CN109077068A - 一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用 - Google Patents

一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用 Download PDF

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邵华
魏彩霞
王威
张弛
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Abstract

本发明涉及一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，该真菌链格孢（Alternaria alternata）是从新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中黄花刺茄自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的真菌链格孢中分别采用常规方法制备分生孢子悬浮液和粗毒素，再分别将制备的分生孢子悬浮液和粗毒素均匀喷洒在黄花刺茄植株上，对恶性杂草黄花刺茄具有很强的致病作用和控制效果，本发明培养操作简单、培养基质材料易获得、所得到的孢子悬浮液及毒素稳定性强，获取工艺简单，可大批量生产；以其作茎叶喷施，使用方便，可有效杀灭目标杂草黄花刺茄，具有较高的环境安全性。

Description

一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用。
背景技术
外来生物入侵是一个世界性的问题。入侵生物通过取代原有物种或抑制新物种在入侵地的生存而降低生物多样性，从而破坏生态系统稳定性，影响当地经济发展。我国是受生物入侵危害最为严重的国家之一，特别是近年来随着经济的飞速发展和国际贸易的日益繁荣，一些外来物种通过商业、旅游等途径悄然进入我国。据统计，目前在我国已有外来入侵植物600 余种，其中有50余种位列国际自然保护联盟公布的全球100种最具威胁的外来物种中；目前已造成严重危害的种类已多达103种，其中仅紫茎泽兰、豚草、水葫芦和大米草等几种外来入侵植物每年给我国造成的经济损失就超过140亿美元，总体损失可高达千亿。
近年来，外来植物黄花刺茄(Solanum rostratum Dunal.)在我国的入侵态势逐渐加剧。黄花刺茄又名刺萼龙葵，为茄科茄属一年生草本植物，耐干旱，繁殖能力强。原产地为北美，现已广泛分布于南北美洲、欧亚大陆和大洋洲。在我国，黄花刺茄于1981年进入辽宁，后扩散至吉林、河北、北京、甘肃、内蒙古等地；近年来该植物入侵新疆乌鲁木齐、昌吉、吐鲁番、托克逊等地，在荒漠、荒漠草原带和绿洲农田中均有分布，对干旱区脆弱的生态环境造成严重威胁。黄花刺茄的果实上带刺，可粘附在动物身上四处扩散；果实可漂浮在水面上，易于随水流传播。黄花刺茄可侵入田间和草场，危害作物和牧草；其中，据估测，黄花刺茄入侵对我国玉米产业造成的潜在经济损失总值高达29.37-350.83亿元。
黄花刺茄适应性强，在荒地、田间、河滩地、沟边路旁都能生长，对农牧业生产造成严重危害。目前防控黄花刺茄的主要手段有人工防治和化学除草。人工防治只能在较短时间、较小范围起作用，且费时费力；化学除草剂因为靶向单一，易产生抗体，且化学除草剂由于在自然界缺乏将其分解的微生物，会对环境造成污染；而生物农药因其来源于自然，可被微生物降解，对环境较为友好，适应可持续发展的需求。因此，开展生物防治是目前黄花刺茄防治最具潜力的和开发前景的方法。
发明内容
本发明目的在于，提供一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，该真菌链格孢(Alternaria alternata)是从新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中黄花刺茄自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，将分离纯化得到的真菌链格孢中分别采用常规方法制备分生孢子悬浮液和粗毒素，再分别将制备的分生孢子悬浮液和粗毒素均匀喷洒在黄花刺茄植株上，对恶性杂草黄花刺茄具有很强的致病作用和控制效果，本发明培养操作简单、培养基质材料易获得、所得到的孢子悬浮液及毒素稳定性强，获取工艺简单，可大批量生产；以其作茎叶喷施，使用方便，可有效杀灭目标杂草黄花刺茄，具有较高的环境安全性。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，该真菌链格孢 (Alternaria alternata)是从新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中黄花刺茄自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的真菌链格孢中分别采用常规方法制备分生孢子悬浮液和粗毒素，再分别将制备的分生孢子悬浮液和粗毒素均匀喷洒在黄花刺茄植株上，其中：
将制备的真菌分生孢子悬浮液配置成浓度为106/ml-108/ml均匀的喷洒于野外健康黄花刺茄植株叶片上，喷洒48h后植株叶片出现明显病斑点，2d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化，9d后整个植株萎蔫死亡；
将制备的真菌粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，均匀喷洒在野外黄花刺茄植株上，喷雾处理48h后，黄花刺茄植株开始失水黄化，叶片周围出现枯萎凋亡现象，8d后植株完全死亡。
所述一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，粗毒素的野外实施量为 30ml/m2。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，该真菌链格孢 (Alternaria alternata)是从新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中黄花刺茄自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，采集时间为2015年8月。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为链格孢。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，其中真菌链格孢的分离鉴定为：
黄花刺茄致病菌株的分离纯化：在新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中采集黄花刺茄病株，带回实验室，以马铃薯蔗糖培养基(PDA)分离纯化得到五十余株真菌，回接黄花刺茄植株检测致病性，根据柯赫氏法则验证致病菌株，经过对各个菌株致病性的比较分析，确定以链格孢作为研究对象进行进一步的培养；
菌株的形态特征鉴定：在PDA培养基上温度25℃培养7d菌落直径可达45mm以上，病菌菌落圆形，表面气生菌丝较发达，呈灰白色，短絮状，呈辐射状扩展：菌丝无色，分隔，直径约1.3－2.7m，可产生大量分生孢子；
菌株分子技术鉴定：提取菌株的基因组DNA，采用rDNA ITS通用引物：ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)，ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)进行rDNA ITS序列的PCR扩增，获得长度为480bp(rDNA ITS)基因片段，从NCBI Blast检索与目标序列同源性高的DNA序列，与本试验所测序列分别进行菌株种内比对，由比对结果确定真菌链格孢与链格孢(Alternaria alternata)是用一个种。
菌株的最佳培养条件和接种侵染条件：该真菌链格孢菌落生长的最适培养基为马铃薯葡蔔糖琼脂(PDA)，最适温度25℃，最适酸碱度为pH6.5，在这些条件下，菌落生长快，大量产生分生孢子。病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在106个/mL-108/ml数量级，接种后保湿和暗光24小时，并在整个侵染时期保持温度25-28℃；
链格孢菌块的致病性
把经灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1mL灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70％酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用，在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在PDA上培养的大小约为0.5×0.5cm2的菌块，置于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达1cm2(图3)；
链格孢菌丝悬浮液对黄花刺茄盆栽的致病性
挑取链格孢菌丝接种PDA培养基中，在温度25℃恒温培养7d后即可产生大量分生孢子，无菌水收集分生孢子(孢子浓度106/ml-108/ml)，制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液均匀的喷洒于黄花刺茄盆栽健康植株叶片上，用无菌水喷洒的黄花刺茄作对照，接种后用塑料袋套在黄花刺茄上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株患病率达100％,整个植株叶片已经开始失水黄化；7d后整个植株萎蔫死亡；
链格孢菌株的粗毒素的致病性：用马铃薯葡萄糖(以下简称PDB)培养液培养7d后，四层纱布过滤1次，所得滤液再用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速为4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素，进而将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液。用该毒素的喷洒野外黄花刺茄叶片，48h后植株叶片开始失水黄化，叶周出现枯萎；8d后整个植株萎蔫死亡。
链格孢菌株生防菌的制备和应用：
(1)分生孢子悬浮液的制备：
①液体培养制备法：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的移入PDA平板培养基上培养5d 后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖培养液中(2块/100mL)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养14d后用无菌纱布过滤，获得孢子和培养滤液的混合滤液，孢子浓度106/ml-108/ml，(以上操作均在无菌条件下)，将其滤液直接制备成悬浮液；将病菌的孢子悬浮液喷洒至健康的黄花刺茄盆栽植株叶片上，48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；7d后整个植株萎蔫死亡；将病菌的孢子悬浊液喷洒至野外健康的黄花刺茄植株叶片上，48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株叶片已经开始失水黄化；9d后整个植株萎蔫死亡，孢子悬浮液对黄花刺茄有良好的防除作用。
②固体培养基制备法：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的移入PDA平板培养基上培养7d 后，可产生大量分生孢子，以无菌水收集分生孢子(孢子浓度为106/ml-108/ml)，制得孢子悬浮液；将链格孢病菌的孢子悬浊液喷洒至健康的黄花刺茄盆栽植株叶片上，48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；7d后整个植株萎蔫死亡；将链格孢病菌的孢子悬浊液喷洒至野外健康的黄花刺茄植株叶片上，48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株叶片已经开始失水黄化；9d后整个植株萎蔫死亡。链格孢子悬浮液对黄花刺茄有良好的防除作用。
③在实际应用中，也可采取液体-固体联合培养方式进行生产。
(2)粗毒素的制备：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的链格孢移入PDA平板培养基上培养5d后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖培养液中(2块/100mL)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养7d，将马铃薯葡萄糖培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速 4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空蒸空得到粗毒素，将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，喷洒在黄花刺茄叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液50ml，喷雾处理48h后植株开始失水黄化，叶周出现枯萎现象，9d后植株完全死亡。其优点是：链格孢菌株制剂对黄花刺茄有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，其优点是：从自然界中分离获得的黄花刺茄致病菌链格孢，其分生孢子对外来入侵恶性杂草黄花刺茄具有很强的致病作用，它的代谢产物(毒素)对该杂草也有很强的毒性致死作用；通过菌株液体发酵所得的链格孢菌株制剂对黄花刺茄具有很好的防除效果；具有潜在的商业开发和应用价值，在黄花刺茄的生物防治实践中具有重要的应用前景。
本发明所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，其链格孢的rDNA ITS序列表：
CTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTC TAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTA TCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA
附图说明
图1为本发明黄花刺茄在野外的单一群落照；
图2为本发明黄花刺茄链格孢的形态特征：其中A为PDA上第5d菌落正面；B为PDA上第5d菌落背面；C为菌丝；D为孢子图片；
图3为本发明链格孢菌块侵染黄花刺茄叶片5d后的症状(病斑)：其中A为清水对照，B 为链格孢菌块处理图片；
图4为本发明链格孢孢子悬浮液喷洒室内黄花刺茄盆栽后7d植株发病情况：其中A为链格孢分生孢子悬浮液作用前，B为链格孢孢子悬浮液处理第3天；C为链格孢孢子悬浮液处理第5天；D为链格孢孢子悬浮液处理第7天图片；
图5为本发明链格孢孢子悬浮液喷洒野外黄花刺茄9d植株发病情况：其中A为作用前， B为链格孢孢子悬浮液作用9d后图片；
图6为本发明黄花刺茄链格孢粗毒素室内生物测定结果：其中A为清水对照，B为链格孢粗毒素处理图片；
图7为本发明链格孢粗毒素喷洒野外黄花刺茄8d植株发病情况：其中A为链格孢毒素溶液作用前，B为链格孢毒素溶液作用8d后图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
黄花刺茄致病菌的分离纯化与筛选：
黄花刺茄病原菌的分离纯化：
菌株的分离：选取自然生境中采集的带有典型病斑的叶片，用清水冲洗干净，在病健交界处剪取2mm×2mm大小的组织块，在超净工作台依次在70％的酒精，0.1％的升汞中消毒，然后在灭菌水中连续漂洗3次，取出后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分之后放在PDA平板中，于25℃恒温培养箱中培养；
待马铃薯蔗糖培养基(PDA)平板培养基上的菌落长到一定大小时，进行分离纯化并经致病性测定后移入马铃薯蔗糖培养基(PDA)试管斜面后于冰箱4℃下保存备用；
寄主植物来源及培植：采集无明显病害症状的相对健康植株，去除衰老叶片后移栽到温室内的水槽内备用，在接种试验前2d选取长势良好且大小适中的健康黄花刺茄植株，分别植入塑料钵中，塑料钵底部加施少量营养土并灌满自来水，将盆钵植株放在温室自然温度下生长；
黄花刺茄病害诊断和回接：挑取少量分离纯化所得的病原菌菌种接种马铃薯蔗糖培养基 (PDA)培养基中，在温度25℃恒温培养7d，拨取菌丝并将其配制成菌丝悬浮液(菌丝湿重与无菌水1:100)，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于黄花刺茄叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，用无菌水涂抹的黄花刺茄作对照，接种后用塑料袋套在黄花刺茄上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后适时观察发病情况并记录病害症状；
待接种植株的叶片出现症状后，用组织分离法对病原菌进行再分离，对前后分离病原菌的培养性状、分生孢子以及分生孢子梗等形态特征等进行比较；
黄花刺茄生防菌的筛选：
在温度25℃条件下，将分离所得的各个菌株分别按菌丝湿重与无菌水1:100的比例配制成菌丝悬浮液，接种前，用无菌水将黄花刺茄叶片冲洗干净，采用涂抹法接种，用无菌毛刷将菌丝均匀地涂抹于黄花刺茄叶片上，直至叶片上菌丝液开始下滴为止，以无菌水涂抹的黄花刺茄作为对照，接种后，用塑料袋套在黄花刺茄上，保持高湿度，48h后，除去塑料袋,观察记录植株的感病率和病害严重度；
黄花刺茄病原菌分类地位鉴定：
病原菌的形态学鉴定：马铃薯蔗糖培养基(PDA)上培养病原菌，适时观察记录病原菌的各种形态特征；菌落直接用数码相机拍摄，真菌的菌丝在光学显微镜下观察，并用显微成像系统拍摄；
病病原菌的分子鉴定：总DNA的提取采用氯仿/异戊醇提取法，采用rDNA ITS序列的 PCR扩增通用引物：ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)，ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)进行rDNA序列的PCR扩增，再将得到的PCR产物进行测序，获得长度为480bp(rDNA ITS)基因片段，从NCBI Blast检索与目标序列同源性高的DNA 序列，与本试验所测序列分别进行菌株种内比对，由比对结果确定分离得到的黄花刺茄病原菌与链格孢(Alternaria alternata)是同一个种；
链格孢孢子悬浮液对黄花刺茄致病性测验及其制备：
病原真菌菌块对黄花刺茄叶片的致病性测验：
将经灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1mL灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70％酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用，在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在PDA上培养的大小约为0.5×0.5cm2的菌块，置于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达1cm2(图3)；
链格孢孢子悬浮液对黄花刺茄盆栽的致病性测验：
挑取链格孢菌丝接种PDA培养基中，在温度25℃恒温培养7d后即可产生大量分生孢子，无菌水收集分生孢子(孢子浓度106/ml-108/ml)，制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液均匀的喷洒于黄花刺茄盆栽健康植株叶片上，用无菌水喷洒的黄花刺茄作对照，接种后用塑料袋套在黄花刺茄上以保持高湿度，48h后揭去塑料袋，接种期间温度为25-28℃，接种后48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；7d后整个植株萎蔫死亡(图4)；
链格孢孢子悬浮液对野外黄花刺茄的致病性测验：
挑取链格孢菌丝接种PDA培养基中，在温度25℃恒温培养7d后可产生大量分生孢子，以无菌水收集分生孢子(孢子浓度106/ml-108/ml)，制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液均匀的喷洒于野外健康黄花刺茄植株叶片上，喷洒后用塑料袋套在黄花刺茄上以保持高湿度，48h 后揭去塑料袋，喷洒48h后植株叶片出现明显病斑点；2d后植株患病率达100％，整个植株叶片已经开始失水黄化；9d后整个植株萎蔫死亡(图5)；
分生孢子悬浮液的制备：
液体培养制备法：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的链格孢移入PDA平板培养基上培养5d后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖(PDB)培养液中(2块/100mL)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养14d后无菌纱布过滤，获得孢子和培养滤液的混合滤液(孢子浓度106/ml-108/ml，以上操作均在无菌条件下)，采用旋转蒸发仪将获得混合液进行蒸发，得到浓缩液(孢子浓度106/ml-108/ml)，即得链格孢孢子的悬浮制剂；
固体培养基制备法：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的链格孢移入马铃薯蔗糖培养基 (PDA)平板培养基上培养7d后，可产生大量分生孢子，以无菌水收集分生孢子(孢子浓度 106/ml-108/ml)，制得孢子悬浮液；
在实际应用中，也可采取液体-固体联合培养方式进行生产；
链格孢孢子的悬浮制剂的应用极其优点：将所得的链格孢孢子的悬浮制剂均匀的喷洒在黄花刺茄叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液30ml，其优点是：链格孢孢子的悬浮制剂对黄花刺茄有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。
实施例2
黄花刺茄致病菌的分离纯化与筛选依据实施例1：
病原菌粗毒素对黄花刺茄致病性测验及其制备：
病原菌粗毒素的提取：
黄花刺茄链格孢的产毒培养：
在超净工作台上，将链格孢菌株移殖于试管马铃薯蔗糖培养基(PDA)斜面培养基进行活化，将活化后的链格孢菌株移入马铃薯蔗糖培养基(PDA)平板培养基上培养5d后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖(PDB)培养液中(2块/100mL)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养7d，得到发酵液；
粗毒素的提取：
将培养后所得的发酵液，用四层纱布过滤1次，所得滤液再次用双层层析滤纸过滤，将滤液离心20min，转速为10000r/min，所得上清液即为毒素粗提液；
乙酸乙酯萃取试验：
在分液漏斗中先装入100mL粗毒素，再装入等体积的乙酸乙酯萃取剂，充分震荡使得两种液体混匀，静置至分层后，从下缓慢移出有机相，再向水相中加入等体积的萃取剂，如此连续萃取三次，合并有机相，得到萃取有机相和萃取水相，对有机相进行旋转蒸发，蒸发掉有机溶剂，萃取产物即为的粗毒素，将其密封温度4℃冰箱保存备用；
毒素生物测定：
离体叶片针刺法：将萃取得到的毒素配制为2.5㎎/ml的水溶液，将灭菌的培养皿大小的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入1mL灭菌蒸馏水，剪取生长健壮无病斑的叶片，用清水冲洗干净后，用70％酒精擦洗一遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次后晾干，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，保湿培养备用；在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，分别吸待测液40uL，滴于伤口处，再用保鲜膜密封保湿，重复3次，用无菌水作对照，恒温培养箱25℃保存5d，5d后病菌直径达1cm2(图6)；
粗毒素水剂对野外黄花刺茄致病性的测试：
将菌种移殖于试管PDA斜面培养基进行活化，将活化后的链格孢移入马铃薯蔗糖培养基 (PDA)平板培养基上培养5d后，然后用直径为5mm的打孔器打取菌饼接入马铃薯葡萄糖(PDB) 培养液中(2块/100mL)，放入摇床振荡培养，设置温度为25℃、转速110r/min，连续培养 7d，将PDB培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心 20min，转速4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空抽滤得到粗毒素，将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，均匀喷洒在黄花刺茄植株上，喷雾处理48h后，黄花刺茄植株开始失水黄化，叶片周围出现枯萎凋亡现象，8d后植株完全死亡(图7)；
粗毒素水剂的制备：
挑取少量马铃薯蔗糖培养基(PDA)培养基中的菌丝接种在马铃薯葡萄糖(PDB)上并摇床7d，将马铃薯葡萄糖(PDB)培养液经过四层纱布过滤得到滤液，所得滤液再用双层滤纸过滤，然后滤液离心20min，转速4000r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪真空蒸空得到粗毒素，进而将所得粗毒素配制为5㎎/ml的溶液；
链格孢粗毒素制剂的应用及其优点：将所得的链格孢粗毒素制剂均匀的喷洒在黄花刺茄叶面，每平方米喷雾使用量为稀释后的菌液30ml，对黄花刺茄有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。
序列表
<110> 中国科学院新疆生态与地理研究所
<120> 一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 一种真菌链格孢(Alternaria alternata在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用)
<400> 1

Claims (2)

1.一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，其特征在于，该真菌链格孢（Alternaria alternata）是从新疆昌吉黄花刺茄的野外自然居群中黄花刺茄自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的真菌链格孢中分别采用常规方法制备分生孢子悬浮液和粗毒素，再分别将制备的分生孢子悬浮液和粗毒素均匀喷洒在黄花刺茄植株上，其中：
将制备的真菌分生孢子悬浮液配置成浓度为106/ml-108/ml均匀的喷洒于野外健康黄花刺茄植株叶片上，喷洒48h后植株叶片出现明显病斑点，2d后植株患病率达100%，整个植株叶片已经开始失水黄化，9d后整个植株萎蔫死亡；
将制备的真菌粗毒素配制为5㎎/ml的溶液，均匀喷洒在野外黄花刺茄植株上，喷雾处理48h后，黄花刺茄植株开始失水黄化，叶片周围出现枯萎凋亡现象，8d后植株完全死亡。
2.根据权利要求1所述的一种真菌链格孢在防控外来入侵杂草黄花刺茄中的应用，其特征在于，粗毒素的野外实施量为30ml/m2。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114806896A (zh) * 2022-06-06 2022-07-29 青岛农业大学 一株互隔交链孢霉、除草剂及其应用
CN115216409A (zh) * 2022-08-10 2022-10-21 武汉轻工大学 一种五爪金龙的生物防控方法

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CN102823419A (zh) * 2012-09-21 2012-12-19 农业部环境保护科研监测所 一种防止天然草原外来植物入侵的方法

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