CN114395487B - 一株核桃根腐病病原菌ml-1、生防菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体公开了一株核桃根腐病病原菌ML‑1及其应用，所述病原菌ML‑1的保藏编号为CGMCC 3.20697，保藏日期为2021年12月27日。本发明获得的病原菌ML‑1是引起当地核桃根腐病的病原菌之一，枯草芽孢杆菌对该病原菌有明显的抑制作用。

Description

一株核桃根腐病病原菌ML-1、生防菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株核桃根腐病病原菌ML- 1、生防菌剂及其应用。

背景技术

石漠化是一种由人为因素引起的植被破坏、水土流失、土地退化现象。广西石漠化面积达3000多万亩，仅次于云南和贵州，居全国第三位，河池市作为桂西北喀斯特地貌主要地区，其石漠化现象尤为严重。严重的石漠化对当地的生态、社会经济及人民生活都会造成严重的影响，其治理工作已成为当下重要任务。石漠化地区因其特有的恶劣条件，使得以林草为主的治理工程收效甚微，如何有效的修复石漠化，其保护水土资源、防止水土流失是关键。

核桃(Juglans regia L.)在我国经济树种中有重要地位，是世界著名四大干果之首，具有极高的经济价值。我国有着悠久的核桃栽培历史，是世界核桃栽培起源地之一，但因种植技术粗犷、管理经验匮乏，病虫害现象严重，导致我国核桃产品在国际市场的占有率和售价方面竞争力较弱。

河池市是广西石漠化最严重的地区之一。自2012年起河池市在石漠化地区开始规模化种植核桃，现已发展到260多万亩，现已成为西南岩溶石漠化地区核桃种植面积最大的市，亦是华南地区核桃种植面积最大的市。但因技术、管理、环境等各种原因引起的病虫害尤为严重。

国内对核桃根腐病的相关研究不多，能够引起核桃根腐病的病原菌有镰刀菌、腐霉菌、丝核菌、疫霉菌、链格孢菌和蠕孢菌等，而镰刀菌是真菌感染的主要致病菌。

根腐病属土传病害，真菌孢子易扩散，防治难度较大。目前国内主要是以化学防治为主，但是对环境易造成污染。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株核桃根腐病病原菌ML-1、生防菌剂及其应用，所述病原菌ML-1是引起核桃根腐病的病原菌之一，枯草芽孢杆菌对该病原菌有明显抑制作用。

本发明的第一个目的是提供了一株核桃根腐病病原菌ML-1，所述病原菌 ML-1的保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CGMCC 3.20697。

进一步地，所述病原菌ML-1培养所用的培养基为真菌培养基。

进一步地，所述真菌培养基为PDA培养基。

进一步地，所述PDA培养基配方为：PDA培养基200g，葡萄糖20g，琼脂15g，无菌水1L。

本发明第二个目的是提供了一种抑制上述病原菌ML-1的生防菌剂。

进一步地，所述生防菌剂包括枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述生防菌剂由枯草芽孢杆菌制成。

本发明第三个目的是提供了所述生防菌剂在防治核桃根腐病中的用途。

进一步地，所述核桃根腐病由病原菌ML-1引发。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种一株核桃根腐病病原菌ML-1，所述病原菌ML-1是引起核桃根腐病的病原菌之一，枯草芽孢杆菌对该病原菌有明显的抑制作用，能够用于核桃根腐病的防治。

生物材料保藏信息说明

ML-1，在本申请中称作病原菌ML-1，已于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3.20697，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明分离获得的病原菌ML-1的菌株形态图和电镜扫描图；

其中，A为ML-1的菌株形态图；

B为ML-1的电镜扫描图；

图2为本发明中病原菌ML-1和枯草芽孢杆菌的对峙效果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明提供了一株核桃根腐病病原菌ML-1、生防菌剂及其应用。

具体实施例如下：

实施例1

一、材料

1、实验培养基及配方

筛选培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，无菌水1L。青霉素钠、硫酸链霉素。

真菌培养基：PDA培养基200g，葡萄糖20g，琼脂15g，无菌水1L。

细菌培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，无菌水950ml，5mol/L氢氧化钠溶液50ml。

2、实验材料

病原菌筛选材料：河池市周边有典型病症的核桃植株根系组织。

拮抗菌：枯草芽孢杆菌，实验室保存菌株。

二、实验方法

1、病原样本采集

在河池市周边核桃种植园采集因核桃根腐病感染而枯死的植株根部组织，发病植株死亡的原因为枝干枯死，放置在4℃冰箱中短期保存，备用。

2、病原真菌分离

将采集到的患病植株根部用解剖刀切取边长为0.5cm的正方体根块，先用自来水清洗干净，放入在超净工作台内的装有滤纸的培养皿中，充分吸干根块表面水分后采用三步法对表面进行消毒，消毒后用无菌水冲洗干净。将处理后的根块放于装有滤纸的培养皿中，充分吸干根块表面水分，用镊子将根块插入筛选培养基中，置于恒温培养箱培养，待长出菌落，用接种针从菌落边缘挑取菌丝接到PDA平板中培养，备用。

3、病原菌致病性测定

将筛选出的病原菌活化，后在培养皿中倒入无菌水，用接种环轻轻刮菌丝，使病原菌分生孢子在无菌水中制成菌悬液，将菌悬液稀释至孢子个数为 1×10^-6个/ml，备用。健康核桃幼苗根部用无菌水冲洗干净，后用75％酒精消毒，用解剖刀将核桃幼苗一条侧根切开一个伤口，用菌悬液对伤口浸泡2h，后将核桃幼苗种于育苗盆中，育苗盆中的土为无菌土，最后将浸泡后的菌悬液浇在核桃幼苗根部；以无菌水作为对照。完成接种后将两组植株放在相同环境培养，记录两组植株生长情况。待实验组发病后，对发病组的核桃幼苗根组织切块重新分离致病菌，通过比较观察重新分离的致病菌是否和接种的致病菌一致。

4、核桃根腐病病原菌形态学鉴定

将病原菌活化后参照林晓民等的《中国菌物》对病原菌菌落大小和形状、菌丝外形、菌落生长情况，用光学显微镜观察并记录菌丝亚显微形态，并在电子显微镜下观察菌丝、分生孢子和孢子梗的显微结构特征。

5、拮抗菌对峙实验

将病原菌和拮抗菌(枯草芽孢杆菌)活化，在装有培养基的直径为9cm 的培养皿中，在距离培养皿中心2cm处接两株核桃根腐病病原菌，两株病原菌过培养皿中心点成一条直线。置于培养箱中培养两天，待菌丝长出后，在两株病原菌中心接种筛选到的拮抗菌，后置于培养箱继续培养，观察现象。

三、实验结果

1、核桃根腐病病原菌菌株分离、纯化

经过分离纯化，获得一株核桃根腐病病原菌，记为ML-1。

2、核桃根腐病病原菌致病性实验

经回染的健康核桃幼苗在培养30天后，试验组出现核桃根腐病典型的病症，用无菌水浇灌的对照组核桃幼苗都没明显病症。实验组植株的叶片变黄，有的开始出现叶片萎蔫现象，挖掘根部，发现根部发黑，部分开始腐烂，症状与典型核桃根腐病症状类似。对发病植株根部组织切块用PDA培养基培养，观察得到的病原菌菌落形态和原先接种的病原菌菌落形态，发现两种病原菌菌落形态和生长情况相同，初步证明该病原菌是河池市石漠化地区核桃根腐病病原菌。

3、形态学鉴定

ML-1菌株经培养后，菌落平均半径为2.50cm，菌丝颜色为白色，外形呈絮状(图1左)，菌落有两种类型的分生孢子，小型分生孢子外形为卵圆形，大小相差不大，无分隔或有一个分隔(如图1右)，在接种后2-3天出现，平均大小为6×8μm；大型分生孢子，在接种后3-5天后出现，外形为镰刀型，有 1-3个分隔，大小差别不大。依据以上形态观察，可以初步鉴定为木贼镰刀菌。

4、拮抗菌对峙实验

如图2所示，虽然核桃根腐病病原菌先长出菌丝，但是在接入拮抗菌五天后，病原菌和拮抗菌之间有明显的抑菌带，说明拮抗菌对病原菌有良好的抑菌效果，也就是说枯草芽孢杆菌对本申请的ML-1菌株具有抑制作用。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.一株核桃根腐病病原菌木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）ML-1，其特征在于，所述病原菌ML-1的保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CGMCC 3.20697。