CN104789613A

CN104789613A - 绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法

Info

Publication number: CN104789613A
Application number: CN201510159715.6A
Authority: CN
Inventors: 花日茂; 付稳; 吕培; 柏钰; 吴祥为; 史陶中
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明公开了一种绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，它涉及天然活性物质的提取分离技术。该提取与分离技术的方法路线为：（1）绣线菊内生真菌的培养（2）除去发酵液中的菌丝体（3）萃取（4）浓缩（5）柱层析分离（6）过滤；本发明所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，是一种步骤简单、准确性高、分离时间短、成本低、环保的提取与分离方法。本发明提取得到的抑菌活性组份对苹果腐烂病菌、茄褐纹病菌和梨黑星病菌的抑制效果明显，其中对苹果腐烂病菌的抑制中浓度（EC₅₀）为2.2μg/mL，抑制效果最为明显，具有较好的抗植物病原菌活性。

Description

绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，涉及天然活性物质的提取分离技术，具体涉及绣线菊内生真菌的抗菌发酵液中抑菌活性组份的提取和分离方法。

背景技术

在天然产物有效成分的提取方法中，常用的传统提取方法如浸渍法、蒸汽或水蒸馏法、压榨法、渗流法和索氏提取等提取效率不高、有效成分损失多、周期长、工序多。传统的纯化制备技术包括离心分离法、醇水法、盐析法、酸碱法、离子交换法和结晶法等，这些方法存在步骤繁琐、效率较低等局限性。

植物内生真菌是一类生活在植物体内，并与植物营互利共生关系的真菌。内生真菌在与宿主植物共生的过程当中，一方面接受来自宿主植物提供的光合产物、矿物质和水等，一方面又会产生一些结构和功能新奇的代谢产物提高宿主植物的抗病虫害和抗干旱、水涝等逆境的能力。

目前，关于植物内生真菌对植物病原菌的抑制作用的报道较少，从植物内生真菌及其代谢物中快速提取分离具有抗植物病原菌的活性物质具有重要意义，对加速我国生物农药的发展具有促进作用。

发明内容

关于绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取和分离方法，本发明的目的在于提供一种准确性高、分离时间短、成本低、环保的提取和分离方法。

绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份提取与分离的具体操作步骤如下：

（1）绣线菊内生真菌的培养

将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±1℃条件下活化培养3天，得到活化菌；将活化菌接种到液体培养基上，接种量为每100mL液体培养基中接入直径6mm的活化菌菌饼4～6个，在28±1℃、转速160r·min^-1条件下，摇床避光培养5～7天，得到发酵液；

（2）除去发酵液中的菌丝体

将发酵液减压抽滤2～3次，分离出菌丝体，收集合并得到滤液；抽滤时控制压力≤0.08MPa；

（3）萃取

在滤液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第一正丁醇相和第一萃取液；在第一萃取液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第二正丁醇相和第二萃取液；在第二萃取液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第三正丁醇相和第三萃取液；合并第一正丁醇相、第二正丁醇相和第三正丁醇相为正丁醇相；

（4）浓缩

将正丁醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏，回收正丁醇；

（5）柱层析分离

采用石油醚湿法装柱、干法上样的方法，对浓缩浸膏进行柱层析分离；用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，收集得到抑菌活性组份的液体混合物；

（6）过滤

将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤漏斗减压抽滤，得到白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；所述抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为80%～85%；细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C₁₀H₁₅NO₃，分子量为197；结构式为:

细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。

所述液体培养基由蛋白胨15g、葡萄糖20g、氯化钙0.5g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸亚铁0.01g、硝酸钠1g、水1L组成；

步骤（4）浓缩时，向正丁醇相中加入1/3体积的纯水形成共沸体系，浓缩条件：水浴温度为55～60℃，压力≤0.08MPa；

步骤（5）中浓缩浸膏和上样的硅胶的质量比为1：2；上样的硅胶和装柱的硅胶的质量比为1：20；所述硅胶的规格为200-300目；

所述梯度洗脱：先用乙酸乙酯洗脱，再用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱和高效液相色谱技术相结合分析确定洗脱梯度：按乙酸乙酯和甲醇的体积比为15～1：1～15；最后到甲醇洗脱；收集得到抑菌活性组份的液体混合物，同时，回收乙酸乙酯和甲醇；

步骤（6）中减压抽滤的压力≤0.08MPa。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.本发明操作步骤简单易操作，高效液相色谱和薄层色谱技术的相结合保证了对目标物分离的准确性，节省了时间；提取分离过程中有机溶剂的回收利用降低了成本，有利于环保；

2.本发明提取分离得到的抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为80%～85%；抑菌活性组份对苹果腐烂病菌的抑制中浓度（EC₅₀）为2.2μg/mL；

3.本发明提取分离得到的抑菌活性组份在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌、梨黑星病菌抑制率分别为95.87%、77.66%，具有较好的抗植物病原菌活性；

4.本发明所述的提取分离方法对细交链孢菌酮酸的提取率为68.8%，在传统的天然产物提取中，提取率相对较高。

本发明所述抑菌活性组份对苹果腐烂病菌的抗菌试验如下：

1.植物病原菌

苹果腐烂病菌

2.病原微生物的培养

用接种针挑取少量苹果腐烂病菌的斜面培养物接入PDA固体培养基，在28±1℃恒温培养箱中活化培养活化3天。

3.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性

将抑菌活性组份用无菌水溶解，过0.22μm无菌滤头，制备抑菌活性组份浓度分别为25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.0μg/mL 、0.5μg/mL的PDA平板，每个浓度设置3个重复，以加入1mL无菌水的PDA作为对照，接种苹果腐烂病菌，28±1 ℃恒温培养箱中培养24h，十字交叉法记录各浓度菌落直径和对照菌落直径，采用下述公式计算抑制率：

4.结果与分析

计算抑菌活性组份在各浓度下对苹果腐烂病菌的抑制率，如表1：

注：1)表中数据为3次重复测定的菌丝生长抑制率；

2)NA，即No Activity，表示无抑菌活性；

3)NG，即No Growth，表示病原菌不生长。

由表1可知，本发明所述抑菌活性组份对苹果腐烂病菌具有较好的抗菌活性，在抑菌活性组份浓度为0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL 、25μg/mL时对苹果腐烂病菌的抑制率分别为0、34.22%、41.66%、82.23%、96.02%、100%、100%、100%；通过计算，得到抑菌活性组份对苹果腐烂病菌的抑制中浓度（EC₅₀）为2.2μg/mL；其对苹果腐烂病菌具有较好的抗菌活性。

附图说明

图1为抑菌活性组份在不同浓度下对苹果腐烂病菌的抑制作用图；

图2为抑菌活性物质细交链孢菌酮酸标准品在10μg/mL浓度下高效液相色谱图；

图3为发酵液萃取前，发酵液中细交链孢菌酮酸的高效液相色谱图；

图4为发酵液萃取后，发酵液中细交链孢菌酮酸的高效液相色谱图。

图1中，从上到下、从左到右，抑菌活性组份的浓度依次为对照、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL。

由图2～4可知，本发明所述提取方法对抑菌活性物质细交链孢菌酮酸的提取率相对较高；细交链孢菌酮酸的保留时间在7.2min，发酵液萃取前、后细交链孢菌酮酸的峰面积分别为842.177、262.755 ，采用以下公式计算提取率：

计算出的提取率为68.8%，图2～4中横坐标为时间，纵坐标为吸光度，VWD1 A表示UV紫外检测器，Wavelength=274nm表示波长为274nm；

图2～4的高效液相色谱条件：

仪器：安捷伦1260；

流速：1.0 mL/min；

流动相：乙腈：0.1%三氟乙酸水=40：60；

色谱柱： Agilent Eclipse XDB-C18 ，5μm ，4.6×250mm ；

柱温：30℃；

检测器及检测波长：UV紫外检测器，波长274nm。

具体实施方式

以下实施例所用原料的说明：

绣线菊内生真菌，所用菌株名称为XXB07，属于链格孢属（Alternaria sp.），来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7292，保藏日期为2013年3月8日；

植物病原菌：

苹果腐烂病菌，拉丁学名为V. mali Migabe & Yamada，来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc 8017；

梨黑星菌，拉丁学名为Fusicladium tremulae A.B. Frank，来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc 85463；

茄褐纹病菌，中文名称为茄褐纹拟茎点霉，拉丁学名为Phomopsis vexans，来源于中国农业科学研究院花卉研究所，菌株保藏编号为37034；

苹果轮纹病菌，拉丁学名为Physalospora piricola Nose，来源于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cfcc 5583；

苹果炭疽病菌，拉丁学名为Colletotrichum gloeosporioides，来源于中国农业科学农业微生物菌中保藏中心，菌株保藏编号为36199。

液体培养基由蛋白胨15g，葡萄糖20g，氯化钙0.5g、磷酸氢二钾0.1g，硫酸亚铁0.01g，硝酸钠1g，水1L组成；

柱层析所用硅胶的规格： 200～300目；

实施例1

绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离的具体操作步骤如下：

（1）绣线菊内生真菌的培养

将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±1℃条件下活化培养3天，得到活化菌；将活化菌接种到上述液体培养基上，接种量为每100mL液体培养基中接入直径6mm的活化菌菌饼5个，在28±1℃、转速160r·min^-1条件下，摇床避光培养5天，得到发酵液；

（2）除去发酵液中的菌丝体

将发酵液减压抽滤3次，分离出菌丝体，收集合并得到4.5L滤液；抽滤时控制压力≤0.08MPa；

（3）萃取

4.5L滤液分成9份，每份500mL，在第一份500mL滤液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第一含萃取物正丁醇；将第二份500mL滤液加入第一含萃取物正丁醇中，常温萃取，得到第二含萃取物正丁醇；以此类推，再将剩下的7份500mL滤液分别进行萃取，完成第一遍萃取，得到第一萃取液和第一正丁醇相；再取500mL正丁醇按第一遍萃取操作方法对第一萃取液进行第二遍萃取，得到第二萃取液和第二正丁醇相；再取500mL正丁醇按第一遍萃取操作方法对第二萃取液进行第三遍萃取，得到第三萃取液和第三正丁醇相；合并第一正丁醇相、第二正丁醇相和第三正丁醇相为正丁醇相共1.5L；

（4）浓缩

将正丁醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏2.8g，回收正丁醇；浓缩时控制水浴温度为55～60℃，压力≤0.08MPa；

（5）柱层析分离

采用石油醚湿法装柱、干法上样的方法，将2.8g浓缩浸膏和5g硅胶混匀，干法上样；称量100g硅胶,石油醚湿法装玻璃层析柱；所述玻璃层析柱的规格为：长600mm,直径50mm；

用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱：

先用200mL乙酸乙酯洗脱；接着梯度洗脱分别用600mL体积比10:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用600mL体积比8:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用300mL体积比5:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用200mL体积比2:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用100mL体积比1:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱；最后再用100mL甲醇洗脱；每75mL洗脱液为一个馏分，共得到28个馏分，通过薄层色谱和高效液相色谱技术相结合指导馏分合并，得到抑菌活性组份的液体混合物；

（6）过滤

将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤漏斗减压抽滤，抽滤时控制压力≤0.08MPa，得到120mg白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；

将抑菌活性组份通过高效液相色谱分析，采用面积归一化法计算得到抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为80%；细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C₁₀H₁₅NO₃，分子量为197；结构式为：

细交链孢菌酮酸具有抑制苹果腐烂病菌的活性。

实施例2

（1）绣线菊内生真菌的培养

将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±1℃条件下活化培养3天，得到活化菌；将活化菌接种到液体培养基上，接种量为每100mL液体培养基中接入直径6mm的活化菌菌饼5个，在28±1℃、转速160r·min^-1条件下，摇床避光培养7天，得到发酵液；

（2）除去发酵液中的菌丝体

将发酵液减压抽滤3次，分离出菌丝体，收集合并得到4.2L滤液；抽滤时控制压力≤0.08MPa；

（3）萃取

4.2L滤液分成7份，每份600mL，在第一份600mL滤液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第一含萃取物正丁醇；将第二份600mL滤液加入第一含萃取物正丁醇中，常温萃取，得到第二含萃取物正丁醇；以此类推，再将剩下的5份600mL滤液分别进行萃取，完成第一遍萃取，得到第一萃取液和第一正丁醇相；再取600mL正丁醇按第一遍萃取操作方法对第一萃取液进行第二遍萃取，得到第二萃取液和第二正丁醇相；再取600mL正丁醇按第一遍萃取操作方法对第二萃取液进行第三遍萃取，得到第三萃取液和第三正丁醇相；合并第一正丁醇相、第二正丁醇相和第三正丁醇相为正丁醇相共1.8L；

（4）浓缩

将正丁醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏2.5g，回收正丁醇；浓缩时控制水浴温度为55～60℃，压力≤0.08MPa；

（5）柱层析分离

采用石油醚湿法装柱、干法上样的方法，将2.5g浓缩浸膏和5g硅胶混匀，干法上样；称量100g硅胶,石油醚湿法装玻璃层析柱；所述玻璃层析柱的规格为：长600mm,直径50mm；

用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱：

先用200mL乙酸乙酯洗脱；接着梯度洗脱分别用600mL体积比15:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用600mL体积比10:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用300mL体积比5:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱、用100mL体积比1:1的乙酸乙酯和甲醇混合液洗脱；最后再用100mL甲醇洗脱；每60mL洗脱液为一个馏分，共得到32个馏分，通过薄层色谱和高效液相色谱技术相结合指导馏分合并，得到抑菌活性组份的液体混合物；

（6）过滤

将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤漏斗减压抽滤，抽滤时控制压力≤0.08MPa，得到100mg白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；

将抑菌活性组份通过高效液相色谱分析，采用面积归一化法计算得到抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为85%；细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C₁₀H₁₅NO₃，分子量为197；结构式为:

细交链孢菌酮酸具有抑制苹果腐烂病菌的活性。

实施例3

本发明提取分离得到的抑菌活性组份对其它植物病原菌的抗菌活性试验：

1.植物病原菌

梨黑星菌、茄褐纹病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌

2.病原微生物的培养

用接种针挑取少量上述植物病原菌的斜面培养物接入PDA固体培养基，在28±1℃恒温培养箱中活化培养活化3天。

3.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性

将抑菌活性组份用无菌水溶解，过0.22μm无菌滤头，制备抑菌活性组份浓度为100μg/mL的PDA平板，设置3个重复，以加入1mL无菌水的PDA作为对照，分别接种梨黑星病菌、茄褐纹病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌，28±1 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，十字交叉法记录各菌落直径和对照菌落直径，采用下述公式计算抑制率：

4.结果与分析

计算细交链孢菌酮酸在100μg/mL浓度下对植物病原菌的抑制率，如表2：

注：表中数据为3次重复测定的菌丝生长抑制率

由表2可知，本发明提取分离所得到的抑菌活性组份在100μg/mL浓度下对茄褐纹病菌、梨黑星病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌的抑制率分别为95.87%、77.66%、22.88%、15.06%，其中该抑菌活性组份对茄褐纹病菌和梨黑星病菌具有较好的抗菌活性；

本发明所述抑菌活性组份具有抗植物病原菌活性。

Claims

1.绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，具体操作步骤如下：

（1）绣线菊内生真菌的培养

（2）除去发酵液中的菌丝体

（3）萃取

（4）浓缩

（5）柱层析分离

（6）过滤

将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤漏斗减压抽滤，得到白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；所述抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为80%～85%；细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C₁₀H₁₅NO₃，分子量为197；结构式为：

细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。

2.根据权利要求1所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，其特征在于：所述液体培养基由蛋白胨15g、葡萄糖20g、氯化钙0.5g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸亚铁0.01g、硝酸钠1g、水1L组成。

3.根据权利要求1所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，其特征在于：步骤（4）浓缩时，向正丁醇相中加入1/3体积的纯水形成共沸体系，浓缩条件：水浴温度为55～60℃，压力≤0.08MPa。

4.根据权利要求1所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，其特征在于：步骤（5）中浓缩浸膏和上样的硅胶的质量比为1：2；上样的硅胶和装柱的硅胶的质量比为1：20；所述硅胶的规格为200-300目；

所述梯度洗脱：先用乙酸乙酯洗脱，再用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱和高效液相色谱技术相结合分析确定洗脱梯度：按乙酸乙酯和甲醇的体积比为15～1：1～15；最后到甲醇洗脱；收集得到抑菌活性组份的液体混合物，同时，回收乙酸乙酯和甲醇。

5.根据权利要求1所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，其特征在于：步骤（6）中减压抽滤的压力≤0.08MPa。