CN104371932A - 一种am真菌菌剂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种真菌菌剂的生产方法，尤其是涉及一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：玉米催芽、接种、苗期管理、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价；本发明方法独特、菌剂质量高、侵染率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌菌剂的生产方法，尤其是涉及一种AM真菌菌剂的生产方法。
背景技术
菌根(Mycorrhiza)是菌根真菌与植物根系形成的共生体。自然界中93％以上的植物都能形成菌根。AM真菌又称丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhiza Fungi，简称AMF)。前人研究认为，AM真菌能够促进植物对矿质养分尤其是磷和微量元素的吸收,增强植物抵抗养分胁迫的能力，减少氮、磷肥的使用量和流失，从而避免水体富营养化。同时，其菌丝可以形成菌丝桥,在不同植株间传递养分,成为生态系统养分循环的重要通道。AM真菌能够提高植物的抗逆性：能改善植物的水分状况，提高植物的抗旱能力；能提高植物抗盐胁迫的能力；能够提高植物抗有机污染能力；能提高植物的抗病能力；能提高植物对重金属污染的抵御能力。
AM真菌在林木育苗方面应用较广，且效应显著。林先贵等(2002)对16种不同种类植物对菌根的依赖性进行测定，除菊花外，其余植物都有较高的依赖性，但依赖强度存在差异。同时，接种菌根后，株高、地上部分、地下部分鲜重和侵染率都大于对照。黄春梅等(2005)对孟加拉粉大蕉试管苗接种光壁无梗囊霉(Acaulospota laevis)、苏格兰球囊霉(Glomus caledonium)和摩西球囊霉(Glomus mosseae)，认为菌根的形成对其苗高生长有促进作用。张林平等(2002)用摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根内球囊霉(Glomus intraradices)和地表球囊霉(Glomus versiforme)接种温室营养钵银杏幼苗后，均能显著提高苗高、叶数、叶面穗和叶片干重。刘建福等(2005)研究表明AM真菌能够促进澳洲坚果幼苗的生长，增强根系活力，促进根系对矿质养分的吸收和累积，并促进植株的光合作用。苹果是典型的AM真菌的宿主植物，对菌根真菌的依赖性较强。AM真菌能促进苹果树对矿质营养和水分的吸收和利用，显著影响苹果树生长和内源激素含量，提高苹果树的抗病性。宋富强等(2004)研究认为AM真菌接种大青杨苗木，能显著促进苗木苗高、地径、总干生物量的增加，同时增加苗木对难溶性P肥的吸收和利用。AM真菌的宿主范围相当广泛，除了在树木上外，对蔬菜、粮食作物也有很好的接种效果。利用AM真菌接种青椒、西瓜、草莓、香蕉、玉米和沼泽稻(Waterland rice)等均取得很好的接种效果。
以上AM真菌对植物的有益作用仅限于小规模的科学实验，在生产上的大面积的应用还未见报道，其主要原因是AM真菌的菌剂生产技术不够成熟，生产的菌剂质量不高，侵染率低。
目前还没有克服上述缺陷的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种方法独特、菌剂质量高、侵染率高的一种AM真菌菌剂的生产方法。
本发明通过如下方式实现：
一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
a、玉米催芽：挑选籽粒饱满、无破损、无虫咬的栽培用玉米种子，先用75％酒精溶液灭菌30s，再用无菌水冲洗5次，置于培养箱中，温度为28℃，暗催芽；
b、接种：每个花盆中先填充1/3的培养基质，然后撒0.5～1.0cm接菌剂，再铺1/3的培养基质，每盆撒20～25粒红三叶草种子和3粒已催芽的玉米，盆中用灭菌河沙基质填充，浇水；
c、苗期管理：配置Hoagland营养液，使用方法：幼苗期，每周一次浇1/2强度的营养液，所有营养元素减半，100mL/盆；成苗后，每周一次全营养液，也可磷减半；收获期，不再浇营养液至少4个月以后，以上针对全沙培养基质；
d、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价；
所述菌种为摩西球囊霉、缩球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物为玉米、红三叶草；所述培养基质为纯河沙；所述培养容器为18cm×24cm的塑料花盆；所述容器的消毒：75％的乙醇溶液擦拭花盆；
所述Phillips和Hayman的染色方法：挖取容器中正常生长的宿主植物毛细根，清洗后剪成1cm长根段置于FAA固定液中固定24h后，把固定液彻底冲洗净，加入10％KOH溶液浸透根样，90℃中加热1h，用清水洗去KOH，加碱性双氧水软化根段，室温下放置20min后洗去碱性H2O2，加入5％乳酸溶液或1％HCl酸化3－4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯蓝染色液于90℃中加热30min，使染料很快渗透到根组织和真菌的细胞中，染色后，将根样放到乳酸甘油中浸泡除去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片，在显微镜下观察丛枝、泡囊、菌丝的结构特征。统计根段中菌根真菌侵染的根段数，根据以下公式，计算侵染率及侵染等级：
菌根侵染率＝有菌根感染的根段长度/检查根段总长度×100％
侵染等级：1级——受感染的营养根占观察总根数的0～5％
2级——受感染的营养根占观察总根数的6～25％
3级——受感染的营养根占观察总根数的26～50％
4级——受感染的营养根占观察总根数的51～75％
5级——受感染的营养根占观察总根数的76～100％；
所述FAA固定液为甲醛6ml、冰醋酸1ml、酒精20ml、蒸馏水40ml比例配置，所述碱性双氧水为3mlNH4OH加到30ml10％H2O2中，加水60ml混匀即可；
所述纯河沙是河沙过2mm筛，沙粒的粒径≤2mm，水冲洗3遍，先用0.5％的高锰酸钾溶液喷洒，再用薄膜覆盖，太阳下暴晒3天，掀膜后晾晒3天所得。
本发明有如下效果：
1)方法独特：本发明提供的AM真菌菌剂的生产方法，其包括玉米催芽、接种、苗期管理、菌剂质量分析；本发明通过对摩西球囊霉(Glomus mosseae(Nicolson&Gerdemann)Gerdemann&Trappe)、缩球囊霉(GlomusconstrictumTrappe)、根内球囊霉(Glomusintraradices Schenck&Smith)和地表球囊霉(Glomusversiforme(Kaisten)Berch)四种AM真菌的扩繁，生产出高质量的AM真菌菌剂，并利用自繁的菌剂进行了接种实验，实现了枸杞的菌根化育苗，马铃薯和芹菜的大田接种，取得了很好的接种效果。
2)侵染率高：本发明采用了红三叶草和玉米两种植物作为宿主植物，对缩球囊霉、摩西球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉四种AM真菌进行菌种扩繁。如表1所示：四种AM真菌对三叶草和玉米的侵染率均在90％以上，
表1 扩繁的AM真菌菌剂的侵染率
3)菌剂质量高：AM真菌扩繁的基质中真菌孢子密度测定
表2 扩繁的AM真菌菌剂孢子密度评价
如表2所示：调查根段中有丰富的菌丝和泡囊结构，1cm的根段中，最多的泡囊的数达338个。同时，培养基质中的真菌孢子密度超过160个/50g基质。如图1、2、3和4所示：未接种的三叶草和玉米根系中未发现被侵染。同时，玉米具有耐旱性强，易成活，根系发达，侵染率高，产孢量大等优点，更适合于菌剂扩繁。因此认为，采用玉米和三叶草进行混合接种则是最好的菌根真菌扩繁方式。
附图说明
图1为接菌三叶草根系中的丛枝和泡囊结构；
图2为未接种的三叶草根系；
图3为接菌玉米根系中的泡囊结构和根内孢子；
图4为未接种的玉米根系。
具体实施方式
一种AM真菌菌剂的生产方法，该方法包括如下步骤：
a、玉米催芽：挑选籽粒饱满、无破损、无虫咬的栽培用玉米种子，先用75％酒精溶液灭菌30s，再用无菌水冲洗5次，置于培养箱中，温度为28℃，暗催芽；
b、接种：每个花盆中先填充1/3的培养基质，然后撒0.5～1.0cm接菌剂，再铺1/3的培养基质，每盆撒20～25粒红三叶草种子和3粒已催芽的玉米，盆中用灭菌河沙基质填充，浇水；
c、苗期管理：如表1所示：配置Hoagland营养液，使用方法：幼苗期即30天内，每周一次浇1/2强度的营养液，所有营养元素减半，100mL/盆；成苗后，每周一次全营养液，也可磷减半；收获期，不再浇营养液至少4个月以后，以上针对全沙培养基质；
表3 Hoagland营养液配方 植物(pH5.7-6.0)
注：营养液一栏表示配制1L营养液所需取用的母液量。
d、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价。
所述菌种为摩西球囊霉(Glomus mosseae(Nicolson&Gerdemann)Gerdemann&Trappe)、缩球囊霉(Glomus constrictum Trappe)、根内球囊霉(Glomus intraradices Schenck&Smith)和地表球囊霉(Glomusversiforme(Kaisten)Berch)；所述宿主植物：玉米(Zaemays)、红三叶草(Trifolium pretenseL.)；所述培养基质：纯河沙。河沙过2mm筛，沙粒的粒径≤2mm，水冲洗3遍，先用0.5％的高锰酸钾溶液喷洒，再用薄膜覆盖，太阳下暴晒3天，掀膜后晾晒3天，备用；所述培养容器为18cm×24cm的塑料花盆；所述容器的消毒：75％的乙醇溶液擦拭花盆。
所述Phillips和Hayman的染色方法：挖取容器中正常生长的宿主植物毛细根，清洗后剪成1cm长根段置于FAA固定液中固定24h后，把固定液彻底冲洗净，加入10％KOH溶液浸透根样，90℃中加热1h，用清水洗去KOH，加碱性双氧水软化根段，室温下放置20min后洗去碱性H2O2，加入5％乳酸溶液或1％HCl酸化3～4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯蓝染色液于90℃中加热30min，使染料很快渗透到根组织和真菌的细胞中，染色后，将根样放到乳酸甘油中浸泡除去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片，在显微镜下观察丛枝、泡囊、菌丝的结构特征。统计根段中菌根真菌侵染的根段数，根据以下公式，计算侵染率及侵染等级。
菌根侵染率＝有菌根感染的根段长度/检查根段总长度×100％
侵染等级：1级——受感染的营养根占观察总根数的0～5％
2级——受感染的营养根占观察总根数的6～25％
3级——受感染的营养根占观察总根数的26～50％
4级——受感染的营养根占观察总根数的51～75％
5级——受感染的营养根占观察总根数的76～100％。
所述FAA固定液为甲醛6ml、冰醋酸1ml、酒精20ml、蒸馏水40ml比例配置，所述碱性双氧水为3mlNH4OH加到30ml10％H2O2中，加水60ml混匀即可。
摩西球囊霉：Glomus mosseae BGCNM02A、缩球囊霉：Glomusconstrictum BGCNM03B、根内球囊霉：Glomus intraradicesBGCAH01、地表球囊霉：Glomus versiforme BGCNM01A。
Claims (5)
1.一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
a、玉米催芽：挑选籽粒饱满、无破损、无虫咬的栽培用玉米种子，先用75％酒精溶液灭菌30s，再用无菌水冲洗5次，置于培养箱中，温度为28℃，暗催芽；
b、接种：每个花盆中先填充1/3的培养基质，然后撒0.5～1.0cm接菌剂，再铺1/3的培养基质，每盆撒20～25粒红三叶草种子和3粒已催芽的玉米，盆中用灭菌河沙基质填充，浇水；
c、苗期管理：配置Hoagland营养液，使用方法：幼苗期，每周一次浇1/2强度的营养液，所有营养元素减半，100mL/盆；成苗后，每周一次全营养液，也可磷减半；收获期，不再浇营养液至少4个月以后，以上针对全沙培养基质；
d、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价。
2.如权利要求1所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述菌种为摩西球囊霉、缩球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物为玉米、红三叶草；所述培养基质为纯河沙；所述培养容器为18cm×24cm的塑料花盆；所述容器的消毒：75％的乙醇溶液擦拭花盆。
3.如权利要求1所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述Phillips和Hayman的染色方法：挖取容器中正常生长的宿主植物毛细根，清洗后剪成1cm长根段置于FAA固定液中固定24h后，把固定液彻底冲洗净，加入10％KOH溶液浸透根样，90℃中加热1h，用清水洗去KOH，加碱性双氧水软化根段，室温下放置20min后洗去碱性H2O2，加入5％乳酸溶液或1％HCl酸化3－4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯蓝染色液于90℃中加热30min，使染料很快渗透到根组织和真菌的细胞中，染色后，将根样放到乳酸甘油中浸泡除去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片，在显微镜下观察丛枝、泡囊、菌丝的结构特征。统计根段中菌根真菌侵染的根段数，根据以下公式，计算侵染率及侵染等级：
菌根侵染率＝有菌根感染的根段长度/检查根段总长度×100％
侵染等级：1级——受感染的营养根占观察总根数的0～5％
2级——受感染的营养根占观察总根数的6～25％
3级——受感染的营养根占观察总根数的26～50％
4级——受感染的营养根占观察总根数的51～75％
5级——受感染的营养根占观察总根数的76～100％。
4.如权利要求3所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述FAA固定液为甲醛6ml、冰醋酸1ml、酒精20ml、蒸馏水40ml比例配置，所述碱性双氧水为3mlNH4OH加到30ml10％H2O2中，加水60ml混匀即可。
5.如权利要求2所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述纯河沙是河沙过2mm筛，沙粒的粒径≤2mm，水冲洗3遍，先用0.5％的高锰酸钾溶液喷洒，再用薄膜覆盖，太阳下暴晒3天，掀膜后晾晒3天所得。
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