CN117946871A - 一种松茸子实体分离培育菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种松茸子实体分离培育菌种的方法及其应用，属于菌种培育技术领域。该方法包括以下步骤：(1)初级菌种的分离和培育；(2)一级摇瓶菌种培育；(3)二级摇瓶菌种培育。上述方法获得的菌种经液体发酵可进一步获得松茸菌丝体、菌丝体粉和菌丝体浓缩液。本发明打破了松茸不可人工分离菌种培育的壁垒，可以在人工培育下大量产出松茸菌丝体粉和松茸菌丝体浓缩液。根据本发明的方法得到的原种菌丝体种还可用于松茸栽培，为一年四季产出松茸提供了基础菌种保障。另外，本发明培育得到的松茸菌丝体的松茸多糖含量高，具有更高的营养和药用价值。
Description
技术领域
本发明属于菌种培育技术领域，尤其涉及一种松茸子实体分离培育菌种的方法。
背景技术
松茸学名松口蘑，隶属担子菌亚门，口蘑科，是松株等树木外生菌根真菌，是我国二级濒危保护物种。松茸对生长环境要求极为苛刻，生长极为缓慢，一般需5-6年，产量极少，价格昂贵。
研究表明，松茸富含松茸多糖、不饱和脂肪酸、核酸衍生物、多种氨基酸及肽类物质。松茸所含松茸多糖的抗肿瘤活性远远高于灵芝，在被研究的15种真菌中松茸抗肿瘤活性居首位。因此，世界各国及各大科研机构正积极地进行野生松茸的人工栽培及菌种分离培育的研究，但至今仍无法突破菌种分离培育技术及人工栽培的难题。
发明内容
本申请目的之一在于提供了一种松茸子实体分离培育菌种的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)初级菌种的分离和培育：采集成熟70-80％无虫松茸，在无菌室内无菌条件下用75％酒精消毒松茸子实体，然后用手术刀把松茸纵剖两半，在菌盖菌柄处，切取0.5cm3-0.6cm3菌肉，移放到装有斜面培养基的高20cm直径3cm的试管中，接种后，恒温24-26℃无光培养8-10天至菌丝长满试管，形成初级菌种；
(2)一级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将初级菌种以1％接种量接入装有100ml培养基的250ml三角瓶中，恒温24-26℃摇床震荡培养6-9天，成为一级摇瓶菌种；
(3)二级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将一级摇瓶菌种以10％接种量接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中，恒温24-26℃摇床震荡培养6-9天，至此，松茸菌种分离培育完成。
优选地，所述步骤(1)中斜面培养基配方为：葡萄糖2份，硫酸镁0.1份，琼脂2份，酵母膏0.5份。
更优选地，所述步骤(2)和(3)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，酵母粉1份，奶粉1份，蛋白胨0.12份，磷酸二氢钾0.15份，硫酸镁0.01份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
本发明的目的之二在于提供一种松茸菌丝体的培育方法，所述方法包括以下步骤：
(1)小罐一级液体发酵：将上述分离培育完成的菌种按1％接种量接入已经放好5％V/V培养基的小罐进行一级发酵，罐压保持30-40kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.2-0.4V/V·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时，进行初步扩菌培养；
(2)中罐二级液体发酵：将小罐中菌丝体转入已经放入5％V/V培养基的中罐进行二级发酵，罐压保持40-50kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.3-0.5V/V·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时；
(3)大罐三级液体发酵：将中罐中菌丝体转入已经放入5％V/V培养基的大罐进行三级发酵，罐压保持50-60kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.5-0.7V/V·min，保持24-26℃恒温培养120-144小时，至此，松茸菌丝体培育完成。
其中，上述表示培养基的加入量的单位％V/V是指培养基的体积与罐的体积比。
优选地，所述步骤(1)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆3份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠1份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
更优选地，所述步骤(2)中培养基的配方为：蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆2份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠0.1份，硫酸镁0.1份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
更优选地，所述步骤(3)中培养基的配方为：蔗糖3份，黄豆粉5份，蛋白胨0.1份，磷酸二氢钾0.3份，硫酸镁0.15份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
更优选地，步骤(1)的小罐的体积为50L-150L，优选为80-120L；步骤(2)的中罐的体积为0.5T-1.5T，优选为0.8T-1.2T；步骤(3)的大罐的体积为4T-6T，优选为4.5T-6.5T。
本发明的目的之三在于提供一种松茸菌丝体粉的制备方法，所述制备方法为：在上述松茸菌丝体的培育方法的步骤(3)后，还包括步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集菌丝体，然后再经烘干工艺，得到松茸菌丝体粉。
优选地，所述烘干工艺在70-85℃的温度下进行。
本发明的目的之四在于提供一种松茸菌丝体浓缩液的制备方法，所述制备方法为：上述松茸菌丝体粉的制备方法中步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集滤液，经浓缩罐浓缩，得到松茸菌丝体浓缩液。
上述步骤中使用的培养基的配制如下：
按照各个培养基配方中的配比进行称料，然后以各配方中所有原料的总重与水的重量比为1:1加入蒸馏水，进行充分搅拌，再经121℃高温灭菌30分钟，待冷却后即可使用。
本发明的松茸子实体分离培育菌种的方法通过步骤(1)得到的初级菌种即具有活性，之后的一级摇瓶菌种培育和二级摇瓶菌种培育步骤是对初级菌种的进一步优化和培育。并且，本发明采用三级液体发酵技术，通过对罐体积进行筛选并选择发酵条件，可以以高产率得到松茸菌丝体。
另外，本发明培育得到的松茸菌丝体的松茸多糖的含量可高达20％左右，远远高于野生松茸的8％左右的松茸多糖含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明打破了松茸不可人工分离菌种培育的壁垒，可以在人工培育下大量产出松茸菌丝体粉和松茸菌丝体浓缩液。根据本发明的方法得到的原种菌丝体种还可用于松茸栽培，为一年四季产出松茸提供了基础菌种保障。
另外，本发明培育得到的松茸菌丝体的松茸多糖含量高，具有更高的营养和药用价值。
具体实施方式
实施例1
培养基根据上述说明书发明内容部分描述的配方和配制方法进行配制。
(1)初级菌种的分离和培育：采集成熟70-80％无虫松茸，在6-8小时之内将松茸运到无菌室，在无菌条件下用75％酒精消毒松茸子实体，然后用手术刀把松茸纵剖两半，在菌盖菌柄处，切取0.5cm 3-0.6cm 3菌肉，移放到装有斜面培养基的高20cm直径3cm无菌试管中，接种后，恒温24-26℃进行无光培养8天，至菌丝长满试管，形成初级菌种；上述松茸采集自吉林省龙井市天佛山松茸自然保护区；
(2)一级摇瓶菌种培育：将上述试管中的菌丝以1％接种量接到装有100ml培养基的250ml三角瓶中，接入菌丝后，放入24-26℃恒温摇床震荡培养7天后成为一级摇瓶菌种；
(3)二级摇瓶菌种培育：将一级摇瓶中的菌种以10％接种量接到装有200ml培养基的500ml三角瓶中，接入菌种后，保持24-26℃恒温摇床震荡培养7天，至此，松茸菌种分离培育完成；
(4)小罐一级液体发酵：将分离培育完成的松茸菌种按1％接种量接入已经放好5％V/V培养基的100L体积小罐中，罐压保持35kPa，搅拌132转/分钟，通气量1:0.2-0.4V/V·min，保持24-26℃恒温进行一级发酵，培养70小时进行初步扩菌培养；
(5)中罐二级液体发酵：当小罐中菌丝体繁殖到一定程度即可转入已经放入5％V/V培养基的1T体积中罐进行二级发酵培养，罐压保持45kPa，搅拌132转/分钟，通气量1:0.3-0.5V/V·min，保持24-26℃恒温培养72小时；
(6)大罐三级液体发酵：待中罐菌丝体大量繁殖达到转罐标准，即可转入已经放入5％V/V培养基的5T体积大罐进行三级发酵，罐压保持52kPa，搅拌132转/分钟，通气量1:0.5-0.7V/V·min，保持24-26℃恒温培养130小时，至此，松茸菌丝体培育完成；
(7)大罐三级液体发酵结束后，进行松茸菌丝体提取，采用板框压滤机进行压滤，收集菌丝体，然后在80℃下经烘干工艺，得到松茸菌丝体粉50kg；同时，把压滤后的松茸菌丝体滤液经浓缩罐浓缩后，得到松茸菌丝体浓缩液100kg。
采用苯酚-硫酸法，测定波长为490nm，对步骤(7)中得到的菌丝体粉的松茸多糖含量进行了测定，结果为22％。
以上实施例说明，通过本发明的松茸子实体分离培育菌种和菌丝体的方法可以以高产率得到松茸菌丝体，并且得到的松茸菌丝体具有较高的松茸多糖含量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种松茸子实体分离培育菌种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)初级菌种的分离和培育：采集成熟70-80％无虫松茸，在无菌室内无菌条件下用75％酒精消毒松茸子实体，然后用手术刀把松茸纵剖两半，在菌盖菌柄处，切取0.5cm3-0.6cm3菌肉，移放到装有斜面培养基的试管中，接种后，恒温24-26℃无光培养8-10天至菌丝长满试管，形成初级菌种；
(2)一级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将初级菌种以1％接种量接入装有100ml培养基的250ml三角瓶中，恒温24-26℃摇床震荡培养6-9天，成为一级摇瓶菌种；
(3)二级摇瓶菌种培育：根据配方配制培养基，将一级摇瓶菌种以10％接种量接入装有200ml培养基的500ml三角瓶中，恒温24-26℃摇床震荡培养6-9天，至此，松茸菌种分离培育完成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中斜面培养基配方为：葡萄糖2份，硫酸镁0.1份，琼脂2份，酵母膏0.5份。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，酵母粉1份，奶粉1份，蛋白胨0.12份，磷酸二氢钾0.15份，硫酸镁0.01份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
4.一种松茸菌丝体的培育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)小罐一级液体发酵：将权利要求1或权利要求2中分离培育完成的菌种按1％接种量接入已经放好5％V/V培养基的小罐进行一级发酵，罐压保持30-40kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.2-0.4V/V·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时，进行初步扩菌培养；
(2)中罐二级液体发酵：将小罐中菌丝体转入已经放入5％V/V培养基的中罐进行二级发酵，罐压保持40-50kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.3-0.5V/V·min，保持24-26℃恒温培养60-84小时；
(3)大罐三级液体发酵：将中罐中菌丝体转入已经放入5％V/V培养基的大罐进行三级发酵，罐压保持50-60kPa，搅拌120-140转/分钟，通气量1:0.5-0.7V/V·min，保持24-26℃恒温培养120-144小时，至此，松茸菌丝体培育完成。
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基的配方为：葡萄糖2份，蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆3份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠1份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基的配方为：蔗糖2份，干酵母粉1份，玉米浆2份，磷酸二氢钾0.25份，氯化钠0.1份，硫酸镁0.1份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养基的配方为：蔗糖3份，黄豆粉5份，蛋白胨0.1份，磷酸二氢钾0.3份，硫酸镁0.15份，维生素B10.005份，维生素B20.005份。
8.一种松茸菌丝体粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：在权利要求4-7中任一项所述的松茸菌丝体的培育方法的步骤(3)后，还包括步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集菌丝体，然后再经烘干工艺，得到松茸菌丝体粉。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述烘干工艺在70-85℃的温度下进行。
10.一种松茸菌丝体浓缩液的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：权利要求8或权利要求9步骤(4)所述大罐三级液体发酵结束后，采用板框压滤机进行压滤，收集滤液，经浓缩罐浓缩，得到松茸菌丝体浓缩液。
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