CN102676413B - 对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌及代谢产物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌，其特征在于：它属于硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus，CQT14-24，该菌株从楚科奇海深水区沉积物分离获得，其保藏号为CGMCC No.4607，该菌株的形态特征为：菌落正面灰白色，反面灰色，不透明，与培养基结合紧密，孢子丝直、柔曲，成簇或丛。孢子椭圆形至卵圆形，表面光滑。气丝黑灰色。基丝淡黑灰色。应用效果：CQT14-24菌株发酵物菌液、菌丝均有很强的杀虫活性，获得的化合物只是菌丝提取物其中的一个，还可再分离到其它杀虫化合物，菌株本身具有很好的农药开发潜力。由菌株已获得的吲哚咔唑化合物在发酵物中含量高，杀虫活性强，较容易开展后续的研究工作，有望在短期内创制成一种新杀虫剂。
Description
技术领域
本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海环境放线菌及代谢产物。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年2月25日，保藏编号CGMCC No.4607，分类命名硝孢链霉菌(Streptomycesnitrosporeus)。
背景技术
人类的农业生产总是伴随着对有害生物防治，而长期使用化学农药又带来环境污染的副作用，因此，解决栽培植物化学农药污染问题，一直是世界性关注的热点。我国是农业大国，农产品出口在国民经济中占据重要的比例，近几年来，国际上对农药残留问题日益重视，禁用限用的农药越来越多、残留标准不断提高，每年因化学农药残留问题造成中国农产品出口的直接和间接损失都达几十亿以上。目前，国内的农药生产大多以仿造国外作为主导产品，我国加入WTO后，对具有自主产权的农药的要求也日益提高，而从天然产物中开发高效低毒的新先导化合物是创制新农药的关键。与其他生物源农药相比，微生物源农药以其开发费用低、更容易实现产业化的优势，成为国内外开发新农药的首选资源，寻找微生物源的新结构活性物质或已有化合物的新功能是生物农药创制的重要途径。
为解决陆地生境微生物发现新化合物的几率越来越低的现状，与陆地完全不同的海洋环境尤其是海洋极端环境生存的放线菌受到广泛关注，但受资源限制，有关极地与深海环境微生物产生杀虫物质的研究很少。楚科奇海是北冰洋的边缘海，位于北极圈内，多暴风雪，深水海域同时具备极地和深海2种生境，恶劣的气候迫使生存的生物能产生较为特异的药用物质。海洋生物产生的吲哚咔唑化合物(Staurosporine)曾报道用于抗动物肿瘤，从未有人做过杀虫尝试。
发明内容
本发明的目的是提供一株对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌及代谢产物。发明提供了该放线菌的特征及培养基配方，常规分离获得上清液和菌丝体及分离获得吲哚咔唑(Staurosporine)代谢产物，其人工培养浓缩液或菌丝体与菌液分别经丙酮和乙酸乙酯粗提取，都对小菜娥、菜青虫、蚜虫、美国白蛾等对农业造成较大损失的害虫具有很强的杀伤作用。菌丝体粗提物再经甲醇∶丙酮(1∶1)提取，获得1个吲哚咔唑化合物Staurosporine，该化合物对上述4种害虫也有很强的杀伤作用，上述粗提物与化合物对害虫的杀伤均为胃毒活性。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海环境放线菌，其特征在于该菌株从楚科奇海深水区沉积物分离获得，分类属于硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus，菌株编号：CQT14-24，保藏号为CGMCC No.4607，该菌株的形态特征为：
(1)菌落特征：菌落正面灰白色，反面灰色，不透明，与培养基结合紧密，蔗糖硝酸盐琼脂：气丝丰茂，粉状，白色至浅灰黄色，葡糖天冬素琼脂：气丝浅灰色，基丝浅黄色，无可溶色素，葡萄糖营养琼脂：气丝白色至黄灰色，基丝淡灰色，反面浅褐色，可溶色素浅褐色，葡萄糖酵母麦芽汁琼脂：浅灰黄褐色，基丝灰黄色，反面浅黄褐色至浅褐色；
(2)形态和培养特征：孢子丝直、柔曲，成簇或丛，孢子椭圆形至卵圆形，表面光滑，气丝黑灰色，基丝淡黑灰色；
(3)生理生化特征：明胶液化，牛奶不凝固，淀粉水解，硝酸盐还原，不产生类黑色素，利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、半乳糖、乳糖；不利用山梨醇、D-甘露醇。
所适合的培养基为：可溶性淀粉12-15g，玉米浸汁6-7ml，海泥浸汁300-350ml，KNO3 1-2g，K2HPO4 0.5-0.6g，MgSO4 0.5-0.6g，NaCl 10-15g，KCl 0.03-0.05g，MgCl2 0.23-0.25g，水700-750ml，pH 7.0-8.0，19-23℃，140-150rpm，培养14-15天，常规分离获得上清液和菌丝体。
所述的菌株发酵物即上清液和菌丝体的粗提物对小菜娥、菜青虫、蚜虫、美国白蛾害虫均有强杀虫活性，由发酵物分离纯化获得吲哚咔唑化合物(Staurosporine)，对上述害虫也有杀虫活性。
所述的吲哚咔唑化合物(Staurosporine)通式(1)为：
该化合物Staurosporine为淡黄色粉末；UV254nm下有蓝色暗斑，UV365nm下有蓝紫色荧光，碘化铋钾显色剂显红色；UV(HPLC-DAD)vmax243，291，333，353，370nm；ESIMS m/z 467[M+1]+HRMALDITOFMS m/z 467.2098[M+1]+(calcd for C28H27N4O3，467.2078)。
本发明的应用效果在于：CQT14-24菌株发酵物菌液、菌丝均有很强的杀虫活性，获得的化合物只是菌丝提取物其中的一个，还可再分离到其它杀虫化合物，菌株本身具有很好的农药开发潜力。由菌株获得的吲哚咔唑化合物在发酵物中含量高，杀虫活性强，较容易开展后续的研究工作，有望在短期内创制成一种新杀虫剂。
具体实施例
本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中，本发明的具体技术步骤如下：
实施例1：硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporus CQT14-24菌株分获得、生物学特性及鉴定
T14-24 Streptomyces nitrosporeus于2002年8月分离自北极楚科奇海深海区沉积物，分离获得后，经常规杀虫模型(小菜娥胃毒模型)筛选出来，对其生物学、分子生物学特性进行了研究，并根据上述特性鉴定菌株
形态特征：于改良的高氏1号培养基19℃培养7天，用光学显微镜观察菌体形态。
培养特征：在上述培养基培养7天后，观察菌落形成及颜色。
生理生化特征：参照《放线菌鉴定手册》用常规方法进行。
实验结果：
(1)菌落特征：改良的高氏1号培养基：菌落正面灰白色，反面灰色，不透明，与培养基结合紧密。蔗糖硝酸盐琼脂：气丝丰茂，粉状，白色至浅灰黄色。葡糖天冬素琼脂：气丝浅灰色。基丝浅黄色。无可溶色素。葡萄糖营养琼脂：气丝白色至黄灰色。基丝淡灰色，反面浅褐色。可溶色素浅粉褐色。葡萄糖酵母麦芽汁琼脂：浅灰黄褐色。基丝灰黄色，反面浅黄褐色至浅褐色；
(2)形态和培养特征：孢子丝直、柔曲，成簇或丛。孢子椭圆形至卵圆形，表面光滑。气丝黑灰色。基丝淡黑灰色；
(3)生理生化特征：明胶液化，牛奶不凝固，淀粉水解，硝酸盐还原，不产生类黑色素。利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、半乳糖、乳糖；不利用山梨醇、D-甘露醇；
分子生物学特征：菌株在高氏1号培养基，19℃培养10天，常规方法提取菌株基因组DNA，扩增16SrDNA片段并测序。DNA序列在NCBI，使用BLASTN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在基因库中进行同源性搜索。从Genebank中选择了近缘菌株的16SrDNA基因序列，用DNAMAN软件进行同源性分析，并构建系统发育树。CQT14-24登录号：FJ821473
(4)根据上述结果和分析，将其鉴定为硝孢链霉菌Streptomycesnitrosporus。该菌株已经于菌株已于2011年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4607。
实施例2：硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporus CQT14-24菌株人工培养发酵
经过用常规方法对硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporus CQT14-24菌株生长条件进行优化，选择最适的培养基由如下组成：可溶性淀粉12g，玉米浸汁6ml，海泥浸汁300ml，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NaCl 10g，KCl0.03g，MgCl2 0.23g，水700ml；硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporusCQT14-24菌株的培养条件如下：在摇瓶或发酵罐中，温度控制在19～23℃之间；转速控制在140-150rpm；如果是发酵罐培养，气液比和罐压可以分别控制在1∶1和0.05MPa，pH 7.0-7.5。
在培养过程中，可以采用豆油或泡敌等消泡剂进行消泡。培养时间控制在14～15天之间。此时的CQT14-24培养发酵物，无论菌丝、菌液的粗提物都对测试的4种害虫有强胃毒活性，同时再提取可获得吲哚咔唑化合物Staurosporine。
实施例3：硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus CQT14-24菌株人工培养后的发酵物提取与代谢物分离纯化
上述发酵物，采用常规的分离手段离心或过滤等，将所述发酵液分离为上清液和菌丝体。
(1)菌丝体破壁后加入丙酮(体积1∶2)提取，提取液蒸干，得到菌丝体丙酮粗提取物(简称：丙酮提取物)
(2)菌丝体提取物菌液用常规减压蒸干方法浓缩5倍，为发酵浓缩液(简称：浓缩液)
(3)发酵浓缩液加入乙酸乙酯(体积1∶1)提取，提取液蒸干，得到菌液乙酸乙酯提取物(简称：菌液提取物)
上述粗提物经0.5％的二甲基亚砜DMSO溶解，用于杀虫测试
菌株代谢物分离纯化
(1)菌丝体用甲醇∶丙酮(1∶1)溶液500ml超声提取3次，每次30分钟，提取液过滤以后蒸干，得到菌丝体提取物
(2)菌丝体提取物上硅胶柱柱层析，用石油醚/丙酮/甲醇梯度洗脱，收集丙酮∶甲醇(5∶1)洗脱部分。
(3)将洗脱部分用甲醇溶解后，凝胶色谱Sephadex LH-20上样，再用100％甲醇洗脱，采用薄层色谱检测洗脱组分，制备得到吲哚咔唑化合物Staurosporine
实施例4：吲哚咔唑化合物结构鉴定
本实施例将获得的Staurosporine进行分析和鉴定，其结果如下：
Staurosporine为淡黄色粉末；UV254nm下有蓝色暗斑，UV365nm下有蓝紫色荧光，碘化铋钾显色剂显红色；UV(HPLC-DAD)vmax243，291，333，353，370nm；ESIMS m/z 467[M+1]+HRMALDITOFMS m/z 467.2098[M+1]+(calcd for C28H27N4O3，467.2078)。1H、13C NMR数据，见表1。
表1：Staurosporine的1H、13C NMR数据表(DMSO-d6)
实施例5：硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus CQT14-24菌株粗提物与化合物杀虫测试
上述粗提物与吲哚咔唑化合物Staurosporine经0.5％的二甲基亚砜DMSO溶解，用于杀虫测试
甘蓝叶适量，分别浸入在测液中浸泡约20秒后取出晾干，置于培养盒中，试虫饥饿7-8小时置于菜叶上饲养，每个处理20头试虫，重复3次，用甘蓝叶浸入对应的丙酮、无菌发酵浓缩液、乙酸乙酯、0.5％DMSO作为对照，观察，记录48-96小时的实验数据。
试验证明(表2)，硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus CQT14-24菌株提取物对所试害虫具有强杀虫活性，所有对照死亡率为2.7％-5.3％，最高不超过5.3％，各种提取物的致死率介于78.1％-98.8％，其中活性最好的为发酵浓缩液，致死率均超过90％。
表2CQT14-24菌株提取物对不同害虫致死率(％)
尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (4)
1.对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌，其特征在于它属于硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus，CQT14-24，该菌株从楚科奇海深水区沉积物分离获得，其保藏号为CGMCC No.4607，该菌株的形态特征为：
(1)菌落特征：菌落正面灰白色，反面灰色，不透明，与培养基结合紧密，蔗糖硝酸盐琼脂：气丝丰茂，粉状，白色至浅灰黄色，葡糖天冬素琼脂：气丝浅灰色，基丝浅黄色，无可溶色素，葡萄糖营养琼脂：气丝白色至黄灰色，基丝淡灰色，反面浅褐色，可溶色素浅褐色，葡萄糖酵母麦芽汁琼脂：浅灰黄褐色，基丝灰黄色，反面浅黄褐色至浅褐色;
(2)形态和培养特征：孢子丝直、柔曲，成簇或丛，孢子椭圆形至卵圆形，表面光滑，气丝黑灰色，基丝淡黑灰色；
(3)生理生化特征：明胶液化，牛奶不凝固，淀粉水解，硝酸盐还原，不产生类黑色素，利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇、半乳糖、乳糖；不利用山梨醇、D-甘露醇。
2.根据权利要求1所述的对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌，其特征在于，所适合的培养基为：可溶性淀粉12-15g，玉米浸汁6-7ml，海泥浸汁300-350ml，KNO31-2g，K2HPO40.5-0.6g，MgSO40.5-0.6g，NaCl10-15g，KCl0.03-0.05g，MgCl20.23-0.25g，水700-750ml，pH7.0-8.0，19-23℃，140-150rpm，培养14-15天，常规分离获得上清液和菌丝体。
3.根据权利要求2所述的对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海环境放线菌，其特征在于：所述的菌株发酵物即上清液和菌丝体的粗提物对小菜娥、菜青虫、蚜虫、美国白蛾害虫均有强杀虫活性，由发酵物分离纯化获得吲哚咔唑化合物(Staurosporine)，对上述害虫也有强杀虫活性。
4.根据权利要求3所述的对多种害虫具有强杀伤作用的极地与深海生境放线菌，其特征在于：所述的吲哚咔唑化合物(Staurosporine)通式(1)为：
该化合物Staurosporine为淡黄色粉末；UV254nm下有蓝色暗斑，UV365nm下有蓝紫色荧光，碘化铋钾显色剂显红色；UV(HPLC-DAD)vmax243，291，333，353，370nm；ESIMS m/z467[M+1]+HRMALDITOFMS m/z467.2098[M+1]+(calcd for C28H27N4O3，467.2078)。
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