CN100490630C - 一种人工培育松茸子实体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工培育松茸子实体的方法，首先，选用松茸0288JiangZhonghai-China菌株在蒋氏培养液进行母种培养，温度25℃约20-25d松茸菌丝长满试管；然后，母种转接入蒋氏培养基进行原种培养，温度25℃约45d松茸菌丝长满瓶；其次，原种转接入蒋氏培养基进行生产种培养，温度25℃约60d松茸菌丝长满袋或瓶；最后，惊菌与促蕾15-25d生长得松茸子实体。本发明的松茸0288JiangZhonghai-China菌株保藏编号CGMCCNO.1719。本发明首创了人工培育松茸子实体的方法，利用该方法可以大规模地栽培松茸，解决野生资源的匮乏，为松茸资源的综合开发，工厂化生产，药用、食用开辟广阔前景。
Description
技术领域
本发明涉及真菌人工培育方法，具体涉及一种人工培育松茸子实体的方法。
背景技术
松茸[Tricholoma matsutake(Ito et Imai)Sing.]又名松口蘑、松蕈等，是世界珍稀名贵的野生食用菌，是中华人民共和国国家二级保护植物。主要分布在我国黑龙江(鸡西完达山、牡丹江地区)、辽宁、吉林、安徽、台湾、四川、甘肃、山西、贵州、云南、广西、西藏、福建、台湾等省区，主产区为东北地区和云南。国外分布于日本、朝鲜半岛、俄罗斯等国家。
松茸具有很高的食用价值和药用价值，价格极其昂贵，历来被视为食用菌的珍宝，素有“菌中之王”、“山中钻石”、“绿色黄金”等美称。日本人尤其酷爱松茸，是日本国宴不可缺少的名菜。近二十年来价格飞涨，日本人嗜食松茸，本国的野生资源远不能满足需要，每年从中国、朝鲜、美国、加拿大等国进口约2000吨(其中含松茸的近缘种类)。如日本人把中国进口的松茸切成小薄片，改为小型精装，仅一个精装的松茸，售价高达数百日元，每千克达1870美元。
松茸含有蛋白质、氨基酸、多种维生素、碳水化合物和矿物质等有效成分，有多种生理功能：它可以强身、益肠胃、增强人体免疫力，生精益气，理气化痰，延缓衰老。现代医学临床实验表明，松茸具有治疗糖尿病和抑制癌细胞增殖作用的特殊功能。松茸子实体的热水提取物即松茸多糖类物质对小鼠肉瘤S一180的抑制率高达91.8％，对艾氏腹水癌的抑制率为70％，是抗癌药物筛选源之一。
由于无节制地大量采集野生子实体已造成松茸濒临灭绝。因此，人工驯化栽培松茸成为人们保护利用这种珍稀“蘑菇之王”的迫切愿望。日本人对松茸的人工纯培养进行了多年研究，尽管在固体培养基上出现了松茸原基，但迄今为止还没有发现人工纯培养出菇的确切报道。所谓松茸的半人工栽培是日本人经过百年研究才摸索出来的一种就地增产或就地保护途径，具体说就是以天然松茸的菌丝体、子实体和孢子为材料，进行自然接种或移植；赤松林地清理，营造良好的土壤环境；采取塑料荫棚创造松茸发生的温、湿条件等措施，达到出菇增产的目的。
探索松茸发育的遗传机理，人为控制或调节松茸子实体基因的即时表达，将会把松茸人工驯化栽培研究引向深入。揭开蘑菇之王——松茸人工栽培之谜是人们近百年来的愿望。它无论对促进树木生长，还是对促进社会经济的发展都具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种人工培育松茸子实体的方法，选用松茸0288JiangZhonghai—China菌株，采用该方法人工培育松茸菌子实体，为松茸人工栽培开发创造新前景。
本发明的技术解决方案是：首先，选用松茸0288JiangZhonghai—China菌株在蒋氏培养液进行母种培养，温度25℃约20-25d松茸菌丝长满试管；然后，母种转接入蒋氏培养基进行原种培养，温度25℃约45d松茸菌丝长满瓶；其次，原种转接入蒋氏培养基进行生产种培养，温度25℃约60d松茸菌丝长满袋或瓶；最后，惊菌与促蕾15-25d生长得松茸子实体。
本发明的松茸0288JiangZhonghai—China菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号是：CGMCCNO.1719。
松茸0288JiangZhonghai—China菌株，是经分离松茸孢子诱变菌株而得。子实体产生担子，担子中的两个核进行核配，经过减数分裂产生单核的担孢子，单核担孢子萌发成单核菌丝，由两个可亲和的单核菌丝结合形成双核菌丝，或者单核担孢子自己分裂形成双核担孢子，由双核担孢子萌发生成双核菌丝，两种方式形成的双核菌丝后产生新的子实体。2002年8月8日于黑龙江凤凰山采得后实验室分离孢子，采用紫外线、γ射线诱变松茸孢子得松茸0288JiangZhonghai—China菌株，经多年紫外线、γ射线诱变，松茸0288JiangZhonghai—China菌株是松茸子实体基因得以表达的菌株。
其中，蒋氏培养液由以下成份组成：葡萄糖10g、烟酸0.5mg、琼脂16g、马铃薯100g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g、水1000mL。
其中，蒋氏培养液的配制如下：马铃薯100g切薄片放容器中加水1000ml煮沸8分钟，用4目沙布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，琼脂条16g切成小块加入滤液中热煮沸并用玻璃棒不停的搅拌，琼脂完全溶解即溶液成透明状再加水得1000ml蒋氏培养液，PH：4.5-6.0。
其中，固体培养料渗透营养液得含水量65％的蒋氏培养基；固体培养料由以下成份组成：蒙古栎(Q.mongolica)锯末屑50℅、白桦(B.platyphylla)锯末屑28℅、黄豆汁液1℅、玉米粉1℅、麸皮20℅；营养液由以下组份组成：葡萄糖10g、烟酸0.5mg、马铃薯100g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g、水1000mL；其中营养液的配制如下：马铃薯100g切薄片放容器中加水1000ml煮沸8分钟，用4目沙布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，再加水得1000ml营养液。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：松茸0288JiangZhonghai—China菌株发酵培养，蒋氏培养液1000ml加入发酵罐，再加入30ml菌球，发酵92h，罐压0.5-0.8Kpa，搅拌速率210rpm/min，pH：4.5-6.0，通气量1:0.5v/v.m，发酵液中松茸0288JiangZhonghai—China菌株菌丝干重为2.9％；其中，菌球培养：50ml蒋氏培养液接入0288JiangZhonghai—China菌株试管菌，每支试管接种5瓶，150r/min振荡培养。
本发明首创了人工培育松茸子实体的方法，利用该方法可以大规模地栽培松茸，解决野生资源的匮乏，为松茸资源的综合开发，工厂化生产，药用、食用开辟广阔前景。
附图说明
图1为本发明组培瓶培养成蕾10d的松茸子实体照片。
图2为本发明组培瓶培养成蕾15d的松茸子实体照片。
图3为本发明组培瓶培养成蕾18d的松茸子实体照片。
图4为本发明组培瓶培养成蕾20d的松茸子实体照片。
具体实施方式
A、选用松茸0288JiangZhonghai—China菌株，该松茸菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.1719。
B、松茸母种培养：首先，将马铃薯100g切成薄片，放在容器里加入1000ml水煮沸8分钟，用4目纱布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，琼脂条16g切成小块加入滤液煮沸并用玻璃棒不停的搅拌，使琼脂完全溶解即溶液成透明状，加水得1000ml蒋氏培养液；然后，母种按常规接种，分装试管时尽量避免培养液附在试管口，这样会更容易感菌，试管的装液量为10ml，试管数量为10支扎捆灭菌，冷却后接种松茸0288JiangZhonghai—China菌株，温度25℃约20-25d松茸菌丝长满试管。
C、松茸原种培养：首先，将马铃薯100g切成薄片，放在容器里加入1000ml水煮沸8分钟，用4目纱布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，加水得1000ml蒋氏营养液；然后，营养液加入固体培养料得含水65％的蒋氏培养基，固体培养料由以下成份组成：蒙古栎(Q.mongolica)锯末屑50℅、白桦(B.platyphylla)锯末屑28℅、黄豆汁液1℅、玉米粉1℅、麸皮20℅；其次，蒋氏培养基按无菌操作规程接种母种，每只母种试管接原种5瓶组培瓶，25℃约45d松茸菌丝长满瓶。
D、松茸生产种培养：首先，蒋氏培养基的配制同上，然后，蒋氏培养基按无菌操作规程接种原种，每瓶原种接生产种5袋或20瓶，25℃约60d松茸菌丝长满瓶或袋。每年7-8月制作松茸生产种较合适。
E、惊菌与促蕾：当生产种菌丝长满袋后须用竹板拍打地面造成声响，搬动松茸菌袋进行惊菌移入到栽培室；其中，出菇管理条件：早、午、晚温差变化在18℃-10℃之间；空气相对湿度85％～90％；光暗差以三分阴、七分阳即200-500Lx光照；足够的通风保证氧气供给。
通过本方法诱导菌蕾，其丛状黄色，基生有时有二叉如鹿角状，此时要小心把小的菌蕾用镊子去掉一些，保证营养集中，15-25d菌蕾逐渐长大成子实体，如图1、2、3、4所示。
Claims (5)
1.一种人工培育松茸子实体的方法，首先，选用松茸0288JiangZhonghai—China菌株在蒋氏培养液进行母种培养，温度25℃约20-25d松茸菌丝长满试管；然后，母种转接入蒋氏培养基进行原种培养，温度25℃约45d松茸菌丝长满瓶；其次，原种转接入蒋氏培养基进行生产种培养，温度25℃约60d松茸菌丝长满袋或瓶；最后，惊菌与促蕾15-25d生长得松茸子实体；其中，松茸0288JiangZhonghai—China菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号是：CGMCCNO.1719；其中，蒋氏培养液由以下成份组成：葡萄糖10g、烟酸0.5mg、琼脂16g、马铃薯100g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g、水1000mL；其中，固体培养料渗透营养液得含水量65％的蒋氏培养基；固体培养料由以下成份组成：蒙古栎(Q.mongolica)锯末屑
白桦(B.platyphylla)锯末屑28℅、黄豆汁液
玉米粉
麸皮
；营养液由以下组份组成：葡萄糖10g、烟酸0.5mg、马铃薯100g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g、水1000mL。
2.根据权利要求1所述的一种人工培育松茸子实体的方法，其特征在于：其中，蒋氏培养液的配制如下：马铃薯100g切薄片放容器中加水1000ml煮沸8分钟，用4目沙布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，琼脂条16g切成小块加入滤液中热煮沸并用玻璃棒不停的搅拌，琼脂完全溶解即溶液成透明状再加水得1000ml蒋氏培养液，PH：4.5-6.0。
3.根据权利要求1所述的一种人工培育松茸子实体的方法，其特征在于：其中营养液的配制如下：马铃薯100g切薄片放容器中加水1000ml煮沸8分钟，用4目沙布过滤得滤液，滤液中加入葡萄糖10g、烟酸0.5mg、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钠(NaH2PO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4)0.25g、蛋白胨1.5g、酒石酸0.75g，再加水得1000ml培养液。
4.根据权利要求1所述的一种人工培育松茸子实体的方法，其特征在于：松茸0288JiangZhonghai—China菌株发酵培养，蒋氏培养液1000ml加入发酵罐，再加入30ml菌球，发酵92h，罐压0.5-0.8Kpa，搅拌速率210rpm/min，pH：4.5-6.0，通气量1:0.5v/v.m，发酵液中松茸0288JiangZhonghai—China菌株菌丝干重为2.9％。
5.根据权利要求4所述的一种人工培育松茸子实体的方法，其特征在于：其中，菌球培养：50ml蒋氏培养液接入0288JiangZhonghai—China菌株试管菌，每支试管接种5瓶，150r/min振荡培养。
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