CN107384805B - 一种食用菌复壮型菌株的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食用菌菌株复壮的方法，包括种菇选择、组织分离、单根菌丝分离、转接复壮、培养料筛选、出菇验证和生产中试试验。与现有技术相比，本发明充分利用了食用菌菌丝生长的生物学特性，以光学显微镜下典型单根菌丝的细胞分离，结合生产培养基筛选。采用该方法获得的复壮型菌株生长同步性高，生长速度较复壮前提高10~20%左右，单位体积菌丝量提高15~25%，且出菇潮次更为明显。

Description

一种食用菌复壮型菌株的生产方法

技术领域

本发明涉及食用菌栽培性状和菌种生产领域，具体涉及到食用菌复壮型菌株的筛选和生产方法。

背景技术

食用菌被誉为“山珍”，营养、药用价值很高，含有人体不能自身合成的8种必需氨基酸，特别是真菌多糖、糖肽、三萜类等活性成分，具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫力、抑制肿瘤和抗癌的作用。随着人类对食用菌营养和药用价值认识的提高，消费需求将越来越大。我国食用菌总产量占世界总产量的70%以上，仅次于粮、菜、果、油位居第5位，已成为我国现代农业的主导产业之一。

目前，我国食用菌菌种生产多采用无性繁殖的方式，存在菌株退化严重的问题，随着我国食用菌产业规模的快速发展，生产用菌株的种性保持工作就显得尤为重要。依据不同食用菌种类的生物学特征，开展生产用、稳定性高的食用菌复壮型菌株的筛选和生产将有利于推进我国食用菌产业的转型升级，推动我国食用菌产业尽快走上质量效益型发展之路。

发明内容

本发明的目的是针对目前食用菌生产存在的菌株退化问题，采用组织分离结合单菌丝纯化方法，进行适用于食用菌实际产业发展需求的复壮型菌株的生产，提供一种更好的解决菌株退化的方法。

本发明的食用菌菌株复壮的方法包括如下步骤：

（1）种菇选择

复壮型菌株生产用种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体，选择器官分化尚未结束时菌膜与菌柄相连的幼菇，或依据具体食用菌种类的分化特点选择相应生长旺盛的组织部位。

（2）组织分离

将选择的种菇用无菌水冲洗后，用75%的酒精溶液表面消毒，在无菌条件下，采用经火焰灼烧过的手术刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的直径3-5mm的组织块，转接于事先制作的母种、直径90 mm的无菌培养基培养皿中央，倒置，24℃暗培养5-7天。

（3）单根菌丝分离

将培养好的平板置于在普通正置光学显微镜下，采用10倍目镜，在菌落边缘处，筛选生物学性状典型，且生长势强的单根菌丝，采用事先灭菌的特制接种针，将挑选的单根菌丝自距顶端15-20μm处切断，将切下的菌丝片段挑出，转接于母种无菌斜面培养基前端，共计挑取50-60次，分别转接于事先制作的50-60支母种无菌斜面培养基，并依次编号，斜面向下，24℃暗培养10-15天。

（4）转接复壮

无菌条件下，从（3）制备的母种无菌斜面培养基内的距菌落边缘2-3cm处挑取5-7mm的菌丝块（包含培养基），分别转接入新的母种、直径90 mm的无菌培养基培养皿中央，24℃暗培养8-10天，剔除菌丝生长势较差的培养皿所对应的试管种。

（5）培养料筛选

将保留的菌丝生长势较强的试管种重新编号，剔除菌丝分解基质能力强的菌株，保留分解基质能力强的菌株。

（6）出菇验证

对保留的菌丝生长势较强的试管种，分别进行菌落形态观察和接种于出菇培养基中进行出菇实验验证，并测定其农艺学性状与栽培性状，从而获得备选复壮型菌株。

（7）生产中试试验

采用出菇培养基对备选复壮型菌株进行较大规模的生产试验，并进行生产性能测定，从而确定最终的生产用复壮型菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明充分利用了食用菌菌丝生长的生物学特性，以光学显微镜下典型单根菌丝的细胞分离，结合生产培养基筛选。采用该方法获得的复壮型菌株生长同步性高，生长速度较复壮前提高10~20%左右，单位体积菌丝量提高15~25%，且出菇潮次更为明显。

附图说明

图1为本发明筛选的复壮用香菇种菇。

图2为本发明挑取单根菌丝培养成的菌落形态。

图3为图2在正置光学显微镜10倍目镜下的菌丝形态。

图4为本发明挑取的单根菌丝萌发形态。

图5为本发明获得的复壮型香菇菌株的菌落形态。

图6为本发明复壮型香菇菌株的出菇状态。

图7为复壮前香菇菌株在出菇培养基内的生长状态。

图8为本发明获得的复壮型香菇菌株在出菇培养基内的生长状态。

图9为复壮前香菇菌株的菌丝量测定。

图10为本发明获得的复壮型香菇菌株的菌丝量测定。

图11为本发明筛选的复壮用灵芝种菇。

图12为本发明筛选的复壮用猴头种菇。

实施例1

2015年在山西农大食用菌生产基地，利用本发明方法获得了复壮型香菇808菌株。复壮型香菇菌株的生产方法，具体步骤如下：

（1）种菇选择 选择复壮型香菇菌株生产用种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体，通常选择器官分化尚未结束时，菌膜与菌柄相连的幼菇（见图1）。

（2）组织分离 将选择的种菇用无菌水冲洗后，用75%的酒精溶液表面消毒，在无菌条件下，采用经火焰灼烧过的手术刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的直径3-5 mm的组织块，转接于事先制作的PDA母种无菌培养基培养皿中央，倒置，24℃暗培养5天（见图2）。

（3）单根菌丝分离 将培养好的平板置于在普通正置光学显微镜下，采用10倍目镜，在菌落边缘处，筛选双核明显、锁状联合典型，且生长势强的单根菌丝（见图3），采用事先灭菌的特制接种针，将挑选的单根菌丝自距顶端15-20μm处切断，并将切下的包含顶端在内的菌丝片段挑出，转接于PDA母种无菌斜面培养基前端，共计挑取60次，分别转接于60支PDA无菌斜面培养基，之后，斜面向下，24℃暗培养15天（见图4）。

（4）转接复壮 无菌条件下挑取PDA母种无菌斜面培养基内的距菌落边缘2-3 cm处5-7 mm包含培养基的菌丝块，转接入新的PDA母种无菌斜面培养基中央，24℃暗培养8天，剔除菌丝生长势较差的培养皿所对应的试管种（见图5）。

（5）培养料筛选 将保留的菌丝生长势强的试管种重新编号，分别转接于相应香菇栽培的出菇培养基中，剔除菌丝分解基质能力强的菌株，保留分解基质能力强的菌株所对应的试管。

（6）出菇验证 对保留的菌丝生长势较强的试管种，进行菌落形态观察和接种于出菇培养基中进行出菇实验验证，并测定其农艺学性状与栽培性状，从而获得备选复壮型菌株。

（7）生产中试试验 采用出菇培养基对复壮的菌株进行较大规模的生产试验（见图6），并进行生产性能测定，从而确定最终的生产用复壮型菌株。

结果表明：采用该方法获得的复壮型香菇808菌株生长同步性高，生长速度较复壮前明显提高（见图7、图8），平均提高20.4%；单位体积菌丝量明显提高（见图9、图10），平均提高24.3%，且出菇潮次更为明显。

所述PDA母种培养基包括：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，配制PDA无菌培养基培养皿和PDA斜面培养基。

所述出菇培养基为：阔叶树的木屑85%、麸皮8%、米糠5%、石膏粉1%、过磷酸钙1%，料与水之比1∶0.9。

实施例2

2016年在山西农大食用菌生产基地，利用本发明方法获得了复壮型晋灵芝1号菌株。晋灵芝1号的复壮型菌株生产方法的多数步骤同香菇，但在种菇选择上，要选择子实体顶端乳白色边、菌盖尚未开展的的幼菇（如图11），采用的灵芝出菇培养基为：阔叶树木屑63%、棉籽壳15%、麸皮10%、米糠5%、石膏粉1%、过磷酸钙1%，料与水之比1∶1.1。

其余操作步骤同实施例1。

结果表明：采用该方法获得的复壮型晋灵芝1号菌株生长同步性高，生长速度较复壮前提高10.8%，单位体积菌丝量提高15.1%，菇形良好。

实施例3

2017年在山西农大食用菌生产基地，利用本发明方法获得了复壮型晋猴头96菌株。

猴菇菌为红菇目猴头菌科食用菌类型，因子实体形态似刺猬或猴头而得名。复壮型菌株生产用种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体，通常选择子实体圆整，头状，单生，致密，无柄，短刺，直径5-8cm的幼菇（见图12）采用的猴头母种培养基：用马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，柠檬酸2g，水1000mL配制PDA无菌培养基培养皿和PDA斜面培养基，所述培养皿直径90mm；出菇培养基为：棉籽壳85%、米糠7%、麸皮6%、过磷酸钙1%、石膏粉1%，料与水之比1∶1.1。其余操作步骤同实施例1。

结果表明：采用该方法获得的复壮型晋猴头96菌株生长同步性高，生长速度较复壮前提高15.9%，单位体积菌丝量提高20.0%，出菇集中于前两潮。

Claims (2)

1.一种食用菌菌株复壮的方法，包括如下步骤：

（1）种菇选择

复壮型菌株生产用种菇要求菇形理想，长势健壮，无虫无病的子实体，选择器官分化尚未结束时菌膜与菌柄相连的幼菇，或依据具体食用菌种类的分化特点选择相应生长旺盛的组织部位；

（2）组织分离

将选择的种菇用无菌水冲洗后，用75%的酒精溶液表面消毒，在无菌条件下，采用经火焰灼烧过的手术刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的直径3-5mm的组织块，转接于事先制作的母种、直径90 mm的无菌培养基培养皿中央，倒置，24℃暗培养5-7天；

（3）单根菌丝分离

将培养好的平板置于在普通正置光学显微镜下，采用10倍目镜，在菌落边缘处，筛选生物学性状典型，且生长势强的单根菌丝，采用事先灭菌的特制接种针，将挑选的单根菌丝自距顶端15-20μm处切断，将切下的菌丝片段挑出，转接于母种无菌斜面培养基前端，共计挑取50-60次，分别转接于事先制作的50-60支母种无菌斜面培养基，并依次编号，斜面向下，24℃暗培养10-15天；

（4）转接复壮

无菌条件下，从（3）制备的母种无菌斜面培养基内的距菌落边缘2-3cm处挑取5-7 mm的菌丝块，分别转接入新的母种、直径90 mm的无菌培养基培养皿中央，24℃暗培养8-10天，剔除菌丝生长势较差的培养皿所对应的试管种；

（5）培养料筛选

将保留的菌丝生长势较强的试管种重新编号，剔除菌丝分解基质能力弱的菌株，保留分解基质能力强的菌株；

（6）出菇验证

对保留的菌丝生长势较强的试管种，分别进行菌落形态观察和接种于出菇培养基中进行出菇实验验证，并测定其农艺学性状与栽培性状，从而获得备选复壮型菌株；

（7）生产中试试验

采用出菇培养基对备选复壮型菌株进行较大规模的生产试验，并进行生产性能测定，从而确定最终的生产用复壮型菌株。

2.根据权利要求1所述的食用菌菌株复壮的方法，其特征在于，所述步骤（4）的菌丝块包含培养基。

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