CN107641641B - 一种快速简单的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速简单的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法，其中包括香蕉种质根系粗提物的获得、根系提取物过滤除菌、含有香蕉根系粗提物的PDA培养基的配制、FocTR4的接种、FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算等步骤。根据香蕉种质根系提取物对FocTR4的抑制率初步判断该香蕉种质的抗枯萎病能力，该方法简单易行、成本低、速度快，可以在5天内完成香蕉种质抗枯萎病能力的初步评价。
Description
技术领域
本发明涉及香蕉抗病育种领域，尤其涉及一种快速简单的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法。
背景技术
香蕉（Musa spp.）是全球重要的经济作物，是仅次于柑橘的第二大水果，同时也是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。我国是香蕉的重要原产地，是世界上第二大香蕉生产国。香蕉产业已成为我国华南地区重要的农业支柱产业，然而近年来，香蕉正遭受香蕉枯萎病的严重危害。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxyporum f.sp. Cubense，Foc）引起的土传真菌病害。其中Foc热带四号小种（FocTR4）的致病寄主范围最广，致病能力也最强。国际香蕉和大蕉改良网络组织主席Emile Frison于2003年甚至发出警告：香蕉可能会因为FocTR4的危害在十年内灭绝！2013年，以香蕉作为粮食作物的非洲首次发现了FocTR4，引起了国际上的强烈关注。
Foc进入土壤后，在没有香蕉寄主的情况下仍可生存长达30年之久，使得香蕉枯萎病的防治难度极大。目前，香蕉枯萎病的防治办法主要有化学防治、农业防治、生物防治等。尽管做了很多探索，到目前为止仍未找到有效的化学试剂和农业、生物防治方法。抗枯萎病香蕉种质的选育是应对香蕉枯萎病的最根本、最有效、最持久的方法。然而，香蕉抗病种质的筛选与鉴定往往需要先对获得的候选抗枯萎病种质进行组培扩繁，之后再进行枯萎病菌接种试验或枯萎病发病蕉园种植试验，最后根据发病情况筛选出抗枯萎病香蕉种质。这种筛选方法不仅需要掌握香蕉组织培养技术，还需要消耗大量的人力、物力和财力，同时筛选出抗枯萎病香蕉种质的概率也较低，因此建立一种简单、快速、低成本的香蕉种质枯萎病抗性评价方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法，通过简单的实验在较短的时间内初步评价香蕉种质枯萎病抗性，可以缩短抗枯萎病种质筛选的时间，该方法简单易行、成本低。
本发明的技术方案：
一种快速简单的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法，其中包括香蕉种质根系粗提物的获得、根系提取物过滤除菌、含有香蕉根系粗提物的PDA培养基的配制、FocTR4的接种、FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算等步骤。根据香蕉种质根系提取物对FocTR4的抑制率初步判断该香蕉种质的抗枯萎病能力，该方法简单易行、成本低、速度快，可以在5天内完成香蕉种质抗枯萎病能力的初步评价。
具体方法为：
1、香蕉种质根系粗提物的获得
以四叶一心、生长均匀一致的香蕉种质为材料。取根系，用自来水冲洗2-3次去除根系泥土。用滤纸吸干根系表面残留水分，称取根系20 g，加入无菌水50 ml，置于榨汁机中打磨成匀浆。收集匀浆并分装至2个50 ml离心管中，5000 rpm离心4分钟后吸取上清液，定容至100 ml，即获得浓度为200 g/L的根系粗提物。
2、根系粗提物过滤除菌
在紫外灭菌的超净工作台中，用2 ml无菌注射器吸取根系粗提物，使用0.22 μm过滤头过滤除菌，使用灭菌的玻璃瓶收集根系粗提物。
3、含有香蕉根系粗提物的PDA固体培养基的配制
配制100 ml PDA培养基，高压灭菌后待温度降至50~60℃时，加入等体积的过滤除菌的香蕉根系提取物，制备含有100 g/L的过滤除菌的根系粗提物PDA培养基，摇匀后倒入灭菌的9 cm培养皿中，每个培养皿加入20 ml培养基，凝固后作为处理组备用。以加入等体积水的PDA培养基为对照组。
4、FocTR4的接种
以PDA固体培养基上培养7天的枯萎病菌FocTR4为材料，使用灭菌的黄色枪头（枪头口直径为5 mm）打孔获得FocRT4菌块，将菌块长有菌丝一面向下接种于处理组培养基和对照组培养基中央，各10个重复。28℃倒置培养。
5、FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算
接种后每天测量菌落直径，待对照组菌落长至2/3板时计算抑制率。抑制率计算方法为：抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）÷对照组菌落直径×100%。
与常规的抗枯萎病香蕉种质筛选方法相比，本发明具有以下优点：
1、本发明仅需20 g甚至更少的香蕉种质根系即可完成，样品需求量少。
2、本发明通过与已有香蕉枯萎病抗病材料比较，根据菌落生长情况和抑制率即可初步判断香蕉种质的抗性，无需在枯萎病抗病评价前对候选种质进行大量的组培扩繁，降低了枯萎病抗性评价的技术要求、节约了成本。
3、本发明仅需进行香蕉种质根系粗提物的制备和过滤除菌、含有过滤除菌根系粗提物的PDA培养基的制备和枯萎病菌接种，方法简单易行。
4、利用本发明可在5天内完成香蕉种质枯萎病抗性评价，节约了时间。
附图说明
图1 不同香蕉种质根系提取物对FocTR4的抑制率。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
1、香蕉种质根系粗提物的获得
以四叶一心、生长均匀一致的三明野生蕉、‘天宝蕉’、‘福州粉蕉1号’、‘中蕉九号’和‘中蕉四号’香蕉种质为材料。取根系，用自来水冲洗2-3次去除根系泥土。用滤纸吸干根系表面残留水分，称取根系20 g，加入无菌水50 ml，置于榨汁机中打磨成匀浆。收集匀浆并分装至2个50 ml离心管中，5000 rpm离心4分钟后吸取上清液，定容至100 ml，即获得浓度为200 g/L的根系粗提物。
2、根系粗提物过滤除菌
在紫外灭菌的超净工作台中，用2 ml无菌注射器吸取根系粗提物，使用MILLEX公司生产的0.22 μm过滤头过滤除菌，使用灭菌的玻璃瓶收集根系粗提物。
3、含有香蕉根系粗提物的PDA固体培养基的配制
配制100 ml PDA培养基，高压灭菌后待温度降至60℃时，加入等体积的过滤除菌的香蕉根系提取物，制备含有100 g/L的过滤除菌的根系粗提物PDA培养基，摇匀后倒入灭菌的9 cm培养皿中，每个培养皿加入20 ml培养基，凝固后作为处理组备用。以加入等体积水的PDA培养基为对照组。
4、FocTR4的接种
以PDA固体培养基上培养7天的枯萎病菌FocTR4为材料，使用灭菌的黄色枪头（枪头口直径为5 mm）打孔获得FocRT4菌块，将菌块长有菌丝一面向下接种于处理组培养基和对照组培养基中央，各10个重复。28℃倒置培养。
5、FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算
接种后每天测量菌落直径，从表1可以看出：在含有100 g/L的‘中蕉九号’和‘中蕉四号’根系提取物培养基上FocTR4菌落直径最小，其次是三明野生蕉，之后是‘福州粉蕉1号’，‘天宝蕉’，在对照组培养基上FocTR4直径最大。待对照组菌落长至约2/3板时（第5天）计算抑制率。从图1可以看出5种香蕉种质根系粗提物对FocTR4的抑制效果从高到低依次为：‘中蕉九号’≈‘ 中蕉四号’>三明野生蕉≈‘福州粉蕉1号’>‘天宝蕉’，与已报道的香蕉枯萎病抗性评价结果基本一致。其中，‘中蕉九号’和‘中蕉四号’已被证实为抗枯种质，它们的根系提取物对FocTR4的抑制率也最高；野生蕉也一般被认为具有较好的抗病能力，‘福州粉蕉1号’含有B基因组，B基因组中被认为存在着A基因不存在的抗逆相关基因，三明野生蕉和‘福州粉蕉1号’根系提取物对FocTR4的抑制率虽不如‘中蕉九号’和‘中蕉四号’，但却也明显优于栽培品种‘天宝蕉’；‘天宝蕉’对枯萎病的高度易感，在实际生产中也受枯萎病为害严重。以上结果表明根系粗提物对FocTR4的抑制效果可以作为初步评价香蕉种质枯萎病抗性的方法，同时还可以通过与抗枯萎病香蕉种质抑制效果比较初步筛选抗枯萎病香蕉种质。
表1 菌落直径测定结果
本发明所需样品少、技术要求低、成本低、方法简单易行，可以在5天内完成香蕉种质枯萎病抗性能力评价，具有较大的生产应用价值。可以加速抗枯萎病香蕉种质的筛选，对香蕉抗枯萎病育种具有重要意义。
Claims (1)
1.一种快速简单的香蕉种质枯萎病抗性初步评价方法，其特征在于：所述方法包括香蕉种质根系粗提物的获得、根系粗取物过滤除菌、含有香蕉根系粗提物的PDA固体培养基的配制、FocTR4的接种、FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算；
具体包括如下：
（1）香蕉种质根系粗提物的获得
以四叶一心、生长均匀一致的香蕉种质为材料，取根系，用自来水冲洗2-3次去除根系泥土，用滤纸吸干根系表面残留水分，称取根系20 g，加入无菌水50 ml，置于榨汁机中打磨成匀浆；收集匀浆并分装至2个50 ml离心管中，5000 rpm离心4分钟后吸取上清液，定容至100 ml，即获得浓度为200 g/L的根系粗提物；
（2）根系粗提物过滤除菌
在紫外灭菌的超净工作台中，用2 ml无菌注射器吸取根系粗提物，使用0.22 μm过滤头过滤除菌，使用灭菌的玻璃瓶收集根系粗提物；
（3）含有香蕉根系粗提物的PDA固体培养基的配制
配制100 ml PDA固体培养基，高压灭菌后待温度降至50~60℃时，加入等体积的过滤除菌的香蕉根系粗取物，制备含有100 g/L的过滤除菌的根系粗提物PDA固体培养基，摇匀后倒入灭菌的9 cm培养皿中，每个培养皿加入20 ml培养基，凝固后作为处理组备用；以加入等体积水的PDA固体培养基为对照组；
（4）FocTR4的接种
以PDA固体培养基上培养7天的枯萎病菌FocTR4为材料，使用灭菌的黄色枪头打孔获得FocRT4菌块，将菌块长有菌丝一面向下接种于处理组培养基和对照组培养基中央，各10个重复，28℃倒置培养；
（5）FocTR4菌落直径的测定和抑制率的计算
接种后每天测量菌落直径，待对照组菌落长至2/3板时计算抑制率；抑制率计算方法为：抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）÷对照组菌落直径×100%。
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