CN102925372B - 一株海洋真菌小红酵母及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的海洋真菌——小红酵母（Rhodotorula minuta）MNP100101A，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 2012289，保藏日期2012年7月18日。本发明的有益效果主要体现在：提供了一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌小红酵母（Rhodotorula minuta）MNP100101A，对肿瘤细胞HepG2（肝癌细胞）、PC-12（神经癌细胞）均具有一定的细胞毒性，为新药筛选提供了基础。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌——小红酵母（Rhodotorula minuta ）100101A，及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
（二）背景技术
从陆地微生物中寻找新的抗肿瘤药物的成功率已大大降低，而海洋微生物作为新的药物来源正越来越受到世界关注。海洋环境苛刻，具有低温、低照、高盐、高压和寡营养等特点，海洋微生物由于栖息于这样的极限环境下, 产生了与陆地生物完全不同的代谢系统和机体防御系统，所以能产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物，并且许多特异的化学结构类型是在陆地微生物中难以发现的。同时据研究，海洋微生物产生的次级代谢产物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等生物活性也是陆生微生物所无法比拟的。
海洋微生物作为抗肿瘤活性物质的新来源，受到了全世界海洋研究工作者的关注。
（三）发明内容
本发明的目的即是为了在海洋微生物中寻找具有抗肿瘤活性的物质，提供一株抗肿瘤活性海洋真菌——小红酵母（Rhodotorula minuta）100101A及其应用，为研究开发新型抗肿瘤药物提供先导化合物。
本发明采用的技术方案是：
一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——小红酵母（Rhodotorula minuta ）100101A，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M 2012289，保藏日期：2012年7月18日。
该菌株的菌落特征如下：涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，28℃培养48 h后长出圆形、湿润、淡红色、易挑起，直径约为0.5-0.8cm的菌落；所述小红酵母Rhodotorula minuta 100101A细胞特征如下：椭圆形，单球菌，大小为2.3-5.0μm×4.0-10.0μm。
本发明小红酵母100101A是从浙江省东海海域采集的海水中筛选分离得到。
菌株的筛选纯化方法为：将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，多次平板划线至出现单菌落，再挑取单菌落至新鲜土豆斜面培养基上，28℃培养48 h，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株，并对该菌株进行菌种鉴定。
将所述的小红酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA部分核苷酸序列与美国国立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information USA，NCBI）的基因库中的微生物18sRNA序列比对，将其命名为海洋小红酵母Rhodotorula minuta 100101A。所述小红酵母Rhodotorula minuta 100101A的18sRNA的部分核苷酸序如下：
CTTCCGTAAGGGTAACCTGCGGAAGGATCATTAATGAATTTTAGGACGTTCTTTTTAGAAGTCCGACCATTTCATTTTCTTACACTGTGCACACACTTCTTTTTACACACACTTTTAACACATTAGTATAAGAATGTAATAGTCTCTTAATTGAGCATAAACAAAAATAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCTTTGGTATTCCGAAGAGTATGTCTGTTTGAGTATCATGAAACTCTCAACCCCCCTATTTTGTAATGAAATGGGCGTGGGCTTGGATTATGGTTGTCTGTCGGCGTAATTGCCGGCTCAACTGAAATACACGAGCAACCCTATTGAAATAGACGGTTTGACTTGGCGTAATAATTATTTCGCTAAGGACGTCTTCTTCAAATATAAGAGGTGCTTCTAATGCGCTTTATAGCACTTTAAGCTTTAGATCTCAAATCAGTCAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGGCGGAGGAAGA。
本发明还涉及所述的小红酵母100101A在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述抗肿瘤药物为治疗神经癌或肝癌的药物。
具体的，所述应用为所述小红酵母100101A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获得：小红酵母100101A接种至液体发酵培养基，于25~35℃、150~250r/min振荡条件下培养14~30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以甲醇：水体积比为2：8~10：0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体培养基组成为：葡萄糖15~25g/L，蛋白胨5~15g/L ，酵母浸出粉8~15 g/L，磷酸铁0.05~0.15 g/L， 溶剂为人工海水，pH 6~7。
所述人工海水每100 ml组成为：NaCl 2.448 g，Na2SO4 0.3917g，KCl 0.0664 g，KBr 0.0096 g，SrCl2 0.0024 g，MgCl·6H2O 0.4981 g， CaCl2·H2O 0.1102 g，NaHCO3 0.0192 g，H3BO3 0.0026 g， NaF 0.0004 g， 蒸馏水100 ml。具体的，所述正丁醇提取物可按如下方法获得：
（1）将保藏的小红酵母Rhodotorula minuta 100101A菌株接种于斜面培养基，于25-35℃培养24-48 h，得到活化后的菌种；所述的斜面培养基组成为：葡萄糖15~25g/L，蛋白胨5~15g/L，酵母浸出粉8~15g/L，磷酸铁0.05~0.15 g/L，琼脂 15~25 g/L，溶剂为人工海水，pH 6~7；
（2）将步骤（1）活化培养后的海洋真菌小红酵母Rhodotorula minuta 100101A菌体接种至液体种子培养基中，于25~35℃条件下培养16~48h，得到种子液；所述液体种子培养基组成为：葡萄糖15~25g/L，蛋白胨5~15g/L ，酵母粉8~15 g/L，磷酸铁0.05~0.15 g/L，溶剂为人工海水，pH 6~7；
（3）将步骤（2）种子液以1%~10%的体积比的接种量，移种到液体发酵培养基中，25~35℃、150~250r/min振荡条件下培养14~30天，得到发酵液；所述液体培养基组成为：葡萄糖15~25g/L，蛋白胨5~15g/L，酵母粉8~15 g/L，磷酸铁0.05~0.15 g/L，溶剂为人工海水，pH6~7；
（4）将步骤（3）的发酵液于4℃条件下细胞破碎，离心分离除去菌体，所得发酵液用正丁醇萃取后收集上层萃取液，旋蒸浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏；
（5）将步骤（4）的油状提取物总浸膏以甲醇：水体积比为2：8~10：0的溶液为流动相（10:0时即全部为甲醇），进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一株新的具有抗肿瘤活性的海洋真菌小红酵母（Rhodotorula minuta ）100101A，对肿瘤细胞HepG2（肝癌细胞）、PC-12（神经癌细胞）均具有一定的细胞毒性，为新药筛选提供了基础。
（四）附图说明
图1为斜面培养基上海洋小红酵母100101A的菌体形态；
图2 为光学显微镜（40倍）下海洋小红酵母100101A的菌体形态。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
海洋小红酵母菌株的分离纯化及菌种鉴定
（1）菌株的分离纯化方法为：将采集的海水运用稀释涂布法涂于马铃薯平板培养基上，多次平板划线至出现单菌落，挑取单菌落至新鲜马铃薯平板培养基上，28℃培养48 h，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株。
（2）对筛选获得的菌株100101A进行18sRNA的PCR产物扩增，并与美国国立生物信息中心（NCBI）的基因库中的微生物18sRNA核苷酸序列比对，将其命名为海洋小红酵母Rhodotorula minuta 100101A，提交中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No：M2012289，保藏日期2012年7月18日。
实施例2：海洋小红酵母的菌种活化及大量发酵培养
（1）将实施例1中筛选获得的菌株接种于斜面培养基，于28℃培养48h，得到活化后的菌株，所述斜面培养基按如下组成配制：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，磷酸铁0.1g，琼脂20g，人工海水1L，pH6.0。
（2）活化后的菌株接种于液体种子培养基中，液体种子培养基和发酵培养基配方相同：葡萄糖20g，蛋白胨20gL，酵母粉10g，磷酸铁0.1g，人工海水1L，pH6.0。
（3）将海洋小红酵母菌株液体种子液以10%的体积比的接种量接种到大规模发酵培养基中，在28℃、200r/min摇床恒温培养14d后取出发酵液，在超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎20min，然后于4℃条件8000r/min离心15min分离菌体与发酵液，得小红酵母发酵液。
实施例3：海洋小红酵母发酵液粗提物活性成分的提取
小红酵母发酵液以等体积正丁醇萃取3次后旋蒸浓缩，得发酵液粗提物。粗提物经0.45μm滤膜过滤除杂后过HP-20大孔树脂层析柱，以甲醇-水体积比分别为2:8，4:6，6:4，8:2，10:0五个极性段进行梯度洗脱，各极性段收集洗脱液，旋蒸浓缩挥干分别对应得到A、B、C、D、E共5段极性部位。
实施例4：发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验
具体步骤如下：选取两株肿瘤细胞，分别为肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞和人肝癌HepG2细胞，取对数期的细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板中，培养48h，待测样品（5个极性部位A、B、C、D、E）加入0.1%DMSO10μL溶解后，用无血清的1640细胞培养基稀释，加100μL至试验组中，使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml，5个极性部位A、B、C、D、E的浓度均为200μg/ml，阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基，空白对照组则为无细胞和样品的无血清培养基，依托泊苷（VP-16）作为阳性对照品，每个浓度设5个复孔，肿瘤细胞在CO2培养箱（37℃）培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT20μL，继续培养4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150μL，振荡10min，用酶标仪充分振荡使得MTT紫色产物完全溶解，测490nm的A值，根据公式：抑制率=（A阴性对照组-A空白对照组）-（A样品组-A空白对照组）/(A阴性对照组-A空白对照组)即可求得抑制率。
经MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法体外抗肿瘤实验表明：发酵液粗提物极性部位对肿瘤细胞HepG2 、PC-12均具有一定的细胞毒性，其对PC-12和HepG2两种肿瘤细胞的抑制活性分别如下表所述：
表1：不同极性部位对PC-12的抑制活性
| 极性部位 | A | B | C | D | E |
| 抑制率 | 6.32% | 10.56% | 21.82% | 79.93% | 86.24% |
表2：不同极性部位对HepG2的抑制活性
| 极性部位 | A | B | C | D | E |
| 抑制率 | 5.27% | 12.76% | 38.40% | 75.32% | 91.26% |
结论：
通过以上实验可以看出，发酵液粗提物极性部位对肿瘤细胞HepG2、PC-12具有一定的细胞毒性。D、E对2种肿瘤细胞抑制率均超过50%，其中E组分对PC-12的抑制率为86.24%，且对HepG2抑制率达到91.26%，具有较好的抗肿瘤活性，可根据活性追踪研究开发成新型抗肿瘤药物的先导化合物，具有作为抗肿瘤药物的潜在用途。
Claims (3)
1.一株海洋真菌——小红酵母(Rhodotorula minuta)MNP100101A，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC No：M2012289，保藏日期：2012年7月18日。
2.如权利要求1所述的小红酵母MNP100101A在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗神经癌或肝癌的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述小红酵母MNP100101A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获得：小红酵母MNP100101A接种至液体发酵培养基，于25～35℃、150～250r/min振荡条件下培养14～30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以甲醇：水体积比为2：8～10：0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集甲醇体积浓度80％以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体发酵培养基组成为：葡萄糖15～25g/L，蛋白胨5～15g/L，酵母浸出粉8～15g/L，磷酸铁0.05～0.15g/L，溶剂为人工海水，pH6～7。
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Non-Patent Citations (3)
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| 刘秀莲等.海洋红酵母的研究进展.《生物技术通讯》.2008,第19卷(第2期),293-295. * |
| 周与良.中国海红酵母属( Rhodotorula Harrison) 的种类.《南开大学学报（自然科学）》.1999,第32卷(第4期),全文. * |
| 海洋红酵母的研究进展;刘秀莲等;《生物技术通讯》;20081231;第19卷(第2期);293-295 * |
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