CN106367352A - 一种食用菌菌种提纯复壮及新品种选育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简便、高效提纯复壮食用菌菌种的方法。食用菌菌种在长期传代过程中，会出现菌种退化，具体表现为菌丝生长慢、抗性减弱、产量下降、菇质差等，显微镜观察可见菌丝细胞壁穿孔、细胞壁不完整等形态学缺陷。本发明利用含有1‑40ppm的结晶紫的食用菌试管种培养基培养退化的食用菌菌种，抑制抗逆性差的菌体生长，然后分离生长快的尖端菌丝，筛选锁状联合多而清晰、细胞壁完整、抗逆性强、活力高的菌丝进行出菇试验验证，产量高、品质好、性状符合要求的为提纯复壮的菌株。此外，结晶紫会产生一定的诱变作用，出菇试验中筛选出菇特性、子实体形状发生变异的子实体进行组织分离，进行下一轮的出菇试验验证，可以得到食用菌新品种。

Description

一种食用菌菌种提纯复壮及新品种选育的方法

技术领域

本发明属于食用菌菌种选育技术领域，具体涉及一种利用含有结晶紫的培养基培养食用菌菌种，使退化的菌株提纯复壮及产生变异新品种的方法。

背景技术

中国食用菌栽培历史悠久，食用菌生产和出口均居世界第一。目前，我国80%的农业区域均有食用菌产业项目，在农村产业化调整中承担着重要的作用。食用菌菌种作为发展食用菌的基础生产资料，对食用菌生产起着关键性作用，直接影响产量和质量。然而，食用菌菌种在长期保藏及转代过程中普遍存在生产性能变劣、种性衰退等现象。例如平菇当家品种2026、89、2028、科佳1号等，以及香菇当家品种808、939、L26、L66等，这些优良品种在长期保藏及转代培养过程中，菌种质量逐渐退化，由于长期科技投入不足、管理不善，加剧了退化过程，出现菌丝生长慢、抗性减弱、产量下降、菇质差等现象，给食用菌生产造成极大的经济损失。

我们研究发现，退化的食用菌菌株存在以下几个问题，（1）种性不纯：同一试管不同部位的菌丝对峙培养，有拮抗带；出菇不一致，畸形菇多；不同子实体组织分离的菌株对峙培养，有拮抗带；（2）菌丝体病态：食用菌菌种为丝状真菌，退化的菌株显微镜观察可见细胞壁穿孔、不平整，锁状联合少等现象；（3）活力低：菌株生长慢，菌丝不粗壮，木质素、纤维素等酶活低。相较常规食用菌新品种诱变、杂交选育6-8年的选育周期，该食用菌菌种的提纯、复壮及新品种选育的方法是提高菌种质量的简便、高效手段。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术现状提供一种食用菌菌种简便、高效提纯复壮及新品种选育的方法，其可在较短的时间内提高退化菌株的生活力，提高食用菌产量和质量。

本发明采用如下技术方案：

一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其技术方案为：利用含有结晶紫的食用菌试管种培养基培养退化的食用菌菌种，然后采用菌丝尖端切割法分离尖端菌丝，转移到常规食用菌试管种培养基中培养，对培养出的菌株进行筛选并进行出菇试验验证，产量、品质及性状符合要求的即为提纯复壮的菌株。

所述结晶紫在食用菌试管种培养基中的浓度为1-40ppm，优选的浓度为10-40ppm。

所述常规食用菌试管种培养基为PDA培养基、麦芽浸汁培养基或米饭培养基等，所述含有一定浓度结晶紫的食用菌试管种培养基是在常规食用菌试管种培养基的基础上添加一定浓度的结晶紫。

所述对培养出的菌株进行筛选是采用本领域的常规筛选方法，具体为：筛选以下性状最优的三株菌株：锁状联合多而清晰，细胞壁完整，抗逆性强，活力高。

具体地，本发明对食用菌菌种提纯复壮方法的步骤如下：

（1）退化的食用菌菌种：生产中，出现明显退化的食用菌菌种，具体表现为：经常规传代多次或应用多年而未经提纯复壮，出现菌丝生长慢、抗逆性差、出菇不齐、产量低等，显微镜观察可见细胞壁穿孔、不平整，锁状联合少等现象。

（2）制备食用菌试管种培养基：可以选择培养食用菌试管种的常用培养基，如PDA培养基、麦芽浸汁培养基、米饭培养基等；

其中，PDA培养基组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12-15g，蒸馏水补足至1000ml；制备方法为，将马铃薯洗净去皮切片，加水180ml，煮沸30分钟后过滤，再加葡萄糖、琼脂，将过滤液补足到1000ml，按照250ml/瓶分装到500ml的三角瓶中，115℃高压灭菌20min后备用。

（3）配制结晶紫溶液：取1g市售分析纯结晶紫，加入10ml蒸馏水中研磨搅拌均匀，定溶到100ml，配制成1%浓度的结晶紫溶液，装入玻璃瓶中备用。

（4）含有结晶紫的食用菌试管种培养基配制：加热食用菌试管种培养基至完全液化，无菌条件下加入一定量的1%浓度的结晶紫溶液，优选结晶紫在食用菌试管种培养基中浓度为1-40ppm，摇匀，冷却至40-45℃，倒入无菌培养皿中。

（5）菌种活化：将退化的食用菌菌种试管种，由试管口到底部3-6个不同部位取菌块接入含有常规食用菌试管种培养基的培养皿中，用报纸包好，置于20-28℃的培养箱中培养，待菌丝长满平皿，用无菌打孔器在菌丝不同部位打孔3-10个，制备活化的食用菌菌饼。

（6）食用菌菌丝提纯复壮培养方法：取含有1-40ppm结晶紫的食用菌试管种培养基培养皿，将活化的食用菌菌饼接入培养基中，报纸包好，20-28℃培养，待菌丝生长至培养皿边缘，挑取菌落外缘尖端菌丝，接入食用菌试管种培养基中，即为初步提纯复壮的菌株。

（7）初步提纯复壮的菌株筛选：通过菌落形态观察、显微镜观察，筛选显微镜观察锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝浓厚、粗壮、整齐的菌株进行出菇试验。

（8）出菇试验：将经过筛选的初步提纯复壮的菌株在常规食用菌试管种培养基中活化，接入到食用菌常规栽培料中进行出菇试验，考察出菇早晚、产量、菇形、菇质等，产量、质量、性状符合生产要求的即为提纯复壮的菌株。

本发明还提供了一种食用菌新品种选育方法，其是在以上提纯复壮的方法的基础上进行以下步骤：

（9）新品种的筛选：结晶紫会产生一定的诱变作用，出菇试验中会出现少量菌株特性、菇形、菇质与原种差异子实体，进行组织分离得到分离株，通过对峙培养、ISSR多态性、酯酶同工酶差异性分析，可以得到食用菌新品种。

本发明的优点在于：方法简便，一般的食用菌栽培企业即可操作，操作流程少，效果好。

与其它几种提纯复壮方法的比较：

“断桥法”和菌丝尖端分离提纯复壮：仅可筛选出生长速度快的菌株，而生长速度快往往并非高产优质食用菌菌株。

原生质体再生法：可产生大量原生质体，需要对产生的大量原生质体进行分离、筛选和出菇验证，技术难度较大。

具体实施方式：

实施例1 香菇灵仙1号菌种的提纯复壮

香菇灵仙1号是河北平泉香菇主栽品种，来源于平泉希才应用菌科技发展有限公司，由于长期传代培养，出现菌种退化，表现为菌丝生长慢，显微镜观察锁状联合少而不规则，细胞壁表面不平滑等现象。

操作步骤为：

食用菌试管种培养基PDA培养基的配制。PDA培养基组成为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12-15g，蒸馏水补足1000ml。制备方法为，现将马铃薯洗净去皮切片，加水180ml，煮沸30分钟后过滤，再加葡萄糖、琼脂，将过滤液不足到1000ml，按照250ml分装到500ml三角瓶中，115℃ 20min高压灭菌后备用。

菌种活化：将退化的食用菌菌种试管种，由试管口到底部5个不同部位取菌块接入含有PDA培养基的培养皿中，用灭菌报纸包好，置于25℃的培养箱中培养，待菌丝长满平皿，用无菌打孔器在菌丝不同部位打孔5个，制成食用菌菌种菌饼。

1%结晶紫溶液配制：1g市售分析纯结晶紫，加入10ml蒸馏水中研磨搅拌均匀，定溶到100ml，配制成1%浓度的结晶紫溶液，装入玻璃瓶中加盖备用。

含有结晶紫的食用菌试管种培养基PDA培养基的配制：微波炉加热PDA食用菌试管种培养基至完全液化，无菌条件下分别加入0.025、0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.85ml、1.0ml的1%浓度的结晶紫溶液，摇匀，冷却至40-45℃，倒入直径90mm、高25mm的无菌培养皿中，每皿装量30ml，制成含有1ppm、4ppm、10 ppm、20ppm、30 ppm、40 ppm结晶紫的PDA培养基培养皿备用。

食用菌菌丝提纯复壮培养方法：将活化的食用菌菌种菌饼接入含有不同浓度结晶紫PDA培养基中部，报纸包好，25℃培养，待菌丝生长至培养皿边缘，挑取菌落外缘尖端菌丝，接入食用菌常规试管种培养基中，25℃培养，即为初步提纯复壮的菌株。

初步提纯复壮的菌株筛选：通过菌落形态观察、显微镜观察，筛选锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝浓厚、粗壮、整齐的菌株进行出菇试验。

出菇试验：试验在平泉4月初大棚进行。将经过筛选的初步提纯复壮的菌株接入栽培料，进行出菇试验。栽培料配方为杂木屑78%、麸皮19%、蔗糖1%、石膏1%；采用17×33cm耐压聚乙烯袋，每袋装350g干料，每处理200袋，按常规装袋、灭菌、接种，接种后1周挑选每处理无污染的150袋，分3组每组50袋随机摆放进行发菌及出菇。测量菌丝生长速度，考察出菇早晚、产量、菇形、菇质等。产量、质量、性状符合生产要求的即为提纯复壮的菌株。

新品种的筛选：结晶紫会产生一定的诱变作用，将出菇试验中出现的少量菌株特性、菇形、菇质与原种差异子实体，进行组织分离得到分离株，通过对峙培养、ISSR多态性、酯酶同工酶分析，可以鉴定为食用菌新品种。

结果：

表1 含有不同浓度结晶紫PDA培养基对香菇菌种的提纯复壮作用

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菌饼在含有不同浓度结晶紫PDA培养基中培养结果见表1，由表可知，随着结晶紫浓度的增加，能够长满皿的菌株数量不断减少，满皿时间逐渐延长。

挑取能够长满皿的尖端菌丝在含有PDA培养基试管中传代培养，通过显微镜观察，可见提纯复壮的菌株菌丝浓厚、锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝粗壮整齐，菌株生活力均较提纯复壮前的对照菌株提高。现将每个处理浓度生长速度最快的3个菌株的生长情况列表如下（表2）：

由表2可知，含有不同浓度结晶紫培养基培养后，食用菌生长速度提高，锁状联合数量增加，其中以10-40ppm浓度处理菌丝生长速度快、锁状联合多，为最佳浓度范围。筛选生长速度快、锁状联合多而整齐、菌丝粗壮的菌株进行出菇实验。

表2 初步提纯复壮的菌株筛选

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出菇实验结果见下表3，由表可知，提纯复壮的菌株提高了栽培料中菌丝的生长速度，提前出菇7-14天，畸形菇比例显著降低，产量普遍提高，产量由高到低分别为16号、10号、7号、13号、4号、1号菌株。可见，10-40ppm结晶紫培养基浓度具有较高的提纯复壮效率。

此外，在16号菌株（40ppm）出现椭圆形和圆形两种形态的香菇子实体，比例分别为9%和91%，说明对香菇菌株产生了诱变作用。分别对16号椭圆形子实体和圆形子实体进行组织分离，分别得到分离株16-A（椭圆形）和16-B（圆形），经对峙培养，出现拮抗带，初步判断16-A为变异新品种。

表3 出菇实验

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小结：经过不同浓度结晶紫PDA培养基培养而提纯复壮的筛选菌株均提高了产量，显著减少畸形菇比例，起到提纯复壮作用。另外，含有40ppm结晶紫PDA培养基提纯复壮出的16号菌株出现了椭圆形和圆形两种形态的香菇子实体，而且分离株相互拮抗，说明诱变产生了新品种。

实施例2 金针菇杂19的提纯复壮

金针菇杂19是黄金针菇主栽品种，来源于河北创新食用菌研究所的市售品种，由于长期传代培养，出现菌种退化，表现为菌丝生长慢，畸形菇比例高，显微镜观察锁状联合少而不规则，细胞壁表面不平滑等现象。

操作步骤同实施例1，采用了含有结晶紫食用菌试管种培养基为含有10 ppm和30ppm结晶紫的PDA培养基。栽培试验采用秋种秋收。

结果表明：

挑取能够长满皿的尖端菌丝在PDA培养基试管中传代培养，通过显微镜观察，可见提纯复壮的菌株菌丝浓厚、锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝粗壮整齐，菌株生活力均较对照提高。筛选生长速度快、菌丝粗壮的6个菌株进行出菇试验，结果见如下。

由表4可知，6个提纯复壮的菌株均显著提高产量，而且可以观察到出菌丝生长快、出菇齐、畸形菇减少、菇质提高等现象，以4号菌株产量最高，平均418g/袋。

表4 对提纯复壮的菌株出菇试验

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实施例3 平菇89的提纯复壮

平菇89是平菇主栽品种，因子实体肉厚、密实、口感好而深受欢迎，菌株来源于河北创新食用菌研究所的市售品种。该品种90年代曾经可以在10-15℃出菇，而且产量高；近年来菇农普遍反映低温不出菇，产量低，经过研究发现，该菌株低温条件下木质素酶活极低，显微镜观察锁状联合少而不规则，细胞壁表面不平滑等现象。

操作步骤同实施例1，采用了含有结晶紫食用菌试管种培养基为含有10 ppm和30ppm结晶紫的PDA培养基，栽培试验采用早春投料、4月下旬采收。

结果表明：

挑取能够长满皿的尖端菌丝在PDA培养基试管中传代培养，通过显微镜观察，可见提纯复壮的菌株菌丝浓厚、锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝粗壮整齐，菌株生活力均较对照提高。另外测定了菌株5℃、10℃、15℃、20℃的木质素酶活性。筛选生长速度快、菌丝粗壮、低温木质素酶活高的5个菌株进行出菇试验，结果见如下：

由表5可知，5个提纯复壮的菌株均较提纯复壮前的对照菌株低温条件下提高了木质素酶活，锁状联合增多。

表5 菌株筛选

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注：菌饼直径5mm。

对筛选的菌株进行出菇试验，结果见表6，由表可知，提纯复壮的菌株提前3-4天满袋，提前出菇9天，产量普遍提高，以1号菌株产量最高，平均430g/袋。此外可以观察到出菇齐、畸形菇减少、菇质提高等现象。

表6 菌株出菇试验

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Claims (7)

1.一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于：利用含有结晶紫的食用菌试管种培养基培养退化的食用菌菌种，然后采用菌丝尖端切割法分离尖端菌丝，转移到常规食用菌试管种培养基中培养，对培养出的菌株进行筛选并进行出菇试验验证，产量、品质及性状符合要求的即为提纯复壮的菌株。

2.如权利要求1所述的一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于：所述结晶紫在食用菌试管种培养基中的含量为1-40ppm。

3.如权利要求2所述的一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于：所述结晶紫在食用菌试管种培养基中的含量为10-40ppm。

4.如权利要求1所述的一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于：所述常规食用菌试管种培养基为PDA培养基、麦芽浸汁培养基或米饭培养基，所述含有一定浓度结晶紫的食用菌试管种培养基是在常规食用菌试管种培养基的基础上添加一定浓度的结晶紫。

5.如权利要求1所述的一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于：所述对培养出的菌株进行筛选具体为：筛选以下性状最优的三株菌株：锁状联合多而清晰，细胞壁完整，抗逆性强，活力高。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种食用菌菌种提纯复壮的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）制备含有结晶紫的食用菌试管种培养基：首先制备常规食用菌试管种培养基，然后配制结晶紫溶液，将常规食用菌试管种培养基液化，无菌条件下加入结晶紫溶液，摇匀，冷却即得；

（2）菌种活化：取待提纯复壮的退化的食用菌菌种试管种，由试管口到底部3-6个不同部位取菌块接入含有常规食用菌试管种培养基的培养皿中，置于20-28℃的培养箱中培养，待菌丝长满培养皿，用无菌打孔器在不同部位打孔3-10个，制备活化的食用菌菌饼；

（3）初步提纯复壮：取含有1-40ppm结晶紫的食用菌试管种培养基培养皿，将活化的食用菌菌饼接入培养基中， 20-28℃培养，待菌丝生长至培养皿边缘，挑取菌落外缘尖端菌丝，接入食用菌试管种培养基中，即为初步提纯复壮的菌株；

（4）初步提纯复壮菌株的筛选：选取锁状联合数量多、均匀、清晰，菌丝浓厚、粗壮、整齐的菌株进行出菇试验；

（5）出菇试验：将步骤（4）筛选出的菌株在常规食用菌试管种培养基中活化，接入到食用菌常规栽培料中进行出菇试验，产量、质量、性状符合生产要求的即为提纯复壮的菌株。

7.一种食用菌新品种选育方法，其特征在于：在权利要求1-5任一项所述的方法的出菇试验中，筛选出菇特性和/或子实体形状发生变异的子实体进行组织分离，进行下一轮的出菇试验验证，即可得到食用菌新品种。