CN105296360A - 桑黄母种组织分离转管培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是桑黄母种的组织分离转管培育方法，主要解决了解决现有桑黄母种的培育方式具有一次性接种量太小、菌丝萌发速度慢、污染率高等问题。本发明包括以下步骤：（1）将桑黄子实体上切取块状组织，将块状组织接种到试管培养基中，在恒温暗室中培养直至长出黄色绒毛状菌丝体；（2）当菌丝体长到距离块状组织2～3cm时，挑取包含边缘菌丝体的培养基转接到另一试管培养基内进行培育，转接1次以上获得纯化菌丝体；（3）纯化菌丝体长满试管培养基后，将长满纯化菌丝体的试管培养基切成块状，将块状培养基接种到扩大培养基上培育后获得桑黄母种。本发明具有有效增大一次接种量、减少劳动强度，加快萌发速度以及降低污染率等优点。

Description

桑黄母种组织分离转管培育方法

技术领域

本发明涉及一种桑黄母种培育方法，具体涉及的是桑黄母种的组织分离转管培育方法。

背景技术

桑黄，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科，针层孔菌类真菌。学名PhellinusLinteus,中文名裂蹄针层孔菌，俗称桑臣、桑黄菇等；是寄生于桑树等阔叶树的一种药用真菌，素有“森林黄金”之美称。据《药性论》记载：味甘辛，无毒。《全国中草药汇编》则记载桑黄具有“利五脏，软坚，排毒，止血，活血和胃止泻”等功效，是目前国际公认的生物抗癌领域中有效率最佳的药用真菌。

桑黄分类学上属担子菌门（Basidiomycota）、层菌纲（Hymenomycetes）、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochtaceae)、木层孔菌属(Phellinsu)，是大型珍稀药用真菌。

桑黄菌子实体多年生，硬木质，无柄，侧生。菌盖扁半球形、马蹄形或不规则形，长径3～21厘米，短径2～12厘米，厚1.5～10厘米。有黄色翻边，底部面亦颜色鲜黄。菌肉蛋黄色或浅咖啡色，木质。桑黄菌属于多孔菌科、木层孔菌属真菌。据《药性论》记载：桑黄性甘平、无毒、治血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经。近年来，随着桑黄具有抗肿瘤活性的报道，桑黄的用量日益加大，特别是韩、日对我国野生资源掠夺式的收购，野生桑黄资源的储备越来越少。

野生的桑黄生境非常特殊、复杂，导致其数量非常稀少，加上人工栽培难度大，这极大的限制了桑黄在临床上的应用。近年来国内外对野生桑黄子实体的成分、药理等方面的研究较多，而对人工的栽培方面的研究较少见。目前韩国学者采用室外荫棚木段埋畦栽培桑黄取得成功。日本也开展了桑黄栽培产业，并具有相当规模，取得了巨大经济效益。国内对桑黄的研究尚处于起步阶段，部分地方现在也有少量摸索性的试验，但由于栽培技术还不够成熟，造成产量低，形成的子实体质量差(不成形)，人工栽培桑黄子实体国内尚不成熟，存在着技术要求高，培养条件苛刻、生长周期长等问题。

由于桑黄的抗癌机理渐渐被人们所认识，市场上对桑黄的需求越来越大。由于受利益的驱使人们无节制地开采野生桑黄，致使野生资源濒临灭绝、无法恢复，而人工生产技术又不成熟。因此，研究和发展桑黄的人工栽培新方法，这对于满足市场的需求非常重要。

目前人工栽培方式主要有两种，一种是以桑树、杨树、栎树的段木栽培为主，另一种是袋料栽培。无论是段木栽培还是袋料栽培，现有均需要先培育出桑黄母种，现有技术中桑黄母种通过组织培养方式进行培育时，均是挑选生长出的健壮菌丝进行扩大培育，该培育方式导致一次性接种量太小、菌丝萌发速度慢、污染率高等问题，且该操作方式工作强度大，不适合桑黄母种的大量成形。

发明内容

本发明的目的在于解决现有桑黄母种的培育方式具有一次性接种量太小、菌丝萌发速度慢、污染率高等问题，提供一种解决上述问题的桑黄母种的组织分离转管培育方法。

为解决上述缺点，本发明的技术方案如下：

桑黄母种的组织分离转管培育方法，包括以下步骤：

（1）将桑黄子实体上切取块状组织，将块状组织接种到试管培养基中，在恒温暗室中培养直至长出黄色绒毛状菌丝体；

（2）当菌丝体长到距离块状组织2～3cm时，挑取包含边缘菌丝体的培养基转接到另一试管培养基内进行培育，转接1次以上获得纯化菌丝体；

（3）纯化菌丝体长满试管培养基后，将长满纯化菌丝体的试管培养基切成块状，将块状培养基接种到扩大培养基上培育后获得桑黄母种。

本发明采用纯化操作有效避免菌丝体中包含杂菌，且通过纯化操作有效提高纯化菌丝体的健壮强度；本发明通过将培养基和菌丝一起接种的方式，有效增大一次接种量、减少劳动强度。通过菌丝体转接的操作和块状培养基接种的联合操作，有效达到增大接种量、加快萌发速度以及降低污染率的效果。

进一步，所述包含边缘菌丝体的培养基转接量为3～5%，所述块状培养基的接种量为5～8%。即当转接的试管培养基为100ml时，该试管培养基内转接的包含边缘菌丝体的培养基为2～5ml；当扩大培养基为100ml时，该接种到扩大培养基中的块状培养基为5～8ml。

通过该接种量的设置，有效提高培育菌丝体的速度，同时，能最大化地避免杂菌的影响。通过实验证明：当接种量越大时，越容易污染杂菌，进而影响培育速度；当接种量越少时，该菌丝体的萌发速度越慢，也对培育速度造成影响。本发明分别采用3～5%及5～8%的接种量，其不仅仅可以保证最大化地降低污染率，而且通过该接种量，可以使包含边缘菌丝体的培养基接种到试管培养基中10天内即可使纯化菌丝体长满试管培养基，也可使纯化菌丝体在7天内培育得到桑黄母种。

且通过该接种方法以及接种量的设置，最后获得的桑黄母种中杂菌污染率降低到了1%以下，并且桑黄母种培育获得的时间减少到30天以内，甚至只需20天即可获得桑黄母种，极大地提高生产效率。

为了达到减少培育时间的同时达到有效避免杂菌污染的效果，所述切成块状的培养基为1～2mm见方的大小，均匀分布在培养基表面。所述菌丝体转接次数优选为1～3次。

为了提高培育速度，所述桑黄子实体上切取的块状组织大小为1～4mm见方。

所述块状组织在试管培养基中的培育条件为：25℃恒温暗室中培养；所述菌丝体在扩大培养基上的培育条件为：26～28℃暗室中培养。

为了能在最短的时间内培育出强壮的桑黄母种，所述试管培养基和扩大培养基的组成成份相同，其具体配比如下：

去皮马铃薯190～210g、葡萄糖20g、KH₂P0₄2g、MgSO₄1g、VB110mg、桑树枝粉15g，水1000ml。

所述桑树枝粉的制备方法如下：将二年生新鲜的野生桑树枝阴干至水含量低于15%，然后用粉碎机打碎后过40目筛获得桑树枝粉。通过该桑树枝粉制备方法制备出的桑树枝粉，其能有效保证为桑黄母种提供快速成长的养分能最大化析出释放到培养基中，而且通过该比例的培养基配比，能较长时间的保证桑黄母种的活性，经过实验证明，本发明配比的培养基培育出的桑黄母种放置在4～6℃的环境中保存时，保存时间可达到3个月以上。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

1、本发明有效提高纯化菌丝体的健壮强度，有效增大一次接种量、减少劳动强度，加快萌发速度以及降低污染率；

2、采用本发明方式培养的桑黄母种，活力特别旺盛，污染率极低，可以在极短的时间内大量培养原种。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

桑黄母种的组织分离转管培育方法，包括以下步骤：

（1）将桑黄子实体上切取块状组织，将块状组织接种到试管培养基中，在恒温暗室中培养直至长出黄色绒毛状菌丝体；

即，在灭菌后的接种箱内，双手将表面消毒后的野生桑黄子实体分开成两半，切取2*2mm左右小方块组织。用接种针将菌肉组织移接于试管培养基的中央，其中，切取桑黄菌肉组织时的用具和切取的组织绝不要与桑黄菌体的其他部分相接触，以免造成污染，接种后置于25℃恒温暗室中培养，2d时即见由组织块长出黄色绒毛状菌丝，此时须连续观察，检查杂菌污染情况。发现有青、绿、黄、桔红等颜色小点及糊状物，说明已污染杂菌，应及时剔除。

上述野生桑黄子实体采自四川省绵阳市游仙区梓绵乡乌鸡寺村，其子实体的主要生物学性状如下：担子果多年生，无柄盖形，新鲜时木栓质，无嗅无味，干后硬木质。菌盖为蹄形，长达10cm，宽7cm，基部厚达5cm。菌盖表面黄褐色。硬木质，厚达1cm，略呈放射状生长。

（2）待继续培育3d时，桑黄菌丝长到离接种块2～3cm位置处，挑取包含边缘菌丝体的培养基转接于另一空白的试管培养基上，本实施例中该空白的试管培养基为100ml，该转接到试管培养基中的包含边缘菌丝体的培养基为3ml，培育5d后，观察是否有杂菌产生，如果没有即可获得纯化的桑黄菌丝，如果有杂菌产生，则继续将挑取包含边缘菌丝体的培养基转接于另一空白的试管培养基上培育。

（3）继续培育纯化菌丝体，2d后该纯化菌丝体长满试管培养基，此时，将长满纯化菌丝体的试管培养基切成块状，块状培养基为2mm见方的大小，将块状培养基接种到扩大培养基上，本实施例中该盛装该扩大培养基的容器为培养皿或锥形瓶，本实施例中该容器采用培养皿，该培养皿中扩大培养基为100ml，此时该转接到扩大培养基中的块状培养基为8ml，均匀分布在培养皿的表面，接种完成后在26～28℃的暗室中培养7d后获得桑黄母种。

本实施例中所述试管培养基和扩大培养基的组成成份相同，其具体配比如下：

去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、KH₂P0₄2g、MgSO₄1g、VB110mg、桑树枝粉15g，水1000ml。所述桑树枝粉的制备方法如下：将二年生新鲜的野生桑树枝阴干至水含量低于15%，然后用粉碎机打碎后过40目筛获得桑树枝粉。

本实施例中该桑黄母种培育的时间仅仅只有19天；将本实施例制成的桑黄母种放置在4～6℃条件下保存，在保存时间为60d、80d、100d、120d分别对桑黄母种的活力进行检测，经过检测，上述60d、80d、100d、120d时，该桑黄母种均能正常萌发菌丝体。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中试管培养基和扩大培养基的组成成份不同，具体组成如下：

去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、KH₂P0₄2g、MgSO₄1g，桑汁1000ml。桑汁的具体制作工艺如下：将二年生野生桑树枝用粉碎机打碎后过20目筛，获得桑树枝粉，称取桑树枝粉15g放入1000ml水中，煮15分钟后，纱布过滤后即成桑汁。

将本实施例制成的桑黄母种放置在4～6℃条件下保存，在保存时间为60d、80d、100d、120d分别对桑黄母种的活力进行检测，经过检测，上述60d、80d时，该桑黄母种均能正常萌发菌丝体，但80d时需要5d后才有菌丝体萌发，速度缓慢；100d时菌丝体萌发速度更加缓慢，10d左右才能清楚看到菌丝体的萌发，120d时该桑黄母种不能萌发菌丝体。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中试管培养基和扩大培养基的组成成份不同，具体组成如下：

去皮马铃薯190g、葡萄糖20g、KH₂P0₄2g、MgSO₄1g、VB110mg、桑树枝粉15g，水1000ml。所述桑树枝粉的制备方法如下：将一年生的野生桑树枝烘干至水含量低于15%，然后用粉碎机打碎后过40目筛获得桑树枝粉。

将本实施例制成的桑黄母种放置在4～6℃条件下保存，在保存时间为60d、80d、100d、120d分别对桑黄母种的活力进行检测，经过检测，上述60d、80d、100d时，该桑黄母种均能正常萌发菌丝体；120d时桑黄母种也能萌发，但萌发速度缓慢。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中转接到试管培养基中的包含边缘菌丝体的培养基为1ml；转接到扩大培养基中的块状培养基为3ml。

包含边缘菌丝体的培养基接种到试管培养基中培育13d时纯化菌丝体才能长满试管培养基；而扩大培养基中的块状培养基需要培养至少10d后，才能获得桑黄母种。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中转接到试管培养基中的包含边缘菌丝体的培养基为5ml；转接到扩大培养基中的块状培养基为10ml。

在该接种量的情况下，包含边缘菌丝体的培养基接种到试管培养基中后，虽然培育7d即可使纯化菌丝体长满试管培养基，但经检测该试管培养基中菌丝体染杂菌的机率增加到30%以上，增加了转管的次数，进而极大的增长了纯化菌丝体的时间，降低了培育效率；同时，该扩大培养基中的菌丝体染杂菌的机率也增加到30%。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将桑黄子实体上切取块状组织，将块状组织接种到试管培养基中，在恒温暗室中培养直至长出黄色绒毛状菌丝体；

（2）当菌丝体长到距离块状组织2～3cm时，挑取包含边缘菌丝体的培养基转接到另一试管培养基内进行培育，转接1次以上获得纯化菌丝体；

（3）纯化菌丝体长满试管培养基后，将长满纯化菌丝体的试管培养基切成块状，将块状培养基接种到扩大培养基上培育后获得桑黄母种。

2.根据权利要求1所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于：所述包含边缘菌丝体的培养基转接量为2～5%，所述块状培养基的接种量为5～8%。

3.根据权利要求1所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于：所述切成块状的培养基为1～2mm见方的大小。

4.根据权利要求1所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，所述菌丝体转接次数为1～3次。

5.根据权利要求1所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，所述桑黄子实体上切取的块状组织大小为1～4mm见方。

6.根据权利要求1所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，所述块状组织在试管培养基中的培育条件为：25℃恒温暗室中培养；所述菌丝体在扩大培养基上的培育条件为：26～28℃暗室中培养。

7.根据权利要求1～6任一项所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，所述试管培养基和扩大培养基的组成成份相同，其具体配比如下：

去皮马铃薯190～210g、葡萄糖20g、KH₂P0₄2g、MgSO₄1g、VB110mg、桑树枝粉15g，水1000ml。

8.根据权利要求1～6任一项所述的桑黄母种的组织分离转管培育方法，其特征在于，所述桑树枝粉的制备方法如下：将二年生新鲜的野生桑树枝阴干至水含量低于15%，然后用粉碎机打碎后过40目筛获得桑树枝粉。