CN102174440B - 一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用。该抗生链霉菌是从2000多种海洋放线菌中筛选出的均对辣椒疫霉病菌、黄瓜疫霉菌、黄瓜炭疽病和辣椒炭疽病菌具有较好抑制活性的菌株，名称为抗生链霉菌H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010364。从该菌株中分离得到具有抑菌活性的抗霉素A18(1)，分子式为C28H41N2O9，分子量为549.3。将该抗霉素A18(1)和乳化剂、甲醇混合得到稳定性较好的生物制剂。该生物制剂喷施后12天，施用倍数500×防治辣椒疫病的效果为90.00％，防治黄瓜疫病的效果为86.67％，防治辣椒炭疽的效果为86.67％，防治黄瓜炭疽的效果为90.00％。
Description
技术领域
本发明属于生物农药研究领域，特别涉及一种抗生链霉菌及其活性产物制成的生物制剂与应用。
背景技术
化学农药因其能快速有效地抑制或杀死植物病原菌，所以人们长期以来主要依靠化学农药防治植物病害，也使得病原菌的抗药性显著提高，从而导致化学农药的防治效果降低甚至失效。在实际生产中，应结合不同的手段进行综合防控，减少对化学农药的依赖程度，延缓化学农药的抗药性产生。
农用抗生素是一类高效、广谱、无污染的农药。据统计世界上67％的抗生素产品都来自微生物，而其中2/3又来自放线菌。由于海洋放线菌在生理和遗传背景上的特殊性，必定能产生结构新颖的代谢物质，因此海洋放线菌代谢物的研究越来越受到人们的重视。
发明内容
本发明的首要目的旨在探寻生物农药的新来源，提供一种抗生链霉菌。
本发明的另一目的在于提供上述抗生链霉菌的活性产物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供通过上述制备方法得到的抗生链霉菌的活性产物及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗生链霉菌(Streptomycesantibioticu)，名称为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticu subsp.antialbonostocticus)H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(湖北武汉大学内)，保藏编号为CCTCC M 2010364；
所述的抗生链霉菌H74-18是从近海海泥和红树林分离的2000多种海洋放线菌中筛选出的具有对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、黄瓜疫霉菌(Phytophthora cucumisativus)、黄瓜炭疽病(Colletorichum cucumisativus)和辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)具有较好抑制活性的菌株。
所述的抗生链霉菌H74-18具有以下特征：①高氏一号培养基上基内菌丝和气生菌丝丰茂，基丝不断裂，孢子丝着生在气生菌丝上，孢子丝柔曲，孢子光滑呈圆柱形，成熟的孢子链孢子个数在8个左右，没有观察到孢囊、孢核等结构；②在天门冬素、马铃薯块、高氏合成一号、淀粉琼脂、克氏等5种固体培养基上均生长良好，形成丰富的气生菌丝和基内菌丝，气丝灰白至暗灰色，基丝黄至棕红色，但在察氏、淀粉铵培养基上只有少量白色气丝生长，色素在高氏合成一号固体培养基、马铃薯块上有部分扩散，在天门冬素、淀粉琼脂上不扩散，在其它培养基不产色素；③生理生化为：能使明胶液化，能水解淀粉，在纤维素上不生长，牛奶不胨化，也不液化，不产黑色素，能利用葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、棉子糖和肌醇；④全细胞水解液含L，L-DAP(左旋)、甘氨酸，丙氨酸和天门冬氨酸，含有核糖和葡萄糖，无特征性糖(糖型C)，细胞壁组份属I型；⑤16S rDNA序列结果在GeneBank中进行同源性比较，发现菌株H74-18与Streptomyces antibioticus EF063450处于同一分枝，亲缘关系最近，同源性高达99.9％，但其在培养特征、生理生化特征上与Streptomyces antibioticus有较大差异，据其采集地点为新会崖门大桥，故鉴定菌株H74-18为抗生链霉菌崖门亚种(Streptomyces antibioticus subsp.yamensis)。
一种抗霉素A18(1)，从上述抗生链霉菌H74-18中分离得到，分子式为C28H41N2O9，分子量为549.3，结构式如式I所示：
式I
其中R1为-CH2CH2CH2CH2CH3；
R2为-CH(CH3)CH(CH3)CH3；
所述的抗霉素A18(1)的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗生链霉菌H74-18的活化；
(2)抗生链霉菌H74-18的发酵，具体为：
①种子液的制备：将步骤(1)活化的抗生链霉菌H74-18接种到培养基中，28℃下160～180rpm摇瓶培养48h，得到种子液；
②发酵液的制备：将种子液以体积百分比10％的接种量接至30L发酵罐中培养，初始pH值7.0～7.2，发酵温度为28℃，搅拌速度为300r/min，培养72h；
所述的发酵培养基组成为：酵母粉25g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min；
(3)抗霉素A18(1)的提取
①发酵液8000r/min离心30min，收集菌体；菌丝体在pH值为3.0、体积百分比70％的乙醇中振荡24h，然后用乙酸乙酯萃取；萃取液减压浓缩得到粗提物；
②利用规格200-300目的硅胶柱对粗提物进行层析，采用干法装柱，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，梯度比例为体积比5∶1、3∶1、1∶1和1∶3，每个梯度为1000mL，洗脱速度为10mL/min，每100mL收集一个样品，分部收集洗脱液，得到40个组份，将第16～36组分合并，得到洗脱液A；
③将洗脱液A用按体积比3∶1混合的石油醚/甲醇混合液萃取，得到去除大部分油脂后的物质，再过规格为50～100目的葡聚糖柱，甲醇∶氯仿梯度洗脱，梯度依次为体积比9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、2∶1和4∶1，每浓度梯度为500mL，洗脱的总体积是3500mL，流速5mL/min，每100mL为一个组分；将第10至15组分合并，再用规格为200-300目的硅胶柱层析分离，洗脱剂为体积比5∶1混合的石油醚/丙酮溶液，总体积为200mL，10mL收集一份，总共收集20个组分，将第10～11组分合并为组分E；
④将步骤③得到的组分E继续用规格为200-300目的硅胶柱分离，洗脱条件为按体积比5∶1混合的石油醚/丙酮溶液，洗脱总体积为200mL，每20mL收集一份，得到10个组份；
⑤将步骤④得到的活性组份4减压浓缩，得白色晶体S，将S溶解于按体积比1∶1混合得到的石油醚/丙酮溶液中，置4℃冰箱重结晶。
⑦采用高效液相色谱对组份S进行分离纯化，收集峰面积大的馏份，得到抗霉素A18(1)；色谱条件：色谱柱为C18反相硅胶柱，甲醇/水＝50∶50；流速：1.0mL/min；吸收波长：320nm。
步骤(1)中所述的活化的方式优选为使用斜面培养基于28℃培养菌株H74-18，直至菌丝和孢子生长成熟(需时为5-7天)；
所述的培养基优选为改良的高氏一号培养基，组成如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O1.03g，琼脂16g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min；
所述抗霉素A18(1)应用于制备防治辣椒疫病、黄瓜疫病、黄瓜炭疽病和辣椒炭疽病的生物制剂。
所述的生物制剂为抗霉素A18(1)粉末、乳化剂和甲醇按质量比2∶5∶43混合均匀得到；乳化剂优选为土温-80。
所述的生物制剂应用于防治辣椒疫病、黄瓜疫病、黄瓜炭疽病或辣椒炭疽病中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的活性组分S-M为抗霉素(antimycin)A18(1)，是一种新结构化合物；
(2)本发明的生物制剂为乳油，配制简单，易于操作，成本合理，生物制剂的乳化型和稳定性较好，属低毒低残留农药。
(3)本发明所述抗生链霉菌崖门亚种的代谢物制剂对4种蔬菜真菌病害防治效果较好。喷施后12天，施用倍数500X防治辣椒疫病的效果为90.00％，防治黄瓜疫病的效果为86.67％，防治辣椒炭疽的效果为86.67％，防治黄瓜炭疽的效果为90.00％。
附图说明
图1是本发明的抗生链霉菌H74-18放大400倍的形态。
图2是本发明的抗生链霉菌H74-18电子显微镜8000倍的形态。
图3为本发明制备的抗生链霉菌H74-18的活性产物S-M的液相制备色谱图。
图4组分S-M的1H-NMR图。
图5组分S-M的13C-NMR图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1拮抗放线菌的筛选
从广东省近海海泥中分离的2000多种放线菌，筛选对辣椒疫霉病菌和辣椒炭疽病菌具有较好抑制活性的菌株。
筛选方法采用对峙培养法。
①辣椒疫霉病菌(辣椒抗疫病鉴定方法初探，天津农业科学，2010，16(5)：100-103)接种6mm菌块至V8固体培养基，辣椒炭疽病菌(辣椒炭疽病3病原核糖体基因ITS区的序列测定及分析，西南农业学报，2007，20(6)：1234-1236)接种6mm菌块至PDA固体培养基平皿上，26-28℃培养。V8固体培养基组分为美国进口V8蔬菜汁100mL，CaCO3 0.2g，琼脂18g，水定容至1000mL；PDA固体培养基为马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂18g，水定容至1000mL。
②待测放线菌接种至改良的高氏一号培养基平皿上，每种放线菌接种一个平皿，28-30℃培养7天，打孔器取6mm的菌块，放在距病菌琼脂块3cm处，26-28℃培养3-4天，观察代测放线菌对病菌的抑制情况。如待测放线菌对病菌有抑制作用，则有明显的抑菌带；如代测放线菌对病菌无抑制作用，则无抑菌带。
所述②改良的高氏一号培养基，组成如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，琼脂16g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min；
对峙培养法筛选结果为：放线菌H74-18对辣椒疫霉病菌和辣椒炭疽病菌具有很好的抑制活性，抑菌带分别为16.8mm和15.8mm。
实施例2放线菌H74-18分类鉴定
(一)形态观察
将该菌株作插片培养，观察基内菌丝、气生菌丝及是否生成孢子丝；孢子丝的形态；有无孢子形成；基质菌丝是否断裂等。分别在第7d、14d、21d和28d取样制片，用光学显微镜和扫描电镜观察(如图1和图2所示)。
插片培养的结果为：在高氏一号培养基上基内菌丝和气生菌丝丰茂，基丝不断裂，孢子丝着生在气生菌丝上，孢子丝柔曲，孢子光滑呈圆柱形，成熟的孢子链孢子个数在8个左右，没有观察到孢囊、孢核等结构。
(二)培养特征
将该菌株分别接种在高氏一号培养基、克氏一号培养基、察氏培养基、天门冬素培养基、淀粉琼脂、淀粉铵和马铃薯块上。于28℃培养，分别于7d、14d、28d观察菌株在各种培养基上的培养特征、生长情况及颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据。如表1所示。
表1培养特征
(三)生理生化特征
参考Lechevalie的方法(Lechevalier et al，1980)测定菌株的明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、纤维素水解、碳源利用等特性。
该菌株能使明胶液化，能水解淀粉，在纤维素上不生长，牛奶不胨化，也不液化，不产黑色素，能利用葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、蔗糖、棉子糖和肌醇。
(四)细胞壁化学组成分析
采用微晶纤维素薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型分析。该菌株全细胞水解液含L，L-DAP(左旋)、甘氨酸，丙氨酸和天门冬氨酸，含有核糖和葡萄糖，无特征性糖(糖型C)，细胞壁组份属I型。
(五)16S rDNA序列测定及分析
采用细菌通用16S rRNA扩增引物序列27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rRNA基因片段，扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序后，将所测的16SrDNA序列(如下所示，总长为1440bp)在GeneBank中进行同源性比较，发现该菌株与Streptomyces antibioticus EF063450处于同一分枝，亲缘关系最近，同源性高达99.9％，但其在培养特征、生理生化特征上与Streptomyces antibioticus有较大差异，据其采集地点为新会崖门大桥，故鉴定菌株H74-18为抗生链霉菌崖门亚种(Streptomyces antibioticus subsp.yamensis)。
ATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTCTTGCAGGCATCTGTGAGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAGGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTYGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGTCCTTCGGGATGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCAGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAA
将该菌株命名为抗生链霉菌H74-18，于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(湖北武汉大学内)，保藏编号为CCTCC M 2010364。
实施例2
制备抗生链霉菌H74-18的活性产物及结构鉴定，该活性产物对辣椒疫病菌等有明显抑制作用，具体过程如下：
(1)抗生链霉菌H74-18的培养
使用斜面培养基于28℃培养抗生链霉菌H74-18，直至菌丝和孢子生长成熟(需时为5-7天)；
所述培养基为改良的高氏一号培养基，组成如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，琼脂16g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min。
(2)抗生链霉菌H74-18的发酵
①种子液的制备：用接种环刮取斜面上的菌丝和孢子接入500mL的三角瓶(内装100mL发酵培养基)，每个三角瓶接入2环，28℃下160～180rpm培养48h，得到种子液；
②发酵液的制备：将种子液以体积百分比10％的接种量接至30L发酵罐(装液量为体积百分比70％)中培养，初始pH值7.0～7.2，发酵温度为28℃，搅拌速度为300r/min，培养72h；
所述的发酵培养基组成为：酵母粉25g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO32g，KNO3 2g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，pH值为7.2～7.4，水1000ml，于115～121℃灭菌30min。
(3)活性产物的提取(辣椒疫病菌活性跟踪)
①将发酵液以8000r/min的速度离心30min，收集菌丝体。将菌丝体在pH值为3.0、体积百分比70％的乙醇中振荡24h，然后用乙酸乙酯萃取，取上层乙酸乙酯，萃取液减压浓缩得到粗提物。
②取粗提物10g，利用硅胶柱层析(硅胶的规格200-300目)对粗提物进行分离，采用干法装柱，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，梯度比例为5∶1、3∶1、1∶1和1∶3，每个梯度为1000mL，洗脱速度为10mL/min，每100mL收集一个样品，分部收集洗脱液，得到40个组份，其中第16个至第30个组份有抑菌活性。用薄层层析板检测各组份，合并条带相似的组分，得到5个组份(其中第16至19组分合并得到组分a、第20至23组分得到组分b、第24至28组分得到组分c、第29至32组分得到组分d、第33至36组分得到组分e)；
所述步骤②的抑菌活性的检测方法为纸片法。将灭菌的纸片(5mm)浸入代测组分样品，晾干，放在平皿上，距辣椒疫霉病菌块(6mm)3cm，26-28℃培养72h，观察辣椒疫病菌生长情况和有无抑菌带，有抑菌带说明具有生物活性。
③有活性的5个组份合并，用石油醚∶甲醇(按体积比3∶1混合)混合液萃取2到3次，去除大部分油脂，将活性物质过葡聚糖柱(Sephadex G-25为50-100目)，甲醇∶氯仿((9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、2∶1、4∶1混合)梯度洗脱，每浓度梯度为500mL，洗脱的总体积是3500mL，流速5mL/min，每100mL为一个组分，收集到的组份通过步骤辣②椒疫病菌活性方法检测各组份的活性，活性组分(第10至15组分)再用硅胶柱层析(规格200-300目)分离，洗脱剂为石油醚∶丙酮(按体积比5∶1混合)，总体积为200mL，10mL收集一份，总共收集20个组分，将得到的组份薄层板检测合并相似的条带，得到9个组份(第1-2组分合并为组分A、第3-4组分合并为组分B、第5-7组分合并为组分C、第8-9组分合并为组分D、第10-11组分合并为组分E、第12-13组分合并为组分F、第14-15组分合并为组分G、第15-17组分合并为组分H、第18-20组分合并为组分I)，9个组分中第5组分(即组分E)对辣椒疫霉病菌的活性最大；
④将步骤③得到的组分E继续用硅胶柱(规格200-300目)分离，洗脱条件为石油醚∶丙酮(按体积比5∶1混合)，洗脱总体积为200mL，每20mL收集一份，得到10个组份，其中第4组份含有白色晶体，对辣椒疫霉病菌具有有抑菌活性。薄层板检测为单一条带。
⑤将步骤④得到的活性组份4减压浓缩，得白色晶体S，将S溶解于10mL石油醚丙酮(1∶1)混合液中，置4℃冰箱重结晶。
⑥采用高效液相色谱对组份S进行分离纯化，收集峰面积大的馏份(如图3所示)，得到对辣椒疫病菌有明显抑制作用的活性产物S-M。色谱条件：色谱柱为SunFireTM C18反相硅胶柱，甲醇/水＝50∶50；流速：1.0mL/min；吸收波长：320nm。
所述代谢物S-M浓度为5.0mg/L时对辣椒疫霉病菌的抑菌带为16.6±0.15mm、黄瓜疫霉菌抑菌带为20.9±0.27mm、黄瓜炭疽病为20.1±0.52mm和辣椒炭疽病菌13.5±035mm。
(4)组分S-M结构鉴定
将组分S-M采用1H-NMR(图4)、13C-NMR方法分析(图5)，鉴定组分S-M为抗霉素(antimycin)A18(1)，分子式为C28H41N2O9，分子量为549.3，结构式如式I所示，为一种新结构化合物。
式I
其中R1为-CH2CH2CH2CH2CH3；R2为-CH(CH3)CH(CH3)CH3。
实施例3
抗生链霉菌崖门亚种的代谢物制剂盆栽防治效果试验
(1)生物制剂的制备：活性产物抗霉素A18(1)粉末0.2g，乳化剂(土温-80)0.5g，甲醇4.3g；按以上比例混合，搅拌均匀即可。
(2)盆栽试验在温室中进行。每个塑料盆钵装自然风干菜园土0.5kg，每钵移栽4叶期健壮辣椒苗2棵或4叶期健壮黄瓜苗2棵，移栽5天后其生长正常进行试验。辣椒疫霉病菌和黄瓜疫霉病菌FR-58(新型杀菌剂氟吗啉对黄瓜疫霉病菌细胞壁主要组分合成及分布的影响.高等学校化学学报，2007，28(4)：658-662)在V8培养液(美国进口V8蔬菜汁150mL，CaCO30.2g，水850mL)中26～28℃培养7～9d，过滤菌丝得孢子液，稀释后浓度控制在103～104左右；黄瓜炭疽病菌(黄瓜抗炭疽病相关基因AFLP标记的SCAR转换，园艺学报，2008，35(1)：123-126)和辣椒炭疽病菌在PDA培养液中28～30℃培养6～7d，过滤菌丝得孢子液，稀释后浓度控制在103～104左右。设：①对照处理1(CK1)，为不接种病原菌；②对照处理2(CK2)，为在辣椒苗和黄瓜苗上均匀喷雾辣椒疫霉病菌、黄瓜疫霉病菌、黄瓜炭疽病菌为和辣椒炭疽病菌的孢子液；③制剂处理，为辣椒苗和黄瓜苗喷雾病原菌孢子液后，晾干，再分别喷雾步骤(1)制备的生物制剂，(制剂∶水)1∶500、1∶100、1∶1500；每个处理15盆。所有对照及处理在移栽后7、12d调查、统计发病率和防治效果。
由表2可知，生物制剂喷施后12天，稀释倍数500×防治辣椒疫病的效果为90.00％，防治黄瓜疫病的效果为86.67％，防治辣椒炭疽的效果为86.67％，防治黄瓜炭疽的效果为90.00％。由此可见，代谢物制剂500×药后12天对4种蔬菜真菌病害的防治效果都在86％以上，防治效果较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.抗霉素A18（1）的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）抗生链霉菌H74-18的活化；
（2）抗生链霉菌H74-18的发酵，具体为：
①种子液的制备：将步骤（1）活化的抗生链霉菌H74-18接种到培养基中，28℃下160～180rpm摇瓶培养48h，得到种子液；
②发酵液的制备：将种子液以体积百分比10%的接种量接至30L发酵罐中培养，初始pH值7.0～7.2，发酵温度为28℃，搅拌速度为300r/min，培养72h；
所述的发酵培养基组成为：酵母粉25g，玉米淀粉20g，海水精3g，CaCO32g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min；
（3）抗霉素A18（1）的提取
①发酵液8000r/min离心30min，收集菌体；菌丝体在pH值为3.0、体积百分比70%的乙醇中振荡24h，然后用乙酸乙酯萃取；萃取液减压浓缩得到粗提物；
②利用规格200-300目的硅胶柱对粗提物进行层析，采用干法装柱，石油醚:乙酸乙酯梯度洗脱，梯度比例为体积比5:1、3:1、1:1和1:3，每个梯度为1000mL，洗脱速度为10mL/min，每100mL收集一个样品，分部收集洗脱液，得到40个组份，将第16～36组分合并，得到洗脱液A；
③将洗脱液A用按体积比3︰1混合的石油醚/甲醇混合液萃取，得到去除大部分油脂后的物质，再过规格为50～100目的葡聚糖柱，甲醇:氯仿梯度洗脱，梯度依次为体积比9:1、7:1、5:1、3:1、1:1、2:1和4:1，每浓度梯度为500mL，洗脱的总体积是3500mL，流速5mL/min，每100mL为一个组分；将第10至15组分合并，再用规格为200-300目的硅胶柱层析分离，洗脱剂为体积比5:1混合的石油醚/丙酮溶液，总体积为200mL，10mL收集一份，总共收集20个组分，将第10～11组分合并为组分E；
④将步骤③得到的组分E继续用规格为200-300目的硅胶柱分离，洗脱条件为按体积比5:1混合的石油醚/丙酮溶液，洗脱总体积为200mL，每20mL收集一份，得到10个组份；
⑤将步骤④得到的活性组份4减压浓缩，得白色晶体S，将S溶解于按体积比1:1混合得到的石油醚/丙酮溶液中，置4℃冰箱重结晶；
⑥采用高效液相色谱对组份S进行分离纯化，收集峰面积大的馏份，得到抗霉素A18（1）；色谱条件：色谱柱为C18反相硅胶柱，甲醇/水=50:50；流速：1.0mL/min；吸收波长：320nm；
所述的抗生链霉菌H74-18于2010年12月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010364；
所述的抗霉素A18（1）的分子式为C28H41N2O9,分子量为549.3，结构式如式I所示：
（式I）
其中R1为-CH2CH2CH2CH2CH3；
R2为-CH(CH3)CH(CH3)CH3。
2.根据权利要求1所述的抗霉素A18（1）的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的活化的方式为使用斜面培养基于28℃培养菌株H74-18，直至菌丝和孢子生长成熟。
3.根据权利要求1所述的抗霉素A18（1）的制备方法，其特征在于：所述的培养基为改良的高氏一号培养基，组成如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，海水精3g，K2HPO4·3H2O 0.66g，FeSO4·7H2O 0.02g，MgSO4·7H2O 1.03g，琼脂16g，水定容至1000ml，pH值为7.2～7.4，于115～121℃灭菌30min。
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