CN102037856B - 一种简易蛹虫草菌种复壮的方法 - Google Patents

一种简易蛹虫草菌种复壮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种简易蛹虫草菌种复壮的方法。该方法包括步骤：将鲜活完整健康的蚕蛹僵化，在僵化的蚕蛹背部和腹部各划2-3个刀口；将僵化的蚕蛹背部朝上平铺在辅助培养基中，在121℃灭菌20min；接种液体菌种，进行菌丝培养和子实体培养；然后对从接种的蚕蛹背部切口处长出的子实体进行组织分离。本发明采用高温高压灭菌的蚕蛹，并在适当增加营养成分和水分后进行菌种复壮，与传统的采用活体蚕蛹注射复壮的方法相比，降低了污染率，提高了成功率，使操作简单，且提高了蚕蛹生物转化率。

Description

一种简易蛹虫草菌种复壮的方法
技术领域
本发明属于蛹虫草培养技术领域，具体涉及一种简易蛹虫草菌种复壮的方法。
背景技术
近年来，很多研究表明人工培养的蛹虫草化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此蛹虫草的开发应用具有极大的潜在市场。人工培养蛹虫草是解决野生虫草来源不足的良好途径，然而人工培养过程中菌种退化现象严重是制约其产业化开发的一大瓶颈。影响人工培养蛹虫草菌种退化的因素很多，简单的可以分成两大类：一类是菌株的遗传特性造成菌种的退化(内因)；另一类是培养条件、操作环节、环境因素导致的菌种退化(外因)。
梁宗琦(蛹虫草的无性型及子实体人工培养研究，西南农业学报，1990(2))研究了蛹草拟青霉(蛹虫草无性型)的一个野生型菌株及其角变分离株的菌落特征、形态特征、寿命及形成子实体能力的差异，结果表明角变菌株和野生型菌株除在颜色和产孢密度有明显差异外，在存活率与子实体形成能力方面也与野生型株不同，因此提出蛹虫草无性型是一个异核体真菌。有研究认为原因是异核体在继代培养时，培养基营养成分的选择作用使真菌寄生性或腐生性核得到了不同积累。
蛹虫草菌种分离的原则是尽最大可能获得优良亲本的遗传特性，并通过无性繁殖的方式保持其遗传的稳定性。由于最终的目的是获得优良形状的子实体，所以，无论是野外分离菌种或者是在培养过程中重新筛选优良菌种，均是从子实体出发分离菌种。
从整体的角度来看，蛹虫草优良菌种的获得和遗传稳定性的保持主要取决于两个因素：第一，有效分离物(亲本完整遗传信息)的获得，即通过人工培养能够获得和亲本性状一致或者更优良的子实体；第二，亲本的遗传信息在无性繁殖增殖传代培养过程中能够保持遗传的稳定性而不发生退化。
目前，常用的复壮方法是采用活体蚕蛹接种来复壮蛹虫草菌种，这种方法虽然能够使菌种复壮，但操作复杂、污染率高、成功率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、污染率低、生物转化率高的蛹虫草菌种复壮的方法，该方法可用于规模化生产。
本发明的蛹虫草菌种复壮的方法包括以下步骤：
(1)蚕蛹的处理：选取鲜活完整健康的蚕蛹，将蚕蛹僵化，在僵化的蚕蛹背部和腹部各划2-3个刀口。所述僵化是将鲜活完整健康的蚕蛹蒸10-15min；或者将鲜活完整健康的蚕蛹在60-85℃烘烤2-4小时。所述刀口的深度为表皮厚度，刀口不要太深，划破表皮即可。
(2)复壮培养基的制备：在培养容器、优选在培养盒中加入辅助培养基，将僵化的蚕蛹背部朝上平铺在辅助培养基中。将培养容器封口，在121℃灭菌20min。所述辅助培养基是水琼脂，其用来在培养过程中补充水分和固定蚕蛹；或者是大米培养基，其用来补充蚕蛹生长过程中所需要的水分、固定蚕蛹，以及补充一部分养分。优选大米培养基。辅助培养基的量以不超过僵化的蚕蛹的三分之二为宜。
(3)接种培养：接种液体菌种，即将培养好的液体菌种稀释后，接种在冷却的培养容器内，将菌种均匀的分布在培养基表面。所述液体菌种是将干燥菌种在无菌状态下粉碎后通过摇瓶液体培养得到，使用前稀释5-10倍。
(4)菌丝培养：将培养容器置于培养室中，适宜温度为18-25℃，湿度为70-85％，避光培养7-8天。
(5)子实体培养：在接种后待菌丝布满整个蚕蛹，开始见光，但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光后，在蚕蛹表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培养阶段，温度应为20-23℃，超过25℃生长缓慢，超过27℃菌丝萎缩不能出菌束。湿度应提高到80-85％。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交换，在培养阶段若发现培养室存在污染应立即清除。
(6)复壮菌种的获得：对从接种的蚕蛹背部切口处长出的子实体进行组织分离，即可获得复壮菌种。所述子实体选自条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体。
本发明的蛹虫草菌种复壮的方法操作简单、污染率低、成功率高，而且由于培养基中水分的添加，增加了培养容器中的小环境湿度，延长了生长时间，提高了僵化的蚕蛹的生物转化率。本发明不但能够较为容易的复壮菌种，而且可以作为一种采用活蚕蛹生产蛹虫草的方法。
本发明采用高温高压灭菌的蚕蛹，并在适当增加营养成分和水分后进行菌种复壮；而传统的采用活体蚕蛹注射复壮的方法，只是对蚕蛹进行表面消毒，所以污染率很高。因此，与活体蚕蛹注射复壮的方法相比，本发明具有污染率低、成功率高、操作简单及蚕蛹生物转化率高等优点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
所用材料：
菌种：采用常规蛹虫草菌株，编号为SX-08。
液体摇瓶用培养基：去皮土豆300克(煮汁)、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、水1000毫升，pH自然。
柞蚕蛹：市售的产自东北的新鲜活体柞蚕蛹。
大米培养基：营养液(按黄豆2％、葡萄糖1％、奶粉5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.05％、维生素B110mg/000ml的比例配成营养液，调整pH至7.2)与大米按照1.5∶1的比例混合。
培养盒：采用PP材料制成。
实施例1蛹虫草菌种的复壮方法
将鲜活完整健康的蚕蛹50只平铺在笼屉上开锅蒸15min使其僵化，室温冷却后将僵化的蚕蛹从头至尾用解剖刀在背部和腹部各划3个刀口。
在培养盒中加入大米40克、液体营养液60克，将5只僵化的蚕蛹背部朝上平铺在营养液中。然后将培养盒封口，在121℃灭菌20min。
将干燥菌种在无菌状态下粉碎，用液体摇瓶用培养基在22℃、140rpm的条件下避光培养120小时。将培养好的液体菌种稀释10倍后，接种在冷却的培养盒内，将菌种均匀地分布在培养基表面。
培养室的温度为18℃，湿度为70％，避光培养8天。待菌丝布满整个蚕蛹，开始见光，避免太阳光直射。菌丝见光后，在蚕蛹表面或四周可见桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。在子实体培养阶段，温度为22℃，湿度为85％。
最后，从上述获得的子实体中筛选条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体进行组织分离，即可获得复壮菌种。
实施例2蛹虫草菌种的复壮方法
将鲜活完整健康的蚕蛹50只平铺在搪瓷托盘上，在85℃烘箱中烘烤20分钟，取出托盘在室温冷却，然后将僵化的蚕蛹从头至尾用解剖刀在背部和腹部各划3个刀口。
在培养盒中加入大米40克、液体营养液60克，将5只僵化的蚕蛹背部朝上平铺在营养液中。然后将培养盒封口，在121℃灭菌20min。
将干燥菌种在无菌状态下粉碎，用液体摇瓶用培养基在22℃、140rpm的条件下避光培养120小时。将培养好的液体菌种稀释10倍后，接种在冷却的培养盒内，将菌种均匀地分布在培养基表面。
培养室的温度为18℃，湿度为70％，避光培养8天。待菌丝布满整个蚕蛹，开始见光，避免太阳光直射。菌丝见光后，在蚕蛹表面或四周可见桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。在子实体培养阶段，温度为22℃，湿度为85％。
最后，从上述获得的子实体中筛选条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体进行组织分离，即可获得复壮菌种。

Claims (7)

1.一种蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鲜活完整健康的蚕蛹僵化，在僵化的蚕蛹背部和腹部各划2-3个刀口；
(2)将僵化的蚕蛹背部朝上平铺在辅助培养基中，在121℃灭菌20min；
(3)接种液体菌种，然后进行菌丝培养和子实体培养；及
(4)对从接种的蚕蛹背部切口处长出的子实体进行组织分离。
2.如权利要求1所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，所述僵化是将所述蚕蛹蒸10-15min或在60-85℃烘烤2-4小时。
3.如权利要求1所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，所述刀口的深度为表皮厚度。
4.如权利要求1所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，所述辅助培养基是水琼脂或大米培养基。
5.如权利要求1所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，所述辅助培养基的量不超过所述僵化的蚕蛹的三分之二。
6.如权利要求1所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，所述液体菌种是将干燥菌种在无菌状态下粉碎后通过摇瓶液体培养得到，使用前稀释5-10倍。
7.如权利要求1-6任一项所述的蛹虫草菌种复壮的方法，其特征在于，步骤(4)所述的子实体为条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体。
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