疫的主要承担者。NK细胞不依赖胸腺、不依赖抗体和补体、无需抗原预先刺激即能分泌细胞毒因子,在无抗体参与的情况下,能在体内外杀伤肿瘤一类细胞,是一种广谱的杀伤细胞,对阻止肿瘤生长起着十分重要的作用。并抗病毒,抗感染,参与免疫调节。研究表明NK细胞在肿瘤免疫中占有重要地位,是机体抗肿瘤的第一道防线。而LAK细胞是一种需要淋巴因子IL-2激活的杀伤细胞,LAK细胞与NK细胞具有互补性,能够杀伤对NK细胞所不能杀伤的的肿瘤一类细胞,比NK细胞具有更为广泛的广谱性,它同样是现代生物疗法最重要的免疫细胞。
鉴于NK细胞和LAK细胞在免疫生物治疗中的重要性,因此寻找强有力的NK和LAK细胞活性增强剂或诱导剂甚为重要。
有关硒的研究与本发明申请所涉及的化合物在结构与功能上都有直接的关系。硒是人体必需的微量元素之一,调查表明人体中血硒含量长期低于0.1ppm有可能引起肝坏死、心肌损伤、癌症和关节炎等众多疾病。硒作为哺乳动物(包括人类)生命必需的微量元素地位确立于1957年K.Schwarz和C.M.Foltz对动物营养作用的发现。近二十年来,硒的生物活性研究取得突飞猛进的发展,科学家们连续发现哺乳动物体内的四种硒酶,包括细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHG-Px)、血浆谷胱甘肽过氧化物酶(P GSH-Px)和I型碘甲状腺素5’脱碘酶(5’-DI),此外,还发现与某些疾病相关的硒酶—硫氧还蛋白酶等。
硒对生命科学的重要性,使得含硒药物和保健功能品成为众人瞩目的热点。通常无机硒不易被吸收,生物活性较低,毒性大;而有机硒易被肌体吸收,在血液中能能维持较长时间,在体内易被转化为有活性的代谢中间体,且生物毒性相对较小。
在本领域的现有技术中,通过人工的方法可以获得具有谷胱甘肽过氧化酶GSHPx样活性作用的化学模拟物。实验证明苯并异硒唑酮类化合物(Benzisoselenazolones,BISA)能够抑制体外微粒体脂质过氧化作用,具有保护机体免受过氧化作用的损伤功能。其中具有以下化学式的2-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2)-酮(依布硒啉,Ebselen,),是目前公认的最有前景的GSH-Px的模拟物,不仅抗氧化活性高,而且毒性极低(LD50>6810mg/kgmice),是迄今为止有机硒类抗氧化剂的最佳代表,日本第一制药公司已完成了Ebselen的三期临床研究。
最近有文章报道R-双苯并异硒唑取代化合物具有抗脑心肌炎病毒(EMCV)、疱疹性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)活性的研究(如Polish J Chem 75,823-830,2001),但除了上述病毒以外,其它DNA病毒和RNA病毒,特别是肝炎病毒(HBV)和艾滋病病毒(HIV)均未报导。
已有几篇专利披露Ebselen衍生物作为药用的研究,它们分别是中国专利98124487.4(申请号)苯并异硒唑酮磺酰胺衍生物在抑制炎症和过敏性疾病方面的作用;中国专利01118666.6(申请号)R-双或糖苯并异硒唑取代化合物的抗炎、抗肿瘤作用和PCT/CN02/00412(申请号)具有抗炎、抗肿瘤和抗血栓形成作用的苯并异硒唑衍生物及其应用;在免疫调节研究方面,尽管有众多的研究利用Ebselen母核,将其改造成免疫增强化合物,但成功的免疫增强药物,特别是有关本发明申请所涉及的化合物的免疫调节研究和生物治疗应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是在Ebselen(依布硒啉)抗氧化母核结构基础上定位改造出免疫调节作用强、适应性更广、毒性较低的新型有机硒生物调节剂和免疫增强剂药物,用于治疗各种免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病,如感染、病毒性肝炎、变态反应性疾病、自身免疫病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和肿瘤治疗等。
本发明涉及的苯并异硒唑衍生物的药物与保健功能品设计思路,是在充分考虑保留Ebselen活性核的基础上,增加新功能基团,定位设计的一系列化合物。由于结构的特点在生物体内具有多种生物活性,尤其具有“生物应答调节剂”(生物学反应调节剂)的特点,以生物应答器中的调节点为靶标,定向产生作用,是一类新型的具有全面调节机体、多作用靶点的活性化合物,特别对NK细胞和LAK细胞等免疫细胞的激活作用,增强机体的免疫功能,显示其抗炎、抗肿瘤和其他免疫损伤疾病作用,具有较好的治疗药物应用前景。
本发明的内容包括:
1、本发明化合物提供以下通式(I)、(II)或(III)的苯并异硒唑衍生物及其药物学上可接受的盐:
其中:R是C1-6亚烷基、亚苯基、亚联苯基、亚三苯基、或者
其中:M是Pt、Pd或Rh,
R′是糖残基或者
其中:R″为Cl、H2O、OH、Br、或者I,
R为-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH-CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3,
R″″为-H、-CH2C6H5OH、-CH2OH、-CH2CONH2、-CH2CH2COOH-CH2(CH2)4NH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-(CH2)3CH、-(CH2)3NHC(NH)NH2、-(CH2)3CHCH2、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或者-CH2CH2SCH3。
在本实施方案中,R优选为C1-4亚烷基、亚苯基、亚联苯基,更优选为亚丁基和亚联苯基。
R′优选为1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-去氧-D-吡喃葡萄糖基。
R和R″″优选分别独立地为-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2SH、或-CH2CH2SCH3。
2、本发明提供包含上述通式(I)、(II)或(III)的苯并异硒唑衍生物,或其药物学上可接受的盐的药物组合物以及药物学上可接受的赋形剂和载体,或其卫生学上可接受的盐的保健功能组合物以及卫生学上可接受的赋形剂和载体,
3、本发明提供上述通式(I)、(II)或(III)的苯并异硒唑衍生物,或其药物学上可接受的盐在制备用于对NK细胞和LAK细胞等免疫细胞调节(增强)药物中的应用,或其卫生学上可接受的盐在制备用于具有免疫调节功能的保健品中的应用,显示其在生物治疗和生物保健调节方面的应用前景。
4、本发明的衍生物或其药物学上可接受的盐可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药,可采用任何可接受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。
采用的给药形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药,例如,片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等,优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式;组合物可包含常规药用载体、赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物,此外,还可包含其它药剂和辅剂等;采用液体形式给药的药物组合物可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20%)和选择性的药用辅剂溶解、分散于载体中,载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等,从而形成溶液剂或混悬剂。
采用的给药方式,可选择通过口、鼻内、直肠、透皮、注射给药和脂质体类靶向给药方式等,优选的给药途径是注射给药,采用常规日剂量方案,该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的结合物或其药学上可接受的盐也可配制成注射用剂,例如使用约0.5至约50%的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中,实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等,从而形成溶液剂或混悬剂;
通常,根据所需给药方式,药学上可接受的组合物包含本发明涉及的结合物约1至99重量%、以及99至1重量%的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量%的本发明结合物,其余为适宜的药用赋形剂。
如果需要的话,本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等,例如:柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的,例如可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences,第18版,(MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,1990)。无论如何,按照本发明的技术,所使用的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物,以用于治疗相应的免疫缺陷病和自身免疫性疾病的诊断、治疗以及抗肿瘤方面疾病。
5、本发明的衍生物或其卫生学上可接受的盐可以纯化合物保健品形式或适宜的保健组合物进行口服用,可采用任何可接受的服用方式进行。
采用的口服用形式为固体、半固体、冻干粉或液体形式,例如片剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂等,优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式;组合物可包含常规使用的载体、食用赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物,此外,还可包含其它保健成分和需要的添加剂和辅剂等;采用液体形式服用的组合物可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20%)和选择性的辅剂溶解、分散于载体中,载体的实例为水、食用乙醇等,从而形成溶液剂或混悬剂。
通常,根据所需口服用形式,卫生学上可接受的组合物将包含本发明涉及的结合物约1至99重量%、以及99至1重量%的适宜的食用赋形剂和添加剂。优选组合物包含约5至75重量%的本发明结合物,其余为适宜的食用赋形剂和添加剂。
本发明组合物中使用的食品添加剂包括乳化剂、抗氧化剂、防腐剂等。
该类剂型的实际制备方法是本领域的技术人员公知的或者显而易见的。无论如何,按照本发明的技术,所使用的组合物将含有保健有效量的本发明结合物,以用于人体免疫调节的保健。
6、本发明提供人和哺乳动物中治疗相应的各种免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病,如感染、病毒性肝炎、变态反应性疾病、自身免疫病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和肿瘤治疗等的方法,包括向需要此等治疗的患者给予有效量的上述通式(I)或(II)的苯并异硒唑衍生物或其药物学上可接受的盐以及联合给予其他治疗药物或免疫调节药物。
7、在本发明的苯并异硒唑衍生物与其他治疗药物或免疫细胞增强药物联合使用时,可同时或者顺序地给药这两种药物,包括先给药本发明的苯并异硒唑衍生物,然后再给药其他的治疗药物或免疫细胞增强药物,以及先给药其他的治疗药物或免疫细胞增强药物,然后再给药本发明的苯并异硒唑衍生物。
8、本发明的苯并异硒唑衍生物在治疗相应的各种免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病,如感染、病毒性肝炎、变态反应性疾病、自身免疫病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和肿瘤治疗时,其给药剂量为约0.05-250mg/kg体重。在与其他的治疗药物或免疫细胞增强药物联合使用时,本发明的衍生物以及相应的其他药物的给药剂量都可显著降低,约为单独使用时的十分之一到二分之一。
在下面的实施例中进一步描述了本发明,药物以1,2-二{(1,2)-苯并异硒唑-3(2H)-酮}-乙烷(或丁烷)为例,这并不限制本发明的范围。
实施方式
实施例1:药物对BALB/C正常鼠的免疫调节作用研究
动物分组和给药方式:
将40只BALB/C鼠随机分为4组,每组10只,实验药物组20只动物,腹腔注射新鲜配置的药物,10只剂量为25.0mg/kg,另外10只剂量为12.5mg/kg,每天1次,连续给药7天;阳性对照组10只动物,腹腔注射阳性对照药物ddp,剂量为2.0mg/kg,每天给药一次,连续7天。对照组10只,腹腔注射溶剂,体积根据体重调整,与药物组相同。每天注射1次,连续7天。
以上各组小鼠经连续给药,在停药后第3天引颈处死,无菌取脾,称湿重,加入2ml培养液将脾剪碎,用150目细胞筛过滤,加入2ml培养液,制成单细胞悬液,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,其中主要为淋巴细胞。用1640培养液调整细胞浓度为2×106/ml作为NK细胞活性测定的效应细胞,0.2%台盼蓝染色,细胞存活率大于95%.
MTT法测脾细胞增殖活性:
用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,调整浓度为3×106/ml。取96孔细胞培养板,每孔加入细胞悬液100μl,10mg/ml的ConA溶液100μl,每个样品设6个复孔,另设3个空白对照孔,每孔加入培养液200μl,轻摇混匀,37℃培养箱培养72小时,培养结束前4小时每孔吸出培养上清,加入5mg/ml的MTT20ul,继续培养;培养结束时3000rpm离心30min,
(表一)NK活性、脾重和脾细胞增殖结果
药物组 | 药物组 | 阳性药物组(DDP) | 空白对照(control) | |
剂量(mg/kg) | 25 | 12.5 | 2 | |
脾细胞增殖(OD) | 0.544 | 0.465 | 0.260 | 0.121 |
脾重(g) | 0.410 | 0.290 | 0.120 | 0.220 |
NK活性 | 0.429 | 0.352 | 0.026 | 0.112 |
弃上清,每孔加入200μl的乙醇-DMSO溶液溶解,595nm测OD值。
脾重和脾细胞增殖结果如表一。从表一可以看出,实验药物组脾细胞增殖活性明显高于对照组,实验药物组小鼠脾重与对照组小鼠脾重相比有所提高,阳性药物组小鼠脾重最小。
实施例2:药物对普通一级小白鼠IC2的免疫调节作用
25克左右的IC2小鼠32只,随机分为4组,每组8只,第1组腹腔注射药物,剂量为25mg/kg,连续给药4天;第2组腹腔注射药物,剂量为12.5mg/kg,连续给药4天;第3组腹腔注射DDP,剂量为2mg/kg;第4组腹腔注射等体积溶剂,连续4天。第五天引颈处死,取脾,淋巴细胞分离液分离单个核细胞调整细胞浓度为2×106/ml,作为NK细胞的效应细胞。取单个核细胞悬液3.6ml,加入104U/ml的IL20.4ml,,转入塑料培养瓶,培养48小时后,吸去培养液及悬浮细胞,加入新的培养液,维持IL2的浓度为1000U/ml,继续培养,两天换一次液。第7天收获贴壁细胞,调整细胞浓度为106/ml,作为LAK细胞的效应细胞。调整YAC-1和P815细胞的浓度为105/ml备用
①NK/LAK细胞活性的测定
设实验孔、靶细胞对照孔、效应细胞对照孔和空白孔,实验孔加入效应细胞和靶细胞各50μl;细胞对照孔加入靶细胞50μl,培养液50μl;效应细胞对照孔加入效应细胞50μl,培养液50μl;空白对照孔加入培养液100μl,每个样品设6复孔,培养4小时,M每孔加入MTT 20μl再培养2小时,3000rpm离心30min,弃上清,每孔加入200μl的乙醇-DMSO溶液溶解,595nm测OD值。
NK/LAK细胞活性=(实验孔OD值-效应细胞对照孔OD值)/靶细胞对照孔OD值×100%
②脾细胞增殖活性的测定单个核细胞悬液和10μg/ml的ConA各100μl/孔加入96孔培养板,培养72小时后用MTT法测脾细胞增殖。
(表二)脾细胞增殖活性
组别 | 剂量(mg/kg) | NK活性(%) | LAK活性(%) | 脾细胞增殖(OD值) |
药物 | 25.0 | 40.95 | 89.02 | 0.528 |
药物 | 12.5 | 34.34 | 0.417 | |
DDP | 2.0 | 2.65 | - | 0.284 |
CONTROL | 10.27 | 67.06 | 0.439 |
③实验结果见表二。实验表明,本发明申请所涉及的苯并异硒唑衍生物可诱导脾细胞对NK细胞的分泌,显著提高NK细胞活性。
实施例3:药物对C57肿瘤鼠生物调节作用的研究
(1)C57肿瘤鼠分别腹腔注射EB(25mg/kg)、DDP和溶剂,连续给药7天,与第10天引颈处死,取睥称脾重,分离单个核细胞,MTT法测脾细胞增殖活性和NK/LAK细胞活性,MTT法测NK细胞活性,方法同上。脾重和脾细胞增殖结果如表三。
(表三)脾重和脾细胞增殖结果如下表
药物组 | 阳性药物组(DDP) | 空白对照 | |
剂量(mg/kg) | 25 | 2 | |
脾细胞增殖(OD) | 0.395 | 0.025 | 0.058 |
脾重(g) | 0.428 | 0.135 | 0.305 |
NK活性(%) | 20.06 | 10.21 | 10.32 |
从表中可以看出实验药物组脾细胞增殖活性与对照组和阳性对照组相比有明显的差异,前者的脾细胞增殖活性明显高于后者;ddp组小鼠的脾重最低,实验药物组小鼠脾重最高,对照组次之;实验药物组小鼠NK细胞活性比其他两组高
(2)药物对C57小鼠肿瘤的影响
接种肿瘤后的3天,对照组颈背部长起肉眼可见的肿块,且生长迅速;阳性对照组和实验药物组小鼠于接种肿瘤后第4、5天始见颈背部肿块,且生长缓慢。接种肿瘤后地10天处死小鼠,剥离肿瘤,称重,结果列于表四。
(表四)药物对Lewis肺癌C57小鼠肿瘤的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药时间(天) | 动物只数前/后 | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) | P值 |
对照组 | - | 7 | 1010 | 2.36±1.23 | ||
DDP组 | 2.0 | 7 | 1010 | 0.47±0.231 | 80.3 | <0.01 |
实验组 | 25.0 | 7 | 109 | 0.61±0.33 | 74.3 | <0.01 |
实验组 | 12.5 | 7 | 66 | 1.20±0.38 | 49.4 | 0.017 |
从表中可以看出,实验药物组和阳性对照组肿瘤瘤重与对照组相比均有显著差异,其中25mg/kg剂量组的抑制率与阳性对照药物DDP2.0mg/kg剂量组差异不显著,12.5mg/kg剂量组与对照组相比有显著差异,但抑制率小于25mg/kg剂量组。
(3)肿瘤组织细胞形态观察
肿瘤组织经石蜡包埋切片后,HE染色,40×光镜下观察,对照组细胞核大,分裂相多,异质性强,与对照组相比DDP组和EB组核浓缩深染,核形态多样有圆形、多边形、条形、圆环形、半月形等,分裂相较少,如图2所示。每组选4张片子,每张片子随机记数3个视野,120-150个细胞,记数分裂细胞,分裂指数=分裂相细胞数/总细胞数,计算分裂指数如下:
从表五中可以看出,DDP组和药物组肿瘤细胞分裂指数明显低于对照组,有显著性差异。DDP组和药物组之间分裂指数无显著差异。
(表五)给药7天后光镜下观察肿瘤组织HE染色的细胞分裂指数
组别 | 剂量(mg/kg) | 给药天数(day) | 分裂指数(X±SD) | p值 |
对照 | - | 7 | 0.71±0.065 | |
DDP组 | 2.0 | 7 | 0.19±0.004 | <0.01 |
药物组 | 25.0 | 7 | 0.34±0.057 | <0.01 |
实施例4:药物对巨噬细胞吞噬功能的影响
体重18-22g的健康小白鼠,随机分成给药组、阴性和阳性对照组。实验前4天给1,2-二{(1,2)-苯并异硒唑-3(2H)-酮}-丁烷(药物1)(25mg/kg),1,2-二{(1,2)-苯并异硒唑-3(2H)-酮}-乙烷(药物2)(25mg/kg)给药4天后,每鼠腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。间隔10小时,颈椎脱臼处死小鼠,正中剪开腹壁皮肤,经腹膜注入生理盐水2ml,轻轻按揉鼠腹部1分钟,然后吸出腹腔洗液1ml,分滴于两片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,移置37℃孵箱温育30分钟。以生理盐水漂洗,以除去未粘片的细胞。晾干,1∶1丙酮一甲醇溶液固定5分钟。4%(V/V)Giemsa一磷酸缓冲液染色3分钟,用流水冲洗,晾于。油镜下计数巨噬细胞,每片200个计算:
①吞噬百分率=吞噬的鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞(吞及未吞的)×100%
②吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞/200个巨噬细胞×2
在计数时,同时观察鸡红细胞被消化的程度,借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能,通常分为4级:
I级:未消化。被吞噬的鸡红细胞完整,胞质浅红或浅黄带绿色,胞核浅紫红色。
II级:轻度消化。胞质浅黄绿色,胞核固缩呈紫蓝色。
III级:重度消化。胞质淡染,胞核呈浅灰黄色。
IV级:完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡,边缘整齐,胞核隐约可见。
(表六).给药4天后巨噬细胞吞噬功能活性评价
药物1 | 药物2 | 阳性药物组(DDP) | 空白对照(control) | |
剂量(mg/kg) | 25 | 25 | 2 | 生理盐水 |
吞噬百分率 | 73% | 68% | 18% | 22% |
I级 | 11% | 9% | 14% | 14% |
II级 | 38% | 32% | 82% | 78% |
III级 | 36% | 37% | 4% | 8% |
IV级 | 15% | 22% | - | - |
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