CN1523994A - 一种用于预防和/或治疗痴呆的以灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其衍生物作为有效成分的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于预防和/或治疗痴呆的以灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其衍生物作为有效成分的组合物。本发明的组合物，能抑制动物脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性，从而防止脑组织内乙酰胆碱的减少。本发明的组合物同时对因脑缺血而引起的脑组织的损伤也有保护作用。因此本发明的组合物能用于阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的预防和/或治疗。

Description

一种用于预防和/或治疗痴呆的以灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其 衍生物作为有效成分的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于预防和/或治疗痴呆的药物组合物，该组合物包含作为有效成分的灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其衍生物。
背景技术
痴呆是区别于正常老化的一种病态现象。根据其发病原因分为阿耳茨海默型痴呆、血管型痴呆，及由酒精中毒、外伤、帕金森氏病的后遗症引起的痴呆等类型。
虽然阿耳茨海默型痴呆的发病机制还不明确，但已知多数患者伴有中枢神经系统中乙酰胆碱的减少。所以用乙酰胆碱前体物或者用阻碍乙酰胆碱分解的药物来提高脑中乙酰胆碱浓度的方法一直用于治疗阿耳茨海默型痴呆。抑制乙酰胆碱酯酶的药物或者与已知胆碱酯酶抑制剂并用的药物现用于治疗阿耳茨海默型痴呆。其代表药物有tacrine、donepezil、rivastigmine、galantamine等。
血管型痴呆是由于脑血管的动脉硬化，使脑内供血不足导致脑细胞损伤而引起的。所以认为作用于脑血管的高血压治疗剂，阿士匹林，保护受损脑细胞的药物适合于治疗血管型痴呆。
目前使用的治疗痴呆的药物只有抑制乙酰胆碱酯酶活性的作用。所以很有必要开发与此同时对血管型痴呆也有疗效的药物。
灵芝(Ganoderma lucidum)为蘑菇的一种，是东洋的传统药材，具有抗炎，抗癌，免疫调节功能，抑制艾滋病毒，降低血压等作用。对灵芝效能的研究论文有：①灵芝的水和乙酸乙酯提取物，经口服给药，均有效于被卡拉胶(carrageenan)，和巴豆油(croton oil)诱发的白鼠浮肿(参见Stavihovha W and Slama J，The anti-inflammatory Ganoderma LucidumThird Intemational Symposiumon Ganoderma lucidum：9-21)。②灵芝的水提取物有效抑制癌细胞的成长(参见Wang SY et al，The anti-tumor effectof Ganoderma lucidum is mediated by cytokines related from activatedmacrophages and Tlymphocytes，Int.J Cancer 70：699-705)。③从灵芝中分离得到的免疫调节蛋白质LZ-8，在试管(in vitro)实验中促进细胞分裂(mitogenic activity)的作用，在生物体内(in vivo)实验中则显示免疫调节活性(参见Kino K et al.，Immunomodulator，LZ-8，prevent antibody productionin mice，Int J Immunophamacol 13(8)：1109-1115)。
本发明者们在寻找对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有效，而且安全无毒性的天然资源的过程中，从在韩国的传统药物灵芝中，提取分离出对乙酰胆碱酯酶活性和脑缺血均有抑制作用的化合物，并确定这个化合物及其衍生物可以用于预防和/或治疗痴呆。
本发明提供了对预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有效的组合物。
发明内容
本发明提供了一种用于预防和/或治疗痴呆的药物组合物，该组合物包含作为有效成分的灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其衍生物。
本发明提供的组合物对预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有效。
本发明提供的组合物，可抑制乙酰胆碱酯酶活性，恢复脑内乙酰胆碱总量，从而具有预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆的作用。该组合物同时能保护因脑缺血而受损的脑组织，从而也具有预防和/或治疗血管型痴呆的作用。
对本发明提供的组合物详细说明如下。
在本发明的组合物中作为有效成分的灵芝提取物的提取方法如下。
将灵芝用己烷提取，残渣再用氯仿提取，其残渣再用甲醇提取。把甲醇提取液减压浓缩，得到甲醇提取物(以下称为GL-M)。提取时，所用的己烷、氯仿、甲醇的量以浸没药材为佳。一般提取每1kg灵芝，所需的溶剂量为2L。
将按上述提取方法得到的灵芝甲醇提取物GL-M，进行一系列硅胶吸附柱层析和高效薄层层析(HPTLC)进一步分离、精制。即：
a)灵芝的甲醇提取物GL-M，进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(500∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到14个组份GL-M-1～GL-M-14；
b)把从上述a)中得到的组份GL-M-8，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(100∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到7个组份GL-M-8-A～GL-M-8-G)；
c)把从上述b)中得到的组份GL-M-8-F，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到5个组份GL-M-8-F-a～GL-M-8-F-e)；
d)把从上述c)中得到的组份GL-M-8-F-b，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到4个组份GL-M-8-F-b-I～GL-M-8-F-b-IV)；
e)把从上述d)中得到的组份GL-M-8-F-b-III，再进行硅胶柱层析，湿法装柱，用氯仿/甲醇(30∶1)洗脱，以高效硅胶薄层层析检查，合并相同的组份，得到GL-M-8-F-b-III-1。
将按上述方法得到的灵芝提取物GL-M-8、GL-M-8-F、GL-M-8-F-b、GL-M-8-F-b-III、GL-M-8-F-b-III-1、抑制乙酰胆碱酯酶活性(后述于实施例)，所以这些灵芝提取物在本发明的组合物中可作为有效成分。
为了确定在本发明的组合物中作为有效成分的灵芝甲醇提取物中所含有的活性成分，对最终得到的GL-M-8-F-b-III-1，进行了质谱分析，确定此化合物为十八碳烯酰胺。从而可知，本发明的灵芝提取物中含有作为有效成分的十八碳烯酰胺。十八碳烯酰胺是已知化合物，是一种存在于脑组织中诱导睡眠的物质。
上述十八碳烯酰胺，能用多种化学合成方法合成。十八碳烯酰胺及其衍生物的制备方法如下：
把脂肪酸化合物(4)和亚硫酰氯(SOCl2)在70～80℃反应，反应结束后冷却至室温，小心加入凉的氨水。把反应生成物减压过滤后进行重结晶，得到十八碳烯酰胺及其衍生物(1)。反应式如下面的反应式1。
                       反应式1
上面的反应式1中R1是十八碳烯酰(9-octadecenoyl)、十六碳烯酰(9-hexadecenoyl)或十四碳烯酰(tetradecanoyl)。
把脂肪酸化合物(5)溶于二氯甲烷后，加入二环乙基碳二亚胺(dicyclohe xylcarbodiimide)，二甲氨哗啶(dimethylaminopyridine)和正戊胺(3-aminopentane)。反应一定时间后，滤除生成的固体物，滤液进行浓缩。浓缩物用柱层析分离，得到十八碳烯酰胺衍生物(2)。反应式如下面的反应式2。
Figure A0281055000072
                            反应式2
反应式2中R2是十八碳烯酰(9-octadecenoyl)、十八碳二烯酰(9，12-octadecadienoyl)或十四碳烯酰(tetradecanoyl)。
亚油酸(linoleic acid，6)溶于二氯甲烷后，加入二环乙基碳二亚胺(dicyclo hexylcarbodiimide)，二甲氨哔啶(dimethylaminopyridine)和戊醇(3-pentanol)。反应一定时间后，滤除生成的固体物，滤液进行浓缩。浓缩物用柱层析分离，得到十八碳烯酰胺衍生物(3)。反应式如下面的反应式3。
Figure A0281055000081
反应式3
反应式3中R3是十八碳二烯酰(9，12-octadecadienoyl)。
用上述合成方法得到的十八碳烯酰胺及其衍生物与灵芝提取物一样，对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有预防和/或治疗效果。
本发明的组合物除了包括灵芝提取物、十八碳烯酰胺及其衍生物外，还可以包含一种以上治疗痴呆和其它疾病的有效成分。
本发明的化合物为了投药，除了上述的有效成分外，还可以添加一种以上用于药物制剂或者食品中的赋型剂。
药物制剂或者食品中能使用的赋型剂为生理盐水、灭菌水、静脉注射液、生理盐水缓冲液、甘油醇、乙醇等。这些成分可以混合一种以上使用，如果有必要也可以附加抗氧化剂、缓冲液、净菌剂等常规辅料。且也可以填加稀释剂、分散剂、界面活性剂、粘合剂和润滑剂，制备成水溶液、悬浮液、乳浊液等注射剂和丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂等多种剂型。进一步应用这一领域的常规方法或根据Remington’s PharmaceuticalScience(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA等书籍介绍的方法，并参考疾病的种类或者制剂的成分，制备成适当的制剂。
本发明的药物制剂组合物，可非口服给药或者口服给药，给药量是根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率、疾病重症等因素来适当调节。然而每日给药量为0.8～3.2mg/kg，分一次或者数次给药为好。
本发明的药物制剂组合物，为了预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆，可以单独使用，也可与手术、放射线治疗、激素治疗、化疗、生物反应调节剂等方法并用。
本发明的食品组合物的剂型是按常规方法制备。本发明的组合物中添加赋型剂，干燥后制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉末、饮料、粥等多种剂型。本发明的组合物除了上述剂型外，还可以包括所有可能制备的剂型。
附图说明
图1：本发明的灵芝提取物(GL-H：灵芝的己烷提取物，GL-C：灵芝的氯仿提取物，GL-M：灵芝的甲醇提取物，GL-E：灵芝的乙醇提取物)对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图2：本发明的甲醇提取物中分离、精制得到的各组分的产率以及各组分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图3：合成的十八碳烯酰胺在不同浓度下对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
图4：本发明的甲醇提取物中最终分离得到的组分GL-M-8-F-b-III-1对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性的选择性抑制作用。
图5：本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺在生物体内实验中(in vivo assay)对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用(腹腔注射给药)。
图6、图7、图8：本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1对白鼠被动逃避实验的结果。
图9：本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1对脑缺血的作用。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本
发明的范围。
实施例1灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用1(试管实验)
1.灵芝提取物的制备
1)初步处理
将干燥的灵芝3kg粉碎成小片，置于烧瓶中，加入己烷(约6L)使灵芝刚被浸没，在40～50℃加热提取2次，每次2个小时。每次提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得到灵芝的己烷提取物GL-H(17.6g)。
己烷提取后的灵芝残渣，加入氯仿(约6L)使灵芝刚被浸没，在40～50℃加热提取2次，每次2个小时。每次提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得到灵芝的氯仿提取物GL-C(55g)。
氯仿提取后的灵芝残渣，加入甲醇(约6L)使灵芝刚被浸没，在常温下加热提取2次，每次48个小时。每次提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得到灵芝的甲醇提取物GL-M(65g)。
甲醇提取后的灵芝残渣，加入乙醇(约6L)使灵芝刚被浸没，在常温下加热提取2次，每次48个小时。每次提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得到灵芝的乙醇提取物GL-E(59g)。
2)灵芝提取物GL-M的分离、精制
从上述1)中得到的灵芝提取物GL-M(60g)，用硅胶柱层析
Figure A0281055000101
进行分离。湿法装柱，用氯仿/甲醇(500∶1)洗脱，每流份为100ml，以高效硅胶薄层层析(HPTLC)检查。展开溶剂为氯仿/甲醇(30∶1)，展开后用碘蒸气显色，合并相同的流份，减压回收溶剂，得到14个组份，即GL-M-1～GL-M-14。
从上述14个组份中选择GL-M-8(300mg)，用硅胶柱层析 进行分离。湿法装柱，用氯仿/甲醇(100∶1)洗脱，每流份为50ml，以高效硅胶薄层层析检查。展开溶剂为氯仿/甲醇(30∶1)，展开后用碘蒸气显色，合并相同的流份，减压回收溶剂，得到7个组份，即GL-M-8-A～GL-M-8-G。
从上述7个组份中选择GL-M-8-F(86mg)，用硅胶柱层析
Figure A0281055000112
进行分离。湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，每流份为30ml，以高效硅胶薄层层析检查，展开溶剂为氯仿/甲醇(30∶1)，展开后用碘蒸气显色，合并相同的流份，减压回收溶剂，得到5个组份，即GL-M-8-F-a～GL-M-8-F-e。
从上述5个组份中选择GL-M-8-F-b(60mg)，用硅胶柱层析
Figure A0281055000113
进行分离。湿法装柱，用氯仿/甲醇(50∶1)洗脱，每流份为10ml，以高效硅胶薄层层析检查。展开溶剂为氯仿/甲醇(30∶1)，展开后用碘蒸气显色，合并相同的流份，减压回收溶剂，得到4个组份，即GL-M-8-F-b-I～GL-M-8-F-b-IV。
从上述4个组份中选择GL-M-8-F-b-III(40mg)，用硅胶柱层析
Figure A0281055000114
Figure A0281055000115
进行分离。湿法装柱，用氯仿/甲醇(30∶1)洗脱，每流份为5ml，以高效硅胶薄层层析检查。展开溶剂为氯仿/甲醇(30∶1)，展开后用碘蒸气显色，合并相同的流份，减压回收溶剂，得到3个组份，即GL-M-8-F-b-III-1～GL-M-8-F-b-III-3。
2.对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
1)乙跣胆碱酯酶的分离
乙跣胆碱酯酶是由20～25g的ICR小鼠大脑中分离得到的。用闸刀砍断小鼠头部，取出大脑后称重，加入相当于2倍小鼠大脑重量的12.5mM磷酸钠缓冲液(sodium phosphate buffer)。研磨成混悬液，在4℃离心分离
Figure A0281055000116
10分钟。取上层液，加入其3倍体积的含有0.5％粹通X-100(tritonX-100)的均匀化缓冲液(homogenation buffer)，在4℃搅拌30分钟后离心分离10分钟
Figure A0281055000118
取上层液1ml置1.5ml小管中，在速冻冰箱(deepfreezer)中保管。
具体操作时要注意小鼠大脑不被损伤，而且分离的全过程要迅速进行。
2)测定对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
取上述1中得到的各种灵芝提取物各50μgl，各加入0.1M磷酸钠缓冲液(PH8.0)925μgl、吐温-20(Tween-20)25μgl和Ellman试剂33μgl。在25℃下放置10分钟后，加入作为反应基质的25mM Acetylthiocholine iodide溶液20μgl和按上述1的方法准备好的乙酰胆碱酯酶33μgl。在412nm测定乙酰胆碱酯酶的初期反应速度，测定时间为5分钟。把没有实验样品时的初期反应速度作为基准值，测定有实验样品时的初期反应速度。测定结果用抑制百分率来表示。
【数学式1】
用这种方法测定从实施例1)中得到的各灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。其结果如图1和图2所示。
由图1可见，在各种灵芝提取物中，甲醇提取物GL-M对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用最佳。
由图2可见，从灵芝的甲醇提取物GL-M分离、精制得到的各组份的产率以及各组份对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。
按本发明的方法最终分离得到的GL-M-8-F-b-III-1的分子结构与十八碳烯酰胺相同，其对乙跣胆碱酯酶活性抑制作用的测定结果如图3所示。
由图3可见，随着十八碳烯酰胺的浓度增加，对乙跣胆碱酯酶活性抑制作用也增加。
3)测定对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性的选择性
现使用的治疗阿耳茨海默型痴呆的药物tacrine几乎没有对乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性的选择性，所以tacrine均抑制乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性。然而丁酰胆碱酯酶不参与中枢神经系统的胆碱传递(cholinergic transmission)，所以tacrine的治疗效果小且副作用大。据此，对本发明中灵芝提取物的最终分离物质GL-M-8-F-b-III-1的乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶活性的选择性作了测定。丁酰胆碱酯酶从人的血浆中分离，对丁酰胆碱酯酶的活性抑制测定方法除了把butyrrylcholine iodide作为基质外，其它过程与乙酰胆碱酯酶的活性抑制测定方法一致。测定结果如图4所示。
由图4可见，灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1对丁酰胆碱酯酶的活性几乎没有抑制作用(10％以内)。与此相反，GL-M-8-F-b-III-1对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用则随着浓度的增加最高可达70％。由此可知，本发明的灵芝提取物只选择性地抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
实施例2灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用2(生物体内实验)
将溶于10％乙醇的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺1mg/kg，10mg/kg，对5周龄的ICR白鼠腹腔注射给药。给药1小时后，从脑组织中分离出乙酰胆碱酯酶。对从脑组织中分离出的乙酰胆碱酯酶活性抑制作用的测定方法与试管实验中的测定方法相同。结果如图5所示。
由图5可见，与对照组相比，在1mg/kg，10mg/kg给药组，乙酰胆碱酯酶活性分别被抑制39％和52％。而且确定了灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1和合成的十八碳烯酰胺对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果相同。
实施例3灵芝提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用3(被动逃避实验)
为了观察本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1在生物体内是否能提高记忆力和学习能力，用3种方法(被动逃避实验I、II、III)进行了step-through被动逃避实验。
体重20-30g(约6周龄)ICR雄性大鼠在室内温度为22℃，相对湿度为50-60％，每12小时自动调节明暗的动物室里适应一周以上后，用于实验。step-through被动逃避实验装置(O′HARA Co.Ltd.，Model PAM5，France)用隔板分为两个空间，其隔板中有一个小孔，使大鼠随意通过。箱子的一面(12×10×10cm)用透明有机玻璃板制成，使箱内明亮，另一面(16×10×10cm)则用黑色有机玻璃板制成，使箱内黑暗。暗箱的底部每隔7mm设置一个格子，当大鼠进入暗箱时将触动箱底的格子，受到100伏的电击。
1)被动回避实验
第一天，把大鼠放入箱子的亮的一侧。大鼠可通过中间隔板的小孔在暗箱和亮箱之间自由来回，适应环境。这时测定从亮箱进入暗箱的时间(反应潜伏期)，只选择反应潜伏期小于30秒的大鼠进行实验。
第二天，在第一天被选择的大鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者10％乙醇)、东莨菪碱组(1mg/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kgl，2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，把大鼠放入箱子的亮的一侧，测定反应潜伏期。当大鼠进入暗箱3秒后，给电刺激(100瓦，3秒钟)。训练15分钟后，再放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，观测至多300秒。
第三天(电刺激24小时后)跟第二天一样，各组大鼠给药30分钟后，测定反应潜伏期。第二天得到的各组大鼠的平均反应潜伏期(15分，trainingtrial)和第三天得到的各组大鼠的平均反应潜伏期(24小时，training trial)是与溶剂组和东莨菪碱组的平均反应潜伏期相对比较而得出的。(比较分析方法：ANOVA；Analysis of Variance)
本实验利用被东莨菪碱诱导记忆丧失的大鼠，通过被动逃避实验，观测灵芝提取物对记忆再生能力的效果。观测结果如图6所示。
由图6可见，无电刺激时，反应潜伏期在各给药组之间没有差异(A)。电刺激训练15分钟后，在生理盐水组(274±17分)和10％乙醇(灵芝提取物的溶剂)组(290±分)的反应潜伏期均显著增加。由此确定，生理盐水组和10％乙醇组大鼠具有正常记忆能力。与正常对照组相比较，东莨菪碱组的反应潜伏期(103分)显著减少(62％)。这一结果表明，在本实验条件下，成功地建立了东莨菪碱诱导的记忆丧失动物模型。给予大鼠灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1，可增加被东莨菪碱抑制的反应潜伏期。10％乙醇(灵芝提取物的溶剂)组，虽然第二天电刺激训练15分钟后的反应潜伏期是没有差异，但是对电刺激24小时后，反应潜伏期减少了33％，但与生理盐水对照组相比较没有统计学上有意义的差异。灵芝提取物0.5mg/kg给药组，电刺激24小时后的反应潜伏期与10％乙醇对照组相同。
综上所述，本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1具有恢复被东莨菪碱抑制的反应潜伏期的效果。这种效果与阳性对照组tacrine(2mg/ml)的效果相似。
2)被动逃避实验II
第一天，应用与被动逃避实验I相同的方法使大鼠适应环境。第二天，将被选择的大鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者0.2％甲基纤维素)、东莨菪碱组(1m/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kg，2mg/kg，10mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和donepezil(0.5mg/kg)同时给药组、灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kgl，2mg/kg，10mg/kg)单独给药组、tacrine(2mg/kg)单独给药组、donepezil(0.5mg/kg)单独给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，把大鼠放入箱子的亮的一侧，测定反应潜伏期。当大鼠进入暗箱3秒后，给电刺激(100瓦，3秒钟)。训练15分钟后，再放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，观测至多300秒。给大鼠电刺激24小时(第三天)后和48小时(第四天)后，在没有给药或电刺激的条件下测定反应潜伏期。测定结果如图7所示。
由图7可见，给予0.2％甲基纤维素(灵芝提取物的溶剂)的溶剂组，在电刺激15分钟，24小时，48小时后，反应潜伏期与生理盐水对照组几乎没有差异。东莨菪碱和试验药物同时给药，在电刺激15分钟后，灵芝提取物部分地恢复了由于东莨菪碱导致的反应潜伏期的减少(记忆力减退)。灵芝提取物浓度为10mg/kg时恢复效果最好。灵芝提取物对反应潜伏期的恢复效果与tacrine和donepezil的效果相似。电刺激24小时后，donepezil组恢复反应潜伏期的效果与对照组相似。灵芝提取物在三个浓度下均有30～50％的恢复效果。电刺激24小时后，灵芝提取物2mg/kg组显示最大的恢复效果，其效果与tacrine组相似，但低于donepezil组。
在本实验中，为了观察灵芝提取物是否影响正常的记忆力，对大鼠只给予灵芝提取物，用与上述方法相同的方法进行被动逃避实验。
图7的左边图谱表示，灵芝提取物和阳性对照药物tacrine和donepezil不但均不影响正常的记忆力，而且在电刺激24小时后，反而有提高正常记忆力的倾向。
3)被动逃避实验III
本实验的目的为观察灵芝的连续给药效果。在实验第一天，应用与实验I，II相同的方法，使大鼠适应环境。第二天，将被选择的大鼠分为溶剂组(给予生理盐水或者0.2％甲基纤维素)、东莨菪碱组(1mg/kg)、东莨菪碱(1mg/kg)和灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kgl，2mg/kg，10mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和tacrine(2mg/kg)同时给药组、东莨菪碱(1mg/kg)和donepezil(0.5mg/kg)同时给药组。通过腹腔注射给药，给药30分钟后，用与实验I，II相同的方法进行电刺激训练。电刺激15分钟后，放入实验箱子里面，测定其反应潜伏期，然后进行下一次电刺激训练。实验第三天开始，在没有电刺激的条件下，连续5天给予灵芝提取物(0.5mg/kgl，2mg/kg，10mg/kg)，tacrine(2mg/kg)，donepezil(0.5mg/kg)。结果如图8所示。
由图8可见，连续给予本发明的灵芝提取物后，被东莨菪碱显著下降的记忆力恢复到了对照组的水平。
实施例4灵芝提取物对因脑缺血而引起的脑损伤组织的保护效果
为了观察灵芝提取物对因脑缺血而引起的脑组织损伤的保护作用，闭合大鼠中冠状动脉(middle coronary artery occlusion；MCAO)建立了脑缺血动物模型(Longa et al.，1986)。选用体重为250-300g的雄性白鼠(Sprague-Dawley)，在诱发脑缺血前后允许自由摄取水和食物，经过一周的适应时间后，用于实验。
白鼠在含有N2O和O2麻醉槽内通入3.0-3.5％恩氟烷麻醉(恩氟烷，中外制药)后固定于手术台上。然后再用1.5-2.0％恩氟烷麻醉，以保证在手术过程中麻醉效果的持续。手术中用加热垫来保持白鼠的体温在37±ó0.5℃。将颈前部去毛消毒后沿颈正中切开约1cm，分离出右侧颈总动脉(common carotid artery)。然后从颈总动脉小心分离出外颈动脉(externalcarotid artery)和内颈动脉(intemal carotid artery)。用丝线结扎颈总动脉和外颈动脉后用注射用针在内颈动脉的起始部上扎一小孔，通过此小孔塞入17mm长的探针，闭塞中大脑动脉。用丝线结扎内颈动脉，固定探针，诱导脑出血。探针的制备方法如下。电灼4～0手术用尼龙丝线的一端，使其成为直径为0.3mm的塞子模样，丝线长度为17mm，外面涂上填加硬化剂的硅酮，即成为探针。缝合手术部位，置于新的笼子里，直至从麻醉中苏醒为止。诱发脑缺血30分钟后，确认神经缺损。即抓住白鼠尾巴，使白鼠完全吊在空中，观察是否出现左侧不全痳痹(left hemiparesis)，是否在往上提起尾巴时或者自发地出现左侧回旋病(circling)(Bederson etal.，1986)。在本实验，白鼠经腹腔注射灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1(0.5mg/kgl，2mg/kg，10mg/kg)30分钟后，闭塞中大脑动脉9个小时，诱发脑出血，砍下头部，迅速分离出大脑。利用brainmatrix(Neurotec.韩国)离frontal pole 1mm的位置开始以2mm厚度切成片后将新鲜脑冠侧切片(fresh brain coronal slice)中取第三个切片(5～7)mm，加入用0.9％生理盐水制成的2％氯化三苯基四唑(2，3，5-triphenyltetrazilium chloride)溶液，37℃染色30分钟，测定脑损伤程度。测定结果如图9所示。
图9表示，本发明的灵芝提取物GL-M-8-F-b-III-1，显著减少因缺血9个小时而引起的大脑皮质和corpus striatum的损伤范围(白色部分)。
实施例5十八碳烯酰胺对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用
十八碳烯酰胺及其衍生物十六碳烯酰胺，十四碳烯酰胺，正戊基十八碳烯酰胺，正戊基十八碳二烯酰胺，正戊基十四碳烯酰胺对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用为用实施例1和二相同的方法测定。对照组为donepezil和tacrine。测定结果如表1所示。
表1
由表1可见，十八碳烯酰胺及其衍生物随着浓度的增加，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用也增加。
工业使用性
本发明的组合物，能抑制动物脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性，防止脑内乙酰胆碱的减少，同时保护因脑缺血引起的脑组织的损伤。因此本发明的组合物对阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆均有预防和/或治疗作用。

Claims (11)

1.一种用于预防和/或治疗痴呆的以灵芝提取物为有效成分的组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，它是能同时预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的药物组合物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，它是能同时预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的食品组合物。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的组合物，其特征在于，所述的灵芝提取物是包括GL-M、GL-M-8、GL-M-8-F、GL-M-8-F-b、GL-M-8-F-b-III、GL-M-8-F-b-III-1的预防和/或治疗痴呆的组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的灵芝提取物是以GL-M-8-F-b-III-1为有效成分的预防和/或治疗痴呆的组合物。
6.含有下列式I所代表的化合物为有效成分的预防和/或治疗痴呆的组合物：
Figure A028105500002C1
                            式I
在式I中，R1是十八碳烯酰、十六碳烯酰或十四碳烯酰。
7.含有下列式II所代表的化合物为有效成分的预防和/或治疗痴呆的组合物：
Figure A028105500002C2
                              式II
在式II中，R2是十八碳烯酰、十八碳二烯酰或十四碳烯酰。
8.含有下列式III所代表的化合物为有效成分的预防和/或治疗痴呆的组合物：
Figure A028105500003C1
                      式III
9.根据权利要求6-8项中任意一项所述的组合物，其特征在于，它是能同时预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的药物组合物。
10.根据权利要求6-8项中任意一项所述的组合物，其特征在于，它是能同时预防和/或治疗阿耳茨海默型痴呆和血管型痴呆的食品组合物。
11.一种灵芝提取物的提取方法，即先用己烷提取，残渣用氯仿提取，其残渣再用甲醇提取，甲醇提取物用硅胶柱层析和高效薄层层析进一步分离、精制。
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