CN108148768B - 一株球托霉菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株球托霉菌菌株及其应用，属于微生物应用技术领域。该菌株为球托霉菌w5菌株，保藏编号为CCTCC：M2017787。本发明将球托霉菌w5孢子配成菌剂，在植物种子萌发并长出2对真叶后，对植物进行根系浇灌，所制得的球托霉菌菌剂可以有效促进植物幼苗的生长，提高作物的抗病能力，在农业生产过程中具有应用潜力。

Description

一株球托霉菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一株球托霉菌菌株及其应用，特别是涉及球 托霉菌w5菌剂的发酵制备方法及其在促进植物生长中的应用。
背景技术
目前，我国人均农业耕地不足1.3亩，仅为美国人均耕地面积的1/6。随着工业化、城镇化步伐加快，我国耕地数量仍在不断减少。另外，由于土壤肥力低等因素，农民为 了确保高产而过量施用化学肥料。例如，当前我国粮食产量占世界的16％，化肥用量 占世界的31％，每公顷用量是世界平均水平的4倍以上。长期不合理过量使用化肥， 造成土壤结构变差、土壤板结、地力下降、农作物减产，农产品硝酸盐含量过高、重金 属含量超标等缺陷，而大量和过量的氮肥和重金属流失于环境中，污染土壤、水体、空 气，威胁人类的食物安全和健康。
微生物菌肥又称作微生物接种剂，是指含有微生物活体的特定制剂，主要分为两大 类，即微生物菌剂类和微生物肥料类。其中，菌剂类主要有固氮菌、根瘤菌、光合菌、 解钾菌和复合菌剂等；肥料类产品即生物有机肥和复合微生物菌肥。因微生物的生命活 动及其代谢产物使得植物得到特定肥效，微生物菌肥在农业可持续发展，保护生态环境 方面有着良好的发展前景。与普通化学肥料比较，微生物菌肥应用于农业生产中有着独 特的优势：(1)不破坏土壤结构，对人、畜等无毒无害；(2)肥效持久；(3)提高 作物产量和改善其品质；(4)成本低廉。
近年来，我国微生物肥料等新型肥料产业正在快速成长，年产量达到900万吨以上。 目前，我国生产应用的微生物肥料按照微生物功能类别可分为固氮菌类、解磷菌类、解钾菌类、光合细菌类、菌根菌类、抗生菌类、复合菌类等，但以固氮菌类、解磷菌类、 解钾菌类和复合菌类为主，而光合细菌类、菌根菌类、抗生菌类的研究较少，仅有个别 有关促进植物生长的根际微生物的报道。总体上，应用细菌如细菌和放线菌作为材料开 发的菌肥远远超过真菌菌肥。
球托霉菌属于小克银汉霉科(Family Cunninghamellaceae)真菌。目前，对该属真菌的研究主要集中于其壳聚糖的编码基因、壳聚糖的合成、以及部分糖苷水解酶如β- 葡萄糖苷酶等的研究。在农业生物技术领域，因该属真菌对土壤中有效氮和磷较敏感， 被用于测定土壤中有效氮或磷的储存量。然而，目前为止，还没有球托霉菌属来源真菌 用于促进植物生长应用的报道。
发明内容
本发明提供了一株球托霉菌菌株，具有有效促进植物幼苗生长、提高作物抗病能力 的作用。
一种球托霉菌菌株，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学， 其保藏名称为球托霉菌w5菌株，保藏编号为CCTCC：M2017787，保藏日期为2017 年12月12日。依据形态学特征和分子数据分析，该菌株的分类命名为Gongronella sp. w5。
本发明提供上述球托霉菌菌株在促进植物生长中的应用。
本发明还提供了一种促进植物生长的球托霉菌菌剂的制备方法，制备步骤如下：
取孢子浓度为1～5×108个/mL的球托霉菌菌剂，在苗木种子萌发并长出2对真叶后， 按照5～15mL/株苗木浇灌根部，后续苗木按照正常田间管理即可。
作为优选，本发明所述球托霉菌w5菌剂的孢子数为3×108/mL。
作为优选，本发明所述制备步骤中的浇灌量为10mL/株。
进一步的，制备孢子使用的发酵菌株为球托霉菌w5，经培养基发酵培养获得发酵液，发酵液经分级分离后获得所述孢子。
更进一步的，所述发酵培养是指将球托霉菌w5接种在经灭菌的发酵培养基中， 在温度为25～31℃、摇床转速为100～150rpm条件下培养3～7天后收集发酵液备用；所 述发酵培养基为每升液体培养基中含10～20g蔗糖、1～2g酵母提取物、0.7～1.5g KH2PO4、0.02～0.15g Na2PO4·7H2O、0.01～0.05g CaCl2。
作为优选，所述的发酵培养基为每升液体培养基中含15g蔗糖、1.5g酵母提取物、1g KH2PO4、0.1g Na2PO4·7H2O、0.01g CaCl2。
进一步的，所述分级分离依次包括以下步骤：
制备的发酵液先经过4～8层纱布过滤；再将滤液经过1000～5000×g离心力离心收 集沉淀孢子。
本发明还提供了一种采用上述制备方法制得的球托霉菌菌剂。
附图说明
图1是球托霉菌w5菌株处理组和对照组猕猴桃植株株高实验结果对比图；
图2为JF8接种后15天植株叶片感染情况，其中，从左至右分别a为清水对照组、 b为球托霉菌w5菌株处理组、c为未施用球托霉菌w5菌剂组；
图3为JF8接种后15天植株枝条感染情况，其中，从左至右分别A为清水对照组， B为球托霉菌w5菌株处理组、C为未施用球托霉菌w5菌剂组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但应该理解这些实施例并非限制本发明的 范围。
实施例1含有本发明球托霉菌菌剂的发酵制备
1、球托霉菌w5菌株的活化
斜面保藏的球托霉菌w5挑取至CPDA斜面上，28℃静置培养3天以活化菌株。
2、培养基的配制及灭菌
配制发酵培养基(15g蔗糖、1.5g酵母提取物、1g KH2PO4、0.1g Na2PO4·7H2O、0.01g CaCl2)，115℃灭菌20min备用。
3、球托霉菌w5菌株孢子的发酵制备
挑取直径活化的4mm球托霉菌w5菌丝体5块，接种到灭菌的发酵培养基中，28℃，120rpm振荡培养4d，4层纱布过滤菌丝体，收集的发酵液在2400×g离心力条件下离 心收集孢子，孢子使用磷酸盐缓冲液(pH 7.5)稀释成3×108/mL备用。
实施例2含有本发明球托霉菌菌剂在促进猕猴桃植株生长方面的应用
1、猕猴桃植株的盆栽种植
取园艺营养土(购于裕丰花市)和普通土(安徽农业大学农翠园)按照1:1混合。 培养基质于0.14MPa，120℃灭菌2小时备用。
将“红阳”猕猴桃种子播种于装灭菌土的栽培盆中，共120盆。待猕猴桃长出2 对真叶后进行间苗移栽，每盆留存高矮一致，生长整齐的实生苗3-5棵。
2、球托霉菌w5菌剂的施用
间苗移栽后，立即将球托霉菌w5孢子悬液(3×108/mL)按照10mL/株直接浇灌 处理60盆猕猴桃植株根部，60盆浇灌无菌水作为对照。
3、生物学性状考察记载
间苗后每隔一月随机抽取对照组与处理组猕猴桃6盆，用常规方法测定植株高度，处理与对照株高有差异后，测定猕猴桃植株叶片数，茎粗，地上部分和根系鲜重，并使 用根系扫描仪扫描测定猕猴桃叶面积、根面积等。
施用球托霉菌w5菌剂后60天，球托霉菌w5菌株处理组和对照组猕猴桃植株株高实验结果对比图见图1，实验结果表明，处理组猕猴桃植株生长显著优于对照组。
施用球托霉菌w5菌剂后60天，球托霉菌w5菌株处理组和对照组猕猴桃植株各生理指标见表1。
Figure BDA0001586624520000041
注：t检验法进行分析，处理组与对照组相比，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差 异显著(P<0.05)。
实验结果表明，处理组猕猴桃植株叶片数、茎粗、地上部分和根系鲜重、叶面积、根面积等指标均显著优于对照组猕猴桃植株。
叶绿素的测定选择从顶叶开始倒数第2对叶片，用SPAD-502叶绿素仪通过测量叶片在两种波长650nm和940nm光学浓度差方式来确定叶片当前叶绿素的相对含量；叶 绿素荧光测定选择从顶叶开始倒数第2对叶片，使用叶绿素荧光仪器PAM-2000测定 猕猴桃叶片叶绿素初始荧光(F0，是PSⅡ反应中心处于完全开放时的荧光产量)、最 大荧光(Fm，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量)、最大荧光与初始荧光差 值(Fv)、PSII原初光能转化效率(Fv/Fm，是PSⅡ最大光化学量子产量)、PSII潜 在活性(Fv/F0)，非光化学淬灭值(NPQ)，光化学淬灭值(qP)。
球托霉菌w5菌株处理组和对照组猕猴桃叶片叶绿素荧光见表2。
Figure BDA0001586624520000042
注：t检验法进行分析，处理组与对照组相比，**表示差异极显著(P<0.01)，* 表示差异显著(P<0.05)。
结果表明，对照组叶绿素含量显著低于处理组叶绿素含量。
实施例3含有本发明球托霉菌菌剂在促进猕猴桃植株抗病方面的应用
选择球托霉菌w5菌剂处理和未处理60天后猕猴桃植株各6盆，选取活化培养的 猕猴桃溃疡病代表菌株JF8，用牙签蘸取JF8单菌落，刺戳“红阳”猕猴桃叶片，以及 实生苗第一对真叶和第三对真叶之间，深达木质部，以清水作为对照。将接种后猕猴桃 置于温度20℃光照培养箱中培养；接种后15天，观察发病情况。实验结果见图2，结 果表明，施用球托霉菌w5菌剂的植株叶片与清水对照组相当，无病原微生物感染现象 发生，而接种病原微生物的对照组叶片均出现病斑。茎干感染实验结果见图3，结果表 明，施用球托霉菌w5菌剂的植株与对照组均出现感染病斑，但对照组较施用球托霉菌 w5菌剂植株感染程度严重。上述实验结果表明球托霉菌w5菌剂可有效提高“红阳” 猕猴桃植株抗溃疡病病菌侵染。

Claims (1)

1.一种球托霉菌菌剂在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述球托霉菌菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏名称为球托霉菌w5菌株，保藏编号为CCTCC：M2017787；
所述促进植物生长的球托霉菌菌剂的制备方法步骤如下：
取孢子浓度为1~5×108个/mL的球托霉菌菌剂，在苗木种子萌发并长出2对真叶后，按照5~15 mL/株苗木浇灌根部，后续苗木按照正常田间管理即可。
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