CN104016982A - 一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，该方法包括：（1）将发酵粗提物以乙醇溶解，分散于水中，制成乙醇浓度为5-30%的上样溶液；（2）将上样溶液通过填充有非极性大孔树脂的层析柱，上样体积为3-15床体积，上样流速为0.5-2床体积/h，非极性大孔树脂的径高比为1:3-1:20；（3）洗脱程序为先用1-3床体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再用3-9床体积的70-100%的乙醇洗脱，吸附和洗脱流速均为1-6床体积/h，收集乙醇洗脱液，减压，蒸干得到烟曲霉文丙含量大于60%的富集物。本发明利用非极性大孔树脂对烟曲霉文丙吸附量大，解吸完全，得到的富集物中烟曲霉文丙含量高，且操作简单易控，工艺稳定性强；生产过程污染小，安全性高，更利于工业化的生产操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵产物分离纯化的方法，尤其涉及一种利用非极性大孔树脂制备烟曲霉文丙（Fumigaclavine C，通称FC）富集物的方法。
背景技术
海洋是一个开放的复杂系统，在海洋特殊的生态环境下生活着40多万种动植物和上亿种微生物。近年来许多文献报导了海洋生物作为活性化合物和药物来源的巨大潜力，具有重要的研究意义与开发价值。为适应海洋特有环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，有些共生菌似乎与宿主形成了类似于“整体”的统一体，缺一难活。研究表明该“互惠共生”的化学本质是共生菌可产生结构和功能都比较特殊的代谢物，来保护或调节海洋生物的生长发育、抵御天敌、寻取食物等行为。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类急需新药的发现与研发提供广阔的空间。
海洋来源内生真菌菌株编号：CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌，由南京大学谭仁祥教授分离得到。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。烟曲霉文丙是其产生的一种生物碱类次级代谢物，烟曲霉文丙纯品为白色针状结晶，其具有同环孢菌素A相媲美的免疫抑制活性，是一种潜在的免疫抑制剂候选药物。
目前已报道的烟曲霉文丙的制备方法为生物发酵法，包括发酵培养与分离纯化两个制备环节，其中烟曲霉文丙的发酵培养方法已有较多报道，包括培养基的配方、培养条件、过程控制方法等。
另外，烟曲霉文丙的制备方法目前还采用硅胶柱层析法，如专利号为200310112694.X的专利报道，将发酵粗提物上硅胶柱，先用10倍柱体积的氯仿洗脱，然后用氯仿/甲醇混合溶剂（体积比氯仿/甲醇为50/1）洗脱，合并含有烟曲霉文丙的部分得到烟曲霉文丙富集物。
但是，采用上述已知的方法进行烟曲霉文丙的制备，所用有机溶剂挥发性和毒性均较强、用量较大，生产过程污染大、安全性差，不利于工业化生产操作。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对烟曲霉文丙深入研究的瓶颈问题，提供一种从发酵粗提物中富集烟曲霉文丙的方法，利用该方法得到的富集物中烟曲霉文丙的含量高，操作简单易控，工艺稳定性强；生产过程污染小，安全性高，更利于工业化的生产操作。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，包括以下步骤：
（1）将发酵粗提物以乙醇溶解，然后分散于水中，制成乙醇浓度为5-30 %的上样溶液；
（2）将上述上样溶液通过填充有非极性大孔树脂的层析柱，上样体积为3-15床体积，上样流速为0.5-2床体积/h，所述非极性大孔树脂的径高比为1:3-1:20；
（3）进行洗脱，洗脱程序为先用1-3 床体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再用3-9 床体积的70-100%的乙醇洗脱，吸附和洗脱流速均为1-6 床体积/h，收集乙醇洗脱液，减压，蒸干得到烟曲霉文丙含量大于60 %的富集物。
优选的，所述发酵粗提物可以是任何可以产生烟曲霉文丙的菌体的发酵液经乙酸乙酯萃取后，将乙酸乙酯蒸发浓缩得到。
优选的，所述发酵粗提物可以是任何可以产生烟曲霉文丙的菌体的固体培养物经极性有机溶剂提取后，进行固液分离，将有机溶剂蒸发浓缩后得到。所述的极性有机溶剂是已知任何极性有机溶剂，包括醇类、酮类、醛类等，较佳的为醇类，优选乙醇。本发明所采用的固液分离方法为本领域常规的固液分离方法，如离心、抽滤、微滤等。
优选的，所述非极性大孔树脂为D101型聚苯乙烯大孔吸附树脂。
采用本发明所述的方法，利用非极性大孔树脂对烟曲霉文丙的吸附量大，解吸完全，所得到的富集物中烟曲霉文丙含量高，且其操作简单易控，工艺稳定性强；生产过程污染小，安全性高，更利于工业化的生产操作。
附图说明
图1是本发明实施例的发酵粗提物（A）、纯化后的烟曲霉文丙富集物（B）的HPLC检测图谱。
具体实施方式
本发明的一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，包括以下步骤：
（1）将发酵粗提物以乙醇溶解，然后分散于水中，制成乙醇浓度为5-30 %的上样溶液；
（2）将上述上样溶液通过填充有非极性大孔树脂的层析柱，上样体积为3-15床体积，上样流速为0.5-2床体积/h，所述非极性大孔树脂的径高比为1:3-1:20；
（3）进行洗脱，洗脱程序为先用1-3 床体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再用3-9 床体积的70-100%的乙醇洗脱，吸附和洗脱流速均为1-6 床体积/h，收集乙醇洗脱液，减压，蒸干得到烟曲霉文丙含量大于60 %的富集物。
以下，本发明将根据具体实例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。下列实例中未注明具体条件的实验方法，一般按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在本实施例中，发酵粗提物的获得按如下方式进行：
菌种：海蟹共生烟曲霉（CY018，Aspergillus fumigatus）
平板培养基：葡萄糖20 g，去皮马铃薯200 g，琼脂20 g，用自来水溶解并定容至1000 ml。
种子培养基：糖蜜100 g、蔗糖56.89 g、硝酸钠3.5 g、磷酸氢二钾1 g、氯化钾0.5 g、七水硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、硫酸锌0.01 g、硫酸铜0.005 g、色氨酸1 g，用自来水溶解并定容至1000 ml。
发酵培养基：同种子培养基。
1.发酵培养方法
将-80℃保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 ml种子培养基的1000 ml摇瓶中，以28°C、150 rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入发酵培养基，以28°C、130 rpm摇床振荡培养4.5天，后将转速降为0 rpm，静置培养8天，获得发酵液。
2.发酵粗提物制备
将所获得的含烟曲霉文丙的发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，搅拌进行萃取，共萃取3次。萃取的乙酸乙酯层合并进行减压蒸干得到发酵粗提物。
3.烟曲霉文丙富集物制备
发酵粗提物经检测烟曲霉文丙含量为6.38%，HPLC检测图谱见图1（A）。将发酵粗提物以乙醇溶解后分散于水中，制成乙醇浓度为20 %的上样溶液，然后将上样溶液通过填充有非极性大孔树脂的层析柱，上样体积为8.6 BV（Bed Volume，床体积，简称BV），上样流速1BV/h，树脂径高比为1:10，洗脱程序为先用2 BV的水洗脱，弃去水洗脱液，再用6BV的90 %的乙醇洗脱，吸附和洗脱流速均为4 BV/h，收集乙醇洗脱液，减压蒸干得到烟曲霉文丙含量为67.5 %以上的富集物。所得烟曲霉文丙富集物经HPLC检测，检测图谱见图1（B）。
由图1（B）所示，烟曲霉文丙在该色谱条件下的保留时间是16min，图1的横坐标为保留时间（分钟）。
从上述实施例可以看出，采用本发明所述的方法，利用非极性大孔树脂对烟曲霉文丙的吸附量大，解吸完全，所得到的富集物中烟曲霉文丙含量高，且其操作简单易控，工艺稳定性强；生产过程污染小，安全性高，更利于工业化的生产操作。
需要说明的是，以上较佳实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所作出各种变换或变型，均属于本发明的范畴。
Claims (4)
1.一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，其特征在于，所述利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法包括以下步骤：
（1）将发酵粗提物以乙醇溶解，然后分散于水中，制成乙醇浓度为5-30 %的上样溶液；
（2）将上述上样溶液通过填充有非极性大孔树脂的层析柱，上样体积为3-15床体积，上样流速为0.5-2床体积/h，所述非极性大孔树脂的径高比为1:3-1:20；
（3）进行洗脱，洗脱程序为先用1-3 床体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再用3-9 床体积的70-100%的乙醇洗脱，吸附和洗脱流速均为1-6 床体积/h，收集乙醇洗脱液，减压，蒸干得到烟曲霉文丙。
2.根据权利要求1所述的一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，其特征在于，所述发酵粗提物是任何可以产生烟曲霉文丙的菌体的发酵液经乙酸乙酯萃取后，将乙酸乙酯蒸发浓缩得到。
3.根据权利要求1所述的一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，其特征在于，所述发酵粗提物是任何可以产生烟曲霉文丙的菌体的固体培养物经极性有机溶剂提取后，进行固液分离，将有机溶剂蒸发浓缩后得到。
4.根据权利要求1所述的一种利用大孔树脂制备烟曲霉文丙的方法，其特征在于，所述非极性大孔树脂为D101型聚苯乙烯大孔吸附树脂。
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