CN103865812B - 丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，该方法包括以下步骤：⑴分离筛选地表球囊霉的孢子；⑵将种子A、培养容器A及温室、苗床消毒；⑶制备地表球囊霉菌剂：①在消毒后的种子A上滴加地表球囊霉的孢子后加盖玻璃珠进行培养，收获玻璃珠和植物根系；②玻璃珠和植物根系加水搅拌混匀后过滤，得到新生孢子；③将所有孢子进行二次鉴定，该培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂；⑷配制灭菌基质；⑸将种子B、培养容器B及温室、苗床消毒；⑹在灭菌基质上平铺地表球囊霉孢子后覆灭菌基质，再播种消毒后的种子B进行栽培，即得扩繁的菌剂；⑺对扩繁的菌剂测定AM真菌孢子密度，确定扩繁的菌剂质量。本发明高效、经济、环保。

Description

丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法

技术领域

本发明涉及现代农业生产技术领域，尤其涉及丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）菌剂的温室扩繁方法。

背景技术

菌根（mycorrhizae）是自然界中普遍存在的一种共生现象，它是陆生高等植物的根系与土壤中一类特定真菌形成的互惠共生体，这些真菌统称为菌根真菌，包括丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌、外生菌根（ectomycorrhiza）真菌、内外菌根（ecto-endotrophic mycorrhiza）真菌等，其中AM真菌在自然界中的分布最为广泛，可以与地球上大约90%的陆生高等植物形成共生体。AM真菌不仅可以促进植物提高对土壤中P、N、Cu、Fe等营养元素和水分的吸收，增强植物耐受盐碱胁迫、干旱胁迫、重金属污染和病虫害等各种逆境胁迫的能力，提高植物的产量和品质；而且作为多功能的高效生物肥料还具有改良土壤结构，减少化肥、农药的施用，帮助恢复受损的生态系统，对环境保护、园林绿化以及农业的可持续发展具有深远的意义。目前美国、英国、法国、澳大利亚等发达国家都在加紧研究AM真菌在环境保护、园林绿化以及农业可持续发展等领域中应用的途径和方法，近年来已取得了较快的发展。

AM真菌是一类专性活体营养微生物。在离体条件下，AM真菌自身不能合成或直接从土壤中吸收光合产物，只能依赖其宿主植物提供碳源物质，是一种严格意义上的共生真菌。在其生产扩繁方面，只能将其接种在宿主植物根系上，通过与宿主植物共培养的方法进行繁殖。迄今为止尚不能完全在离体条件下进行单独纯培养，从而限制了其在生产实践中的大规模应用。

目前，关于AM真菌的活体培养方法主要有：盆栽培养法、培养基培养法、静止营养液培养法、流动营养液培养法、雾化培养法、玻璃珠分室培养法以及大田培养法等。关于AM真菌的离体纯培养方法还处在探索阶段，至今尚没有突破性的进展，相关研究主要集中在AM真菌在离体条件下的生长发育、AM真菌生长对营养物质吸收的途径，以及AM真菌与宿主植物根系之间的物质交换和信息交流等方面。此外，还有AM真菌的离体双重培养法，主要包括：AM真菌与植物普通根系的双重培养法、AM真菌与Ri-T-DNA转型根的双重单胞无菌培养法，以及AM真菌与Ri-T-DNA 转型根双重培养的改良分室单孢培养系统等等。其中，静止营养液和流动营养液培养法产生孢子量较少，菌丝与侵染根段保存时间短，目前很少采用。离体双重培养法多用于分子遗传、生理生化研究。双重无菌培养法和玻璃珠培养法可获得纯度较高的AM真菌，但数量较少，操作和技术难度大，仅适用于科学研究和特殊目的要求的试验工作。大田培养法是在开放的环境中培养AM真菌，容易受到污染，而且仅适用于在某些地区当季自产自用，不适用于商业化菌剂生产的目的。

目前用于商业化生产的方法主要是盆钵培养法和雾化培养法。盆钵培养法是将 AM真菌的繁殖体（孢子、菌丝、泡囊、菌根根段或侵染土壤）接种于活体植物生长的盆钵基质中，最终获得AM真菌繁殖体的混合菌剂。到目前为止，来自盆钵培养法的根段和孢子仍然是最广泛和最可靠的菌剂，并且此方法是最经典、最传统、经济、简单可靠的AM真菌培养方法，其优点在于操作简易、方法可靠，缺点是开放管理易污染，培养周期较长，繁殖体产量少、占用空间大，且不便于运输携带等等。而后者是由Hung & Sylvia在1988年设计了AM真菌菌剂生产的雾化培养法，这种方法需要特制的气雾培养箱，这是目前较为先进的工厂化生产AM真菌的方法。雾化培养法生产的菌剂纯度高、质量轻，可直接用于接种，也可混合其它基质用于生产，但是雾化培养法成本高，雾化培养系统对营养液要求的参数较多，尤其是对磷和pH值的控制十分严格。因而，雾化培养法虽然也适用于商业化菌剂的生产，但是对成本和技术要求相对较高，不适于大规模使用，与盆钵培养法相比推广使用较少。美国、英国、法国、日本等国已经尝试通过严格控制温室的各种环境因子开展工厂化的菌剂生产，并实现了AM真菌菌剂生产及应用的商品化。他们所生产的制剂不仅纯度高、质量好，而且大都通过严格的工厂标准化生产体系。目前，相关的AM真菌菌剂已经在英国、法国、丹麦、荷兰以及日本等国家广泛地应用于蔬菜、花卉、水果等的种植；同时在新西兰和澳大利亚的牧草生产上均获得了显著的经济效益和生态效益。

基于上述，国外已有相关的菌剂出售，其商品制剂的工厂化生产技术已趋于成熟，但因其价格昂贵，运输不便及在实际使用中存在的诸多问题，导致高质量的AM菌剂还相对较少。目前，国内也开始有相关企业涉足本领域，但其产品质量参差不齐，而且产量小，购买后仍需进一步扩繁。总体而言，国内在AM真菌菌剂的工厂化、商业化生产方面仍然处在起步阶段，加之AM真菌不能离开宿主植物进行单独培养，因此实现AM真菌菌剂的大规模商业化生产仍较为困难。AM真菌菌剂商业化生产只能采用在温室条件下将AM真菌与宿主植物共培养4~5个月的方式开展，且宿主植物的类型、营养基质的配方、培养条件等均为生产工艺上的关键因子。相关的研究表明，对摩西球囊霉（Glomus mosseae）91菌株而言，沙：土=1：1的混合物是其良好的扩繁基质，而沙：土=3：1的混合物对摩西球囊霉（G. mossese）93菌株的生长最为有利。以单一蛭石为基质时，根内球囊霉（Glomus intraradices）对宿主植物根系的侵染强度高、根系发达、产孢量也好，菌剂接种势最高。因此，开展最适的AM菌剂温室工厂化生产技术研究对我国农林业、环境保护以及园林绿化等方面的发展具有十分重要意义。

在AM真菌盆栽培养体系中，AM真菌的生长繁殖受到很多因素的影响，如宿主植物种类、培养基质的成分、温度、营养成分的含量、湿度、光照等。其中，宿主植物作为AM真菌扩繁的共生载体是其最关键的影响因素之一，宿主植物与AM真菌的相互作用决定着二者之间的亲和力、共生体的建立以及菌根的生长、发育和繁殖等。无论是双子叶植物，还是单子叶植物，绝大多数维管植物均可以和AM真菌形成菌根共生体。研究表明，玉米（Zea mays）、白车轴草（Trifolium repens）、高粱（Sorghum bicolor）、洋葱（Allium capa）、大麦（Hordeum vulgare）、苜蓿（Medicago sativa）、花生（Arachis hypogaea）、青葱（Allium fistulosum）、棉花（Gossypium hirsutum）、石刁柏（Asparagus officinalis）、百喜草（Paspalum notatum）、苏丹草（Sorghum sudanense）等均是优良宿主植物的候选材料，其中美、英、新西兰等国常用的为苏丹草、百喜草、白三叶等。AM真菌和宿主植物虽然不存在严格的宿主专一性，但是不同的AM真菌与不同的宿主植物之间存在不同的共生能力已经得到证实。研究还发现，不同的宿主植物对同一AM真菌的依赖性不同。它们能够选择性地促进或抑制一些AM真菌孢子的形成和发育。因此通过筛选某一特定菌种的最佳宿主植物，构建相关的培养体系，在生产实践中具有重要的应用价值。

地表球囊霉（Glomus versiforme）是在1884年由Karsten发现，并命名为Endogone versiformis。后Gerdemann和Trappe在1974将其从内囊霉属中分离出来，划归球囊霉属，并将该种并入大果球囊霉（Glomus macrocarpus）。1979年Daniels和Trappe又重新发表它为新种“地表球囊霉”Glomus epigaeum。1983年Berch & Fortin检查了这些种的标本后确认：E. versiforme是一个球囊霉属的种，但它不同于G. macrocarpus，而和G. epigaeum是同一个种。由于Karsten命名在前，因此将两者合为一个种后，定名为Glomus versiforme。其中文名称翻译为“地表球囊霉”。

地表球囊霉隶属于球囊菌门（Glomeromycota）、球囊菌纲（Glomeromycete）、球囊菌目（Glomerale）、球囊霉科（Glomeraceae）、球囊霉属（Glomus），具有厚垣孢子，在土壤中单生。孢子圆形或近圆形，黄至黄棕色，反射光下沿孢子壁有一圈深色，孢子直径为90~150 μm。孢壁三层，厚4~6 μm，第一层无色透明易逝壁，约1 μm，成熟时常脱落，有时只剩部分残屑。第二层淡黄至淡黄棕色，层状壁，3~4 μm。第三层单一壁，1 μm，和第二层不能分，孢子破裂后可见，呈亮金黄色。菌丝连点宽8~12 μm，直或小喇叭形，有一由内壁形成的隔封闭连点。连孢菌丝无色透明，直径4~7 μm，孢子成熟后即萎缩脱落等主要特征。地表球囊霉是一种全球性广布型AM真菌，可以与多种陆生高等植物形成共生体，进而提高宿主植物对土壤中矿质营养和水分的吸收，促进宿主植物的生长，提高宿主植物的种内和种间竞争能力，调节植物群落的结构和组成，在物种多样性的保护和生态系统稳定性的维持方面发挥了重要作用。地表球囊霉已经成为当前菌根学研究中广泛使用的AM真菌类型之一。但由于现有AM真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）菌剂生产过程仍存在费用昂贵、批量化生产过程周期长、受环境因素影响大、菌剂生产数量有限、孢子繁殖体数量少、质量不稳定和种植管理程序繁琐等问题，因而迫切需要研制一套适合地表球囊霉扩繁的技术体系和方法。

目前有关丛枝菌根培养所公开的专利技术内容大多只涉及AM真菌广谱性的培养方法（例如，研制特定的培养装置、采用混合化的培养基质）和AM真菌在生产实践中的具体应用（例如，某一类或某一种AM真菌实现植物的高效建植、改良栽培方法等等）。

专利号为CN1511944A的“生产丛枝菌根真菌菌剂的方法”，主要涉及一种采用混合培养基质，选择多种宿主植物混播混作的方式来生产丛枝菌根真菌菌剂的方法；专利号为CN1548524A的“一种高效抗旱、耐高磷营养丛植菌根真菌及其生产方法”，主要涉及一种选用高粱作为宿主植物，采用沸石、河沙混合物作为培养基质来生产高效抗旱、耐高磷营养的丛枝菌根真菌摩西球囊霉（Glomus mosseae）93-6菌株的生产方法；专利号为CN1354252A的“以玻璃珠为培养基质的丛枝菌根真菌的培养”，主要涉及一种使用特定的培养装置及培养介质开展丛枝菌根真菌的培养方法；专利号为CN102057826A的“利用摩西球囊霉或根内球囊霉降低蔬菜辛硫磷残留的方法”，主要涉及摩西球囊霉或根内球囊霉的扩繁，摩西球囊霉菌剂或根内球囊霉菌剂在蔬菜作物上的使用、辛硫磷的施用和蔬菜的管理，通过形成丛枝菌根共生体，降低蔬菜中辛硫磷的残留的方法；以及专利号为CN103329743的“一种提高玉米产量的方法”，主要涉及通过在隔沟灌溉条件下对玉米接种丛枝菌根真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）菌剂，公开了一种提高玉米产量的方法。

上述专利虽然提供了通用型的菌剂生产方法，但由于AM真菌种类多样，每一种AM真菌都有自己独特的生物学特性和特征，利用上述方法常常不能对每一种AM真菌进行有效的扩繁，因而迫切需要针对每一种特定的AM真菌建立其专用的扩繁技术和方法。但目前有关单一种类AM真菌的扩繁方面，仅有专利号为CN1548524A有关摩西球囊霉（Glomus mosseae）和专利号为CN102057826A有关根内球囊霉（Glomus intraradices）的技术体系，而对于地表球囊霉（Glomus versiforme）菌剂仅仅涉及到其在生产实践中的具体应用，目前尚没有专一性、标准化的温室扩繁技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效的、经济的、环保的、工厂标准化生产的丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法。

为解决上述问题，本发明所述的丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，包括以下步骤：

⑴分离筛选地表球囊霉的孢子：

在甘肃省庆阳市西峰区E107^o51’、N35^o39’的黄土高原沟壑区采集野生柠条锦鸡儿（Caragana korshinkii）根际0~30cm 深度的根际土壤，置于阴凉处自然风干；然后采用湿筛倾注法从所述根际土壤中分离得到地表球囊霉的孢子；其次，在解剖镜下采用解剖针将孢子和孢子果挑到洁净的培养皿A中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面修饰、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无对所有孢子进行分类，确定其种属、并分类存放；最后，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性判断分离得到地表球囊霉的孢子，并用解剖针将所述地表球囊霉的孢子单独挑出至一个培养皿B中；

⑵选择品种为中穗蛇眼的高粱作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子A；同时，采用巴氏消毒液将直径为8 cm、高5 cm的塑料花盆消毒后作为培养容器A；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；

⑶制备地表球囊霉菌剂：

①在所述培养容器A中装经清洗干净的玻璃珠0.5 kg，在每个所述培养容器A中播种1粒所述消毒后的种子A，采用吸管在解剖镜下从所述培养皿B中吸取一个所述步骤⑴所得的地表球囊霉的孢子，并将其滴加在所述消毒后的种子A上；之后在该消毒后的种子A上加盖0.5cm厚的玻璃珠，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行培养，每隔15天分别给每个所述培养容器A中的植株浇施20 mL去P的Hoagland营养液；同时，每隔一天浇蒸馏水一次；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器A中的地上部分生物体，收获所述培养容器A内的玻璃珠和植物根系；

②将所述培养容器A内所有的玻璃珠和植物根系置于2000 mL的烧杯中，加1000~1200mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤，所述玻璃珠和植物根系留在所述上层筛网之中，由所述地表球囊霉单孢子培养获得的新生孢子将留在所述下层筛网中；

③将所述下层筛网中的所有孢子转移至培养皿C中，在解剖镜下采用解剖针将所述孢子挑到洁净的培养皿D中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面饰纹、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性对培养出来的孢子进行二次鉴定，确认单孢子培养的丛枝菌根真菌为地表球囊霉，并将该单孢子培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂；

⑷配制灭菌基质：

将河沙与黄绵土按3L：1L的比例混合后，使其pH值为6.37~8.09，速效氮为56.8~83.7 mg/kg，速效磷为6.15~11.45 mg/kg，速效钾为76.4~132.5 mg/kg，有机质为26.7~39.6 g/kg；然后在温度为160℃的条件下进行干热灭菌4 h，即得灭菌基质；

⑸选择品种为中穗蛇眼的高粱或品种为九单2号的玉米作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子或玉米种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子B；同时，采用巴氏消毒液将直径为21cm、高16cm的塑料花盆消毒后作为培养容器B；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；

⑹在每个所述培养容器B中先装所述灭菌基质4.5 kg，然后将100个所述步骤⑶所得的地表球囊霉孢子作为接种剂平铺其上，再覆盖1 kg的所述灭菌基质，其次，在每个所述培养容器B中分别播种5粒所述消毒后的种子B，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行栽培，40 d和80 d分别给每个所述培养容器B浇施100 mL去P的Hoagland营养液；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器B中的地上部分生物体，保留所述培养容器B内的土壤基质和植物根系，该所述培养容器B内所有的土壤基质和植物根系取出后置于阴凉、干燥处自然风干，混匀后即得到扩繁的菌剂；

⑺称取20 g所述扩繁的菌剂，采用湿筛倾注法测定AM真菌孢子密度，确定扩繁获得的菌剂质量；当每1 g扩繁菌剂内含≥50个健康有活力的孢子，即判为菌剂扩繁合格。

所述步骤⑴中地表球囊霉的孢子的分离方法是指将100 g风干的所述根际土壤样品置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀并浸泡一天后，采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将所述下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液A，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液B；将所述上清液B转入到所述孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将所述蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿E中，该过滤物中即为分离出的各类丛枝菌根真菌的孢子。

所述步骤⑶或所述步骤⑹中的Hoagland营养液是指将118.075 mg硝酸钙、505.5 mg硝酸钾、115 mg磷酸二氢氨、123.24 mg硫酸镁、2 mL 500倍的铁盐母液和1 mL 1000倍的微量元素母液溶于蒸馏水并定容至1000mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至6.0所得的溶液；所述500倍的铁盐母液是指将七水硫酸亚铁8.2g和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）8.62g溶于蒸馏水并定容至1000 mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至5.5即得；所述1000倍的微量元素母液是指将硼酸5.69g、氯化锰3.56g、硫酸锌0.46g、硫酸铜0.15g、钼酸铵0.86g溶于蒸馏水并定容至1000mL即得。

所述步骤⑹中AM真菌孢子密度的测定方法是指将20 g所述扩繁的菌剂置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将所述下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液C，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液D；将所述上清液D转入到所述孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将所述蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿F中，该过滤物中即为分离出的地表球囊霉的孢子；在解剖镜下对分离出的孢子进行计数，获得孢子总数记为N，最后按下式计算所述地表球囊霉的孢子的密度：M=N/20

式中：

M为每1g扩繁菌剂内含孢子的数目，即AM真菌地表球囊霉的孢子密度；

N为分离自20g扩繁菌剂的孢子总数；

20为测定孢子密度时采用的20g扩繁菌剂数量。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用温室盆栽培养体系，选择高粱作为宿主植物，建立高粱和AM真菌地表球囊霉扩繁的程序，从而建立高质量的AM菌剂生产体系。

2、本发明所用培养基质价格低廉，而且操作简单，适合大规模AM真菌菌剂的生产。

3、由于本发明通过对AM真菌地表球囊霉菌剂培养基质和宿主植物种子的处理，以及培养条件的设计，因此，排除了其它因素对AM真菌扩繁的影响和干扰，促进了AM真菌的产量，大幅提高了产品的稳定性。采用本发明生产出来的孢子可以为科研上提供无污染的纯种AM真菌地表球囊霉的孢子，用于相关的基础性研究；也可以用于地表球囊霉菌剂生物肥料的生产。

4、本发明生产周期短（只需15周），而且获得的地表球囊霉菌剂中AM真菌的有效孢子含量高，数量可达87~209个/克。

5、本发明温室管理采用常规方法，生产成本较低且易于管理，具有省时省力的优点。

具体实施方式

丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，包括以下步骤：

⑴分离筛选地表球囊霉的孢子：

在甘肃省庆阳市西峰区E107^o51’、N35^o39’的黄土高原沟壑区采集野生柠条锦鸡儿（Caragana korshinkii）根际0~30cm 深度的根际土壤，置于阴凉处自然风干；然后采用湿筛倾注法从根际土壤中分离得到地表球囊霉的孢子；其次，在解剖镜下采用解剖针将孢子和孢子果挑到洁净的培养皿A中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面修饰、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无对所有孢子进行分类，确定其种属、并分类存放；最后，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性判断分离得到地表球囊霉的孢子，并用解剖针将地表球囊霉的孢子单独挑出至一个培养皿B中。

其中：地表球囊霉的孢子的分离方法是指将100 g风干的根际土壤样品置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀并浸泡一天后，采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液A，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液B；将上清液B转入到孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿E中，该过滤物中即为分离出的各类丛枝菌根真菌的孢子。

⑵选择品种为中穗蛇眼的高粱作为宿主植物；将饱满、均一、健康的高粱种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子A；同时，采用巴氏消毒液将直径为8 cm、高5 cm的塑料花盆消毒后作为培养容器A；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒。

⑶制备地表球囊霉菌剂：

①在培养容器A中装经清洗干净的玻璃珠0.5 kg，在每个培养容器A中播种1粒消毒后的种子A，采用吸管在解剖镜下从所述培养皿B中吸取一个步骤⑴所得的地表球囊霉的孢子，并将其滴加在消毒后的种子A上；之后在该消毒后的种子A上加盖0.5cm厚的玻璃珠，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行培养，每隔15天分别给每个培养容器A中的植株浇施20 mL去P的Hoagland营养液；同时，每隔一天浇蒸馏水一次；最后在培养15周后进行收获，剪去培养容器A中的地上部分生物体，收获培养容器A内的玻璃珠和植物根系。

其中：Hoagland营养液是指将118.075 mg硝酸钙、505.5 mg硝酸钾、115 mg磷酸二氢氨、123.24 mg硫酸镁、2 mL 500倍的铁盐母液和1 mL 1000倍的微量元素母液溶于蒸馏水并定容至1000mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至6.0所得的溶液。

500倍的铁盐母液是指将七水硫酸亚铁8.2g和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）8.62g溶于蒸馏水并定容至1000 mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至5.5即得。

1000倍的微量元素母液是指将硼酸5.69g、氯化锰3.56g、硫酸锌0.46g、硫酸铜0.15g、钼酸铵0.86g溶于蒸馏水并定容至1000mL即得。

②将培养容器A内所有的玻璃珠和植物根系置于2000 mL的烧杯中，加1000~1200mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤，玻璃珠和植物根系留在上层筛网之中，由地表球囊霉单孢子培养获得的新生孢子将留在下层筛网中。

③将下层筛网中的所有孢子转移至培养皿C中，在解剖镜下采用解剖针将孢子挑到洁净的培养皿D中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面饰纹、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性对培养出来的孢子进行二次鉴定，确认单孢子培养的丛枝菌根真菌为地表球囊霉，并将该单孢子培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂。

⑷配制灭菌基质：

将河沙与黄绵土按3L：1L的比例混合后，使其pH值为6.37~8.09，速效氮为56.8~83.7 mg/kg，速效磷为6.15~11.45 mg/kg，速效钾为76.4~132.5 mg/kg，有机质为26.7~39.6 g/kg；然后在温度为160℃的条件下进行干热灭菌4 h，即得灭菌基质。

⑸选择品种为中穗蛇眼的高粱或品种为九单2号的玉米作为宿主植物；将饱满、均一、健康的高粱种子或玉米种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子B；同时，采用巴氏消毒液将直径为21cm、高16cm的塑料花盆消毒后作为培养容器B；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒。

⑹在每个培养容器B中先装灭菌基质4.5 kg，然后将100个步骤⑶所得的地表球囊霉孢子作为接种剂平铺其上，再覆盖1 kg的灭菌基质，其次，在每个培养容器B中分别播种5粒所述消毒后的种子B，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行栽培，40 d和80 d分别给每个培养容器B浇施100 mL去P的Hoagland营养液；最后在培养15周后进行收获，剪去培养容器B中的地上部分生物体，保留培养容器B内的土壤基质和植物根系，该培养容器B内所有的土壤基质和植物根系取出后置于阴凉、干燥处自然风干，混匀后即得到扩繁的菌剂。

其中：Hoagland营养液同步骤⑶。

⑺称取20 g扩繁的菌剂，采用湿筛倾注法测定AM真菌孢子密度，确定扩繁获得的菌剂质量；当每1 g扩繁菌剂内含≥50个健康有活力的孢子，即判为菌剂扩繁合格。

其中：AM真菌孢子密度的测定方法是指将20 g扩繁的菌剂置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液C，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液D；将上清液D转入到孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿F中，该过滤物中即为分离出的地表球囊霉的孢子；在解剖镜下对分离出的孢子进行计数，获得孢子总数记为N，最后按下式计算所述地表球囊霉的孢子的密度：M=N/20

式中：

M为每1g扩繁菌剂内含孢子的数目，即AM真菌地表球囊霉的孢子密度。

N为分离自20g扩繁菌剂的孢子总数。

20为测定孢子密度时采用的20g扩繁菌剂数量。

Claims (3)

1.丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，包括以下步骤：

⑴分离筛选地表球囊霉的孢子：

在甘肃省庆阳市西峰区E107^o51’、N35^o39’的黄土高原沟壑区采集野生柠条锦鸡儿根际0~30cm 深度的根际土壤，置于阴凉处自然风干；然后采用湿筛倾注法从所述根际土壤中分离得到地表球囊霉的孢子；其次，在解剖镜下采用解剖针将孢子和孢子果挑到洁净的培养皿A中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面修饰、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物、连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无对所有孢子进行分类，确定其种属、并分类存放；最后，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性判断分离得到地表球囊霉的孢子，并用解剖针将所述地表球囊霉的孢子单独挑出至一个培养皿B中；

⑵选择品种为中穗蛇眼的高粱作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子A；同时，采用巴氏消毒液将直径为8 cm、高5 cm的塑料花盆消毒后作为培养容器A；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；

⑶制备地表球囊霉菌剂：

①在所述培养容器A中装经清洗干净的玻璃珠0.5 kg，在每个所述培养容器A中播种1粒所述消毒后的种子A，采用吸管在解剖镜下从所述培养皿B中吸取一个所述步骤⑴所得的地表球囊霉的孢子，并将其滴加在所述消毒后的种子A上；之后在该消毒后的种子A上加盖0.5cm厚的玻璃珠，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行培养，每隔15天分别给每个所述培养容器A中的植株浇施20 mL去P的Hoagland营养液；同时，每隔一天浇蒸馏水一次；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器A中的地上部分生物体，收获所述培养容器A内的玻璃珠和植物根系；所述Hoagland营养液是指将118.075 mg硝酸钙、505.5 mg硝酸钾、115 mg磷酸二氢氨、123.24 mg硫酸镁、2 mL 500倍的铁盐母液和1 mL 1000倍的微量元素母液溶于蒸馏水并定容至1000mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至6.0所得的溶液；所述500倍的铁盐母液是指将七水硫酸亚铁8.2g和乙二胺四乙酸二钠8.62g溶于蒸馏水并定容至1000 mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至5.5即得；所述1000倍的微量元素母液是指将硼酸5.69g、氯化锰3.56g、硫酸锌0.46g、硫酸铜0.15g、钼酸铵0.86g溶于蒸馏水并定容至1000mL即得；

②将所述培养容器A内所有的玻璃珠和植物根系置于2000 mL的烧杯中，加1000~1200mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤，所述玻璃珠和植物根系留在所述上层筛网之中，由所述地表球囊霉单孢子培养获得的新生孢子将留在所述下层筛网中；

③将所述下层筛网中的所有孢子转移至培养皿C中，在解剖镜下采用解剖针将所述孢子挑到洁净的培养皿D中，在体视显微镜下观察，根据孢子的形状、大小、颜色、表面饰纹、孢子壁的层次及染色反应、孢子内含物，连孢菌丝、孢子囊、辅助细胞的有无，根据常规地表球囊霉孢子的特征、特性对培养出来的孢子进行二次鉴定，确认单孢子培养的丛枝菌根真菌为地表球囊霉，并将该单孢子培养出来的地表球囊霉孢子作为地表球囊霉菌剂；

⑷配制灭菌基质：

将河沙与黄绵土按3L：1L的比例混合后，使其pH值为6.37~8.09，速效氮为56.8~83.7 mg/kg，速效磷为6.15~11.45 mg/kg，速效钾为76.4~132.5 mg/kg，有机质为26.7~39.6 g/kg；然后在温度为160℃的条件下进行干热灭菌4 h，即得灭菌基质；

⑸选择品种为中穗蛇眼的高粱或品种为九单2号的玉米作为宿主植物；将饱满、均一、健康的所述高粱种子或玉米种子采用体积浓度为0.1%的次氯酸钠溶液消毒2 min，然后用蒸馏水清洗干净，得到消毒后的种子B；同时，采用巴氏消毒液将直径为21cm、高16cm的塑料花盆消毒后作为培养容器B；并在培养前一星期，采用巴氏消毒液对温室、苗床进行消毒；

⑹在每个所述培养容器B中先装所述灭菌基质4.5 kg，然后将100个所述步骤⑶所得的地表球囊霉孢子作为接种剂平铺其上，再覆盖1 kg的所述灭菌基质，其次，在每个所述培养容器B中分别播种5粒所述消毒后的种子B，在白天温度为25±2℃或夜间温度为19±2℃、相对湿度为65±5%、光照强度为800~1100 μmol m^?2 s^?1、光照周期保持在白天为14h或夜晚为10 h的条件下进行栽培，40 d和80 d分别给每个所述培养容器B浇施100 mL去P的Hoagland营养液；最后在培养15周后进行收获，剪去所述培养容器B中的地上部分生物体，保留所述培养容器B内的土壤基质和植物根系，该所述培养容器B内所有的土壤基质和植物根系取出后置于阴凉、干燥处自然风干，混匀后即得到扩繁的菌剂；所述Hoagland营养液是指将118.075 mg硝酸钙、505.5 mg硝酸钾、115 mg磷酸二氢氨、123.24 mg硫酸镁、2 mL 500倍的铁盐母液和1 mL 1000倍的微量元素母液溶于蒸馏水并定容至1000mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至6.0所得的溶液；所述500倍的铁盐母液是指将七水硫酸亚铁8.2g和乙二胺四乙酸二钠8.62g溶于蒸馏水并定容至1000 mL后，采用质量浓度为1%的HCl调节其pH值至5.5即得；所述1000倍的微量元素母液是指将硼酸5.69g、氯化锰3.56g、硫酸锌0.46g、硫酸铜0.15g、钼酸铵0.86g溶于蒸馏水并定容至1000mL即得；

⑺称取20 g所述扩繁的菌剂，采用湿筛倾注法测定AM真菌孢子密度，确定扩繁获得的菌剂质量；当每1 g扩繁菌剂内含≥50个健康有活力的孢子，即判为菌剂扩繁合格。

2.如权利要求1所述的丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，其特征在于：所述步骤⑴中地表球囊霉的孢子的分离方法是指将100 g风干的所述根际土壤样品置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀并浸泡一天后，采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将所述下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液A，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液B；将所述上清液B转入到所述孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将所述蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿E中，该过滤物中即为分离出的各类丛枝菌根真菌的孢子。

3.如权利要求1所述的丛枝菌根真菌地表球囊霉菌剂的温室扩繁方法，其特征在于：所述步骤⑹中AM真菌孢子密度的测定方法是指将20 g所述扩繁的菌剂置于1000 mL的烧杯中，加800 mL水，经搅拌、充分混匀后采用上层孔径为0.355 mm、下层孔径为0.05 mm的两层筛网进行过滤；将所述下层筛网中的残留物全部移到100 mL的离心管中后，在4000转/分的条件下离心4分钟，弃上清液C，添加质量浓度为50%的蔗糖溶液到离心管的1/2~2/3处，充分混匀，再在4000转/分的条件下离心4分钟，得到上清液D；将所述上清液D转入到所述孔径为0.05 mm的筛网中，用自来水将所述蔗糖溶液冲洗干净，并将过滤物全部移到培养皿F中，该过滤物中即为分离出的地表球囊霉的孢子；在解剖镜下对分离出的孢子进行计数，获得孢子总数记为N，最后按下式计算所述地表球囊霉的孢子的密度：M=N/20

式中：

M为每1g扩繁菌剂内含孢子的数目，即AM真菌地表球囊霉的孢子密度；

N为分离自20g扩繁菌剂的孢子总数；

20为测定孢子密度时采用的20g扩繁菌剂数量。