CN101691557A - 一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用。本发明通过抑菌圈法从近洋海泥中分离得到一株海洋放线菌，其代谢物对青枯病菌具有显著的抑制作用。将该海洋放线菌命名为阳江链霉菌，于2009年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167。本发明还公开了此海洋放线菌中具有对青枯病菌具有抑制作用的代谢物的制备方法。该制备方法通过控制所述阳江链霉菌的发酵条件、对菌丝体浸提、再用硅胶柱层析对发酵上清液和菌丝体浸提液进行分离得到。该制备方法简单易行，成本低。应用此代谢物制备得到的防治青枯病的制剂效果好，稳定性好，属低毒低残留农药。

Description

一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物农药研究领域，特别涉及一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用。

背景技术

花生是我国重要的经济作物和油料作物，青枯病(Pseudomonassolanacearum)是花生上的毁灭性病害。我国花生青枯病发病面积约300khm2，华南地区是青枯病的重点发病区，发病率通常在10～20％，尤以苗期最为严重，发病严重的损失达70％以上。目前还没有有效的农药可用，防治该病最经济有效的途径是培育和种植抗青枯病的花生品种并采用生物防治等新方法，因此寻找防治青枯病新活性生物代谢产物是重要的防治途径之一。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种海洋放线菌，其代谢物具有显著的抑制青枯病菌的作用。

本发明的另一目的在于提供上述海洋放线菌的代谢物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述代谢物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种海洋放线菌，名称为阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)，于2009年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167；

所述阳江链霉菌在高氏一号培养基上生长良好、气丝II 61′灰色，基丝鲛青，孢子丝颜色灰色，产淡黄色素；在光学显微镜下观察，基丝不断裂、气生菌丝形成孢子丝，孢子丝直、柔曲。在扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，轴长约0.6～0.7μm，径长约0.9～1.0μm；孢子表面光滑、不带刺、无疣、链生；

所述阳江链霉菌的16S rDNA序列如SEQ ID：No.1所示。

所述阳江链霉菌的代谢物的制备方法，包含以下步骤：

(1)阳江链霉菌的培养

使用斜面培养基于28～30℃培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

所述培养基为改良的高氏一号培养基，其具体组成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，海水精3g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O1.03g，琼脂16g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28～30℃下160～180rpm培养48～60h得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比8～10％的接种量接至发酵培养基中，于28～30℃以300～400rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵90～96小时；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉30g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(3)对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，得到上清液和菌丝体；

B、上清液用乙酸乙酯萃取至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用80～90％乙醇溶液浸提6小时以上，80～90％乙醇溶液的加入量为菌丝体质量的2～4倍，浸提至少2次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取浸提液的水层至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并，得到粗提物，接着通过硅胶柱(200～300目)层析进行分离，洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5；每10g粗提物使用40～50g硅胶进行层析，洗脱时间设置为1180分钟，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，取第17～25收集单位；

E、接着，将第17～25收集单位合并，得SA组分，通过硅胶柱层析(200～300目)分离，洗脱液为石油醚和丙酮按体积比为1∶1.7混合；每1.25g SA组分使用5～6g硅胶进行层析，流速为2mL/min，每50mL为一收集单位，第二收集单位即为对花生青枯病菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物。

步骤(3)A中，所述的离心的优选条件为4800rpm离心10分钟；

步骤(3)B中，所述的萃取优选为乙酸乙酯与上清液按体积比1∶1混合后进行萃取；

步骤(3)C中，所述的浸提优选于30℃～50℃下进行；所述的萃取优选为乙酸乙酯与浸提液按体积比1∶1混合后进行萃取。

所述阳江链霉菌的代谢物应用于制备防治青枯病的制剂；

所述防治青枯病的制剂包含以下成分：所述阳江链霉菌的代谢物、乳化剂和甲醇按质量比(1.0～1.5)∶(0.5～1.0)∶(3.5～4.0)混匀即可得到所述防治青枯病的制剂；

所述乳化剂优选为吐温-80；

所述防治青枯病的制剂应用于防治青枯病，优选为防治花生青枯病、番茄青枯病和辣椒青枯病，更优选为防治花生青枯病。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明所述阳江链霉菌的代谢物具有抑制青枯病，对于花生青枯病的效果更为明显。

(2)本发明的制剂为乳油，配制简单，易于操作，成本合理，制剂的乳化型和稳定性较好，属低毒低残留农药。

(3)本发明所述的防治青枯病的制剂稀释1000倍对青枯病的防治效果在70％以上。

附图说明

图1是实施例1中的阳江链霉菌放大200倍的形态图。

图2是实施例1中的阳江链霉菌在电子显微镜下的形态图。

图3为实施例2中阳江链霉菌的代谢物的制备流程图。

图4为实施例2利用硅胶柱层析制备阳江链霉菌的代谢物的流程图。

图5为实施例2制备的阳江链霉菌的代谢物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

从近海的海泥中分离的2000多种放线菌中采用抑菌圈法筛选得到菌株阳江链霉菌对花生青枯病菌有明显的抑制作用，对该菌株进行分类鉴定，具体如下：

(一)形态观察

将菌株阳江链霉菌作插片培养，观察基内菌丝、气生菌丝及是否生成孢子丝；孢子丝的形态；有无孢子形成；基质菌丝是否断裂等。分别在7d、14d、21d和28d取样制片，用光学显微镜和扫描电镜观察。

在高氏一号培养基上生长良好、气丝II 61′灰，基丝鲛青，孢子丝颜色灰色，产淡黄色素。在光学显微镜下观察，基丝不断裂、气生菌丝形成孢子丝，孢子丝直、柔曲。在扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，轴长约0.6～0.7μm，径长约0.9～1.0μm；孢子表面光滑、不带刺、无疣、链生(如图1和图2所示)。

(二)培养特征：将菌株阳江链霉菌接种在高氏一号培养基、克氏一号培养基、察氏培养基、葡萄糖天门冬素培养基、淀粉琼脂、淀粉铵、马铃薯块上。于28℃培养，分别于7d、14d、28d观察菌株在各种培养基上的培养特征、生长情况及颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据。如表1所示。

表1菌株阳江链霉菌的培养特征

注：+++、++、+分别表示生长的强弱程度：+++表示生长很好，++表示生长良好，+表示可以生长

(三)生理生化特征

参考Lechevalie的方法(Lechevalier et al，1980)测定菌株的明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、纤维素水解、碳源利用等特性。

菌株阳江链霉菌能使明胶较快液化；水解淀粉能力较强；在纤维素上不生长；既不能使牛奶凝固也不能胨化；产生黑色素。对葡萄糖、甘露醇、肌醇利用最好，蔗糖次之，对棉子糖利用较差，不能利用木糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖。

(四)细胞壁化学组成分析

采用微晶纤维素薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型分析。菌株全细胞水解液含L，L-DAP(左旋)、甘氨酸，丙氨酸和天门冬氨酸，含有核糖和葡萄糖，无特征性糖，细胞壁组份属I型。

(五)16S rDNA序列测定及分析

菌株阳江链霉菌的16S rDNA核苷酸全序列总长为1428bp，序列如下所示：

TTACACATGC AAGTCGAACG ATGAACCTCC TTCGGGAGGG GATTAGTGGC GAACGGGTGA

GTAACACGTG GGCAATCTGC CCTGCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC

CGGATACGAC CACTGAGGGC ATCCTCGGTG GTGGAAAGCT CCGGCGGTGC AGGATGAGCC

CGCGGCCTAT CAGCTTGTTG GTGGGGTGAT GGCCTACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC

CTGAGAGGGC GACCGGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG

CAGTGGGGAA TATTGCACAA TGGGCGAAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA

CGGCCTTCGG GTTGTAAACC TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GAAAGTGACG GTACCTGCAG

AAGAAGCGCC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGTAGGGCG CGAGCGTTGT

CCGGAATTAT TGGGCGTAAA GAGCTCGTAG GCGGCTTGTC GCGTCGGTTG TGAAAGCCCG

GGGCTTAACC CCGGGTCTGC AGTCGATACG GGCAGGCTAG AGTTCGGTAG GGGAGATCGG

AATTCCTGGT GTAGCGGTGA AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAAGGCGG

ATCTCTGGGC CGATACTGAC GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA

CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGTTGGGC ACTAGGTGTG GGCGACATTC CACGTCGTCC

GTGCCGCAGC TAACGCATTA AGTGCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC

AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC

GAAGAACCTT ACCAAGGCTT GACATACACC GGAAAGCATC AGAGATGGTG CCCCCCTTGT

GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG

TCCCGCAACG AGCGCAACCC CTGTCCTGTG TTGCCAGCGG GTCATGCCGG GGACTCACAG

GAGACCGCCG GGGTCAACTC GGAGGAAGGT GGGGACGACG TCAAGTCATC ATGCCCCTTA

TGTCTTGGGC TGCACACGTG CTACAATGGC CGGTACAATG AGCTGCGATA CCGCGAGGTG

GAGCGAATCT CAAAAAGCCG GTCTCAGTTC GGATTGGGGT CTGCAACTCG ACCCCATGAA

GTCGGAGTCG CTAGTAATCG CAGATCAGCA TTGCTGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG

TACACACCGC CCGTCACGTC ACGAAAGTCG GTAACACCCG AAGCCGGTGG CCCAACCCTT

GGGAGGGAGC CGTCGAAGGT GGGACTGGCG ATTGGGACGA AGTCGTAA

根据系统发育树及形态特征比较分析，鉴定该菌株为一新种，命名为阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)。

所述菌株于2009年7月31日保藏于位于中国武汉的中国典型生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167。

实施例2

制备对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物，如图3和4所示：

(1)阳江链霉菌的培养

使用斜面培养基于28℃培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

所述培养基为改良的高氏一号培养基，组成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，海水精3g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，琼脂16g，pH值为7.2～7.4，水1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，30℃下160rpm培养48h，得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比8％的接种量接至发酵培养基中，于30℃以300rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵96小时；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉30g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(3)对青枯菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，4800rpm离心10分钟，得到上清液和菌丝体；

B、上清液与乙酸乙酯按体积比1∶1混合后进行萃取，萃取3次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用相当于菌丝体质量2倍的90％乙醇溶液于室温浸提6小时，浸提3次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取萃取浸提液的水层3次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并。称取粗提物10g，进行硅胶柱(200～300目)层析，硅胶的用量为40g，洗脱液为石油醚和丙酮按不同比例混合的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5，，每梯度洗脱体积为1.5L，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，共收集了59单位。生物测定发现19-57组分对青枯菌具有活性，采用展开剂(石油醚∶丙酮∶乙酸乙酯∶氯仿＝1∶1∶1∶1)点板发现：17-25号组分相似(S_A)，26-43组分相似(S_B)，44-57组分相似(S_C)。活性检测发现S_A对青枯菌活性最大。

E、接着，将组分系列(S_A)1.25g进行硅胶柱层析(200～300目)，硅胶的用量为5g，洗脱液为石油醚和丙酮1∶1.7，流速为2mL/min，每50mL为一收集单位，共收集了3单位。生测发现：第二收集单位对花生青枯病菌活性最强，即为对青枯菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物。

F、通过高效液相色谱方法对制备得到的阳江链霉菌的代谢物进行分析，可知有效的抑制青枯病菌的成分M在此阳江链霉菌的代谢物中为主要成分，见图5；色谱条件：色谱柱为SunFireTM C18反相硅胶柱，甲醇∶水＝80∶20，流速5mL/min，波长254nm。

高效液相色谱分离代谢物得到主要活性成分M，M对花生青枯菌的MIC(最小抑制浓度)为3.91mg/ml。

实施例3

制备对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物：

(1)阳江链霉菌的培养

使用改良的高氏一号培养基配制成的斜面培养基于30℃培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28℃下180rpm培养60h，得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比10％的接种量接至发酵培养基(同实施例2)中，于28℃以400rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵90小时；

(3)对青枯菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，4800rpm离心10分钟，得到上清液和菌丝体；

B、上清液与乙酸乙酯按体积比1∶1混合后进行萃取，萃取3次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用相当于菌丝体质量4倍的80％乙醇溶液于室温浸提6小时，浸提3次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取萃取浸提液的水层3次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并。称取粗提物10g，进行硅胶柱(200～300目)层析，硅胶的用量为50g，洗脱液为石油醚和丙酮按不同比例混合的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5，每梯度洗脱体积为1.5L，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，共收集了59单位。合并第17-25号收集单位，为S_A组分。

E、接着，将组分系列(S_A)1.25g进行硅胶柱层析(200～300目)，硅胶的用量为6g，洗脱液为石油醚和丙酮1∶1.7，流速为2mL/min，每50mL为一收集单位，共收集了3单位。生测发现：第二收集单位对花生青枯病菌活性最强，即为对青枯菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物。

F、通过高效液相色谱方法对制备得到的阳江链霉菌的代谢物进行分析，测得有效的抑制青枯病菌的成分M在此阳江链霉菌的代谢物中为主要成分；色谱条件：色谱柱为SunFireTM C18反相硅胶柱，甲醇∶水＝80∶20，流速5mL/min，波长254nm。

实施例4

防治青枯病的制剂的制备：实施例2制备的阳江链霉菌的代谢物1.5g，吐温-800.5g，甲醇4.0g混合，搅拌均匀即可。

制备的防治青枯病的制剂对花生青枯病的盆栽防治试验：采用沙土培养的方法种植种苗；选用一次性塑料杯，内放沙土，每杯选择两颗饱满的种子播下，待其发芽，出现3-4片叶子时，进行盆栽试验；试验时，伤根法浸泡花生青枯病菌液6小时以上，青枯菌液浓度为10⁹cfu·mL^-1，再移植入种植盆中，每盆移植两棵苗，并添加5ml花生青枯病菌液；将制备的制剂用水分别稀释1000倍、2000倍和4000倍，采用灌根法处理，每盆淋药液30ml左右。每组处理重复10盆，共20棵苗。处理后7、10天观察发病情况，计算防治效果，CK表示空白组，结果如表2所示。制备的制剂对辣椒青枯病和番茄青枯病的盆栽防治试验与花生青枯病一致，结果如表2所示。

从表2中可以看出，本发明所述的阳江链霉菌的代谢物制备的防治青枯病的制剂对青枯病的防治效果良好。

实施例5

防治青枯病的制剂的制备：实施例3制备的阳江链霉菌的代谢物1.0g，吐温-801.0g，甲醇3.5g混合，搅拌均匀即可。测试方法同实施例4，结果显示本实施例制备的防治青枯病的制剂防治效果良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>广东省农业科学院植物保护研究所仲恺农业工程学院

<120>一种海洋放线菌及其代谢物的制备方法与应用

<130>1

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1428

<212>DNA

<213>阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)

<400>1

ttacacatgc aagtcgaacg atgaacctcc ttcgggaggg gattagtggc gaacgggtga  60

gtaacacgtg ggcaatctgc cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac  120

cggatacgac cactgagggc atcctcggtg gtggaaagct ccggcggtgc aggatgagcc  180

cgcggcctat cagcttgttg gtggggtgat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc  240

ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag  300

cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga  360

cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg gtacctgcag  420

aagaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg cgagcgttgt  480

ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcttgtc gcgtcggttg tgaaagcccg  540

gggcttaacc ccgggtctgc agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag gggagatcgg  600

aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg  660

atctctgggc cgatactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata  720

ccctggtagt ccacgccgta aacgttgggc actaggtgtg ggcgacattc cacgtcgtcc  780

gtgccgcagc taacgcatta agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc  840

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc  900

gaagaacctt accaaggctt gacatacacc ggaaagcatc agagatggtg ccccccttgt  960

ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag  1020

tcccgcaacg agcgcaaccc ctgtcctgtg ttgccagcgg gtcatgccgg ggactcacag  1080

gagaccgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta  1140

tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg agctgcgata ccgcgaggtg  1200

gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa  1260

gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg  1320

tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaaccctt  1380

gggagggagc cgtcgaaggt gggactggcg attgggacga agtcgtaa               1428

Claims (10)

1.一种海洋放线菌，其特征在于：所述海洋放线菌命名为阳江链霉菌(Streptomyces yangjiangensis)，于2009年7月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209167。

2.权利要求1所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)阳江链霉菌的培养

使用改良的高氏一号培养基制备斜面培养基，于28～30℃在斜面培养基上培养阳江链霉菌，直至菌丝和孢子生长成熟；

所述的改良的高氏一号培养基，其具体组成如下：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，海水精3g，K₂HPO₄3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄7H₂O 1.03g，琼脂16g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(2)阳江链霉菌的发酵

A、阳江链霉菌种子液的制备：将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28～30℃下160～180rpm培养48～60h得到阳江链霉菌种子液；

B、阳江链霉菌的发酵：将阳江链霉菌种子液以体积百分比8～10％的接种量接至发酵培养基中，于28～30℃以300～400rpm的转速、10～15L/min的空气通气量进行发酵90～96小时；

所述的发酵培养基组成为：酵母粉30g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO₃2g，KNO₃ 2g，K₂HPO₄3H₂O 0.66g，FeSO₄·7H₂O 0.02g，MgSO₄7H₂O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水定容至1000ml，于115～121℃灭菌30min；

(3)对青枯病有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物的制备

A、将发酵液离心，得到上清液和菌丝体；

B、上清液用乙酸乙酯萃取至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物I；

C、菌丝体用体积百分比为80～90％乙醇溶液浸提6小时以上，体积百分比为80～90％乙醇溶液的加入量为菌丝体质量的2～4倍，浸提至少2次，将浸提液合并，减压浓缩至没有乙醇，得到浸提液的水层；接着用乙酸乙酯萃取浸提液的水层至少2次，取萃取液，减压浓缩至没有乙酸乙酯，得到粗提物II；

D、粗提物I和粗提物II合并，得到粗提物，接着通过硅胶柱层析进行分离，洗脱液为石油醚和丙酮的混合液，极性由小至大洗脱，石油醚和丙酮的洗脱起始体积比为5∶1，结束体积比为1∶5；每10g粗提物使用40～50g硅胶进行层析，洗脱时间设置为1180分钟，流速为5mL/min，每100mL为一收集单位，取第17～25收集单位；

E、接着，将第17～25收集单位合并，得S_A组分，通过硅胶柱层析分离，洗脱液为石油醚和丙酮按体积比为1∶1.7混合；每1.2g S_A组分使用5～6g硅胶进行层析，流速为2mL/min，每50mL为一收集单位，第二收集单位即为对花生青枯病菌有显著抑制作用的阳江链霉菌的代谢物；

所述的硅胶柱的规格为200～300目。

3.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)A中，所述的离心的条件为4800rpm离心10分钟。

4.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)B中所述的萃取为乙酸乙酯与上清液按体积比1∶1混合后进行萃取。

5.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)C中所述的浸提于30℃～50℃下进行。

6.根据权利要求2所述海洋放线菌的代谢物的制备方法，其特征在于：步骤(3)C中所述的萃取为乙酸乙酯与浸提液按体积比1∶1混合后进行萃取。

7.一种阳江链霉菌的代谢物，通过权利要求2～6任一项所述的制备方法进行制备。

8.一种防治青枯病的制剂，包含权利要求7所述的阳江链霉菌的代谢物。

9.权利要求8所述防治青枯病的制剂的制备方法，其特征在于：所述阳江链霉菌的代谢物、乳化剂和甲醇按质量比(1.0～1.5)∶(0.5～1.0)∶(3.5～4.0)混匀，得到所述防治青枯病的制剂。

10.权利要求8所述防治青枯病的制剂应用于防治青桔病。

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