CN1552710A

CN1552710A - 烟曲霉文丙在抗炎免疫抑制药中的应用

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Publication number: CN1552710A
Application number: CNA200310112694XA
Authority: CN
Inventors: ��̷�; 谭仁祥; 徐强; 赵颖; 刘俊彦; 王俊
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2004-12-08
Anticipated expiration: 2023-12-19
Also published as: CN1266149C

Abstract

烟曲霉文丙(Fumigaclvine C)是从狗牙根(Cynodon dactylon)内生真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus，菌株编号：CY018)固体发酵产物中分离得到的。烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)对Con A所致小鼠肝损伤有显著的改善作用。其作用机理主要可能是抑制淋巴细胞的活化其中包括抑制淋巴细胞释放肿瘤坏死因子以及抑制淋巴细胞与细胞外基质的黏附。Fumigaclavine C作为具有免疫抑制作用的化合物可用于各种肝炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥等各种免疫性疾病的治疗以及在制备治疗各种肝炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥药物中的应用。

Description

烟曲霉文丙在抗炎免疫抑制药中的应用

一、技术领域

本发明属于生物制药技术领域。

二、背景技术

烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)的化学结构自1977年首次报道以来，对该化合物的相关研究相当的少而且都集中于其的提取分离及其结构鉴定。在其药理方面，尤其是其抗炎免疫抑制作用，至今没有任何报道。

三、发明内容

本发明的目的是研究烟曲霉文丙在抗炎免疫抑制药中的应用。

本发明的技术方案：

1.烟曲霉文丙的提取分离及其鉴定

烟曲霉文丙(Fumigaclvine C)是从狗牙根(Cynodon dactylon)内生真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus，菌株编号：CY018)分离得到。

1)菌株来源：本研究所用的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是从2001年11月采自江苏盐城丹顶鹤自然保护区的植物狗牙根(Cynodon dactylon)叶中分离得到的一株内生真菌，菌株编号CY018，现保存于南京大学功能生物分子研究所。

2)制法：将菌株接种到含400毫升的1000毫升三角瓶中，在28±1℃、150转/分钟的转速下摇瓶发酵4天得到种子液，将15毫升种子液接种到含有固体培养基(15克小米，0.5克酵母膏，0.1克酒石酸钠，0.1克谷氨酸钠，0.01克绿矾和0.1毫升玉米油)的250毫升的三角瓶中，在28±1℃发酵35天。将得到的发酵产物用甲醇在室温下浸渍过夜，过滤，滤液减压浓缩得到浸膏1，如此用甲醇处理三次，合并浸膏。将浸膏悬浮于水，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并减压浓缩得到浸膏2，对浸膏2进行硅胶柱层析，先用10倍柱体积的氯仿洗脱，然后用氯仿/甲醇混合溶剂(体积比氯仿/甲醇(50/1))洗脱，合并含有烟曲霉文丙的部位成浸膏3(利用薄层层析(孔C)指导合并。烟曲霉文的TLC特征：用氯仿/甲醇(V/V∶10/1)展开，Rf＝0.45，硫酸显色后电吹风加热显红色斑点，放置后斑点逐渐变成蓝色)。将浸膏3进行硅胶柱层析，用石油醚/丙酮混合溶剂(V/V∶100/8)洗脱，薄层层析指导合并含有烟曲霉文丙的部位，用氯仿/甲醇(V/V∶10/1)重结晶得到烟曲霉文丙。其结构式为：

结构鉴定：白色针状晶体(氯仿/甲醇(V/V∶10/1))，熔点192-194℃，IR：v_max ^KBr(cm^-1)3401.5，3058.2，2961.7，1715.7，1609.4，1460.9，1381.0，1260.8，749.3；EIMS：366，307(100％)，291，238，194，108，82，43；ESIMS：365[M-H]^-；ESIMS：367[M+H]⁺；¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR数据(CDCl₃)见实施方案表1。

2.烟曲霉文丙的药理实验

1)刀豆蛋白(Con A)致小鼠肝损伤

取ICR小鼠(6-8周龄，雌性)，尾静脉以18mg/kg Con A的生理盐水攻击，8小时后眼眶采血，离心取血清测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。同时摘取肝脏，10％甲醛固定，石蜡包埋，H&E染色，作组织病理学检查。

2)脾细胞的制备

取ICR小鼠(6-8周龄，雌性)，无菌摘取脾脏，置盛有5ml、RPMI1640培养基(4℃)的培养皿中，使细胞进入溶液并分散成单个细胞，过滤，4℃、1000rpm离心5min，除去上清，加入0.17M Tris-0.75％NH₄Cl溶液20ml，离心，以除去红细胞，，再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤2次，计数，调成5×10⁶cells/ml，细胞存活率大于99％。

3)刀豆蛋白(Con A)所致脾淋巴细胞增殖

取5×10⁵cells/well置96孔培养板中，加入5μg/ml刀豆蛋白(Con A)置37℃，5％CO₂，培养72小时。终止培养前4h加入5mg/ml 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2氢-四唑溴化物(MTT)20μl。4小时后1000rpm离心5min，吸去上清，每孔加入200μl二甲亚砜，振荡，待完全溶解后在酶联免疫测定仪上于540nm测吸光度。将Con A刺激组除以不加Con A组的吸光度作为Con A对脾细胞的刺激指数(stimulationindex)。

4)肿瘤坏死因子TNF-α的检测

取ICR小鼠(6-8周龄，雌性)，用18mg/kg Con A静脉注射2小时，眼眶采血，离心取血清并储存于-80℃。另取正常小鼠的脾细胞5×10⁵cells/well置96孔培养板中，加入5μg/ml刀豆蛋白(Con A)置37℃ ，5％CO2，培养24小时，离心取上清。血清及培养上清中的TNF-α的浓度用ELISA试剂盒检测。

5)脾细胞黏附功能的测定

取ICR小鼠(6-8周龄，雌性)，静脉注射(i.v)Con A 18mg/kg，2小时后制备脾细胞，细胞调成5×10⁶/ml待用。将四型胶原(type IV collagen)，纤维粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)用PBS稀释成50μg/ml，取50μl加入96孔ELISA板中，4℃过夜。用PBS洗2次，再用0.2％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭2小时，PBS再洗3次。

加入100μl制备好的脾细胞到处理好的96孔板中，800rpm离心2分钟使细胞下沉，于37℃作用45分钟。测定孔用RPMI 1640洗3次以洗去未黏附的细胞，加入3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2氢-四唑溴化物(MTT)5mg/ml 20μl于37℃培养4小时。1000rpm离心5分钟，吸弃上清，加入200μl DMSO于37℃溶解20分钟，在酶标仪上测540nm处的吸光值。只用BSA包被而不加细胞的孔值记为OD_control，加入细胞不经冲洗直接染色的孔值记为OD_total，黏附细胞百分数＝(OD_测定-OD_control)/(OD_total-OD_oontrol)×100％。

3.烟曲霉文丙的药理实验结果分析果

1)烟曲霉文丙对Con A所致小鼠肝损伤的影响

连续3次每隔6个小时腹腔注射Fumigaclavine C(5，10，20 and 40mg/kg)和Cs A(10mg/kg)，对照组腹腔注射给予相应量的生理盐水。末次给药1小时后尾静注射给予18mg/kg Con A。由表2，表3及图2可见，20mg/kg和40mg/kg Fumigaclavine C本身未显示肝毒性，但对于Con A所致肝损伤的转氨酶的升高以及肝脏的病理改变则具有剂量依赖性的抑制作用。CsA亦显著地改善了Con A所致肝损伤。此外，两者均能降低ConA所致的小鼠死亡率。

2)烟曲霉文丙对Con A所致小鼠肝损伤中脾指数的影响

连续3次每隔6个小时腹腔注射Fumigaclavine C(2.5，5，10，20 and 40mg/kg)和Cs A(10mg/kg)，对照组腹腔注射给予相应量的生理盐水。末次给药1小时后尾静脉给予18mg/kg Con A。由表4可见，Fumigaclavine C能剂量依赖性的抑制Con A所致肝损伤中脾指数的升高，CsA亦显著地抑制了脾指数的升高。

3)烟曲霉文丙对Con A所致小鼠肝损伤2小时血清中TNF-α的影响

连续3次每隔6个小时腹腔注射Fumigaclavine C(5，10，and 20mg/kg)，对照组腹腔注射相应量的生理盐水。末次给药1小时后尾静脉给予18mg/kg Con A。如图3，Fumigaclavine C剂量依赖性地抑制了Con A所致肝损伤小鼠血清TNF-α的升高。在20mg/kg时，其抑制率达到70.7％。

4)烟曲霉文丙对Con A刺激脾细胞TNF-α的释放及其细胞存活的影响

由附图4可知，对于刺激脾细胞24小时TNF-α的释放，Fumigaclavine C显示了浓度依赖性的抑制作用。与此同时，它浓度依赖性抑制了Con A所致脾细胞的增殖。但是，对于正常小鼠脾细胞，Fumigaclavine C在所用浓度下并无杀伤作用(结果未给出)。

5)烟曲霉文丙体内给药对Con A所致肝损伤小鼠脾细胞与细胞外基质黏附能力的影响如附图5所示，Fumigaclavine C体内给药可以剂量依赖性地抑制Con A所致肝损伤小鼠脾细胞与细胞外基质的黏附。在20mg/kg时，其对fibronectin、laminin及type IVcollagen的抑制率分别为40.2％，27.2％ and 38.0％。

本发明采用的烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)可作为具有免疫抑制作用的化合物用于各种肝炎、类风湿关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥等各种免疫性疾病的治疗。

四、附图说明

图1.Fumigaclavine C的化学结构。

图2.Fumigaclavine C对Con A所致小鼠肝损伤病理组织变化的改善作用。各组小鼠处理如表2。(A)正常组；(B-C)Fumigaclavine C毒性20mg/kg和40mg/kg组；(D)环孢素A组；(E)模型组(F-H)Fumigaclavine C给药5，10，20mg/kg组。(放大倍数×100)。

图3.Fumigaclavine C对血清中TNF-α水平的影响。正常组小鼠不作任何处理，给药组每隔6小时分别腹腔注射给予Fumigaclavine C 5，10，20mg/kg 3次，末次给药后1小时，模型组及给药组分别尾静脉注射18mg/kg Con A。2小时后眼眶采血，离心得血清测TNF-α。结果以mean±SEM表示。N：正常小鼠；Con：模型小鼠。^*P＜0.05，^**P＜0.01 Con(Dunnett’s t-test)；^##P＜0.01 vs N(Student’s t-test)。

图4.Fumigaclavine C体外对Con A诱导的小鼠脾细胞TNF-α的产生和存活率的影响。正常小鼠脾细胞在Fumigaclavine C存在或不存在的条件下与5μg/mL的Con A共孵24小时。培养上清中TNF-α的水平(A)用酶联免疫(ELISA)的方法检测。同时，细胞存活率用MTT方法检测(B)。结果以mean±SEM表示。N：正常小鼠脾细胞；Con.模型小鼠的脾细胞。^##P＜0.01 vs N(Student t-test)；^*P＜0.05，^**P＜0.01vs Con(Dunnett’s t-test)。

图5.腹腔注射Fumigaclavine C对Con A所致肝损伤小鼠中2小时的脾细胞与fibronectin，laminin和collagen IV黏附能力的影响。正常组小鼠不作任何处理，给药组每隔6小时分别腹腔注射给予Fumigaclavine C 5，10，20mg/kg 3次，末次给药后1小时，模型组及给药组分别尾静脉注射18mg/kg ConA。2小时后分离脾细胞并进行黏附能力的检测。结果以mean±SEM表示。N：正常小鼠的脾细胞；C：模型小鼠的脾细胞。^##P＜0.01 vs N(Student’st-test)；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs C(Dunnett’s t-test)。

五、具体实施方式

烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)是利用硅胶、ODS、葡聚糖凝胶柱层析和高效液相等技术从狗牙根(Cynodon dactylon)曲霉属(Aspergillus sp.)内生真菌(菌株编号：CY018)的固体发酵产物中分离得到的一种吲哚类生物碱(见附图1)。其为白色针状晶体(氯仿/甲醇(V/V∶10/1))，熔点192-194℃，IR：v_max ^KBr(cm^-1)3401.5，3058.2，2961.7，1715.7，1609.4，1460.9，1381.0，1260.8，749.3；EIMS：366，307(100％)，291，238，194，108，82，43；ESIMS：365[M-H]^-；ESIMS：367[M+H]⁺；¹H(500MHz)和¹³C(125MHz)NMR结构分析见于表1。

表1.Fumigaclavine C的光谱数据--¹H-(500MHz)和¹³C-NMR(125MHz)

Position δ_c(DEPT) δ_H ^*(J in Hz) HMBC

1 7.97(s)

2 136.6(C) H-1，H-22，H-23，H-4

3 105.9(C) H-1，H-4

4 27.9(CH₂) α2.71(t，11.0)

β3.57(br d，11.0)

5 61.5(CH) 2.68(dd，11.0，8.5) H-4，H-10，H-17

7 57.5(CH₂) α2.67(dd，12.0，9.0) H-17，H-18

β2.76(dd，12.0，3.5)

8 32.9(CH) 2.15(dd，3.5，2.0) H-18

9 71.3(CH) 5.72(br s) H-5，H-18

10 39.2(CH) 3.36(br d，8.5) H-4，H-12

11 129.0(C) H-10，H-13

12 112.6(CH) 6.77(d，6.5) H-14

13 107.7(CH) 7.09(dd，7.5，6.5) H-12

14 122.0(CH) 7.12(d，7.5) H-12

15 132.1(C) H-1，H-13

16 127.9(C) H-1，H-4，H-12，H-14

17 43.4(CH₃) 2.49(s) H-5

18 16.5(CH₃) 1.36(d，7.0)

19 170.9(C) H-20

20 21.1(CH₃) 1.91(s)

21 38.9(C) H-22，H-23，H-24，H-25c，H-25t

22 27.3(CH₃) 1.57(s) H-23

23 27.1(CH₃) 1.57(s) H-22

24 145.6(CH) 6.14(dd，17.0 11.0) H-22，H-23，H-25c，H-25t

25 111.7(CH₂) c 5.17(d，11.0)

t5.17(d，17.0)

s：单峰，d：，双重峰，t：三重峰，br：宽峰

烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)腹腔注射给药对Con A所致小鼠肝损伤有显著的改善作用，其作用包括降低Con A模型小鼠血清中的转氨酶的升高(表2)，改善肝脏组织的病理变化(表3及附图2)，提高模型小鼠的存活率(表2)。而且烟曲霉文丙(FumigaclavineC)即使在两倍的治疗剂量下对肝脏也无毒性。

表2.Fumigaclavine C对ConA所致肝损伤的小鼠血清转氨酶及存活率的影响

剂量动物数存活数谷丙转氨酶谷草转氨酶存活率

组别

(mg/kg) (只) (只) (卡门氏单位) (卡门氏单位) (％)

正常组 - 8 8 5±3 89±12 100

Fumigaclavine C毒性组 20 8 8 6±3 119±15 100

40 8 8 10±3 125±8 100

模型组 18 20 9 6288±545^## 8632±747^## 45Fumigaclavine C给药组 5 10 9 3387±1041^* 4213±879^* 90

10 10 10 1078±519^** 1423±445^** 100

20 10 10 447±271^** 921±328^** 100

环孢素A组 10 8 8 650±501^** 1509±841^** 100

给药组及毒性组小鼠每隔6小时分别腹腔注射给予Fumigaclavine C(5，10，20，40mg/kg)和Cs A(10mg/kg)3次，末次给药后1小时，模型组及给药组分别尾静脉注射18mg/kg Con A。8小时后眼眶采血，离心取血清用于转氨酶的检测。结果以mean±SEM表示。^##P＜0.01 vs 正常组(Student’st-test)；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs 模型组(Dunnett’s t-test)。

在Con A肝损伤模型中，TNF-α是一个关键的致病因子。本研究进一步发现Fumigaclavine C能显著地抑制模型小鼠血清中TNF-α的升高(附图3)，同时显著的抑制模型小鼠的脾指数(表4)，其抑制TNF-α的产生与ConA所致脾细胞增殖的抑制作用相平行(附图4)。这些结果提示烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)改善肝损伤的作用可能与其免疫抑制作用有关，可能是通过抑制脾细胞的活化来减少TNF-α的产生。

此外，淋巴细胞与细胞外基质的黏附在Con A所致肝损伤发病中也具有非常重要的作用。它不仅有助于淋巴细胞进入炎症部位，而且可以促进淋巴细胞的进一步活化。有文献报道抑制TNF-α的释放可以抑制淋巴细胞与细胞外基质的黏附，从而减轻肝损伤。在实验中，我们发现烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)可以显著地抑制模型小鼠脾细胞与三种不同的细胞外基质的黏附作用(附图5)。而这一作用又有助于抑制脾细胞的进一步活化和TNF-α的释放。

以上结果提示，烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)可作为具有免疫抑制作用的化合物用于各种肝炎、类风湿关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥等各种免疫性疾病的治疗和在制备治疗各种肝炎、类风湿关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥药物中得到应用。

表3.Fumigaclavine C对Con A所致肝损伤的病理变化的影响

剂量动物数肝细胞肝细胞炎细胞枯否细胞

组别

(mg/kg) (只) 坏死脂变浸润增生

正常组 - 8 0 0 0 0

Fumigaclavine C毒性组 20 8 0 0 0 0

40 8 0 0 0 0

模型组 - 9 1.78±0.15^## 2.56±0.29^## 1.89±0.20^## 1.89±0.11^##

Fumigaclavine C给药组 5 9 1.11±0.20^* 1.89±0.20 1.22±0.15^* 1.22±0.15^**

10 10 0.30±0.16^** 1.10±0.18^** 1.1±0.10^** 1.00±0.15^**

20 10 0.20±0.14^** 0.90±0.10^** 1.0±0.15^** 0.90±0.10^**

环孢素A组 10 8 0.25±0.25^** 1.13±0.30^** 1.13±0.13^** 1.00±0.19^**

各组小鼠处理如表2，刀豆蛋白注射8小时后摘取肝脏，10％甲醛固定，石蜡包埋，H&E染色，作组织病理学检查。组织病理变化以0-3记分表示(0，没损伤；1，轻度损伤；2，中度损伤；3，严重损伤)。结果以mean±SEM表示。^##P＜0.01 vs 正常组(Student’s t-test)；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs 模型组(Dunnett’s t-test)。

表4.Fumigaclavine C对Con A所致肝损伤的脾指数的影响

剂量动物数体重脾重脾重/体重

组别

(mg/kg) (只) (g) (mg) (mg/g)

正常组 - 8 20.9±0.4 80.4±3.0 3.85±0.06

Fumigaclavine C毒性组 20 8 20.6±0.49 80.2±5.4 3.89±0.48

40 8 20.3±0.4 66.1±7.6 3.24±0.26

模型组 18 9 20.0±0.4 210.9±20.9^## 10.51±0.6^##

Fumigaclavine C给药组 5 9 20.9±0.6 162.7±19.7^* 7.82±0.77^*

10 10 20.6±0.4 121.4±11.6^** 5.98±0.31^**

20 10 20.8±0.5 111.6±6.7^** 5.35±0.24^**

环孢素A组 10 8 20.5±0.5 124.4±9.3^** 6.10±0.45^**

各组小鼠处理如表2。Con A注射前称体重，8小时后取脾脏称重。结果以mean±SEM表示。^##P＜0.01vs 正常组(Student’s t-test)；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs 模型组(Dunnett’s t-test)。

Claims

1.一种烟曲霉文丙其特征是从狗牙根(Cynodon dactylon)内生真菌烟曲霉(Aspergillusfumigatus，菌株编号：CY018)的固体发酵产物中分离得到。其结构式为：

2.烟曲霉文丙作为具有免疫抑制作用的化合物可在制备治疗各种肝炎、类风湿关节炎、红斑狼疮、过敏性皮炎、移植排斥药物中得到应用。