CN109868303A - 一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，将待测小麦种子播种后8‑12d，待小麦幼苗第一叶完全展开，心叶刚露出时，取小麦幼苗第一叶在超净工作台上剪成2‑3cm长的叶段，叶正面向上平铺在含有60‑80mg/L苯并咪唑的0.5％水琼脂培养基表面；将条锈菌新鲜夏孢子与0.05％Tween 20水溶液混匀喷雾接种到剪好的叶段上；将接种后的小麦叶段转移至光照培养箱，10℃黑暗、湿度100％条件下保湿24h，然后在光照强度6000Lux‑8000Lux，相对湿度60％‑80％下培养14‑16d；按照0‑4级标准区分小麦条锈病的反应型。与现有技术相比，本发明通过在小麦离体叶片上接种培养小麦条锈菌，根据小麦条锈病的反应型即可快速鉴定小麦抗条锈病情况，省时省力，不受环境条件的影响，节省实验材料，节省空间，简便快捷。

Description

一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法

技术领域

本发明涉及小麦条锈病抗性检测技术领域，特别是一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法。

背景技术

条锈病是小麦上最重要的病害之一，在全世界范围内均有发生，在我国发生尤为严重。引起小麦条锈病的小麦条锈菌(Puccnia striiformis f.sp.tritici)是一种典型的专性寄生菌，只能在活体上寄生存活，不能人工培养。因此，目前小麦条锈菌生理小种监测和小麦抗条锈病鉴定只能在温室和大田培养健康的小麦植株，通过人工接种或诱发接种，经过保湿、光照培养等，使小麦植株发病。这种方法不仅费时费力，所需要的菌种和小麦材料较多，而且受环境因素影响较大。

离体叶段法鉴定与温室苗期或大田成株期鉴定相比,具有不受天气条件影响、节省实验材料、简便快捷等优点。李舜芳等(1982)比较了离体叶段鉴定和苗期鉴定小麦秆锈菌生理小种，表明离体叶段法可以用于小麦秆锈菌生理小种鉴定。唐伯让等(1993)研究报道了离体叶段法鉴定白粉病中不同保绿剂和幼苗叶龄对发病的影响。何文兰等(1998，1999)研究和改进了小麦离体叶段法鉴定小麦抗白粉病的方法，并利用离体叶段法进行了小麦白粉病、条锈病和叶锈病的抗性鉴定，结果表明离体叶段法比较适合于小麦白粉病鉴定，而对条锈病和叶锈病的鉴定方法尚需改进。杨文香等(2001)对小麦叶锈菌离体叶段培养方法进行了研究报道，表明离体叶段法可用于小麦叶锈菌的培养。以上研究均表明小麦离体叶片培养专性寄生菌体的可行性。

但是，目前小麦条锈菌生理小种监测和小麦抗条锈病鉴定只能通过在温室培养健康的小麦植株，然后利用涂抹法或者撒粉法进行人工接种，经过保湿、低温潜育培养等，使小麦材料发病。这种鉴定方法往往需要占用较大的空间，不仅费时费力，所需要的菌种量和小麦材料较多，而且鉴定结果容易受环境条件的影响。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种快速、有效的小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，包括以下步骤：

1)将待测小麦种子播种于小花盆内，播种后8-12d，待小麦幼苗第一叶完全展开，心叶刚露出时，取小麦幼苗第一叶在超净工作台上剪成叶段备用；

2)离体叶段培养的垫衬物用0.5％的水琼脂培养基，具体配置方法为：称取琼脂粉1.0g放于250ml三角瓶中，加去离子水200ml，放入微波炉中溶解，封口膜封口，高压灭菌锅灭菌30min；超净工作台用75％医用酒精喷施后，紫外线灭菌15min，然后将10cm方形培养皿用75％的酒精擦拭后放在超净工作台上紫外线灭菌15min；用电子天平称量保绿剂0.012g，待水琼脂培养基温度降至不烫手时，于超净工作台内，加入保绿剂，混匀后倒培养基；

3)待方形培养皿中的培养基凝固后，在超净工作台上将步骤1)剪好的叶段按顺序平铺在培养基表面，然后在小烧杯内将条锈菌新鲜夏孢子用清水湿润，调成糊状，然后在小型喷雾器内按照1g孢子：500ml水的比例加入0.05％Tween20水溶液混匀，均匀喷雾接种到剪好的叶段上，盖上培养皿盖；

4)将接种后的小麦叶段移至光照培养箱，10℃黑暗条件下保湿24h，然后在光照强度6000Lux-8000Lux下培养14-16d；

5)小麦材料对条锈菌的反应型按0、0；、1、2、3、4六个类型划分记载，其具体划分标准为：0型：叶上不产生任何可见的症状；0；型：叶上产生小型枯死斑，不产生夏孢子堆；1型：叶上产生枯死条点或条斑，夏孢子堆很小，数目很少；2型：夏孢子堆小到中等大小，较少，其周围叶组织枯死或显著褪绿；3型：夏孢子堆较大、较多，其周围叶组织有褪绿现象；4型：夏孢子堆大而多，周围不褪绿；此外，用“－”和“+”进行进一步精细划分，“－”表示夏孢子堆较其相应正常反应型的夏孢子堆略小；“+”表示夏孢子堆较其相应正常反应型的夏孢子堆略大；

6)根据步骤5)反应型调查结果，进行小麦材料的抗性评价，0型为免疫，0；型为近免疫，1型为高抗，2型为中抗，3型为中感，4型为高感。

作为本发明的优选方案，所述步骤1)中将小麦叶片剪成2-3cm长的叶段。

作为本发明的优选方案，所述步骤2)中保绿剂是浓度为60-80mg/L的苯并咪唑。

作为本发明的优选方案，所述步骤4)中培养箱内的昼温17℃、夜温11℃，每天光照16h、黑暗8h，相对湿度60％-80％。

与现有技术相比，本发明通过对小麦离体叶片上接种培养小麦条锈菌，根据小麦条锈病的反应型即可快速鉴定小麦抗条锈病情况，省时省力，不受环境条件的影响，节省实验材料，节省空间，简便快捷。

附图说明

图1为本发明实施例所用不同浓度的保绿剂离体叶段培养16d后的发病情况：(a)保绿剂浓度为60ml/L；(b)保绿剂浓度为70ml/L；(c)保绿剂浓度为80ml/L。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

1、幼苗培养和叶段准备

将待鉴定小麦种子播种于直径10cm的小花盆内，每盆10-15粒。播种后8-12d待第一叶完全展开，心叶刚露出时，取幼苗第一叶在超净工作台上剪成2-3cm长的叶段备用。

2、培养基的制备

离体叶段培养的垫衬物用0.5％的水琼脂培养基，具体配置方法为：称取琼脂粉1.0g放于250ml三角瓶中，加去离子水200ml，放入微波炉中溶解，封口膜封口，高压灭菌锅灭菌；超净工作台、10cm方形培养皿紫外线灭菌15min，用电子天平称量苯并咪唑颗粒0.012g，待水琼脂培养基温度降至不烫手时，于超净工作台内，加入苯并咪唑，混匀后倒培养基。

3、接种

待方形培养皿中的培养基凝固后，在超净工作台上将剪好的叶段按顺序平铺在培养基表面。将条锈菌孢子与0.05％的Tween20水溶液按照体积比1:500的配比混匀喷雾接种。不同的条锈菌菌种需要用不同的喷雾器进行接种，以防止交叉污染。

4、潜育发病

将接种后的小麦叶段转移至光照培养箱，10℃黑暗条件下保湿24h，然后在光照强度6000Lux,昼温17℃、夜温11℃,每天光照16h、黑暗8h，培养16d。

5、按照0、0；、1、2、3、4级标准调查小麦条锈病的反应型。如图1(a)所示，本实施例小麦叶段发病情况。

实施例2

1、幼苗培养和叶段准备

将待鉴定小麦种子播种于直径10cm的小花盆内，每盆10-15粒。播种后8-12d待第一叶完全展开，心叶刚露出时，取幼苗第一叶在超净工作台上剪成2-3cm长的叶段备用。

2、培养基的制备

离体叶段培养的垫衬物用0.5％的水琼脂培养基，具体配置方法为：称取琼脂粉1.0g放于250ml三角瓶中，加去离子水200ml，放入微波炉中溶解，封口膜封口，高压灭菌锅灭菌30min；超净工作台、10cm方形培养皿紫外线灭菌15min，用电子天平称量苯并咪唑颗粒0.014g，待水琼脂培养基温度降至不烫手时，于超净工作台内，加入苯并咪唑，混匀后倒培养基。

3、接种

待方形培养皿中的培养基凝固后，在超净工作台上将剪好的叶段按顺序平铺在培养基表面。将条锈菌孢子与0.05％的Tween20水溶液按照体积比1:500的配比混匀喷雾接种。不同的条锈菌菌种需要用不同的喷雾器进行接种，以防止交叉污染。

4、潜育发病

将接种后的小麦叶段转移至光照培养箱，10℃黑暗条件下保湿24h，然后在光照强度8000Lux,昼温17℃、夜温11℃,每天光照16h、黑暗8h，培养16d。

5、按照0、0；、1、2、3、4级标准调查小麦条锈病的反应型。如图1(b)所示，本实施例小麦叶段发病情况。

实施例3

1、幼苗培养和叶段准备

将待鉴定小麦种子播种于直径10cm的小花盆内，每盆10-15粒。播种后8-12d待第一叶完全展开，心叶刚露出时，取幼苗第一叶在超净工作台上剪成2-3cm长的叶段备用。

2、培养基的制备

离体叶段培养的垫衬物用0.5％的水琼脂培养基，具体配置方法为：称取琼脂粉1.0g放于250ml三角瓶中，加去离子水200ml，放入微波炉中溶解，封口膜封口，高压灭菌锅灭菌30min；超净工作台、10cm方形培养皿紫外线灭菌15min，用电子天平称量苯并咪唑颗粒0.016g，待水琼脂培养基温度降至不烫手时，于超净工作台内，加入苯并咪唑，混匀后倒培养基。

3、接种

待方形培养皿中的培养基凝固后，在超净工作台上将剪好的叶段按顺序平铺在培养基表面。将条锈菌孢子与0.05％的Tween20水溶液按照体积比1:500的配比混匀喷雾接种。不同的条锈菌菌种需要用不同的喷雾器进行接种，以防止交叉污染。

4、潜育发病

将接种后的小麦叶段转移至光照培养箱，10℃黑暗条件下保湿24h，然后在光照强度7000Lux,昼温17℃、夜温11℃,每天光照16h、黑暗8h，培养16d。

5、按照0、0；、1、2、3、4级标准调查小麦条锈病的反应型。如图1(c)所示，本实施例小麦叶段发病情况。

对比实施例

利用本发明的小麦离体叶段鉴定方法与温室苗期鉴定方法分别对黄淮麦区45份小麦品种进行抗条锈病鉴定(表1)，鉴定结果表明两种鉴定结果基本一致，表明本发明的离体叶段鉴定方法是可靠和可行的。

表1

注：表中HR为高抗，MR中抗,MS中感,HS高感。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将待测小麦种子播种于小花盆内，播种后8-12d，待小麦幼苗第一叶完全展开，心叶刚露出时，取小麦幼苗第一叶在超净工作台上剪成叶段备用；

2)离体叶段培养的垫衬物用0.5％的水琼脂培养基，具体配置方法为：称取琼脂粉1.0g放于250ml三角瓶中，加去离子水200ml，放入微波炉中溶解，封口膜封口，高压灭菌锅灭菌30min；超净工作台用75％医用酒精喷施后，紫外线灭菌15min，然后将10cm方形培养皿用75％的酒精擦拭后放在超净工作台上紫外线灭菌15min；用电子天平称量保绿剂0.012g，待水琼脂培养基温度降至不烫手时，于超净工作台内，加入保绿剂，混匀后倒培养基；

3)待方形培养皿中的培养基凝固后，在超净工作台上将步骤1)剪好的叶段按顺序平铺在培养基表面，然后在小烧杯内将条锈菌新鲜夏孢子用清水湿润，调成糊状，然后在小型喷雾器内按照1g孢子：500ml水的比例加入0.05％Tween20水溶液混匀，均匀喷雾接种到剪好的叶段上，盖上培养皿盖；

4)将接种后的小麦叶段移至光照培养箱，10℃黑暗、湿度100％条件下保湿24h，然后在光照强度6000Lux-8000Lux下培养14-16d；

5)小麦材料对条锈菌的反应型按0、0；、1、2、3、4六个类型划分记载，其具体划分标准为：0型：叶上不产生任何可见的症状；0；型：叶上产生小型枯死斑，不产生夏孢子堆；1型：叶上产生枯死条点或条斑，夏孢子堆很小，数目很少；2型：夏孢子堆小到中等大小，较少，其周围叶组织枯死或显著褪绿；3型：夏孢子堆较大、较多，其周围叶组织有褪绿现象；4型：夏孢子堆大而多，周围不褪绿；此外，用“－”和“+”进行进一步精细划分，“－”表示夏孢子堆较其相应正常反应型的夏孢子堆略小；“+”表示夏孢子堆较其相应正常反应型的夏孢子堆略大；

6)根据步骤5)反应型调查结果，进行小麦材料的抗性评价，0型为免疫，0；型为近免疫，1型为高抗，2型为中抗，3型为中感，4型为高感。

2.根据权利要求1所述的小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，其特征在于：所述步骤1)中将小麦叶片剪成2-3cm长的叶段。

3.根据权利要求1所述的小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，其特征在于：所述步骤2)中保绿剂是浓度为60-80mg/L的苯并咪唑。

4.根据权利要求1所述的小麦抗条锈病的离体叶段鉴定方法，其特征在于：所述步骤4)中培养箱内的昼温17℃、夜温11℃，每天光照16h、黑暗8h，相对湿度60％-80％。