CN105861321B

CN105861321B - 一种白肉灵芝菌种及其栽培方法和应用

Info

Publication number: CN105861321B
Application number: CN201610246676.8A
Authority: CN
Inventors: 胡惠萍; 吴清平; 谢意珍
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd; Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2036-04-20
Also published as: CN105861321A

Abstract

本发明涉及一种白肉灵芝菌种及其栽培方法。所述白肉灵芝Ganoderma leucocontextum HMGIM‑Z110122，保藏编号为CCTCC NO：M2016087。白肉灵芝CCTCC M2016087的栽培方法包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。本发明的有益效果是：本发明提供一种白肉灵芝菌种，并且还提供了相应的人工栽培方法。该白肉灵芝目前稀少，能有效促进小鼠脾细胞增殖，营养价值高，具有很好的经济效益和社会效益。

Description

一种白肉灵芝菌种及其栽培方法和应用

技术领域

本发明涉及一种灵芝菌种，尤其涉及一种白肉灵芝菌种及其栽培方法和应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma)在中国有悠久的药用历史，长期被人们用于气管炎、肝炎、高血压、肿瘤、免疫力紊乱等病症的辅助治疗。现代的药理和临床研究结果也表明灵芝含有抑制肿瘤和调节免疫的活性成分。自DONK(1948)建立灵芝科(Ganodermataceae)以来，目前全世界已报道的灵芝科大型真菌共200余种，我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所利用。目前在国内广泛应用的品种包括赤芝(Ganoderma lucidum)，紫芝(Ganodermasinense)等，灵芝属的许多其它种类也具有类似的效果，值得进一步研究。

目前，关于白肉灵芝的专利申请主要是关于白肉灵芝的提取物用途方面的研究。本申请的白肉灵芝菌种是在林芝市波密县扎西岗乡的阔叶林中青冈树根部采集并分离的新菌种，经研究，未见该菌种的研究报道。

发明内容

本发明提供一种白肉灵芝菌种及其人工栽培方法和用途。

本发明通过以下方案达到上述目的：

本发明的白肉灵芝菌采自西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中，经鉴定为白肉灵芝菌种，并且组织分离获得原始菌株，命名为白肉灵芝Ganoderma leucocontextumHMGIM-Z110122，于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016087)。

上述白肉灵芝CCTCC M 2016087菌种的栽培方法，包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。

在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝菌种的栽培方法中制作母种的培养基为综合PDA培养基，所述综合PDA培养基的配方按质量百分比计为马铃薯18-20％，优选为20％、葡萄糖1.5-2％，优选为2％、琼脂2-2.5％，优选为2％、磷酸二氢钾0.15-0.3％，优选为0.3％、硫酸镁0.05-0.15％，优选为0.15％、维生素B1微量，其余为水。

在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝菌种的栽培方法中制作原种的原种料的原料组成按质量百分比计为高粱75-79％、小米16-20％、CaCO₃1-2％、含水量55-60％。

在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝菌种的栽培方法中制作生产种的生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89％、麸皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽壳48-52％、木屑25-30％、麸皮18-20％、碳酸钙1-2％、硫酸钙1-2％，含水量55-60％。

在一个优选的实施例中，上述白肉灵芝菌种的栽培方法中栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑75-78％、麸皮20-22％、CaCO₃1-2％，含水量60-65％

本发明提供一种优选的白肉灵芝CCTCC M 2016087菌种的栽培方法，包括以下步骤：

(1)制作母种：采集组织分离的菌种白肉灵芝，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于20-25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面即得生产母种，其中所述综合PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯18-20％，优选为20％、葡萄糖1.5-2％，优选为2％、琼脂2-2.5％，优选为2％、磷酸二氢钾0.15-0.3％，优选为0.3％、硫酸镁0.05-0.15％，优选为0.15％、维生素B1微量，其余为水；

(2)制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱75-79％、小米16-20％、CaCO₃1-2％、含水量55-60％，将所述原种料装入菌种袋中，制得原种袋；

(3)制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种，其中生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89％、麸皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽壳48-52％、木屑25-30％、麸皮18-20％、碳酸钙1-2％、硫酸钙1-2％，含水量55-60％，将所述将生产种料装入菌种袋中，制得生产种袋；

(4)接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后，继续遮光后熟培养至菌丝完成后熟期，其中栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑75-78％、麸皮20-22％、CaCO₃1-2％，含水量60-65％，将所述栽培料装入菌种袋中，制得栽培袋；

(5)出芝管理：调节温度为20-21℃、湿度85-90％、光照100-200lux，不通气，保持CO₂含量在2000ppm以上至长出原基，调整温度为26-28℃、空气相对湿度85-90％、光照约200-300lux，不通气，继续保持CO₂含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95％，光照300-500lux，通气，保持CO₂含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。

优选的，上述步骤(4)中的培养室的空气相对湿度为60-70％。

本发明另一方面还提供一种上述白肉灵芝CCTCC M 2016087菌种用于细胞增殖的用途，特别是用于脾细胞增殖的用途。

在一个优选的示例性实施例中，提供一种上述白肉灵芝CCTCC M 2016087的提取物用于细胞增殖的用途，特别是用于脾细胞增殖的用途。

本发明研究者证实了白肉灵芝CCTCC M 2016087水提取物对脾细胞具有显著的增殖效果。

本发明的白肉灵芝CCTCC M 2016087子实体具有以下的形态特征和外观特征：

菌盖10-20*5-10cm,近柄处厚2-3cm，扇形或半圆形扇形，大部分红至红褐色，幼嫩时及成熟时边缘白至浅黄色，渐变黄至红褐色，成熟后接近菌柄部分呈暗红褐色、暗紫红褐色或几乎黑红褐色，具漆样光泽，具同心环纹，常有弱的放射状皱纹。

孔口表面新鲜时白色至奶油色，受伤处带褐色至褐色。孔口近圆形，每毫米4-6个。菌管长达4-6mm，不分层，赭色到淡灰褐色或灰褐色。

菌肉厚达2.2cm，白色，干后白至近白色或微带奶油色，软木栓质至木栓质，近表皮有一薄的带褐色紧密层(皮壳)。

菌柄5-8*3.5-5.5cm，圆柱形至略扁，侧生至偏生，有时近无柄，暗红褐色至暗紫褐色，具光泽，内部白色。

孢子广椭圆形，顶端平截，浅褐色，双层壁，内壁具小刺，非淀粉质，包括最外孢层时为9.5-12.5*7-9μm，不包括最外孢层时为8.0-9.0*5-6.5μm。

经分子生物学鉴定，其ITS分子序列测定及分析结果接近白肉灵芝，相似度达90％以上，结合形态特征与微观特征及分子鉴定结果，得出其为白肉灵芝菌种。

本发明的有益效果是：本发明提供一种白肉灵芝菌种，并且还提供了相应的人工栽培方法。该白肉灵芝目前稀少，有效成分含量较高，并能有效促进小鼠脾细胞增殖，营养价值高，具有很好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1采用实施例1的栽培方法得到白肉灵芝。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1：

白肉灵芝(CCTCC M 2016087)的人工栽培方法，包括以下步骤：

1)按质量百分比计为马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.15％及微量维生素B1、其余为水的原料组成常规制作综合PDA斜面，0.11MPa大气压、121℃高温高压湿热灭菌30min；

2)按质量百分比计为高粱78％、小米20％、CaCO₃2％的原料组成，含水量60％，制作原种料，将原种料装入13cm×25cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得原种袋，折合每原种袋装干料300g；

3)按质量百分比计为棉籽壳89％、麸皮10％、CaCO₃1％的原料组成，含水量55％，制作生产种料，将生产种料装入15cm×30cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得生产种袋，折合每生产种袋装干料350g；

4)按质量百分比计为木屑78％、麸皮20％、CaCO₃2％的原料组成，含水量60％，制作栽培料，将栽培料装入17cm×35cm的耐高温透明聚丙烯菌种袋中，用小木棒在袋料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料环，并扣上配套的盖子，制得栽培袋，折合每袋装干料500g；

5)制作母种：采集组织分离的菌种白肉灵芝CCTCC M 2016087，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面(约7天左右)即得生产母种；

6)制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，接种时确保母种料块埋入原种料中，然后置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后(约25天左右)即得原种；

7)制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种；

8)接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃、空气相对湿度60-70％的培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后(大约30-35d)，继续遮光后熟培养15d至菌丝完成后熟期，切下套环及老种块；

9)出芝管理：调节温度为20-21℃、湿度85-90％、光照100-200lux，不通气，保持CO₂含量在2000ppm以上至长出原基，调节温度为26-28℃、空气相对湿度85-90％、光照约200-300lux，不通气，继续保持CO₂含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95％，光照300-500lux，通气，保持CO₂含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。

本实施例栽培得到的白肉灵芝如图1所示。

实施例2细胞增殖实验

1、赤芝水提取物和白肉灵芝水提物制备

将商购赤芝和白肉灵芝CCTCC M 2016087子实体分别粉碎后，按料液比1:10分别加入蒸馏水，于90℃水浴中恒温3h，过滤，滤渣重复提取2h，过滤，合并滤液浓缩至料液为1:5后，加5倍体积的无水乙醇静置1h，然后过滤，将醇沉后的沉淀冻干后，分别得到赤芝水提取物和白肉灵芝水提物。

2、细胞培养

断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3分钟消毒。无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。用无胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基清洗2次待用。

将取出的用脾脏进行无菌研磨，过100目筛。收集过滤的脾细胞，用无FBS的RPMI-1640培养基吸取分散的细胞悬液吹匀，1000r/min离心5min，弃上清。

加入Tris-NH₄Cl裂解红细胞，充分吹匀。1000r/min离心5min，弃上清。重复一次。加入无PBS的RPMI-1640培养基，悬浮，吹匀，1000r/min离心5min，弃上清。

加入完全RPMI-1640培养基，悬浮，吹匀，计算细胞数并铺96孔板。

3、测定

将铺好板的96孔板放入37℃，5％CO₂培养箱中培养4h。

将上述制备的赤芝水提物和白肉灵芝水提物分别按浓度(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)分组加入96孔板，设置PBS为阴性对照。

在37℃，5％CO₂培养箱中培养44h后，结束培养，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)，继续培养4h。

继续培养4h后，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)并振荡10s，酶标仪于570nm处测定吸光度值。

3.结果及分析

采用SPSS计算赤芝水提物和白肉灵芝水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖百分比值，结果如表1所示。

表1：不同浓度的赤芝水提物和白肉灵芝水提物的脾细胞增殖结果

注：**:P<0.01极显著差异，--：无差异。

从表1可知，与赤芝水提物相比，白肉灵芝CCTCC M 2016087水提物在脾细胞增殖实验中表现突出，尤其是在较低浓度的情况下也能够有效促进小鼠脾细胞增殖，在浓度较低(＜200μg/ml)下，赤芝水提物对于脾细胞的增殖作用不明显，而白肉灵芝水提物达到显著性差异，甚至浓度低至100μg/ml时也能实现增殖脾细胞的显著作用。这可能表明，白肉灵芝CCTCC M 2016087刺激免疫活性的功能较强，是一个具有开发潜力的食药用菌品种。

实施例3活性成分含量测定

1、粗多糖的提取与含量测定

分别称取0.25g赤芝(商购)子实体和0.25g白肉灵芝CCTCC M 2016087子实体，粉碎，按料水比1:40比例加入蒸馏水，沸水浴2h，2000g离心15min，残渣加入等量蒸馏水沸水浴1h，2000g离心15min，沉淀物再用5mL蒸馏水洗涤，2000g离心15min，合并3个上清液，并用蒸馏水定容至25mL。量取1.0mL加无水乙醇5mL，振荡均匀后静置过夜，5000rpm离心15min，弃去上清液，再加无水乙醇5mL，静置过夜后离心，沉淀物用去离子水溶解定容至10mL为样品液，备用。葡萄糖标准曲线的制作和总糖含量测定方法按《中国药典》2010版一部灵芝项下完成。

2、总三萜物质的提取与含量测定

按灵芝中三萜类物质的含量测定标准DB44/T-496-2008中灵芝总三萜的测定方法，分别称取0.5g赤芝(商购)子实体粉和0.5g白肉灵芝CCTCC M 2016087子实体粉于10mL比色管中，加入10mL无水乙醇摇匀，超声波(45kHz)处理1h后，50℃水浴1h，过滤后，提取液加蒸馏水定容至50mL，取0.30mL样品溶液于60℃水浴蒸干。香草醛-高氯酸法测定粗三萜含量，以齐墩果酸作为标准品。

3、数据处理

采用邓肯氏新复极差检验法[利用Excel(2003)和SAS(Release 8.01)软件]对数据进行分析。

赤芝(商购)子实体和白肉灵芝CCTCC M 2016087子实体的粗多糖含量和总三萜含量测定结果如表2所示。

表2：白肉灵芝CCTCC M 2016087与赤芝(商购)的主要有效成分：

从表2发现，本发明的白肉灵芝CCTCC M 2016087的粗多糖与总三萜的含量远高于于赤芝。此外，普通的灵芝子实体的粗多糖多在0.5-1.0mg/g之间，总三萜多在0.6-0.8mg/g之间，因此，本发明的白肉灵芝CCTCC M 2016087的粗多糖与总三萜的含量也远高于普通灵芝品种，具有较高的有效成分。灵芝中粗多糖与总三萜的含量通常被作为其最主要的有效成分指标，用以评价该灵芝的药用价值。这表明该白肉灵芝CCTCC M 2016087有效成分含量高，具开发潜力。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种白肉灵芝菌种，其特征在于，所述白肉灵芝菌种为白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)HMGIM-Z110122，保藏编号为CCTCC NO：M 2016087。

2.一种如权利要求1所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，包括组织分离菌种后制作母种，制作原种，制作生产种，栽培培养及出芝管理。

3.一种如权利要求2所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述制作母种的培养基为综合PDA培养基，所述综合PDA培养基的配方按质量百分比计为马铃薯18-20％、葡萄糖1.5-2％、琼脂2-2.5％、磷酸二氢钾0.15-0.3％、硫酸镁0.05-0.15％、维生素B1微量，其余为水。

4.一种如权利要求2所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述制作原种的原种料的原料组成按质量百分比计为高粱78％、小米20％、CaCO₃2％，该原种料的含水量55-60％。

5.一种如权利要求2所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述制作生产种的生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89％、麸皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽壳48-52％、木屑25-30％、麸皮18-20％、碳酸钙1-2％、硫酸钙1-2％，该生产种料的含水量55-60％。

6.一种如权利要求2所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培培养的栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78％、麸皮20％、CaCO₃2％，该栽培料的含水量60-65％。

7.一种如权利要求2至6中任一权利要求所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制作母种：采集组织分离的菌种白肉灵芝，将菌种无菌接至综合PDA斜面，置于20-25℃培养箱中恒温暗培养，直至菌丝长满斜面即得生产母种，其中所述综合PDA斜面的配方按质量百分比计为马铃薯18-20％、葡萄糖1.5-2％、琼脂2-2.5％、磷酸二氢钾0.15-0.3％、硫酸镁0.05-0.15％、维生素B1微量，其余为水；

(2)制作原种：将生产母种无菌接入原种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得原种，其中原种料的原料组成按质量百分比计为高粱78％、小米20％、CaCO₃2％，该原种料的含水量55-60％，将所述原种料装入菌种袋中，制得原种袋；

(3)制作生产种：将原种无菌接入生产种袋中，置于25℃培养箱中恒温暗培养，至菌丝吃满料后即得生产种，其中生产种料的原料组成按质量百分比计为棉籽壳87-89％、麸皮10-12％、CaCO₃1-2％或棉籽壳48-52％、木屑25-30％、麸皮18-20％、碳酸钙1-2％、硫酸钙1-2％，该生产种料的含水量55-60％，将所述生产种料装入菌种袋中，制得生产种袋；

(4)接种栽培：将生产种无菌接入栽培料袋中，在25℃±1℃培养室中避光培养，待栽培袋中的菌丝长满栽培料后，继续遮光后熟培养至菌丝完成后熟期，其中栽培料的原料组成按质量百分比计为木屑78％、麸皮20％、CaCO₃2％，该栽培料的含水量60-65％，将所述栽培料装入菌种袋中，制得栽培袋；

(5)出芝管理：调节温度为20-21℃、湿度85-90％、光照100-200lux，不通气，保持CO₂含量在2000ppm以上至长出原基，调整温度为26-28℃、空气相对湿度85-90％、光照200-300lux，不通气，继续保持CO₂含量在2000ppm以上，待菌柄伸长期结束并进入菌盖生长期时，通气，调整温度为26-28℃，湿度85-95％，光照300-500lux，通气，保持CO₂含量小于1200ppm，至菌盖的白边完全变黄时，采摘。

8.一种如权利要求7所述的白肉灵芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述步骤(4)中的培养室的空气相对湿度为60-70％。

9.一种如权利要求1所述的白肉灵芝菌种的应用，其特征在于，所述白肉灵芝菌种用于细胞增殖。

10.一种如权利要求9所述的白肉灵芝菌种的应用，其特征在于，所述细胞增殖为脾细胞增殖。