CN110551641A - 一种薇甘菊生防菌的制备及应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种薇甘菊生防菌的制备及应用方法，包括待选病原菌纯培养获取；待选病原菌安全性测试；杀菌剂对生防菌的毒力测试；生防菌温度测试；生防菌致病性保持；生防菌扩繁；生防菌制剂制备。本发明设备及工艺要求简单，所得到的薇甘菊生防菌可有效侵染薇甘菊并实现持续控制，田间表现稳定，对非靶标作物安全，环境友好。本发明以目标病原菌筛选及致病力保持为核心，实现对薇甘菊的防治；通过对非靶标作物安全性评估及对病原菌的有效控制，实现了对非靶标作物的保护，较好的延缓了薇甘菊蔓延并减轻了薇甘菊的危害，适用于林地对薇甘菊的防控。
Description
技术领域
本发明涉及一种薇甘菊生防菌的制备及应用方法，属于植物保护领域。
背景技术
薇甘菊（Mikania micrantha Kunth）为菊科藤本植物，通过攀缘并形成厚毯状枝叶层覆盖宿主植物，使宿主植物不能进行正常光合作用而衰亡；繁殖能力极强，一旦发生即可迅速成灾。
薇甘菊在2002年列入中国首批外来入侵物种名录，2009年首次在茂名发现，此后大肆扩散蔓延，截至2015年底，发生面积31000亩，危害面积约18000亩，对本地原生物种造成了巨大影响。目前薇甘菊主要通过人工铲除和化学除草剂处理，成本高，效率低下，控制时间短，除草剂对宿主植物造成伤害且污染环境，控制效果差。研究并推广应用安全高效的薇甘菊防控技术，已成为当前森防工作亟待解决的问题。
据国外报道，危害薇甘菊的昆虫及螨类共19种，病害41种。假泽兰滑蓟马原生地表现良好的控制效果，而在马来西亚放养时发现其不能正常定居形成群落，原产于巴西的安娜珍蝶在印度取得了较好的防治效果;具有生防潜力病害为薇甘菊柄锈菌。
截至目前，国内报道引进薇甘菊柄锈菌利用文献较多，且取得较好的效果，但仍处于试验阶段，且外来物种的入侵风险仍难以消除；引进的安娜珍蝶虽然在饲养环境下效果良好但放养时发现其不能正常定居形成群落。使用本地原生物种开展生物防治尝试的报道，主要集中在菟丝子利用，亦有报道薇甘菊颈盲蝽、幌伞枫对薇甘菊的影响，但均处于实验室阶段，未开展大面积推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供了一种可操作性强且效果稳定的薇甘菊生防菌的制备及应用方法，该方法筛选本地已有病原真菌作为生防菌，通过病原菌纯化和致病性保持使生防菌的应用效果最大化，同时通过寄主范围测定及病原菌的毒力测定，减小了生防菌对非靶标植物的影响，实现了对薇甘菊的高效安全控制。
为了达到上述目的，本发明提供的一种薇甘菊生防菌的制备方法，该制备方法包括下述步骤：
（1）待选病原菌纯培养获取：在本地薇甘菊集中发生区域开展病害调查，选择发生严重、明显对薇甘菊生物量及开花结果影响的病害采集病叶，保湿带回实验室；使用常规组织分离方法，对病叶病健交界处进行分离，对获得的真菌菌株，进行单根菌丝分离纯化；
将获得的真菌纯培养回接至活体薇甘菊，按柯氏法则判断，筛选致病强、可持续侵染发病的真菌纯培养，对所得纯培养编号并保存菌种；
（2）待选病原菌安全性测试：选取本地具备代表性的林业及农业植物桉树、相思、马尾松、甘蔗、水稻、番薯、香蕉、龙眼、荔枝、黄瓜开展病原菌安全性测试；将步骤（1）获得的待选病原菌纯培养，接种至活体测试物种，5d、10d和15d观察测试物种发病情况；
待选病原菌筛选方法，病原菌回接后，所选10种参试植物发病少于3种，且病斑不扩展，无再侵染现象，作为生防菌使用，其余病原菌淘汰；
如本步骤不能筛选出所需病原菌，则重复步骤（1），重新制备病原菌纯培养，直至选出符合标准的病原菌为止；如筛选合格的病原菌多于1种，则将所有病原菌使用PDA平板培养基，5d一个周期，培养6代，在培养结束后，回接至薇甘菊，选择致病性强的病原菌作为生防菌使用，其余淘汰；本步骤选定的病原菌需进行初步鉴定，淘汰病原菌需保留以供测试；
（3）杀菌剂对生防菌的毒力测试：使用步骤（2）获得的生防菌，PDA平板菌种打孔相同大小的菌丝块，接种至薇甘菊健康叶片，接种2d后去除菌丝块；选择百菌清、多菌灵、霜霉威、咪鲜胺、丙环唑、嘧菌酯代表性杀菌剂，按说明书浓度配制成溶液，喷雾接种过生防菌的薇甘菊叶片，每种杀菌剂处理叶片10片，在喷雾后5d、10d、15d，观察典型病斑的扩展情况；使用十字交叉法，测量各处理病斑扩展情况，同时观察有无卫星状再侵染病斑，病斑扩展面积最小且无再侵染斑的处理，为对生防菌毒力强的杀菌剂；
（4）生防菌温度测试：将生防菌接种至PDA培养基，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5d后测量生防菌菌落直径，直径最大的温度值，记录为T1，该温度为生防菌最适宜生长温度；将生防菌离体接种至薇甘菊叶片，使用培养皿保湿，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5d后测量发病病斑直径，直径最大的温度值，记录为T2，该温度为生防菌最适宜侵染发病温度；
（5）生防菌致病性保持：使用生防菌回接活体无菌薇甘菊组培苗的方式，保持生防菌致病性；薇甘菊组培流程，在晴天中午采集薇甘菊带芽茎段作为外植体，清水洗净，75%酒精浸泡30S，0.1%升汞浸泡15min，无菌水清洗3次，接入高温灭菌的启动培养基；接种7～10d，外植体萌发无菌芽，剔除污染，将无菌芽转入与启动培养基相同配方的培养基；无菌芽培养15d后，形成带5～7对叶的无根苗，将无根苗分割为带一对叶（芽）的茎段，转接入高温灭菌的继代培养基，每瓶接种5个带叶（芽）茎段，15d后，重复本过程，即可获得大量薇甘菊无菌组培苗；将PDA平板培养基培养的生防菌，使用打孔器取菌饼，接种至薇甘菊无菌组培苗叶片，接种后24h，去除菌饼，接种后3～4d，接种叶片可见蓬松菌丝，生长迅速，接种叶片发病，接种后5～7d，未接种叶片被侵染发病，可见生长迅速的蓬松菌丝；挑取未接种叶片发病部位菌丝，回接至PDA平板培养基，即可获得致病性强的生防菌菌种，回接第一代菌种，标记为P1；
（6） 生防菌扩繁：生防菌扩繁采用2种方法：
方法1，组培苗侵染扩繁：使用步骤（5）未发病叶片菌丝，接种无菌组培苗，置于T1温度下培养，接种后10d，组培苗整瓶发病，培养基也长满菌丝；重复本过程，可持续获得大量的生防菌菌种；
方法2，PDA平板培养基扩繁：使用步骤（4）获得的PDA平板培养基生防菌菌种P1，接种至新的PDA培养基，置于T1温度下培养5～7d，菌丝可布满培养基表面，标记为P2；使用P1可扩繁出大量P2菌种，P2菌种直接进入下一步骤使用，不可重复接种，避免致病性衰退；
（7） 生防菌菌剂制备：使用磨浆机将步骤（6）扩繁的菌种粉碎，组培苗扩繁的生防菌带培养基和组培苗粉碎，PDA平板培养基扩繁的菌种，带培养基粉碎；将粉碎后的产物，使用50目筛网加水过滤，获得杂质少的混合浆体；将混合浆体加水定容成菌液，按每瓶组培苗菌种制备500ml或每培养皿菌种制备250ml菌液标准添加清水，菌液定容完成，每升菌液添加30g白糖，搅拌均匀，即获得菌剂。
在步骤（5）中，启动培养基的配方为MS+6-BA0.5g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8。
在步骤（5）中，继代培养基的配方为MS+6-BA0.1 g/L+矮壮素0.5 g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8。
所制备菌剂，现制现用。
该生防菌菌剂的应用方法：
使用喷雾器械，将菌剂喷洒在薇甘菊叶片表面；喷雾时间选择在晴天傍晚，阴天全天均可喷雾；喷雾后4h内遇雨，在喷雾后5～7d检查，如未发生可见侵染，需补喷；大风天气不可喷雾；
喷雾区域栽培物种为多年生植物，且该物种未开展步骤（2）安全性测试，需试用，确定安全后方可大面积喷雾；喷雾区域附近短期作物，如该物种未开展步骤（2）安全性测试，需尽量避免药剂飘移至该作物；
非靶标作物发病处理，使用步骤（3）筛选的杀菌剂，喷雾防治，且后续使用生防菌时，需避免相同情况发生。
本发明的意义：
利用病原真菌作为生防菌开展薇甘菊防控具备以下优势：（1）安全性好，病原菌寄主选择性，通过菌株筛选可实现对薇甘菊的高致病性和致死性，对其它植物及天敌不产生影响或影响轻微；（2）防控效果好，病原菌接种后随着侵入、定植、发病、病原菌自然传播及再侵染等一些列的病程发展，其对薇甘菊的防控效果将逐渐体现，且维持动态平衡，一次接种即可达到长期控制的效果；（3）降低防治成本，减轻环境危害，促进新的生态平衡的形成，最终使薇甘菊疫情得到自然控制。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明。
1） 待选病原菌纯培养获取
2017年4月，在化州市建设农场、茂名市森林公园，化州市石湾区薇甘菊集中发生区域开展病害调查，选择发生严重、明显对薇甘菊生物量及开花结果影响的病害采集病叶，保湿带回实验室。
使用常规组织分离方法，对病叶病健交界处进行分离，对获得的真菌菌株12个，进行单根菌丝分离纯化，编号1～12号。
将获得的真菌纯培养回接至活体薇甘菊叶片，按柯氏法则判断，其中1、7、9三个纯培养接种后2d可出现病斑，5d可使病斑中央叶片组织崩解，15d以后可观察到再侵染病斑，将病斑病健交界处分离，可获得与接种真菌一致的纯培养。
2） 待选病原菌安全性测试
2017年4月，选取桉树、橡胶、相思、马尾松、甘蔗、水稻、番薯、香蕉、龙眼、荔枝、黄瓜开展病原菌安全性测试。将步骤（1）获得的待选病原菌纯培养，接种至活体测试物种，5d、10d和15d观察测试物种发病情况。1号菌可使桉树、香蕉、番薯及黄瓜发病，经初步镜检，1号菌为尖镰孢，予以淘汰；7号菌为炭疽菌，可桉树、橡胶、番薯、香蕉及黄瓜发病，予以淘汰；9号菌为球黑孢，所选作物均未发病，补充试验可使番石榴发病，初步确定9号菌为生防菌，进入下一环节测试。
3）杀菌剂对生防菌的毒力测试
2017年5月1日，使用PDA平板球黑孢菌种打孔相同大小的菌丝块，接种至薇甘菊健康叶片，5月3日去除菌丝块。5月4日使用百菌清800倍液、多菌灵800倍液、霜霉威1500倍液、咪鲜胺1500倍液、丙环唑2500倍液、嘧菌酯3000倍液喷雾接种过生防菌的薇甘菊叶片，每种杀菌剂处理叶片10片。5月9日检查百菌清、多菌灵、霜霉威处理可见叶片发病，病斑直径0.8～1.0cm；5月15日检查丙环唑、嘧菌酯处理可见发病，丙环唑处理病斑直径为0.5cm、嘧菌酯处理病斑直径0.8cm，百菌清、多菌灵、霜霉威处理病斑扩展迅速，百菌清处理病斑直径1.8cm、多菌灵处理1.9cm、霜霉威处理病斑直径2.4cm；5月19日检查，咪鲜胺处理未见发病，丙环唑处理病斑未见明显扩展，其余处理病斑扩展迅速，可见卫星状再侵染斑。判断咪鲜胺为对生防菌毒力强的杀菌剂，次之为丙环唑。
4）生防菌温度测试
2017年5月1日，将生防菌接种至PDA培养基，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5月6日测量生防菌菌落直径，测量值为0.65cm、1.06cm、3.32cm、5.58cm、6.23cm、4.71cm、3.68cm、2.95cm，据此判断，较适宜病原菌生长温度为24℃～30℃，最适温T1为27℃。
2017年5月1日，将生防菌离体接种至薇甘菊叶片，使用培养皿保湿，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5月6日测量病斑直径，测量值分别为0.32cm、0.94cm、1.55cm、1.98cm、2.01cm、1.07cm、0.59cm、0.35cm，据此判断，较适宜生防菌侵染发病温度为18℃～30℃，最适温T2为24℃～27℃。
5）生防菌致病性保持
使用生防菌回接活体无菌薇甘菊组培苗的方式，保持生防菌致病性。
2017年4月采集外植体，共3个批次，外植体为薇甘菊带芽茎段作，清水洗净，75%酒精浸泡30S，0.1%升汞浸泡15min，无菌水清洗3次，接入高温灭菌的启动培养基，培养基配方为MS+6-BA0.5g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8。接种7～10d，外植体萌发无菌芽，剔除污染，将无菌芽转入相同配方的培养基。无菌芽培养15d后，形成带5～7对叶的无根苗，将无根苗分割为带一对叶（芽）的茎段，转接入配方为MS+6-BA0.1 g/L+矮壮素0.5 g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8的继代培养基，每瓶接种5个带叶（芽）茎段，15d后，重复本过程，即可获得大量薇甘菊无菌组培苗。2017年7月15日统计，获得了1500瓶薇甘菊无菌组培苗。
2017年7月15日开始回接生防菌至组培苗，将PDA平板培养基培养的生防菌，使用打孔器取菌饼，接种至薇甘菊无菌组培苗叶片，接种后24h，去除菌饼，7月18日记录，接种叶片可见蓬松菌丝，生长迅速，接种叶片发病，7月22日记录，未接种叶片被侵染发病，可见生长迅速的蓬松菌丝。挑取未接种叶片发病部位菌丝，回接至PDA平板培养基，即可获得致病性强的生防菌菌种，回接第一代菌种，标记为P1。
6） 生防菌扩繁
使用组培苗侵染扩繁。2017年7月25日开始扩繁，将步骤5未发病叶片菌丝，接种无菌组培苗，置于T1温度下培养，接种后10d，组培苗整瓶发病，培养基也长满菌丝。重复本过程，可持续获得大量的生防菌菌种。
7） 生防菌菌剂制备
2017年8月5日，使用磨浆机将步骤6扩繁生防菌带培养基和组培苗粉碎。将粉碎后的产物，使用50目筛网加水过滤，获得杂质少的混合浆体。将混合浆体加水定容成菌液，按每瓶组培苗菌种制备500ml或每培养皿菌种制备250ml菌液标准添加清水，菌液定容完成，每升菌液添加30g白糖，搅拌均匀，即获得菌剂。所制备菌剂，现制现用。
生防菌菌剂应用：
2017年8月5日傍晚使用背负式激动喷雾器喷雾，将菌剂喷洒在薇甘菊叶片表面，喷洒区域为荒地。2017年9月10日，喷洒寄生在龙眼园的薇甘菊。
2017年8月5日处理，在2017年9月5日，检查记录，喷雾薇甘菊植株，不同程度发病，采集标本镜检，除球黑孢以外，发现炭疽菌和茎点霉，对照区采集坏死老叶镜检未见以上三类孢子，说明生防菌可使薇甘菊致病，同时削弱了植株长势，其余病原菌可复发侵染，加重发病。2017年11月5日检查，处理区域发病严重，花量极少，处理区域附近5～8米，可见侵染，叶片发病，镜检可见球黑孢；对照区花量极大，整个植株出现花多叶少的现象。
2017年9月10日处理，2017年9月25日检查，可见明显发病。2017年10月25日检查记录，龙眼园薇甘菊基本发病，龙眼未发病，薇甘菊呈现衰退的迹象，同时发现，围园荆棘丛上覆盖的薇甘菊被侵染发病，对照区未见薇甘菊衰退，且部分寄主植物被薇甘菊完全覆盖。2017年11月，龙眼园清园，2018年5月10日检查记录，处理区薇甘菊植株较少，且普遍被侵染，选10株连片龙眼，铲除薇甘菊称量，处理区薇甘菊鲜重1.1kg，对照区薇甘菊植株较多，部分龙眼枝条被薇甘菊缠绕覆盖，薇甘菊鲜重为7.9kg。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换，本发明的保护范围由所附权利要求限定。
Claims (4)
1.一种薇甘菊生防菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包括下述步骤：
（1）待选病原菌纯培养获取：在本地薇甘菊集中发生区域开展病害调查，选择发生严重、明显对薇甘菊生物量及开花结果影响的病害采集病叶，保湿带回实验室；使用常规组织分离方法，对病叶病健交界处进行分离，对获得的真菌菌株，进行单根菌丝分离纯化；
将获得的真菌纯培养回接至活体薇甘菊，按柯氏法则判断，筛选致病强、可持续侵染发病的真菌纯培养，对所得纯培养编号并保存菌种；
（2）待选病原菌安全性测试：选取本地具备代表性的林业及农业植物桉树、相思、马尾松、甘蔗、水稻、番薯、香蕉、龙眼、荔枝、黄瓜开展病原菌安全性测试；将步骤（1）获得的待选病原菌纯培养，接种至活体测试物种，5d、10d和15d观察测试物种发病情况；
待选病原菌筛选方法，病原菌回接后，所选10种参试植物发病少于3种，且病斑不扩展，无再侵染现象，作为生防菌使用，其余病原菌淘汰；
如本步骤不能筛选出所需病原菌，则重复步骤（1），重新制备病原菌纯培养，直至选出符合标准的病原菌为止；如筛选合格的病原菌多于1种，则将所有病原菌使用PDA平板培养基，5d一个周期，培养6代，在培养结束后，回接至薇甘菊，选择致病性强的病原菌作为生防菌使用，其余淘汰；本步骤选定的病原菌需进行菌种的初步鉴定；
（3）杀菌剂对生防菌的毒力测试：使用步骤（2）获得的生防菌，PDA平板菌种打孔相同大小的菌丝块，接种至薇甘菊健康叶片，接种2d后去除菌丝块；选择百菌清、多菌灵、霜霉威、咪鲜胺、丙环唑、嘧菌酯代表性杀菌剂，按说明书浓度配制成溶液，喷雾接种过生防菌的薇甘菊叶片，每种杀菌剂处理叶片10片，在喷雾后5d、10d、15d，观察典型病斑的扩展情况；使用十字交叉法，测量各处理病斑扩展情况，同时观察有无卫星状再侵染病斑，病斑扩展面积最小且无再侵染斑的处理，为对生防菌毒力强的杀菌剂；
（4）生防菌温度测试：将生防菌接种至PDA培养基，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5d后测量生防菌菌落直径，直径最大的温度值，记录为T1，该温度为生防菌最适宜生长温度；将生防菌离体接种至薇甘菊叶片，使用培养皿保湿，分别置于15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃恒温培养箱，5d后测量发病病斑直径，直径最大的温度值，记录为T2，该温度为生防菌最适宜侵染发病温度；
（5）生防菌致病性保持：使用生防菌回接活体无菌薇甘菊组培苗的方式，保持生防菌致病性；薇甘菊组培流程，在晴天中午采集薇甘菊带芽茎段作为外植体，清水洗净，75%酒精浸泡30S，0.1%升汞浸泡15min，无菌水清洗3次，接入高温灭菌的启动培养基；接种7～10d，外植体萌发无菌芽，剔除污染，将无菌芽转入与启动培养基相同配方的培养基；无菌芽培养15d后，形成带5～7对叶的无根苗，将无根苗分割为带一对叶的茎段，转接入高温灭菌的继代培养基，每瓶接种5个带叶茎段，15d后，重复本过程，即可获得大量薇甘菊无菌组培苗；将PDA平板培养基培养的生防菌，使用打孔器取菌饼，接种至薇甘菊无菌组培苗叶片，接种后24h，去除菌饼，接种后3～4d，接种叶片可见蓬松菌丝，生长迅速，接种叶片发病，接种后5～7d，未接种叶片被侵染发病，可见生长迅速的蓬松菌丝；挑取未接种叶片发病部位菌丝，回接至PDA平板培养基，即可获得致病性强的生防菌菌种，回接第一代菌种，标记为P1；
（6） 生防菌扩繁：生防菌扩繁采用2种方法：
方法1，组培苗侵染扩繁：使用步骤（5）未发病叶片菌丝，接种无菌组培苗，置于T1温度下培养，接种后10d，组培苗整瓶发病，培养基也长满菌丝；重复本过程，可持续获得大量的生防菌菌种；
方法2，PDA平板培养基扩繁：使用步骤（4）获得的PDA平板培养基生防菌菌种P1，接种至新的PDA培养基，置于T1温度下培养5～7d，菌丝可布满培养基表面，标记为P2；使用P1可扩繁出大量P2菌种，P2菌种直接进入下一步骤使用，不可重复接种，避免致病性衰退；
（7） 生防菌菌剂制备：使用磨浆机将步骤（6）扩繁的菌种粉碎，组培苗扩繁的生防菌带培养基和组培苗粉碎，PDA平板培养基扩繁的菌种，带培养基粉碎；将粉碎后的产物，使用50目筛网加水过滤，获得杂质少的混合浆体；将混合浆体加水定容成菌液，按每瓶组培苗菌种制备500ml或每培养皿菌种制备250ml菌液标准添加清水，菌液定容完成，每升菌液添加30g白糖，搅拌均匀，即获得菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种薇甘菊生防菌的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，启动培养基的配方为MS+6-BA0.5g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8。
3.根据权利要求1所述的一种薇甘菊生防菌的制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，继代培养基的配方为MS+6-BA0.1 g/L+矮壮素0.5 g/L，蔗糖30g，卡拉胶5.8g，消毒前PH为5.8。
4.权利要求1至3制备得到的薇甘菊生防菌的应用方法，其特征在于，该应用方法包括：使用喷雾器械，将菌剂喷洒在薇甘菊叶片表面；喷雾时间选择在晴天傍晚，阴天全天均可喷雾；喷雾后4h内遇雨，在喷雾后5～7d检查，如未发生可见侵染，需补喷；大风天气不可喷雾；
喷雾区域栽培物种为多年生植物，且该物种未开展步骤（2）安全性测试，需试用，确定安全后方可大面积喷雾；喷雾区域附近短期作物，如该物种未开展步骤（2）安全性测试，需尽量避免药剂飘移至该作物；
非靶标作物发病处理，使用步骤（3）筛选的杀菌剂，喷雾防治，且后续使用生防菌时，需避免相同情况发生。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN114514836A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-05-20 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种抑制薇甘菊快速生长的生物方法 |
| CN114752509A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-07-15 | 华南农业大学 | 一种增效复配微生物制剂及其制备方法与在薇甘菊防治上的应用 |
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