CN105255744B - 一种灵芝菌种提纯复壮培养方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明属于真菌栽培领域，针对现有的传统灵芝菌种培养基质导致的灵芝菌种活性降低等问题，本发明提供了一种灵芝菌种提纯复壮培养方法及其培养基，该培养方法包括如下步骤：A、制备灵芝菌种复壮培养基：所述灵芝菌种复壮培养基含有下述配比的原料：土豆150‑400g、葡萄糖10‑30g、琼脂粉10‑25g、磷酸二氢钾1‑5g、硫酸镁0.5‑3g、灵芝子实体30‑70g；B、将灵芝菌种培养成菌丝后接种至步骤A所得灵芝菌种复壮培养基；C、按常规条件培养得复壮菌种。本发明配方法制备所得菌丝生长快、洁白、整齐、浓密，所得子实体农艺性状佳。

Description

一种灵芝菌种提纯复壮培养方法及其培养基

技术领域

本发明属于真菌栽培领域，具体涉及一种灵芝菌种提纯复壮培养方法及其培养基。

背景技术

灵芝(ganoderma lucidum)，是中药材宝库中的珍品，素有“仙草”之誉，是中医药事业的源头，作为中医临床原材料，灵芝药用已经有3000多年的历史。灵芝在我国人工栽培已有30多年的历史，栽培面积广、品种多，灵芝品种的质量直接影响其中药产品的品质和疗效。现代药理学研究和临床疗效证明灵芝的药用价值包括抗肿瘤抗放射功能、抗心血管系统疾病、提高免疫力、保肝解毒、调节神经系统、调节血糖等。

灵芝菌种是灵芝生产的前提和关键，灵芝的人工栽培菌种质量的好坏直接影响到栽培的成败、产量的高低以及品质的好坏。生产优良的菌种是灵芝栽培中的一个极其重要的环节，但长期以来，由于科技水平的限制，灵芝菌种在栽培过程中极易发生退化，表现为菌丝生长弱，生命力不强，抗逆性差，病虫害严重。传统的灵芝菌种培养基配方为：马铃薯(200g)，葡萄糖(20g)，琼脂粉(15g)，硫酸镁(1.5g)，磷酸二氢钾(3g)，蒸馏水1000mL。灵芝菌种长期使用这种培养基会导致菌丝活力减弱，产量降低，只有不断的更换新培养基，进行提纯复壮，才能提高菌丝的活力。

发明内容

针对现有的传统灵芝菌种培养基质导致的灵芝菌种活性降低等问题，本发明的目的是要提供一种新的灵芝菌种复壮培养基及其培养方法，该培养基能解决灵芝大规模生产甚至工厂化栽培中出现的菌种抗逆性降低、活性不足、生命力差、产量低等问题。

为实现上述目标，本发明提供了灵芝菌丝提纯培养基和灵芝菌种复壮培养基两种培养基。

其中，灵芝菌丝提纯培养基(即1号培养基)含有下述配比的原料：土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g，蒸馏水适量。

进一步优选，灵芝菌丝提纯培养基含有下述配比的原料：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蒸馏水适量。

进一步的，还可以在灵芝菌丝提纯培养基中玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，灵芝菌丝提纯培养基中配比的原料：土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g，玉米粉5-25g，麸皮25-75g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种50-200g，蒸馏水适量。

进一步的优选，灵芝菌丝提纯培养基中配比的原料：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种100g，蒸馏水适量。

其中，灵芝菌种复壮培养基(即2号培养基)含有下述配比的原料：土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g，灵芝子实体30-70g，蒸馏水适量。

进一步优选，灵芝菌种复壮培养基含有下述配比的原料：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，灵芝子实体50g，蒸馏水适量。

进一步的，还可以在灵芝菌种复壮培养基中玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，灵芝菌种复壮培养基中配比的原料：土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g，玉米粉5-25g，麸皮25-75g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种50-200g，灵芝子实体30-70g，蒸馏水适量。

进一步的优选，灵芝菌种复壮培养基含有下述配比的原料：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种100g，灵芝子实体50g，蒸馏水适量。加适量蒸馏水的判断依据是：

1)涉及下述制备方法步骤2)原料土豆，以及玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮等煎煮时，加水量以原料能全部被水浸透，将水淹没原料即可。

2)涉及到述制备方法步骤3)中将步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水时，此时蒸馏水加入量以原料土豆200g计算，加蒸馏水至溶液总量为800-1000mL。

本发明灵芝菌种复壮培养基是在传统灵芝菌种培养基的基础上，设计了两个培养阶段，在灵芝菌丝提纯培养基中将菌种培养至菌丝；然后将菌丝置于灵芝菌种复壮培养基中培养得到复壮灵芝菌种。在灵芝菌种复壮培养基中添加灵芝子实体的目的是提供灵芝菌丝生长的特殊营养并适应一定的环境条件。并在上述两种培养基中可选择添加玉米粉、麸皮、栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，添加玉米粉的目的是提供复合氮源，添加麸皮的目的是提供氮源，添加栎树树皮、青冈树树皮的目的是提供灵芝生长所需的碳源以及其他营养，两者以任意比例混合皆可。采用本发明培养基分阶段复壮培养，菌丝生长快、整齐浓密，培养得到的灵芝子实体农艺性状佳。

本发明灵芝菌丝提纯培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

如果培养基中还含有玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，则灵芝菌丝提纯培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

本发明灵芝菌种复壮培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与灵芝子实体加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

如果培养基中还含有玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，则灵芝菌种复壮培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种、灵芝子实体加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

上述培养基制备方法中步骤2)所述“加蒸馏水补足至800-1000ml”是以原料土豆200g计算，加蒸馏水至溶液总量为800-1000mL。

本发明的关键是提供了一种采用本发明灵芝菌种复壮培养基的灵芝菌种提纯复壮培养方法，包括如下步骤：

A、按前述原料组成及方法制备灵芝菌种复壮培养基；

B、将灵芝菌种培养成菌丝后接种至步骤A所得灵芝菌种复壮培养基；

C、按常规条件培养得复壮菌种。

其中，在步骤B将灵芝菌种培养成菌丝时，既可以采用现有的传统培养基，即原料配比为土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g的传统培养基。又可以采用本发明提供的灵芝菌丝提纯培养基，即原料配比为土豆150-400g，葡萄糖10-30g，琼脂粉10-25g，磷酸二氢钾1-5g，硫酸镁0.5-3g，玉米粉5-25g，麸皮25-75g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种50-200g的本发明灵芝菌丝提纯培养基。

本发明的有益效果为：

本发明提供的一种灵芝菌种复壮培养基及其制备方法比传统培养基制作方法较特别，该配方由土豆、葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、玉米粉、麸皮、栎树树皮或青冈树树皮、灵芝子实体配制而成，该培养基经过长期试验，摸索而得到，通过该提纯复壮培养基而得到的菌种与传统培养基比较，其菌丝生长快、整齐浓密、菌丝洁白浓密、生长出的灵芝子实体农艺性状佳。

附图说明

图1 SLZ30采用传统培养基培养。

图2 SLZ30采用本发明培养基培养。

图3 SLZ46采用传统培养基培养。

图4 SLZ46采用本发明培养基培养。

图5 SLZ44采用传统培养基培养。

图6 SLZ44采用本发明培养基培养。

具体实施方式

下面结合具体的实施案例对本发明进行进一步的说明，3个灵芝菌种SLZ 30、SLZ46、SLZ44的提纯复壮试验。

灵芝菌种复壮培养基的制备包括以下步骤：

(1)提纯复壮培养基配方

灵芝菌丝提纯培养基，即1号培养基准备：

选取20mm×200mm圆底试管20支，培养料全部在当地选择，土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮和/或青冈树树皮任意比例100g。

灵芝菌种复壮培养基，即2号培养基准备：

选取20mm×200mm圆底试管20支，培养料全部在当地选择，土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮和/或青冈树树皮任意比例皮100g，灵芝子实体50g。

(2)选料及配制：分别按照上述两种培养基配方进行操作配置，按常规方法将土豆去皮，切成薄片，将土豆片，玉米粉，麸皮，栎树树皮和/或青冈树树皮任意比例、灵芝子实体、水1000ml放在锅里一同煮制作1号培养基，另外将土豆片，玉米粉，麸皮，栎树树皮和/或青冈树树皮任意比例，灵芝子实体，水1000ml放在锅里一同煮制作2号培养基。当水沸腾后用文火加热，煮沸过程中不断搅拌，保持20分钟。

(3)过滤：用三层纱布过滤，取上述培养液，用蒸馏水补足至1000mL。

(4)溶解：将琼脂粉放入上培养液中加热溶解，溶解过程中不断搅拌，当琼脂粉溶解后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁，完全溶解后备用。

(5)分装：将溶解后的培养液分装到预先准备好的试管中，每个试管装入量为试管长度的1/5，然后用硅胶塞封口。

(6)灭菌：将分装好的试管进行捆扎，每10只试管捆扎一起，在高压锅内灭菌，121℃维持35分钟。

(7)摆斜面：当锅内温度下降到60℃左右，取出试管并摆斜面，斜面长度为总长度的1/2，冷却后备用。

(二)提纯与复壮

(1)接种至1号培养基中：在无菌操作台上进行操作，选取直径5mm左右的菌种块接种到配制好的试管1号培养基中。

(2)接种至2号培养基中：将接种好的1号培养基试管放入25℃培养箱中培养，每天观测，当斜面菌丝生长到一半后，挑选生长快而健壮的试管，取菌丝的尖端部位菌丝体移接到2号培养基中，同样放在25℃培养箱中培养，菌丝长满后即得到复壮菌种，可以进行大规模生长或工厂化栽培。

1试验材料与方法

1.1试验材料

将枝条粉碎晒干、发酵备用。棉籽壳、玉米芯、麸皮、石膏、石灰均来自当地农贸市场和工厂。

1.2试验方法

1.2.1培养基制作

表1本发明培养基和传统培养基配方

1.2.2原种、栽培种制作

原料选择要选完整无损、无霉变、无虫蛀，未发芽的玉米粒，将玉米用清水浸泡24小时使其充分吸水膨胀后捞出，稍晾片刻，拌入1％的石膏。分装入菌种瓶中，121℃灭菌3小时。

1.2.3栽培袋制作

1.2.3.1拌料

按照如下配方称取栽培材料，将浸泡好的棉籽壳、玉米芯一起拌料，拌料均匀后将麸皮、石膏、石灰混合均匀，再同主料一起拌匀。最后调节水分使其达到65％左右，再堆积1小时。

栽培配方为：棉籽壳60％、杂木屑15％、玉米芯15％、麸皮8％、石膏1％、熟石灰1％。

1.2.3.2装袋

采用17cm×33cm×0.005cm聚乙烯袋，每袋装干料0.5kg，装好后盖上菌盖，准备灭菌。

1.2.3.3灭菌、冷却、接种

将袋料灵芝进行常压灭菌，灭菌时间15小时。当温度下降到30℃时，无菌操作接种。

1.2.3.4发菌和出芝管理

将接种好的栽培袋放在黑暗中培养，培养条件为：温度22-28℃，湿度65％左右。经过30天左右的培养，菌丝发满菌袋。将发菌满的菌袋搬入出芝棚内，进行出芝管理，大约经过1个月的出芝管理，即可采收灵芝子实体。

2.结果与分析

2.1不同配方对灵芝菌丝生长的影响

接种后，每天观察菌丝的生长情况，从菌丝的长势、浓密、整齐和洁白度等外观性状以及菌丝生长速度等方面考察菌丝生长状况。从表2、表3、表4可以看出，采用本发明1号培养基和2号培养基所得菌丝生长速度、长势、菌丝外观、发菌时间都比传染培养基配方佳。

表2 SLZ30灵芝菌丝生长情况

表3 SLZ46灵芝菌丝生长情况

表4 SLZ46灵芝菌丝生长情况

2.2不同配方对灵芝子实体性状及产量的影响

从表5、表6、表7中可以看出，3个菌株经过本发明1号培养基和2号培养基提纯复壮后其菌盖直径、菌盖厚度、单片鲜重、产量、生物转化率相比传统培养基存在的明显的优势，从图1-6中更能直观的看出其差别。

表5 SLZ30灵芝子实体性状及产量的比较

表6 SLZ46灵芝子实体性状及产量的比较

表7 SLZ44灵芝子实体性状及产量的比较

3、结论

上述3个品种的灵芝菌种通过本发明提纯培养基和复壮培养基，从菌丝生长速度、外观以及菌丝长势明显看出其抗逆性、活性得到了显著提高。从子实体的农艺性状中其菌盖直径、厚度、产量和生物转化率可以看出，3个品种菌种通过本发明方法提纯复壮培养后各项数据得到了明显的提高，其产量最高提高了44.32％，最低提高了40.48％，单袋出产密集，产量明显提高。

Claims (5)

1.灵芝菌种提纯复壮培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

A、制备灵芝菌种复壮培养基：所述灵芝菌种复壮培养基含有下述配比的原料：

土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种100g，灵芝子实体50g，蒸馏水适量；

B、将灵芝菌种培养成菌丝后接种至步骤A所得灵芝菌种复壮培养基；将灵芝菌种培养成菌丝是采用如下菌丝提纯培养基，所述菌丝提纯培养基含有下述配比的原料：

土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮，青冈树树皮中至少一种100g，蒸馏水适量；

C、按常规条件培养得复壮菌种。

2.根据权利要求1所述的灵芝菌种提纯复壮培养方法，其特征在于：步骤A所述灵芝菌种复壮培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，灵芝子实体加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

3.根据权利要求1所述的灵芝菌种提纯复壮培养方法，其特征在于：步骤B将灵芝菌种培养成菌丝是采用如下菌丝提纯培养基的制备方法如下：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。

4.灵芝菌种复壮培养基，其特征在于：所述的灵芝菌种复壮培养基原料配比如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，玉米粉10g，麸皮50g，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种100g，灵芝子实体50g，蒸馏水适量。

5.权利要求4所述的灵芝菌种复壮培养基的制备方法，其特征在于：制备方法包括如下步骤：

1)土豆去皮，切片；

2)土豆与玉米粉，麸皮，栎树树皮、青冈树树皮中至少一种，灵芝子实体加水煮沸后煎煮；

3)步骤2)所得煎煮液，过滤，加蒸馏水补足至800-1000ml；

4)向步骤3)所得溶液中加入琼脂粉，加热、搅拌至琼脂粉溶解，再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁溶解得培养基溶液；

5)步骤4)所得培养基溶液按常规方法分装、灭菌、摆斜面即得。