CN103125240A - 一种菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物肥料生产领域的一种高效菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术。本发明所述的适合于高效菌根真菌扩繁技术包括材料选择、生产过程、质量控制及产品形成四部分。本发明材料极易获得，操作简单方便，成本低，所扩繁的菌根真菌菌剂的孢子密度普遍达到50个/cm³以上，有的甚至可以达到100个/cm³以上，扩繁效率较传统扩繁技术至少高出4倍以上；本发明所采用的装置灵活性高，易于实时调整，占用空间小，便于菌根真菌产品质量的检测和规模化生产。本发明形成的高效且易于规模化的AMF扩繁技术将有助于AMF在农业生产中的应用，为农业可持续发展提供新的途径。

Description

一种菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术

技术领域

本发明属于生物肥料生产技术领域，特别涉及一种菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术。

背景技术

（一）在能源危机、资源紧缺、环境污染等压力下，菌根真菌产品的商业化备受关注

生物肥料对提高农作物品质、保护生态环境和农业的可持续发展具有不可替代的作用。尤其是在人类面临能源危机、资源紧缺、环境污染等压力下，生物肥料的研究和应用比以往任何时期都更加受到世界各国的重视。

丛枝菌根真菌(Abuscularmycorrhizalfungi，简称AMF)在提高植物的抗逆性和抗病性、维护植物健康方面发挥着关键作用。丛枝菌根真菌是广泛分布于各种类型土壤中的一类特殊微生物，它可以和地球上约90%的维管植物的根系形成“菌根”(Arbuscularmycorrhiza，简称AM)。菌根是土壤居群一种活跃的、有生命力的互惠共生体，它同时具有植物根系和微生物的特性。国内外关于AMF在促进宿主植物生长发育、增加宿主植物P营养、调节水分代谢和增强植物抗逆性等方面的作用已有大量报道。一些研究表明，VA菌根最显著作用是在低磷土壤中，提高植物吸磷能力。植物接种菌根后，间接地扩大了作物与土壤的接触面积，磷较快地输送到菌根的菌丝，缩短了磷离子扩散到植物根表的距离，从而增加了作物对土壤磷养分的吸收。目前已在洋葱、韭菜、番茄、茄子、辣椒、黄瓜、莴苣、石刁柏、菜豆等蔬菜作物上证实了这一点。因此，丛枝菌根不仅可促进植物对营养元素的吸收，还能提高植物的抗病、抗逆能力，有利于植物的生长，对农林业生产具有重要的意义。

（二）菌根真菌扩繁技术的突破将为其商业化应用提供保障

目前，有关菌根菌的应用还有些技术问题没有解决，特别是菌根真菌还不能在人工条件下离体培养，不能快速生产出大量廉价的菌根菌种。AMF的纯培养是AMF研究及商业化的瓶颈，因此AMF的纯培养一直是人们探索的关键技术，人们从未停止过这方面的研究，目前其仍是世界各国研究的热点和重点。直到目前为止，来自盆钵培养法的根段和孢子仍然是最广泛和最可靠的菌剂。盆钵培养法是AMF菌剂扩繁的主要方式，优点在于操作简易、方法可靠，缺点是开放管理易污染，培养周期较长，繁殖体产量少、占用空间大，不便于运输携带。传统的AMF菌剂生产采用菌剂:砂:土壤=1:1:1比例种植宿主植物进行扩繁，初始菌剂用量较大，菌剂生产效率低，很难满足市场的需求。

鉴于AMF在农业应用的诸多优点和强大的市场需求，急需一种高效且易于规模化的AMF扩繁方法来扩大AMF在农业生产中的应用，为农业可持续发展提供新的途径。

发明内容

本发明针对以上技术问题，设计提供了一种特别适用于高效且易于规模化扩繁菌根真菌菌剂的方法。该方法操作简单方便，成本低，培养周期较短，繁殖体不易污染，繁殖体产量和质量高。该方法所采用装置灵活性高，易于实时调整，占用空间小，便于AMF的检测和规模化生产。

本发明所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术的具体操作步骤如下：

（1）将灭菌土壤装入栽培槽至1/2-4/5高度处，接着装入菌剂混合物至3/4-5/6高度处，浇透水后播种宿主植物种子，然后再覆一层灭菌土壤，并且在栽培槽上方盖一层薄膜保湿；最后将栽培槽置于经酒精消毒后的玻璃温室或塑料大棚内；

（2）培养期间温度控制在15-35℃，按时浇水，并且每10-15天浇灌一次营养液，出苗后揭去栽培槽上方覆盖的薄膜；

（3）宿主植物播种90-120天后，检测孢子密度，当孢子密度≥50个/cm³，即可收获；

（4）收获后，去除植株的地上部分；将根系与砂壤土分离，根系晾干，粉碎成粉末；栽培槽中剩余的砂壤土晾干，最后将根系粉末和晾干的砂壤土混合均匀，即获得丛枝菌根真菌菌剂，然后装入自封袋中，置于阴凉干燥处保存。

所述栽培槽的规格为：(40-70)cm×(15-30)cm×(15-20)cm，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

步骤(1)所述的灭菌土壤为去除杂物和大块颗粒的砂壤土，并且采用间歇灭菌，即150-180℃烘2-5h，放凉后继续150-180℃烘2-5h放凉备用。

步骤(1)所述的菌剂混合物为灭菌土壤和丛枝菌根真菌菌剂的混合物，灭菌土壤和丛枝菌根真菌菌剂的质量比为3-20，优选3-8；所述的丛枝菌根真菌菌剂的孢子数≥30个/cm³。

步骤(1)所述的宿主植物种子播种前经消毒处理：用水将种子表面的包衣淋洗干净，随后用8-15wt%的H₂O₂消毒10-15分钟；迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4-6小时；将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准；将培养皿置于温度25-30℃、湿度60-70%的黑暗生长箱中进行催芽，24-36小时后，选取芽长一致的种子播入。

所述的宿主植物种子为玉米、三叶草、苏丹草、百喜草、红豆、绿豆或芦笋的种子；所述宿主植物的播种密度为：玉米400-500株/m²，三叶草6000-8000株/m²、苏丹草6000-8000株/m²、百喜草5000-6000株/m²、绿豆400-500株/m²、芦笋400-600株/m²。

所述的营养液配比为：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、0.5-3.0mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0；营养液添加量为栽培槽内土壤质量的5-10%。

步骤（2）培养期间每隔15-20天还加入农作物秸秆浸提液，直接浇灌到宿主植物根部，加入量为0.02-0.15ml/cm³。

所述的农作物秸秆浸提液的制备方法为：（1）将农作物秸秆洗干净，烘干后剪成1-5cm长短，装入网孔直径为0.1-0.3mm的网袋中；（2）将装好农作物秸秆的网袋放入纯净水中，秸秆与水的质量比为1:（20-40）；（3）将通气管置于容器底部，1m³水的曝气量为0.2-0.4L/h，浸提发酵过程中避免强光直射，保持通气，外界气温控制在20-35℃，优选25-30℃，经过4-8天，制得农作物秸秆浸提液。

步骤(3)所述的检测孢子密度的操作方法为：采用土钻在栽培槽内选取样品，当天测定。

有益效果：1）本发明中的菌根真菌菌剂生产的材料及条件极易获得，且成本较低，生产过程简单，菌剂产量和质量高；2）本发明所采用的装置（栽培槽）灵活性高，占用空间小，易于实时调整，便于AMF的检测和规模化生产；3）本发明所采用的原料不添加化学合成物质，生产出的菌根真菌菌剂对环境无污染，符合农业可持续发展需要。采用本发明提供的技术扩繁的菌根真菌菌剂的孢子密度普遍达到50个/cm³以上，有的甚至可以达到100个/cm³以上，扩繁效率较传统扩繁技术至少高出4倍以上。本发明形成的高效且易于规模化的AMF扩繁技术将有助于AMF在农业生产中的应用，为农业可持续发展提供新的途径。

附图说明

图1：本发明所述的菌根真菌菌剂扩繁技术及装置的示意图；图中栽培槽尺寸为50cm(长)×16cm(宽)×16cm(高)，栽培槽装入灭菌土壤至3/5高度（96mm）处，接着装入菌剂混合物至4/5高度（96+32=128mm）处，后选取饱满度一致的AMF宿主植物种子播种，上覆一层薄的灭菌土开展扩繁；1-灭菌土壤，2-菌剂混合物。

图2：实施例1中玉米作为宿主植物生产菌根真菌（Glomusmosseae）菌剂90天后的孢子密度对比图。

图3：实施例2中苏丹草作为宿主植物生产菌根真菌（Glomusintraradices）菌剂110天后的孢子密度对比图。

图4：实施例4中百喜草作为宿主植物生产菌根真菌混合菌剂120天后的孢子密度对比图。

具体实施方式

实施例1：

步骤1：

菌剂：选择孢子数≥37.3个/cm³的摩西球囊霉菌（Glomusmosseae）菌剂。

灭菌土壤选择砂壤土经灭菌操作：土壤取自周边20公里没有工矿企业、无污染的耕作土壤表层（0-20cm）。所用土壤符合《土壤环境质量标准》（GB65618-1995）的一级标准：镉≤0.20mg/kg，汞≤0.15mg/kg，砷≤15mg/kg，铜≤35mg/kg，铅≤35mg/kg，铬≤90mg/kg，锌≤100mg/kg，镍≤40mg/kg，六六六≤0.05mg/kg，滴滴涕≤0.05mg/kg。所用土壤肥力指标为：pH6.75，有机质1.45%，EC0.067mS/cm，速效氮120mg/kg，Olsen-P17.7mg/kg，速效钾129mg/kg，交换性钙1370mg/kg，交换性镁164mg/kg，有效硼1.23mg/kg，有效铁5.28mg/kg，有效锰25.6mg/kg，有效铜1.77mg/kg，有效锌3.13mg/kg，砂粒含量大于64%，粘粒含量小于18%。所用去除杂物和大块颗粒，过2mm筛，采用间歇灭菌，即160℃烘2h，放凉后继续160℃烘2h放凉备用。

营养液：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、1mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0。

玉米秸秆浸提液：（1）将玉米秸秆洗干净，烘干后剪成3cm长短，装入网孔直径为0.1mm的网袋中；（2）将装好玉米秸秆的网袋放入纯净水中，秸秆与水的质量比为1:25；（3）将通气管置于容器底部，1m³水的曝气量为0.2L/h，浸提发酵过程中避免强光直射，保持通气，外界气温控制在25-30℃，经过7天，制得的玉米秸秆浸提液。所述的玉米秸秆选择满足指标为：纤维素≤2.0%、半纤维素≥2.2%、木质素≥1.0%、碳元素和氮元素的比例在20-50之间。

栽培槽的规格为：50cm(长)×16cm(宽)×16cm(高)，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

宿主植物种子：选用根系发达、AMF侵染率高（侵染率高于65%）的玉米种子。

种子消毒：用水将玉米种子表面的包衣淋洗干净，随后用10wt%的H₂O₂消毒10分钟。迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4小时。将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中。滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准。将培养皿置于恒温（25℃，湿度65%）的黑暗生长箱中进行催芽。约24小时后，选取芽长一致的种子播入。

步骤2：

摩西球囊霉菌（Glomusmosseae）菌剂扩繁生产选择在温度20-25°C的玻璃温室进行，洁净平整地面，喷施酒精消毒，通风处装纱窗或防虫网。

栽培槽装入灭菌土壤至3/5高度处，接着装入菌剂混合物（灭菌土壤:摩西球囊霉菌菌剂=4，质量比）至4/5高度处，浇透水。选取饱满度一致的玉米种子播种（播种密度500株/m²），上覆一层薄的灭菌土。在栽培槽上方盖一层薄膜保湿，待出苗后揭去薄膜，一周后去掉细弱植株。

常规管理：适时浇水，每10天浇灌一次营养液，添加量为基质（砂壤土）质量的7.5%；每隔15天加入玉米秸秆浸提液，直接浇灌到宿主植物根部，加入量为0.05ml/cm³。

步骤3：

检测：宿主植物（玉米）播种后90天，随机选取6个栽培槽，采用土钻在每个槽选取5个点取样混合成一个样品，共六个混合样品。当天测定菌剂孢子密度，如孢子密度≥50个/cm³，即可收获。若孢子密度<50个/cm³，过十天再检测，直到孢子密度≥50个/cm³收获。

收获与菌剂制备：去除植株的地上部分，用2mm尼龙筛网将宿主植物根系与砂壤土分开；植物根系晾干后，粉碎成粉末，与晾干的砂壤土（含水量<5wt%）混合均匀，即获得AMF菌剂。同时，随机抽取4个样品，检测AMF的孢子密度，即为该批菌剂的最终孢子密度。

贮藏：由上述方法所制得的AMF菌剂装入自封袋中，贴标签（菌种名称、孢子密度、重量、扩繁时间、制备时间、制备者姓名等），置于阴凉干燥处保存。

上述步骤中菌剂添加量占基质总量的1/20，传统方法菌剂添加量占基质总量的1/3；经过90天，采用本发明生产的AMF的孢子数达到56.3个/cm³，与传统的扩繁技术没有统计上的差异，但该技术所用菌剂的量仅为传统扩繁技术的15.0%，即本发明的生产效率是传统扩繁技术的6.67倍。在生产同等AMF菌剂量的前提下，采用本发明的扩繁技术能够显著降低生产场地面积，从而节省生产成本，实现更高的经济效益。

实施例2：

步骤1：

菌剂：选择孢子数为44.3个/cm³的根内球囊霉菌(Glomusintraradices)菌剂。

灭菌土壤选择砂壤土经灭菌操作：土壤取自周边20公里没有工矿企业、无污染的耕作土壤表层（0-20cm）。所用土壤符合《土壤环境质量标准》（GB65618-1995）的一级标准：镉≤0.20mg/kg，汞≤0.15mg/kg，砷≤15mg/kg，铜≤35mg/kg，铅≤35mg/kg，铬≤90mg/kg，锌≤100mg/kg，镍≤40mg/kg，六六六≤0.05mg/kg，滴滴涕≤0.05mg/kg。所用土壤肥力指标为：pH6.75，有机质1.45%，EC0.067mS/cm，速效氮120mg/kg，Olsen-P17.7mg/kg，速效钾129mg/kg，交换性钙1370mg/kg，交换性镁164mg/kg，有效硼1.23mg/kg，有效铁5.28mg/kg，有效锰25.6mg/kg，有效铜1.77mg/kg，有效锌3.13mg/kg，砂粒含量大于64%，粘粒含量小于18%。所用去除杂物和大块颗粒，过2mm筛，采用间歇灭菌，即160℃烘2h，放凉后继续160℃烘2h放凉备用。

营养液：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、1mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0。

小麦秸秆浸提液：（1）将小麦秸秆洗干净，烘干后剪成3cm长短，装入网孔直径为0.1mm的网袋中；（2）将装好小麦秸秆的网袋放入纯净水中，秸秆与水的质量比为1:30；（3）将通气管置于容器底部，1m³水的曝气量为0.2L/h，浸提发酵过程中避免强光直射，保持通气，外界气温控制在25-30℃，经过7天，制得的小麦秸秆浸提液。所述的小麦秸秆选择满足指标为：纤维素≤2.0%、半纤维素≥2.2%、木质素≥1.0%、碳元素和氮元素的比例在20-50之间。

栽培槽的规格为：50cm(长)×16cm(宽)×16cm(高)，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

宿主植物种子：选用根系发达、AMF侵染率高（侵染率高于65%）的苏丹草。

种子消毒：用水将种子表面的包衣淋洗干净，随后用10%的H₂O₂消毒10分钟。迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4小时。将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中。滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准。将培养皿置于恒温（25℃，湿度65%）的黑暗生长箱中进行催芽。约24小时后，选取芽长一致的种子播入。

步骤2：

根内球囊霉菌(Glomusintraradices)菌剂扩繁生产选择在温度18-32oC的塑料大棚进行，洁净平整地面，喷施酒精消毒，通风处装防虫网。

栽培槽装入灭菌土壤至3/5高度处，接着装入菌剂混合物（灭菌土壤:根内球囊霉菌菌剂=7，质量比）至4/5高度处，浇透水。选取饱满度一致的苏丹草（6000株/m²）播种，上覆一层薄的灭菌土。在栽培槽上方盖一层薄膜保湿，待出苗后揭去薄膜，一周后去掉细弱植株。

常规管理：适时浇水，每10天浇灌一次营养液，添加量为基质（砂壤土）质量的7.5%；每隔15天加入小麦秸秆浸提液，直接浇灌到宿主植物根部，加入量为0.05ml/cm³。

步骤3：

检测：宿主植物（苏丹草）播种后110天，随机选取6个栽培槽，采用土钻在每个槽选取5个点取样混合成一个样品，共六个混合样品。当天测定菌剂孢子密度，如孢子密度≥50个/cm³，即可收获。若孢子密度<50个/cm³，过十天再检测，直到孢子密度≥50个/cm³收获。

收获与菌剂制备：去除植株的地上部分，用2mm尼龙筛网将宿主植物根系与砂壤土分开；植物根系晾干后，粉碎成粉末，与晾干的砂壤土（含水量<5%）混合均匀，即获得AMF菌剂。同时，在混合菌剂中随机抽取4个样品，检测AMF的孢子密度，即为该批菌剂的最终孢子密度。

贮藏：由上述方法所制得的AMF菌剂装入自封袋中，贴标签（菌种名称、孢子密度、重量、扩繁时间、制备时间、制备者姓名等），置于阴凉干燥处保存。

上述步骤中菌剂添加量占基质总量的1/32，传统方法菌剂添加量占基质总量的1/3；经过110天，采用本发明生产的AMF的孢子数达到56.0个/cm³，与传统的扩繁技术没有统计上的差异，但该技术所用菌剂的量仅为传统扩繁技术的9.74%，即新技术的生产效率是传统扩繁技术的10.7倍。在生产同等AMF菌剂量的前提下，采用本发明的扩繁技术能够显著降低生产场地面积，从而节省生产成本，实现更高的经济效益。

实施例3：

步骤1：

菌剂：选择孢子数≥37.3个/cm³的摩西球囊霉菌（Glomusmosseae）菌剂和孢子数为44.3个/cm³的根内球囊霉菌(Glomusintraradices)菌剂，摩西球囊霉菌菌剂和根内球囊霉菌菌剂的质量比为1:1。

灭菌土壤选择砂壤土经灭菌操作：土壤取自周边20公里没有工矿企业、无污染的耕作土壤表层（0-20cm）。所用土壤符合《土壤环境质量标准》（GB65618-1995）的一级标准：镉≤0.20mg/kg，汞≤0.15mg/kg，砷≤15mg/kg，铜≤35mg/kg，铅≤35mg/kg，铬≤90mg/kg，锌≤100mg/kg，镍≤40mg/kg，六六六≤0.05mg/kg，滴滴涕≤0.05mg/kg。所用土壤肥力指标为：pH6.75，有机质1.45%，EC0.067mS/cm，速效氮120mg/kg，Olsen-P17.7mg/kg，速效钾129mg/kg，交换性钙1370mg/kg，交换性镁164mg/kg，有效硼1.23mg/kg，有效铁5.28mg/kg，有效锰25.6mg/kg，有效铜1.77mg/kg，有效锌3.13mg/kg，砂粒含量大于64%，粘粒含量小于18%。所用去除杂物和大块颗粒，过2mm筛，采用间歇灭菌，即160℃烘2h，放凉后继续160℃烘2h放凉备用。

营养液：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、1mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0。

栽培槽的规格为：50cm(长)×16cm(宽)×16cm(高)，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

宿主植物种子：选用根系发达、AMF侵染率高（侵染率高于65%）的玉米种子。

种子消毒：用水将玉米种子表面的包衣淋洗干净，随后用10%的H₂O₂消毒10分钟。迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4小时。将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中。滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准。将培养皿置于恒温（25℃，湿度65%）的黑暗生长箱中进行催芽。约24小时后，选取芽长一致的种子播入。

步骤2：

菌剂扩繁生产选择在温度20-25°C的玻璃温室进行，洁净平整地面，喷施酒精消毒，通风处装纱窗或防虫网。

栽培槽装入灭菌土壤至3/5高度处，接着装入菌剂混合物（灭菌土壤:菌剂=9，质量比）至4/5高度处，浇透水。选取饱满度一致的玉米种子播种（播种密度500株/m²），上覆一层薄的灭菌土。在栽培槽上方盖一层薄膜保湿，待出苗后揭去薄膜，一周后去掉细弱植株。

常规管理：适时浇水，每10天浇灌一次营养液，添加量为基质（砂壤土）质量的7.5%。

步骤3：

检测：宿主植物（玉米）播种后90天，随机选取6个栽培槽，采用土钻在每个槽选取5个点取样混合成一个样品，共六个混合样品。当天测定菌剂孢子密度，如孢子密度≥50个/cm³，即可收获。若孢子密度<50个/cm³，过十天再检测，直到孢子密度≥50个/cm³收获。

收获与菌剂制备：去除植株的地上部分，用2mm尼龙筛网将宿主植物根系与砂壤土分开；植物根系晾干后，粉碎成粉末，与晾干的砂壤土（含水量<5wt%）混合均匀，即获得AMF菌剂。同时，随机抽取4个样品，检测AMF的孢子密度，即为该批菌剂的最终孢子密度。

贮藏：由上述方法所制得的AMF菌剂装入自封袋中，贴标签（菌种名称、孢子密度、重量、扩繁时间、制备时间、制备者姓名等），置于阴凉干燥处保存。

上述步骤中菌剂添加量占基质总量的1/40，传统方法菌剂添加量占基质总量的1/3；经过90天，采用本发明生产的AMF的孢子数达到58.2个/cm³，与传统的扩繁技术没有统计上的差异，但该技术所用菌剂的量仅为传统扩繁技术的7.5%，即本发明的生产效率是传统扩繁技术的13.33倍。在生产同等AMF菌剂量的前提下，采用本发明的扩繁技术能够显著降低生产场地面积，从而节省生产成本，实现更高的经济效益。

实施例4：

步骤1：

菌剂：选择孢子数≥37.3个/cm³的摩西球囊霉菌（Glomusmosseae）菌剂和孢子数为44.3个/cm³的根内球囊霉菌(Glomusintraradices)菌剂，摩西球囊霉菌菌剂和根内球囊霉菌菌剂的质量比为1:1。

灭菌土壤选择砂壤土经灭菌操作：土壤取自周边20公里没有工矿企业、无污染的耕作土壤表层（0-20cm）。所用土壤符合《土壤环境质量标准》（GB65618-1995）的一级标准：镉≤0.20mg/kg，汞≤0.15mg/kg，砷≤15mg/kg，铜≤35mg/kg，铅≤35mg/kg，铬≤90mg/kg，锌≤100mg/kg，镍≤40mg/kg，六六六≤0.05mg/kg，滴滴涕≤0.05mg/kg。所用土壤肥力指标为：pH6.75，有机质1.45%，EC0.067mS/cm，速效氮120mg/kg，Olsen-P17.7mg/kg，速效钾129mg/kg，交换性钙1370mg/kg，交换性镁164mg/kg，有效硼1.23mg/kg，有效铁5.28mg/kg，有效锰25.6mg/kg，有效铜1.77mg/kg，有效锌3.13mg/kg，砂粒含量大于64%，粘粒含量小于18%。所用去除杂物和大块颗粒，过2mm筛，采用间歇灭菌，即160℃烘2h，放凉后继续160℃烘2h放凉备用。

营养液：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、1.5mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0。

玉米秸秆浸提液：（1）将玉米秸秆洗干净，烘干后剪成2cm长短，装入网孔直径为0.2mm的网袋中；（2）将装好小麦秸秆的网袋放入纯净水中，秸秆与水的质量比为1:25；（3）将通气管置于容器底部，1m³水的曝气量为0.2L/h，浸提发酵过程中避免强光直射，保持通气，外界气温控制在25-30℃，经过7天，制得的小麦秸秆浸提液。所述的小麦秸秆选择满足指标为：纤维素≤2.0%、半纤维素≥2.2%、木质素≥1.0%、碳元素和氮元素的比例在20-50之间。

栽培槽的规格为：50cm(长)×16cm(宽)×16cm(高)，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

宿主植物种子：选用根系发达、AMF侵染率高（侵染率高于65%）的百喜草种子。

种子消毒：用水将百喜草种子表面的包衣淋洗干净，随后用10%的H₂O₂消毒10分钟。迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4小时。将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中。滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准。将培养皿置于恒温（25℃，湿度65%）的黑暗生长箱中进行催芽。约24小时后，选取芽长一致的种子播入。

步骤2：

菌剂扩繁生产选择在温度20-25°C的玻璃温室进行，洁净平整地面，喷施酒精消毒，通风处装纱窗或防虫网。

栽培槽装入灭菌土壤至3/5高度处，接着装入菌剂混合物（灭菌土壤:菌剂=3，质量比）至4/5高度处，浇透水。选取饱满度一致的百喜草种子播种（播种密度5500株/m²），上覆一层薄的灭菌土。在栽培槽上方盖一层薄膜保湿，待出苗后揭去薄膜，一周后去掉细弱植株。

常规管理：适时浇水，每10天浇灌一次营养液，添加量为基质（砂壤土）质量的7.5%每隔15天加入玉米秸秆浸提液，直接浇灌到宿主植物根部，加入量为0.10ml/cm³。

步骤3：

检测：宿主植物（百喜草）播种后120天，随机选取6个栽培槽，采用土钻在每个槽选取5个点取样混合成一个样品，共六个混合样品。当天测定菌剂孢子密度，如孢子密度≥50个/cm³，即可收获。若孢子密度<50个/cm³，过十天再检测，直到孢子密度≥50个/cm³收获。

收获与菌剂制备：去除植株的地上部分，用2mm尼龙筛网将宿主植物根系与砂壤土分开；植物根系晾干后，粉碎成粉末，与晾干的砂壤土（含水量<5wt%）混合均匀，即获得AMF菌剂。同时，随机抽取4个样品，检测AMF的孢子密度，即为该批菌剂的最终孢子密度。

贮藏：由上述方法所制得的AMF菌剂装入自封袋中，贴标签（菌种名称、孢子密度、重量、扩繁时间、制备时间、制备者姓名等），置于阴凉干燥处保存。

上述步骤中菌剂添加量占基质总量的1/12，传统方法菌剂添加量占基质总量的1/3；经过120天，采用本发明生产的AMF的孢子数达到104个/cm³，显著高于传统的扩繁技术，同时该技术所用菌剂的量仅为传统扩繁技术的25%，即本发明的生产效率是传统扩繁技术的4倍。在生产更高质量AMF菌剂（本技术的孢子密度大于100个/cm³，而传统技术仅为56.3个/cm³）的同时，采用本发明的扩繁技术能够显著降低生产场地面积，从而节省生产成本，实现更高的经济效益。

Claims (10)

1.一种菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，其具体操作步骤如下：

（1）将灭菌土壤装入栽培槽至1/2-4/5高度处，接着装入菌剂混合物至3/4-5/6高度处，浇透水后播种宿主植物种子，然后再覆一层灭菌土壤，并且在栽培槽上方盖一层薄膜保湿；最后将栽培槽置于经酒精消毒后的玻璃温室或塑料大棚内；

（2）培养期间温度控制在15-35℃，按时浇水，并且每10-15天浇灌一次营养液，出苗后揭去栽培槽上方覆盖的薄膜；

（3）宿主植物播种90-120天后，检测孢子密度，当孢子密度≥50个/cm³，即可收获；

（4）收获后，去除植株的地上部分；将根系与砂壤土分离，根系晾干，粉碎成粉末；栽培槽中剩余的砂壤土晾干，最后将根系粉末和晾干的砂壤土混合均匀，即获得丛枝菌根真菌菌剂，然后装入自封袋中，置于阴凉干燥处保存。

2.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，所述栽培槽的规格为：(40-70)cm×(15-30)cm×(15-20)cm，采用不透光的材料，使用前用75%的酒精擦拭灭菌。

3.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，步骤(1)所述的灭菌土壤为去除杂物和大块颗粒的砂壤土，并且采用间歇灭菌，即150-180℃烘2-5h，放凉后继续150-180℃烘2-5h放凉备用。

4.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，步骤(1)所述的菌剂混合物为灭菌土壤和丛枝菌根真菌菌剂的混合物，灭菌土壤和丛枝菌根真菌菌剂的质量比为3-20，优选3-8；所述的丛枝菌根真菌菌剂的孢子数≥30个/cm³。

5.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，步骤(1)所述的宿主植物种子播种前经消毒处理：用水将种子表面的包衣淋洗干净，随后用8-15wt%的H₂O₂消毒10-15分钟；迅速用水淋洗干净，置于饱和硫酸钙溶液中浸泡4-6小时；将浸泡过的种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中，滤纸的湿润程度以倾斜时没有水流出为准；将培养皿置于温度25-30℃、湿度60-70%的黑暗生长箱中进行催芽，24-36小时后，选取芽长一致的种子播入。

6.根据权利要求5所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，所述的宿主植物种子为玉米、三叶草、苏丹草、百喜草、红豆、绿豆或芦笋的种子；所述宿主植物的播种密度为：玉米400-500株/m²，三叶草6000-8000株/m²、苏丹草6000-8000株/m²、百喜草5000-6000株/m²、绿豆400-500株/m²、芦笋400-600株/m²。

7.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，所述的营养液配比为：5mmolL^-1Ca(NO₃)₂、0.5-3.0mmolL^-1KH₂PO₄、5mmolL^-1KNO₃、2mmolL^-1MgSO₄、46μmolL^-1HBO₃、9μmolL^-1MnCl₂、0.8μmolL^-1ZnSO₄、0.3μmolL^-1CuSO₄、0.5μmolL^-1(NH₄)₆Mo₇O₂₄和75μmolL^-1Fe(Fe-EDTA)，营养液初始pH为6.0；营养液添加量为栽培槽内土壤质量的5-10%。

8.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，步骤（2）培养期间每隔15-20天还加入农作物秸秆浸提液，直接浇灌到宿主植物根部，加入量为0.02-0.15ml/cm³。

9.根据权利要求8所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，所述的农作物秸秆浸提液的制备方法为：（1）将农作物秸秆洗干净，烘干后剪成1-5cm长短，装入网孔直径为0.1-0.3mm的网袋中；（2）将装好农作物秸秆的网袋放入纯净水中，秸秆与水的质量比为1:（20-40）；（3）将通气管置于容器底部，1m³水的曝气量为0.2-0.4L/h，浸提发酵过程中避免强光直射，保持通气，外界气温控制在20-35℃，优选25-30℃，经过4-8天，制得农作物秸秆浸提液。

10.根据权利要求1所述的菌根真菌菌剂的规模化扩繁技术，其特征在于，步骤(3)所述的检测孢子密度的操作方法为：采用土钻在栽培槽内选取样品，当天测定。

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