CN106544398B - 一种小麦赤霉病抗性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物抗性鉴定领域，涉及一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，以一叶一心期至二叶一心期的小麦叶片为检测对象，将叶片切割为叶段后在叶段中部接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液使叶片接菌，并在接种2‑3天后即可获得鉴定结果，与单花滴注法相比，本发明方法可以在小麦苗期利用离体叶片进行赤霉病抗性鉴定，同时具有鉴定周期短，操作简单，重复性好和能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点，该发明的发布能够有效促进小麦抗赤霉病遗传、育种及抗病机理等工作取得突破性研究进展。

Description

一种小麦赤霉病抗性鉴定方法

技术领域：

本发明属于植物抗性鉴定领域，涉及一种小麦赤霉病抗性鉴定方法。

背景技术：

小麦(Triticum aestivum L.)作为世界三大粮食作物之一，其产量仅次于玉米和水稻。然而，在小麦整个生长发育过程中，各种生物胁迫和非生物胁迫严重威胁着小麦的产量和品质。其中，非生物胁迫因素主要包括盐碱、干旱、冻害和干热风等；生物胁迫因素主要包括小麦三锈病害(包括条锈、叶锈和秆锈)、小麦赤霉病和小麦白粉病等，这三大病害是威胁小麦生长最为严重的三大真菌病害。其中，真菌病原菌不仅能够影响小麦的产量，而且在侵染小麦的过程中能够分泌许多对人类和家畜有害的毒素和代谢产物，严重影响小麦的品质。

赤霉病(Fusarium Head Blight,FHB)是一种由多种镰刀菌引起的世界范围重大真菌病害，该病害主要发生在湿润和半湿润地区，主要危害作物包括小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻和黑麦等多种禾谷类作物。小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的穗部重大真菌病害，每年都给世界范围内小麦生产带来较大的损失。此外，赤霉菌在侵染过程中还会产生多种真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等，不仅影响小麦的品质及商品价值，还可使人、畜中毒，严重危害人畜健康。随着赤霉病的频繁爆发和危害面积的不断扩大，赤霉病害已引起了人们的广泛关注。

小麦赤霉病抗性可能受多基因控制，抗病机制复杂，其发病程度易受环境条件影响，遗传力低，抗性鉴定困难，抗性资源匮乏，目前尚未发现对赤霉病免疫的种质资源，这些都在一定程度上影响了小麦赤霉病抗性的遗传和育种工作。

现在小麦赤霉病鉴定方法主要是单花滴注法，其主要特征是：在小麦开花期对穗中部小穗的基部小花接种10μL禾谷镰刀菌悬浮液，孢子浓度为每亳升1×10⁵个，每个材料需要做20-30个重复，接种后套透明塑料袋保湿，待赤霉病发病后(大约接种后72小时)去除塑料袋。接种后21天观察并统计发病小穗数和总小穗数，并计算出每穗感病率，通过统计学分析方法判断小麦的赤霉病抗性。该方法具有抗病鉴定周期长，鉴定时期要求特殊，鉴定结果不稳定、易受环境条件和个人主观因素的影响等缺点。如何能够快速准确的鉴定小麦赤霉病抗性成为现有技术中难以解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的诸多不足之处，本发明以一叶一心期至二叶一心期的小麦叶片为检测对象，将叶片切割为叶段后在叶段中部接种禾谷镰刀菌孢子悬浮液使叶片接菌，并在接种2-3天后即可获得鉴定结果，与单花滴注法相比，本发明方法可以在小麦苗期利用离体叶片进行赤霉病抗性鉴定，同时具有鉴定周期短，操作简单，重复性好和能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点，该发明的发布能够有效促进小麦抗赤霉病遗传、育种及抗病机理等工作取得突破性研究进展。

与现有的大田接种相比，本发明避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，节省大量人力物力，适合大批量的育种材料高通量的鉴定。

本发明是通过如下技术方案实现的：

包括如下步骤：利用一叶一心期至二叶一心期的小麦苗期叶片，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，在圆形伤口部位接种1-2.5uL浓度为1.5-2×10⁵个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每份鉴定材料至少做3个重复；

之后将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部；将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，无菌去离子水的深度不超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中；之后将上述的叶段转移至25-28℃培养箱中，培养2-3天，根据接菌部位病症类型统计检测材料的赤霉病抗性，标准如下：

感病品种在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶段表面迅速蔓延，接种后第3天病斑在叶片扩展的最大长度可以达到0.6-1.0cm、颜色较浅，叶段整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；

抗病品种在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病品种相比，其病斑的颜色深，病斑长度小于0.5cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片不发生脱绿现象。

按照上述标准即可筛选出高赤霉病抗性的小麦品种并用于后期的育种工作中。

上述技术方案中，在叶段上制造的圆形贯穿伤口能实现禾谷镰刀菌孢子均匀的向周围组织蔓延，有效消除重复间差异；而且能使禾谷镰刀菌菌丝迅速侵入叶片组织，并从叶片组织中获得充足的营养而繁殖快速；

本发明所述方法利用一叶一心期至二叶一心期的小麦，挑选健壮的植株进行抗病性鉴定。相同材料可以选用多棵一叶一心期幼苗进行赤霉病鉴定，单株的抗病鉴定可以选用二叶一心期幼苗进行抗病性鉴定，这样不仅能保证有足够的叶片进行重复试验，而且能有效缩短抗病鉴定周期，避免长时间的栽培影响植株生长状态进而降低抗病鉴定结果的稳定性和准确性；

本发明使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的浓度为1.5-2×10⁵个/mL，使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的体积为1-2.5uL，所述方法满足接种总孢子量的需求，加快叶段病症发生速度，提高检定效率和结果稳定性。由于本发明的叶段上有贯穿性创伤，这种条件下使用禾谷镰刀菌孢子接种浓度如果高于2×10⁵个/mL，则病害发展过快无法鉴定品种间抗性差异；如果浓度过低会延长抗病鉴定周期，长时间的离体培养会降低叶片活性，影响鉴定结果；固本发明选择上述浓度标准。本发明所述方法在接种完成后将两端浸水的叶段转移至25-28℃培养箱，鉴定效果最好，培养箱温度高于28℃会导致接种部位菌丝大量繁殖，影响判定结果的准确性；

进一步的，所述无菌去离子水中含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，其浓度为25mg/L。6-BA为叶片保绿剂，加入6-BA后可以有效减缓叶片脱绿速度，延长叶片活性时间，提高鉴定结果的稳定性和准确性；

进一步的，所述接种前在振荡器上涡旋禾谷镰刀菌孢子悬浮液1-2min，使禾谷镰刀菌孢子悬浮液混合均匀，颠倒混匀禾谷镰刀菌孢子悬浮液，能显著提高同一待检测小麦材料不同重复发病情况的均一性；

进一步的，所述叶段两端通过插入具有直径0.5cm小孔的鉴定板(一般选择塑料板)置于无菌去离子水中，无菌去离子水水面低于塑料板的表面，便于叶段两端长时间稳定的置于无菌去离子水中，实现叶段在鉴定过程中的稳定性；

进一步的，所述圆形贯穿伤口的直径为0.1-0.15cm，实现伤口大小均匀一致，提高鉴定的准确性和一致性；

进一步的，本发明的采用的禾谷镰刀菌种为典型强致病力菌种，具体采用传统菌种PH-1，该菌种广泛易得，在本发明中能够准确鉴定不同小麦材料的赤霉病抗性，鉴定结果感抗差异显著，易于判断。

与单花滴注法相比，本发明提供了一种新的小麦赤霉病抗性评价标准，以是否产生黑色致密病斑为抗性评判指标。该方法可以避免单花滴注法通过统计发病小穗率来评判小麦的赤霉病抗性，减少个人主观性对鉴定结果的影响。

本发明所述方法还包括赤霉菌分生孢子的培养：选用禾谷镰刀菌为抗性鉴定菌种(如传统菌种PH-1)，首先将禾谷镰刀菌在马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满马铃薯葡萄糖固体培养基后，切取带菌丝的马铃薯葡萄糖固体培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3d，过滤，用无菌去离子水清洗4-5次，用无菌去离子水配制标准浓度的禾谷镰刀菌孢子悬浮液。除上述方法之外，也可以采用其他现有技术获得标准浓度的禾谷镰刀菌孢子悬浮液。

上述马铃薯葡萄糖固体培养基的制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，向滤液中再加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用，所述马铃薯葡萄糖固体培养基有利于禾谷镰刀菌菌丝的生长，缩短鉴定周期。

进一步的，所述无菌绿豆汤液体培养基的制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用，所述无菌绿豆汤液体利于快速繁殖禾谷镰刀菌孢子，缩短鉴定周期。

本发明所述方法还包括鉴定材料的准备：将待检测的小麦种子利用10wt％的次氯酸钠处理10-15min，然后利用无菌去离子水清洗4-5遍，密封，25℃浸泡12h，待种子露白后播种于基质(泥炭、珍珠岩和蛭石质量比1:1:1混合均匀后获得)中，25℃条件下培养至一叶一心期至二叶一心期；

上述过程中小麦种子经过10wt％的次氯酸钠溶液处理能去除种子表面杂菌，避免杂菌污染，提高鉴定结果准确性。

之所采用这种前期准备方法是为了适应本发明的检测需要，利用种子萌发后生长至一叶一心期或二叶一心期的小麦叶片为材料进行小麦赤霉病抗性鉴定，所以不需要考虑大田里的小麦生长周期，可以大大缩短检测所需要的时间，上述小麦叶片准备工作是较之现有其他鉴定方法是鉴定周期最短、最优化的操作流程。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：提供一种赤霉病抗性评价标准，采用离体样本进行检测，根据接菌处是否产生黑色致密坏死斑评价小麦赤霉病抗性，利用该评价方法可以不受小麦生育期和外界环境条件的限制，简单快速地鉴定小麦赤霉病抗性；表型直观可靠，重复性好，同时具有鉴定周期短，操作简单，能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点，该发明的发布能够有效促进小麦抗赤霉病遗传、育种及抗病机理等工作取得突破性研究进展，适合大批量的育种材料高通量的鉴定。

附图说明

图1为实施例1本发明所述方法用于济麦22的鉴定结果灰度图；

图2为实施例1本发明所述方法用于苏麦3号的鉴定结果灰度图；

图3为实施例2本发明所述方法用于济麦22的鉴定结果灰度图；

图4为实施例2本发明所述方法用于济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系的鉴定结果灰度图；

图5为本发明所述的叶片鉴定时形态示意图。

具体实施方式

实施例1

苏麦3号自1974年育成以来，经国内外学者多年多点鉴定和利用，一致认为不仅对赤霉病抗性强而稳定，而且遗传传递力强，配合力好，是目前在小麦赤霉病育种及遗传研究中应用最为广泛的抗源。其所携带的Fhb1基因，属于赤霉病II型抗性主效QTL，位于小麦3BS染色体，具有很强的抗赤霉病延展能力，是现在研究最为广泛和深入的抗赤霉病基因之一。

济麦22是山东省农业科学院作物研究所最新育成的超高产、多抗、优质中筋小麦新品种，属于我国现阶段主要推广品种之一，但其对赤霉病表现为感性。本实施例以这两个品种作为研究材料，运用该发明办法对其赤霉病抗性进行鉴定，其主要操作步骤如下：

1.赤霉菌分生孢子的培养：选用典型的强致病力禾谷镰刀菌(菌种编号：PH-1，山东农业大学农学院作物生物学国家重点实验室保存)为抗性鉴定菌种，首先将该菌株在马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满培养基后，利用手术刀切取适量带菌丝的上述培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3d，然后通过显微镜检测孢子产生情况。将含有足够孢子量的菌液经灭菌纱布过滤后，利用无菌去离子水清洗孢子4-5次，然后利用无菌去离子水将其配制成孢子浓度为1.5-2×10⁵个/mL的孢子悬浮液。

所述马铃薯葡萄糖固体培养基的制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用。

所述无菌绿豆汤液体培养基的制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用。

2.鉴定材料的准备：将苏麦3号和济麦22的小麦种子分别利用10wt％的次氯酸钠处理10-15min，然后利用无菌去离子水清洗4-5遍，密封，25℃浸泡12h，待种子露白后播种于基质(泥炭、珍珠岩和蛭石质量比1:1:1混合均匀后获得)中，每个材料只需2-4棵幼苗。培养室条件下培养至一叶一心期，挑选健壮的植株进行抗病性鉴定。

3.赤霉病抗性鉴定：鉴定材料选用已经完全展开的第一片真叶，挑选植株正常、叶片长而厚、叶色较深的小麦叶片。将小麦叶片从基部剪下，叶基部和叶尖部分去除，只选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求断口整齐，不要造成叶肉组织损伤。然后，利用顶端平整、直径为0.1-0.15cm的管状打孔器(管状打孔器能用小号移液器枪头代替)，在叶片的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，每段叶片的伤口尽量一致，为了提高鉴定结果准确性，每份鉴定材料分别鉴定8个重复。

将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部，如图5所示。将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中，无菌去离子水中加入6-苄氨基腺嘌呤的浓度为25mg/L。在叶片伤口部位接种2.5uL的步骤1中的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，接种完成后密封鉴定盆并水平转移至25℃培养箱中，培养2-3天，待叶片接菌部位出现明显病症后，根据病症类型统计检测材料的赤霉病抗性。

4.赤霉病抗性的鉴定：在接菌处理后2-3天，不同赤霉病抗性的小麦材料接菌部位会出现非常明显的差异。如图1所示，感病品种济麦22在接种2天后接菌部位会呈现水浸状坏死斑，病斑在叶片表面迅速蔓延，接种后第3天病斑平均长度为0.75cm，最长可以达到1.0cm、颜色较浅，叶片整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；相反如图2所示，抗病品种苏麦3号在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密坏死斑，与感病品种相比，其坏死斑的颜色深，病斑面积小，坏死斑长度平均为0.52cm，最大长度为0.6cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片几乎不发生脱绿现象。

可见本发明的鉴定结果与品种本身的抗病特性一致。

实施例2

抗赤霉病基因Fhb7来自十倍体长穗偃麦草，本发明发明人通过多年在温室及大田对遗传改良材料的抗赤霉病鉴定，结果表明该基因在不同遗传背景材料中均表现出对赤霉病的稳定、高效抗性，因此该基因对小麦抗赤霉病的遗传改良具有重要意义。特别是其对济麦22的抗赤霉病改良系材料，不仅保留了济麦22的优异产量性状，而且显著提高了济麦22的赤霉病抗性。本实施例以这两个近等基因系作为研究材料，运用该发明办法对其赤霉病抗性进行鉴定，其主要操作步骤如下：

1.利用现有技术获得分生孢子浓度为1.5-2×10⁵个/mL的典型强致病力禾谷镰刀菌PH-1孢子混悬液。

2.鉴定材料的准备：将济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系和济麦22的小麦种子分别利用10wt％的次氯酸钠处理10-15min，然后利用无菌去离子水清洗4-5遍，密封，25℃浸泡12h，待种子露白后播种于基质中，每个材料仅需2-4棵幼苗。培养室条件下培养至二叶一心期，挑选健壮的植株进行抗病性鉴定。

3.赤霉病抗性鉴定：鉴定材料选用已经完全展开的第一片真叶，挑选植株正常、叶片长而厚、叶色较深的小麦叶片。将小麦叶片从基部剪下，叶基部和叶尖部分去除，只选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求断口整齐，不要造成叶肉组织损伤。然后，利用顶端平整、直径为0.1-0.15cm的管状打孔器，管状打孔器也能用小号枪头代替，在叶片的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，每段叶片的伤口尽量一致，为了提高鉴定结果准确性，每份鉴定材料分别鉴定8个重复。

将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部，如图5所示。将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中，无菌去离子水中加入浓度为25mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)。在叶片伤口部位接种2.5uL的上述禾谷镰刀菌孢子悬浮液，接种完成后密封鉴定盆并水平转移至25℃培养箱中，培养2-3天，待叶片接菌部位出现明显病症后，根据病症类型统计检测材料的赤霉病抗性。

4.赤霉病抗性的鉴定：在接菌处理后2-3天，不同赤霉病抗性的小麦材料接菌部位会出现非常明显的差异。如图3所示，感病品种济麦22在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶片表面迅速蔓延，接种后第3天病斑平均长度为0.75cm，最长可以达到1.0cm、颜色较浅，叶片整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；相反，如图4所示，抗病品种济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系材料在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病品种济麦22相比，其病斑的颜色深，病斑面积小，病斑长度平均为0.49cm，最大长度为0.56cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片几乎不发生脱绿现象。

可见本发明的鉴定结果与该品种穗部的抗病特性一致。

实施例3

在定位抗赤霉病基因Fhb7时，利用两个赤霉病抗性能力不同的小麦-长穗偃麦草代换系材料7el₁和7el₂为亲本，创制了一个包含156个株系的RIL群体。Fhb7来自十倍体长穗偃麦草，本发明发明人通过多年在温室及大田对遗传改良材料的抗赤霉病鉴定，结果表明该基因在不同遗传背景材料中均表现出对赤霉病的稳定、高效抗性，因此该基因对小麦抗赤霉病的遗传改良具有重要意义。本实施例以该RIL群体作为研究材料，运用该发明办法对其赤霉病抗性进行鉴定，其主要操作步骤如下：

1.利用现有技术获得分生孢子浓度为1.5-2×10⁵个/mL的典型强致病力禾谷镰刀菌PH-1孢子混悬液。

2.鉴定材料的准备：将RIL群体不同株系的种子分别利用10wt％的次氯酸钠处理10-15min，然后利用无菌去离子水清洗4-5遍，密封，25℃浸泡12h，待种子露白后播种于基质中，每个材料仅需2-4棵幼苗。培养室条件下培养至一叶一心期，挑选健壮的植株进行抗病性鉴定。

3.赤霉病抗性鉴定：鉴定材料分别选用已经完全展开的第一片真叶，挑选植株正常、叶片长而厚、叶色较深的小麦叶片。将小麦叶片从基部剪下，叶基部和叶尖部分去除，只选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求断口整齐，不要造成叶肉组织损伤。然后，利用顶端平整、直径为0.1-0.15cm的管状打孔器，管状打孔器也能用小号枪头代替，在叶片的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，每段叶片的伤口尽量一致，为了提高鉴定结果准确性，每份鉴定材料分别鉴定8个重复。

将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部。将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中，无菌去离子水中加入浓度为25mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)。在叶片伤口部位接种2.5uL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，接种完成后密封鉴定盆并水平转移至25℃培养箱中，培养2-3天，待叶片接菌部位出现明显病症后，根据病症类型统计检测材料的赤霉病抗性。

4.赤霉病抗性的鉴定：在接菌处理后2-3天，不同赤霉病抗性的植株接菌部位会出现非常明显的差异。感病株系在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶片表面迅速蔓延，颜色较浅，叶片整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；相反，抗病株系在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病材料相比，其病斑的颜色深，病斑面积小，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片几乎不发生脱绿现象，按照是否产生黑色病斑为依据对鉴定结果进行统计。结合穗部赤霉病抗性表型数据分析，结果发现，运用本发明得到的抗性鉴定结果和穗部表型基本一致，数据相似度可以达到95％以上；另外，对表型不相符的株系分别利用与抗病基因紧密连锁的分子标记XBE445653、Xcfa2240和XsdauK66进行基因型分析，结果表明，与单花滴注法鉴定结果相比，该方法得到的鉴定结果可以更好地和基因型对应(表1)。

表1RIL群体部分株系赤霉病鉴定表型与基因型数据

注：S为感病，R为抗病。

由此可见，本发明所述方法得到的鉴定结果不仅和穗部抗性鉴定结果一致，而且鉴定结果准确。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：利用一叶一心期至二叶一心期的小麦苗期叶片，选取叶片平整、宽度一致的部位分割成长3-3.5cm，叶面自身宽度的叶段，要求叶段断口整齐，不要造成叶肉组织损伤，在叶段的上表面中间位置制造一个圆形贯穿伤口，在圆形贯穿伤口部位接种1-2.5uL浓度为1.5-2×10⁵个/mL的禾谷镰刀菌孢子悬浮液，每份鉴定材料至少做3个重复；

之后将制造完伤口的叶片两端插入鉴定板的小孔中，使叶片上表面向上呈现拱形，伤口处于拱形的顶部；将鉴定板放置于含有无菌去离子水的鉴定盆中，去离子水的深度不要超过鉴定板上表面，确保叶片的两端浸没在水中；接种完成后将上述的叶段转移至25-28℃培养箱中，培养2-3天，根据接菌部位病症类型统计检测材料的赤霉病抗性，标准如下：

感病品种在接种2天后接菌部位会呈现水浸状病斑，病斑在叶段表面迅速蔓延，接种后第3天病斑在叶片扩展的最大长度可以达到0.6-1.0cm、颜色较浅，叶段整体表现出严重脱绿，病斑表面多覆盖致密的菌丝；

抗病品种在接种2-3天后只会在伤口周围形成一个黑色致密病斑，与感病品种相比，其病斑的颜色深，病斑长度小于0.5cm，接种部位没有或者只有少量菌丝产生，叶片不发生脱绿现象；

所采用的强致病力鉴定菌种编号为PH-1；

所述圆形贯穿伤口的直径为0.1-0.15cm。

2.根据权利要求1所述小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述无菌去离子水中含有浓度为25mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。

3.根据权利要求1所述小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述接种前在振荡器上涡旋禾谷镰刀菌孢子悬浮液1-2min。

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