CN114175996B - 一种丛枝菌根真菌的扩繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，涉及真菌扩繁技术领域。本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，利用不同的培养基质和宿主，与菌种之间产生良好的互作效应，显著提高丛枝菌根真菌的侵染程度和产孢量，为菌根生物技术的大范围应用提供切实依据。

Description

一种丛枝菌根真菌的扩繁方法
技术领域
本发明属于真菌扩繁技术领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌的扩繁方法。
背景技术
丛枝菌根(arbuscularmycorrhizal,AM)真菌是一类广泛分布于土壤中的有益微生物，能与绝大多数高等植物根系形成共生体系。AM真菌具有一系列有益的生理生态效应，其可以通过巨大的菌丝网络庞大的菌丝网络系统，不仅增强宿主植物对土壤中氮、磷、钾等元素的吸收能力，还可以增强植物耐盐碱胁迫、干旱胁迫、重金属污染和病虫害等各种逆境胁迫的能力，有利于植物的生长发育，对于农林业生产及园林绿化具有重要意义。
近年来，AM真菌作为一种新型的生物菌肥成为人们研究的热点。AM真菌的促生机理已被阐明，菌剂的开发应用成为当前紧要的任务。盆栽培养法是目前商业化AM真菌菌剂扩繁的主要方式，操作简易、方法可靠。在盆栽培养法中，AM真菌生长发育受宿主植物、栽培基质、温度、光照、营养等诸多因素的影响，其中宿主植物与培养基质是影响AM真菌培养的主要因素。对于不同的宿主植物和培养基质AM真菌会产生不同的响应。此外，现有菌根真菌生产过程仍存在费用昂贵，菌剂生产数量有限、孢子繁殖体数量少、质量不稳定和种植管理程序繁琐等问题，因此研制一套高效简易的AM真菌的扩繁技术体系和方法在生产实践中具有重要的应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，方法简单且产孢量巨大，可以高效扩繁AM真菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，包括以下步骤：将丛枝菌根真菌的菌剂接种到培养基质中，然后播种宿主植物的种子，出苗4周后至出苗5个半月期间，每周浇灌一次减半含磷量的Hoagland营养液，停止浇灌后剪掉地上部分，6个月收获得到丛枝菌根真菌的繁殖体；
所述培养基质包括无机混合基质或无机与有机的混合基质。
优选的，所述无机混合基质包括沸石与河沙的混合基质或河沙与蛭石和珍珠岩的混合基质；
所述无机与有机的混合基质包括河沙与蛭石和草炭的混合基质。
优选的，所述无机混合基质包括沸石与河沙按照体积比1:1混合得到的混合基质，或河沙与蛭石和珍珠岩按照体积比2:1:1混合得到的混合基质；
所述无机与有机的混合基质包括河沙与蛭石和草炭按照体积比1:4:1混合得到的混合基质。
优选的，所述种子包括高粱、玉米和红三叶草中的一种或两种种子。
优选的，当以沸石和河沙的混合基质作为培养基质时，以高粱或高粱和红三叶草的混合为宿主植物；
当种植高粱时，每盆种植25颗种子，留苗15棵；
当种植高粱和红三叶草的混合时，每盆种植20颗高粱种子，留苗10棵，种植40颗红三叶草种子，留苗20株；
所述盆为AB280的花盆，底部口径为15.5cm，顶部口径为25cm，高度为17.5cm。
优选的，当以河沙、蛭石和珍珠岩的混合基质作为培养基质时，以玉米为宿主植物；
当种植玉米时，每盆种植8颗种子，留苗4棵；
所述盆为AB280的花盆，底部口径为15.5cm，顶部口径为25cm，高度为17.5cm。
优选的，当与河沙、蛭石和草炭的混合基质作为培养基质时，以玉米和红三叶草的混合作为宿主植物；
种植玉米种子时，每盆种植8颗种子，留苗3棵；种植红三叶草时，每盆种植80颗种子，留苗40株；
所述盆为AB280的花盆，底部口径为15.5cm，顶部口径为25cm，高度为17.5cm。
优选的，所述丛枝菌根真菌包括根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradice)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、幼明近套球囊霉(Glomus etunicatum)、脆无梗球囊霉(Acaulospora delicate)和变形球囊霉(Glomus versiforme)。
优选的，所述播种后控制温度16～25℃，每天光照16h。
优选的，每周除浇灌一次所述减半含磷量的Hoagland营养液外，还包括浇水1～3次。
有益效果：本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，利用不同的培养基质和宿主，与菌种之间产生良好的互作效应，显著提高丛枝菌根真菌的侵染程度和产孢量，为菌根生物技术的大范围应用提供切实依据。
本发明实施例中，Rhizophagus intraradice与4种不同的基质和宿主植物组合均能形成良好的共生体系，菌根侵染率分别高达99.17％、100％、100％和99.17％；在基质为河沙+蛭石+草炭(1:4:1)、宿主植物为玉米+红三叶草的组合中，Rhizophagus intraradice达到最佳的扩繁效果，孢子数目为1912个/g干土，并且扩繁后Rhizophagus intraradice孢子密度较购买的商品菌剂孢子数增加了2～3倍。在所述模式下，其他AM真菌扩繁后，Glomusmosseae孢子数目为711个/g；Glomus versiforme孢子数目为1970个/g；Glomusetunicatum孢子数目为1530个/g；Acaulospora delicate孢子数目为493个/g。因此本发明所述扩繁方法达到高效扩繁AM真菌繁殖体的目的。
附图说明
图1为不同基质和宿主中的丛枝和泡囊结构，图中字母表示不同处理，下同；
图2为不同基质和宿主组合对AM真菌产孢量的影响；
图3为不同基质和宿主的产孢情况。
具体实施方式
本发明提供了一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，包括以下步骤：将丛枝菌根真菌的菌剂接种到培养基质中，然后播种宿主植物的种子，出苗4周后至出苗5个半月期间，每周浇灌一次减半含磷量的Hoagland营养液，停止浇灌后剪掉地上部分，6个月收获得到丛枝菌根真菌的繁殖体；
所述培养基质包括无机混合基质或无机与有机的混合基质。
本发明所述丛枝菌根真菌优选包括根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradice)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、幼明近套球囊霉(Glomus etunicatum)、脆无梗球囊霉(Acaulospora delicate)和变形球囊霉(Glomus versiforme)，其中根内根孢囊霉、摩西球囊霉、幼明近套球囊霉和脆无梗球囊霉，由北京市农林科学院丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)提供；变形球囊霉，由青岛农业大学菌根生物技术研究所提供。
本发明将所述AM真菌的菌剂接种到培养基质中，所述培养基质包括无机混合基质或无机与有机的混合基质。本发明所述无机混合基质优选包括沸石与河沙的混合基质或河沙与蛭石和珍珠岩的混合基质，且所述沸石与河沙的体积比优选为1:1，河沙与蛭石和珍珠岩的体积比优选为2:1:1。本发明所述无机与有机的混合基质优选包括河沙与蛭石和草炭的混合基质，且河沙与蛭石和草炭按照体积比优选为1:4:1。在本发明所述无机与有机的混合基质由于良好的透气性和高保水能力有助于菌根的延伸和扩展，促进AM真菌菌丝和孢子的发育。
本发明优选通过盆栽培养法进行所述AM真菌的扩繁，因此在接种时，优选首先装入2/3体积的所述培养基质，平铺菌剂，再装入剩余1/3的培养基质。本发明所述菌剂与培养基质的质量比优选为1:100。本发明所述培养基质在接种菌剂前优选还包括灭菌，所述灭菌优选包括将所述培养基质在121℃中灭菌1h。本发明所述扩繁方法为温室扩繁，所以在进行所述扩繁前，优选还包括用消毒液对温室和培养容器进行消毒。本发明所述容器优选为盆，所述盆优选为AB280的花盆，底部口径为15.5cm，顶部口径为25cm，高度为17.5cm。在本发明实施例中，每个盆中优选装入2kg所述培养基质。
本发明在装入剩余1/3的培养基质后播种宿主植物的种子，所述宿主植物优选包括高粱、玉米和红三叶草中一种或两种，更优选包括玉米、玉米+红三叶草、高粱或高粱+红三叶草。本发明所述种子在进行播种前优选还包括消毒和催芽，所述消毒优选包括采用浓度为10％(v/v)的双氧水消毒20min。本发明所述催芽优选包括将经消毒后的种子用清水浸泡一整夜(8～12h)后于培养箱中28℃黑暗催芽。
本发明对所述播种的方法并没有特殊限定，如在实施例中在盆中进行播种，单纯种植高粱时，优选每盆每盆播种25颗，留15棵；单纯种植玉米时，优选每盆播种8颗，留苗4棵；混合种植高粱和红三叶草时，高粱每盆播种20颗，留10棵，红三叶草每盆播种40颗，留20株；混合种植玉米和红三叶草时，玉米每盆播种8颗，留3棵，红三叶草每盆播种80颗，留40株。在本发明实施例中，当以沸石和河沙的混合基质作为培养基质时，以高粱或高粱和红三叶草的混合为宿主植物；当种植高粱时，优选每盆种植25颗种子，留苗15棵；当种植高粱和红三叶草的混合时，优选每盆种植20颗高粱种子，留苗10棵，种植40颗红三叶草种子，留苗20株。当以河沙、蛭石和珍珠岩的混合基质作为培养基质时，以玉米为宿主植物；当种植玉米时，每盆种植8颗种子，留苗4棵。当与河沙、蛭石和草炭的混合基质作为培养基质时，以玉米和红三叶草的混合作为宿主植物；种植玉米种子时，每盆种植8颗种子，留苗3棵；种植红三叶草时，每盆种植80颗种子，留苗40株。
本发明在所述播种后优选还包括盖苗和浇水，所述盖苗优选为利用所述培养基质覆盖2cm。本发明优选于出苗1周后定苗，出苗4周后每周用减半含磷量的Hoagland营养液浇一次，并以干湿交替原则浇水；出苗5个半月后停止浇灌任何液体，剪掉地上部分，6个月收获。本发明每周浇所述减半含磷量的Hoagland营养液和水时，以干湿交替原则进行浇水，保证每周浇含磷量的Hoagland营养液一次，其余时间均浇水，浇水量和浇水次数以满足植物正常生长即可。
本发明在所述播种后，优选还包括播后管理，更优选包括：温度：25/16℃(白天/夜晚)；湿度：60％的相对湿度；光照时间：16小时。本发明对所述播后管理期间的光照度并没有特殊限定，300～1300μmol m-2s-1均可。
本发明实施例中，在得到所述繁殖体后优选还包括利用高粱测定所述繁殖体的侵染势，所述测定的方法优选包括平均侵染法(Mean Infection Percentage,MIP)。本发明对所述MIP的测定方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种丛枝菌根真菌的扩繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用的真菌，Rhizophagus intraradice：由北京市农林科学院丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)提供，孢子数620个/g；
Glomus mosseea、Glomus etunicatum和Acaulospora delicate均由北京市农林科学院丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)提供，为商品化菌剂；
Glomus versiforme由青岛农业大学菌根技术研究所提供。
实施例1
一、方法
1、Rhizophagus intraradice扩繁
以不同的培养基质和宿主植物扩繁Rhizophagus intraradice，共4个处理，每个处理4次重复，共计16盆(AB280花盆，每盆装入2kg培养基质，接种20g菌剂)。
处理A：沸石+河沙(1:1)；宿主植物：高粱(每盆播种20颗，留10A棵)+红三叶草(每盆播种40株，留20株)；
处理B：沸石+河沙(1：1)；宿主植物：高粱(每盆播种25颗，留15棵)；
处理C：河沙+蛭石+珍珠岩(2：1：1)；宿主植物：玉米(每盆播种8颗，留苗4棵)；
处理D：河沙+蛭石+草炭(1：4：1)；宿主植物：玉米(每盆播种8颗，留苗3棵)+红三叶草(每盆播种80颗，留40株)。
播种前，对所用基质进行121℃灭菌1h，并用消毒液对温室和培养容器进行消毒。挑选饱满、均一的宿主植物种子，采用浓度为10％H2O2消毒20min，然后用清水浸泡一整夜后于培养箱中28℃黑暗催芽。接入AM真菌菌剂时，先装入2/3的基质，平铺菌剂，再装入剩余1/3的基质，播种后，盖苗，浇水。出苗大约1周后定苗。出苗4周后，每周用减半含磷量的Hoagland营养液浇一次，其余时候浇水，浇营养液和水采用干湿交替原则。5个半月后停止浇灌，剪掉地上部分，6个月收获。
2、Rhizophagus intraradice繁殖体的测定
采用平均侵染法进行扩繁菌剂繁殖体的测定。将不同基质和宿主组合扩繁的4种Rhizophagus intraradice进行菌根化高粱育苗，每个处理重复12次，设立空白无菌剂对照，共计51穴。基质为沸石+河沙(1:1)。播种前，高粱种子用10％H2O2消毒20min，用清水浸泡一晚于培养箱中28℃黑暗中催芽。基质进行121℃灭菌1h。基质：菌种＝9：1(v:v)，基质与菌种充分混合，播种后，盖苗，浇水，在出苗1周左右进行定苗。在出苗2周后，定时浇减半含磷量的Hoagland营养液，1个月后收获。
3、其他菌剂扩繁
选用产孢量最高的D处理扩繁Glomus mosseea、Glomus etunicatum、Acaulosporadelicate、Glomus versiforme，其他处理同Rhizophagus intraradice扩繁。
4、收样时测定地上部鲜重、菌根侵染率、采用湿筛-倾注-蔗糖离心法分离AM真菌孢子，在体式显微镜下记录孢子数量：
其中菌根侵染率的测定方法为曲利苯蓝染色法，同Phillips J M,Hayman DS.Improved procedures for clearing root sand staining parasitic andvesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J].Transactions of the British Mycological Society,1970,55(01):158,IN161-IN18；
分离AM真菌孢子并计算的方法为湿筛-倾注-蔗糖离心法，同刘润进,陈应龙.菌根学[M].北京:科学出版社,2007:1-40。
二、结果
1、不同处理对AM真菌生长发育的影响
1.1不同处理对AM真菌侵染率的影响
四种处理的侵染率无显著性差异(表1)，分别为99.17％、100％、100％和99.17％；处理A的侵染强度与处理B无显著性差异，与其他处理存在显著性差异，各个处理的侵染强度分别为80.53％、72.5％、69.25％和69.83％；各个处理之间丛枝丰度没有显著性差异(图1)，分别为61％、55.25％、55.92％和56.9％。处理A泡囊丰度与处理B无显著性差异，与其他处理存在显著性差异，分别为48.48％、40.5％、36.5％和33.98％。
表1不同基质和宿主组合对AM真菌侵染程度的影响
Figure BDA0003398360550000081
1.2不同处理对真菌孢子数的影响
处理D产孢量最高(图2和图3)，与处理B无显著性差异，与其他处理存在显著性差异，各个处理的产孢量分别为1338个/g干土、1633个/g干1268个/g干土和1912个/g干土。
2、Rhizophagus intraradice繁殖体的测定
结果如表2所示，各个处理的侵染率无显著差异，均为100％；接种处理A扩繁的Rhizophagus intraradice高粱幼苗根系侵染强度最高，与其他处理间存在显著性差异，各个处理的侵染强度分别为53.39％、41.24％、38.21％和41.72％。除接种处理C扩繁的Rhizophagus intraradice外，其他接种处理地上部鲜重均高于对照，接种处理D扩繁的Rhizophagus intraradice高粱地上部鲜重最高，为0.5g，接种处理A扩繁的Rhizophagusintraradice高粱地上部鲜重次之，为0.48g，与CK存在显著性差异；接种处理B扩繁的Rhizophagus intraradice高粱地上部鲜重为0.42g，与CK不存在显著性差异。
表2高粱幼苗侵染和生长情况
Figure BDA0003398360550000082
3、同一条件对不同AM真菌产孢量的影响
选用产孢量最高的D处理对其他四种不同AM真菌进行扩繁。扩繁后孢子数目较扩繁前增加明显(表3)。孢子数增加最多的是Glomus versiforme，扩繁后孢子数目为1970个/g干土，较扩繁前扩大35.18倍，其次为Glomus mosseae，扩繁后孢子数目为711个/g干土，较扩繁前扩大6.23倍；Acaulospora delicate扩繁后孢子数目为493个/g干土，较扩繁前扩大4.18倍；扩大倍数最低的为Glomus etunicatum，扩繁后孢子数目为1530个/g干土，较扩繁前扩大2.92倍。
表3同一条件对不同AM真菌产孢量的影响
Figure BDA0003398360550000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种丛枝菌根真菌的扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：将丛枝菌根真菌的菌剂接种到培养基质中，然后播种宿主植物的种子，出苗4周后至出苗5个半月期间，每周浇灌一次减半含磷量的Hoagland营养液，停止浇灌后剪掉地上部分，6个月收获得到丛枝菌根真菌的繁殖体；每周除浇灌一次所述减半含磷量的Hoagland营养液外，还包括浇水1～3次；
通过盆栽培养法进行所述丛枝菌根真菌的扩繁，所述容器为盆，所述盆为AB280的花盆，底部口径为15.5cm，顶部口径为25cm，高度为17.5cm；每个盆中装入2kg所述培养基质；
以河沙、蛭石和草炭的混合基质作为培养基质，以玉米和红三叶草的混合作为宿主植物；且河沙、蛭石和草炭的体积比为1:4:1；
种植玉米种子时，每盆种植8颗种子，留苗3棵；种植红三叶草时，每盆种植80颗种子，留苗40株；
所述丛枝菌根真菌包括根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradice)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、幼套近明球囊霉(Glomusetunicatum)、脆无梗囊霉(Acaulosporadelicate)和变形球囊霉(Glomusversiforme)；
所述播种后控制温度日间为25℃，夜间为16℃，每天光照16h。
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