CN115216409A - 一种五爪金龙的生物防控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种五爪金龙的生物防控方法,包括五爪金龙生物防控菌‑‑胶孢炭疽菌的分离、纯化、鉴定以及生物防控菌剂的制备、生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片的无菌处理、生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用等步骤。本发明对入侵植物五爪金龙的生物防控技术展开了探索,确定了在生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片表面化学消毒的必要性,最终建立了五爪金龙的生物防控技术体系,解决了该入侵杂草防控过程中长期存在的技术难题,且生产生物防控菌剂的方法简单、操作简便、时间短、产量高、成本低,生物防控菌剂施用所需的环境条件与中国华南地区全年较长时期内的环境条件相符,可在该地区长时期、大范围推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药领域,具体为一种五爪金龙的生物防控方法。
背景技术
五爪金龙为旋花科番薯属多年生常绿藤本植物,是中国华南地区最具危害性的入侵植物物种之一。该物种生长极为迅速,是典型的绞杀性植物,对农作物生产和植物多样性造成了巨大的破坏。
现有技术中,采用人工清除的方式不仅人力投入大,而且无法彻底清除,难以阻止根、茎遗留残体的再生。而采用化学农药的方式虽然对五爪金龙有较好的防控效果,但也会对环境造成严重的污染。为了提高防治效率、减少对环境的化学污染,生物防控可能是防治五爪金龙的一种有效的途径。但到目前为止,在五爪金龙的防治过程中还未见生物防控法的应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明目的是提供一种五爪金龙的生物防控方法,以解决上述背景技术中提出的问题,本发明操作简单,见效快,易于推广,且防控效果更好。
为了实现上述目的,本发明是通过如下的技术方案来实现:一种五爪金龙的生物防控方法,应根据以下步骤和方法进行:
(1)生物防控菌的分离、纯化和鉴定:在野外采集胶孢炭疽菌感染症状的病叶带回实验室,用无菌处理过的刀片切取五爪金龙表面的叶斑,并转移至无菌PDA培养基(200g马铃薯,20g葡萄糖,15g琼脂,0.1g硫酸链霉素,1000mL去离子水)上,置于26℃的培养箱中避光培养7d。将PDA上的每个菌落挑出,转接到新的无菌PDA培养基上进行纯化培养,2-3代便可以获得纯化菌株。结合真菌的ITS测序技术、序列比对分析和菌株形态学特征即可鉴定得到胶孢炭疽菌;
(2)生物防控菌剂的制备:将培养2周的胶孢炭疽菌菌落从PDA培养基转接至无菌PDB培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,1000mL去离子水),然后置于26℃、无光照的培养箱内培养24h。真菌培养液经过三层无菌纱布过滤以清除菌丝,所得滤液为孢子悬浮液,作为五爪金龙的生物防控菌剂母液。以血球计数板对生物防控菌剂母液的孢子浓度进行计数,并用无菌PDB将孢子浓度稀释至2×107mL-1,以此作为五爪金龙的生物防控菌剂;
(3)生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片的无菌处理:生物防控菌剂施用前,用75%乙醇对五爪金龙植株叶片上、下表面进行喷雾处理。待叶片表面乙醇溶液完全挥发后,用75%乙醇对叶片补充喷雾处理1次,以清除叶片表面的微生物;
(4)生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用:在温度为27±1℃、相对湿度为87±2%的环境条件下,用生物防控菌剂对五爪金龙植株叶片上、下表面进行喷雾处理,喷施量以刚好润湿叶片上、下表面为宜。待五爪金龙植株生长14d,在上述温度和湿度条件下,用生物防控菌剂补充喷雾1次。
进一步的,根据步骤(1)所述的生物防控菌分离、纯化和鉴定方法为:生物防控菌菌种为胶孢炭疽菌,分离于野外已感染胶孢炭疽菌的五爪金龙叶片,需经过2~3代的纯化培养得到纯化菌株。
进一步的,菌种鉴定应结合ITS序列分析和菌株的形态学特征进行。
进一步的,步骤(2)所述的生物防控菌剂的制备方法为:生物防控菌剂母液为步骤(1)分离得到的胶孢炭疽菌的孢子悬浮液,由已培养2周的胶孢炭疽菌菌落在无菌PDB培养基中培养得到,培养温度为26℃,培养时间为24h,无需光照。生物防控菌剂由生物防控菌剂母液经无菌PDB稀释得到,孢子浓度为2×107mL-1。
进一步的,所述生物防控菌剂母液和生物防控菌剂应在使用前现制现用,若需4℃保存,则不宜超过6h。
进一步的,步骤(3)所述的生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片表面的无菌处理方法为:乙醇溶液浓度为75%,喷雾处理次数为2次。
进一步的,第2次喷雾处理应在第1次喷雾处理的叶片表面乙醇溶液完全挥发后30min内进行,施用部位为五爪金龙叶片的上、下表面,施用量以叶片刚好润湿为宜。
进一步的,步骤(4)所述的生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用方法为:生物防控菌剂的施用应在步骤(3)中乙醇溶液完全挥发后30~60min内进行,施用时的环境条件为温度27±1℃、相对湿度87±2%,施用部位为叶片上、下表面,施用方式为喷雾施用,施用量以叶片刚好润湿为宜。
进一步的,第2次喷施生物防控菌剂在五爪金龙植株生长14d后进行,施用时的环境温度和湿度与第1次施用时相同。
本发明的有益效果:
1.该五爪金龙的生物防控方法中对菌种的收集便利,生产生物防控菌剂的设备简单、操作简便、时间短、产量高、成本低。
2.该五爪金龙的生物防控方法中生物防控菌剂施用取得最佳防控效果时的温度为27±1℃、相对湿度为87±2%,与中国华南地区全年较长时期内的环境条件相符,可全年长期在该地区大范围推广使用。
3.该五爪金龙的生物防控方法见效时间短,且防控效果好。
附图说明
图1为本发明一种五爪金龙的生物防控方法的技术路线图;
图2为本发明中叶片表面无菌处理后生物防控菌剂对五爪金龙单株叶片数的影响示意图;
图3为本发明中叶片表面无菌处理后生物防控菌剂对五爪金龙单株生物量的影响示意图;
图4为本发明叶片表面无菌处理后生物防控菌剂对五爪金龙单株株高的影响示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。
请参阅图1至图4,本发明提供一种技术方案:一种五爪金龙的生物防控方法,使用时根据以下步骤和方法进行:
1、生物防控菌的分离、纯化和鉴定:在野外采集呈现胶孢炭疽菌感染症状的病叶带回实验室,用无菌处理过的刀片切取五爪金龙表面的叶斑,并转移至无菌PDA培养基上,置于26℃的培养箱中避光培养7d。将PDA上的每个菌落挑出,转接到新的无菌PDA培养基上进行纯化培养,2-3代便可以获得纯化菌株。结合真菌的ITS测序技术、序列比对分析和菌株形态学特征即可鉴定得到胶孢炭疽菌。
本实施例,根据上述步骤所述的生物防控菌分离、纯化和鉴定方法为:生物防控菌菌种为胶孢炭疽菌,分离于野外已感染胶孢炭疽菌的五爪金龙叶片,需经过2~3代的纯化培养得到纯化菌株,菌种鉴定应结合ITS序列分析和菌株的形态学特征进行。
2、生物防控菌剂的制备:将培养2周的胶孢炭疽菌菌落转接到装有50mL无菌PDB培养基的锥形瓶中,用封口膜密封瓶口后置于26℃的培养箱无光照培养24h。真菌培养液经过三层无菌纱布过滤以清除菌丝,所得滤液即为孢子悬浮液,以此作为五爪金龙的生物防控菌剂母液。吸取1mL生物防控菌剂母液滴入血球计数板的计数格中,在普通光学显微镜下对孢子进行计数,再用无菌PDB将孢子浓度稀释到2×107mL-1,以此作为五爪金龙的生物防控菌剂。生物防控菌剂母液和生物防控菌剂均应在使用当天完成制备并在6h内使用。
本实施例,上述步骤中所述的生物防控菌剂的制备方法为:生物防控菌剂母液为步骤(1)分离得到的胶孢炭疽菌的孢子悬浮液,由已培养2周的胶孢炭疽菌菌落在无菌PDB培养基中培养得到,培养温度为26℃,培养时间为24h,无需光照。生物防控菌剂由生物防控菌剂母液经无菌PDB稀释得到,孢子浓度为2×107mL-1,所述生物防控菌剂母液和生物防控菌剂应在使用前现制现用,若需4℃保存,则不宜超过6h。
3、生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片的无菌处理:从样地内采集12个五爪金龙健康植株带回实验室,扦插在霍格兰(Hoagland)营养液中,其中6株的叶片喷施75%乙醇,每个叶片上下表面各喷施0.5mL,作为处理组。剩下6株的叶片喷施等量无菌水,作为对照组。待处理组叶片表面的乙醇溶液完全挥发后,用75%乙醇对叶片补充喷雾处理1次。同样,对照组的叶片喷施等量的无菌水,1h后,从处理组的每个植株上各取8个叶片,分别置于6个250mL锥形瓶中,每个锥形瓶加入75mL无菌水,用封口膜密封锥形瓶瓶口。将锥形瓶放置在摇床上170rpm震荡60min。在超净工作台中用无菌枪头吸取500μL悬浮液,接种到无菌的PDA培养基,涂布均匀。每个样品的悬浮液接种3个PDA平板。采用相同的方法制备对照组叶片的悬浮液并进行涂布培养,作为阳性对照。所有的PDA平板置于26℃的恒温培养箱,无光照培养4d后用于检测微生物的发生情况。检测结果表明,对照组叶片制备的悬浮液在PDA培养基上长出了大量的真菌和细菌,处理组叶片制备的悬浮液在PDA培养基上没有任何微生物的发生,这表明75%乙醇对叶面的喷施对于清除五爪金龙叶片表面的真菌和细菌有效。从样地内再次采集100个五爪金龙健康植株的带叶茎段(长15cm,直径3mm)带回实验室,每个茎段保留2个叶片后扦插在霍格兰营养液中,室温下培养5d,用于生根。从这些已生根的植株中挑选9个具有相同根量、根长、株高、茎粗的植株,去除新生叶,仅保留最初的2个叶片。之后,按照上述方法,用75%乙醇溶液对其中3个植株的叶片进行无菌处理,作为75%乙醇处理组。剩下6个植株的叶片喷施等量无菌水,作为无菌水处理组。本实验重复3次。
本实施例,上述步骤中所述的生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片表面的无菌处理方法为:乙醇溶液浓度为75%,喷雾处理次数为2次,第2次喷雾处理应在第1次喷雾处理的叶片表面乙醇溶液完全挥发后30min进行,施用部位为五爪金龙叶片的上、下表面,施用量以叶片刚好润湿为宜。
4、生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用:用生物防控菌剂对步骤3中75%乙醇处理组植株叶片的上、下表面进行喷雾处理,每个叶片上、下表面的喷施量各为0.5mL,这些植株标记为75%乙醇+菌剂组。同样,对无菌水处理组中3个植株的叶片上、下表面喷施等量的生物防控菌剂,这些植株标记为无菌水+菌剂组。对无菌水处理组中剩下3个植株的叶片上、下表面喷施等量的无菌PDB,这些植株标记为无菌水+PDB组。75%乙醇+菌剂组、无菌水+菌剂组和无菌水+PDB组各自单独培养在温度为27±1℃、相对湿度为87±2%的培养箱内,光暗周期设置为14h/10h,光照强度为200μmol·m–2·s-1。14d后,对75%乙醇+菌剂组以及无菌水+菌剂组植株的叶片再补充喷施1次生物防控菌剂,对无菌水+PDB组植株的叶片再补充喷施1次PDB,每个叶片的喷施量与第1次喷施相同。继续培养14d后测定五爪金龙单株的叶片数、株高和生物量。本实验重复进行3次。
本实施例,上述步骤中所述的生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用方法为:生物防控菌剂的施用应在步骤(3)中乙醇溶液完全挥发后30~60min内进行,施用时的环境条件为温度27±1℃、相对湿度87±2%,施用部位为叶片上、下表面,施用方式为喷雾施用,施用量以叶片刚好润湿为宜,第2次喷施生物防控菌剂在五爪金龙植株生长14d后进行,施用时的环境温度和湿度与第1次施用时相同,且由图2可见,无菌水+PDB、无菌水+菌剂组和75%乙醇+菌剂组五爪金龙的单株叶片数分别为13.33±0.40个、12.21±0.44个和2.44±0.38个,前两者之间无显著差异,但均显著高于后者。由图3可见,无菌水+PDB、无菌水+菌剂组和75%乙醇+菌剂组五爪金龙的单株生物量为0.710±0.006g、0.691±0.100g和0.196±0.005g,前两者之间无显著差异,但均显著高于后者。由图4可见,无菌水+PDB、无菌水+菌剂组和75%乙醇+菌剂组五爪金龙的单株株高分别51.0±1.57cm、49.4±1.54cm和27.4±1.63cm,前两者之间无显著差异,但均显著高于后者。这些结果表明,只有预先通过75%酒精对五爪金龙叶片表面进行无菌处理,才能明显削弱五爪金龙对生物防控菌剂的抗病性,从而使得后期生物防控菌剂的施用对五爪金龙植株的生长产生明显的抑制作用,导致植株单株叶片数、生物量和株高的降低,最终发挥生物防控菌剂对五爪金龙的防控作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于,根据以下步骤和方法进行:
(1)生物防控菌的分离、纯化和鉴定:在野外采集胶孢炭疽菌感染症状的病叶带回实验室,用无菌处理过的刀片切取五爪金龙表面的叶斑,并转移至无菌PDA培养基(200g马铃薯,20g葡萄糖,15g琼脂,0.1g硫酸链霉素,1000mL去离子水)上,置于26℃的培养箱中避光培养7d。将PDA上的每个菌落挑出,转接到新的无菌PDA培养基上进行纯化培养,2-3代便可以获得纯化菌株。结合真菌的ITS测序技术、序列比对分析和菌株形态学特征即可鉴定得到胶孢炭疽菌;
(2)生物防控菌剂的制备:将培养2周的胶孢炭疽菌菌落从PDA培养基转接至无菌PDB培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,1000mL去离子水),然后置于26℃、无光照的培养箱内培养24h。真菌培养液经过三层无菌纱布过滤以清除菌丝,所得滤液为孢子悬浮液,作为五爪金龙的生物防控菌剂母液。以血球计数板对生物防控菌剂母液的孢子浓度进行计数,并用无菌PDB将孢子浓度稀释至2×107mL-1,以此作为五爪金龙的生物防控菌剂;
(3)生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片的无菌处理:生物防控菌剂施用前,用75%乙醇对五爪金龙植株叶片上、下表面进行喷雾处理。待叶片表面乙醇溶液完全挥发后,用75%乙醇对叶片补充喷雾处理1次,以清除叶片表面的微生物;
(4)生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用:在温度为27±1℃、相对湿度为87±2%的环境条件下,用生物防控菌剂对五爪金龙植株叶片上、下表面进行喷雾处理,喷施量以刚好润湿叶片上、下表面为宜。待五爪金龙植株生长14d后,在上述温度和湿度条件下,用生物防控菌剂补充喷雾1次。
2.根据权利要求1所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:根据步骤(1)所述的生物防控菌分离、纯化方法为:生物防控菌菌种为胶孢炭疽菌,分离于野外已感染胶孢炭疽菌的五爪金龙叶片,需经过2~3代的纯化培养得到纯化菌株。
3.根据权利要求2所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:菌种鉴定应结合ITS序列分析和菌株的形态学特征进行。
4.根据权利要求2所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:步骤(2)所述的生物防控菌剂的制备方法为:生物防控菌剂母液为步骤(1)分离得到的胶孢炭疽菌的孢子悬浮液,由已培养2周的胶孢炭疽菌菌落在无菌PDB培养基中培养得到,培养温度为26℃,培养时间为24h,无需光照。生物防控菌剂由生物防控菌剂母液经无菌PDB稀释得到,孢子浓度为2×107mL-1。
5.根据权利要求4所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:所述生物防控菌剂母液和生物防控菌剂应在使用前现制现用,若需4℃保存,则不宜超过6h。
6.根据权利要求1所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:步骤(3)所述的生物防控菌剂施用前五爪金龙叶片表面的无菌处理方法为:乙醇溶液浓度为75%,喷雾处理次数为2次。
7.根据权利要求6所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:第2次喷雾处理应在第1次喷雾处理的叶片表面乙醇溶液完全挥发后30min内进行,施用部位为五爪金龙叶片的上、下表面,施用量以叶片刚好润湿为宜。
8.根据权利要求6所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:步骤(4)所述的生物防控菌剂对五爪金龙植株的施用方法为:生物防控菌剂的施用应在步骤(3)中乙醇溶液完全挥发后30~60min内进行,施用时的环境条件为温度27±1℃、相对湿度87±2%,施用部位为叶片上、下表面,施用方式为喷雾施用,施用量以叶片刚好润湿为宜。
9.根据权利要求8所述的一种五爪金龙的生物防控方法,其特征在于:第2次喷施生物防控菌剂在五爪金龙植株生长14d后进行,施用时的环境温度和湿度与第1次施用时相同。
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