CN109221197A - 一种植物抗病诱抗剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗病诱抗剂及其应用，本发明发现2’‑脱氧鸟苷可直接引起植物活性氧爆发及抗病基因PR1表达上调，提高了植物对病原菌的抗病性，发挥着植物抗病诱抗剂的作用。2’‑脱氧鸟苷来源广泛，具有高效、无污染、造价低廉等特点，作为新型的植物抗病诱抗剂蕴涵巨大应用潜力，符合农业可持续健康发展的要求。

Description

一种植物抗病诱抗剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种植物抗病诱抗剂及其应用。

背景技术

作物病害是危害农业生产、国民经济发展和人民生活水平的自然灾害之一，其造成的损失达10-15％，是作物稳产、高产、优质的关键影响因素。病原菌侵染后可产生有毒物质，限制了作物栽培和农产品储藏运输，直接降低农产品产量和品质。农民不得不喷施农药防控病害发生和发展，以避免或减轻病原菌对作物生理功能的干扰作用。农药可间接通过食物链对生态平衡造成破坏、生物体对农药的富集及不同营养级间的生物放大作用，导致农药在某个环节出现高浓度积聚，对人们身体健康具有潜在的负面影响。农药长期大量频繁使用，导致有些药剂的使用量已经达到最初用量的数倍，病菌抗药性问题日趋严重，是农药防效下降的主因。随着生活质量提高和环境保护意识增强，促使人们探寻一种对人类和环境无害并具良好防效的植物病害防治新策略，其中环境友好、低毒、无残留植物抗病诱抗剂是解决上述问题的主要途径之一。

植物抗病诱抗剂具有提高作物抗病性，增强作物抵抗恶劣环境的能力，进而提高植物对入侵病原菌的抵抗能力。植物体自然存在基础免疫PTI，对真菌、细菌、病毒做出响应，抑制其侵染效率。植物通过细胞膜表面受体蛋白识别病原相关分子，激发植物内源信号，经级联放大作用，产生一系列生理生化反应(如气孔关闭、细胞壁增厚、抗病基因上调表达等)，遏制病原菌进一步侵染。然而，植物自身免疫抗病系统反应能力是有限的，因此需要植物抗病诱抗剂增强其抗病能力。目前已知的植物抗病诱抗剂可分为非生物来源和生物来源两大类，其中，非生物来源的诱抗剂包括无机盐，如氯化汞、硫酸铜等，以及用有机合成的方法获得的寡糖类诱抗剂；生物来源的诱抗剂包括从真菌的代谢物中分离得到或是从菌丝体中提取得到的寡糖类诱抗剂、蛋白类诱抗剂和糖蛋白诱抗剂，但还未见核苷酸类物质诱导植物产生抗病性的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种植物抗病诱抗剂及其应用。

本发明意外的发现，2’-脱氧鸟苷可激发植物叶片活性氧爆发，病程相关基因PR1高量表达，并且显著降低病斑面积以及细菌生长数量，由此提出了本发明。

本发明的第一方面，提供核苷酸类物质在制备植物抗病诱抗剂中的应用。

优选的，所述核苷酸类物质为嘌呤核苷酸；更优选的，所述核苷酸类物质为2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

本发明的第二方面，提供一种植物抗病诱抗剂，所述植物抗病诱抗剂的有效成分为2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

优选的，所述植物抗病诱抗剂中包含1ng/ml-1μg/ml的2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

进一步优选的，所述植物抗病诱抗剂中还包含0.01～0.05％(体积百分含量)的表面活性剂Tween-20。

本发明的第三方面，提供上述植物抗病诱抗剂在防治农作物真菌类和/或细菌类病害中的应用。

本发明的第四方面，提供一种防治农作物真菌类和/或细菌类病害的方法，将所述植物抗病诱抗剂喷施于农作物叶片或者根茎上。

本发明的第五方面，提供2’-脱氧鸟苷或其结构类似物在制备引起植物活性氧爆发及抗病基因PR1表达上调的植物调节剂中的应用。

本发明的第六方面，提供一种能引起植物活性氧爆发及抗病基因PR1表达上调的植物调节剂，所述植物调节剂以有效量的2’-脱氧鸟苷或其结构类似物作为活性成分。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次研究发现，2’-脱氧鸟苷可激发植物叶片活性氧爆发，病程相关基因PR1高量表达，并且显著降低病斑面积以及细菌生长数量，因此，2’-脱氧鸟苷及其结构类似物可以作为植物抗病诱抗剂的有效成分。

(2)与传统诱抗剂相比，2’-脱氧鸟苷具有超高活性，在极低浓度(10ng/ml)下处理植物，就能提高植物叶片中活性氧爆发，胼胝质沉积等生理反应，从而提高植物对病菌的抗病性，具有微量、高效的特点。

(3)核苷酸及其衍生物广泛存在于各种生物当中，故2’-脱氧鸟苷的原材料来源充沛。该植物抗病诱抗剂既可被植物直接吸收利用，又可以自然降解或者转化成其它物质再利用，对环境无污染，对保障农产品安全生产具有重要意义，符合当今社会绿色环保主题和社会可持续发展的方向。

(4)2’-脱氧鸟苷可以激发植物自身抗性，因此对多种农作物都有效果，具有极大的潜在应用价值，利用该物质用于防治植物病时，可以使用直接喷施的方法进行处理，在病害高发期可以提前喷施，做到“治未病，防未然”。

附图说明

图1：分别利用DAB染色与NBT染色方法检测叶片中H₂O₂与超氧阴离子含量，图中DAB与NBT染色结果显示脱氧鸟苷引起H₂O₂与超氧阴离子在拟南芥叶片大量积累。

图2：用定量RT-PCR技术检测拟南芥在喷施0.01％Tween-20水溶液(对照)与100ng/ml 2’-脱氧鸟苷(含0.01％Tween-20)后抗病基因PR1的表达模式结果示意图；图中柱形图表示处理后PR1基因的表达水平，可以看出在2’-脱氧鸟苷处理后PR1基因表达水平相较对照大幅上调。

图3：拟南芥在喷施0.01％Tween-20水溶液(对照)与100ng/ml 2’-脱氧鸟苷(含0.01％Tween-20)两小时后，使用OD₆₀₀＝0.01的Pst DC3000的菌液对拟南芥进行喷施接种，在接种三天后取样拍照(图3a)，并计算细菌生长数量(图3b)。由图3a可以看出2’-脱氧鸟苷处理后的拟南芥发病病斑明显变小；由图3b可以看出细菌生长数量与对照相比显著降低(t检验，P<0.05)。“*”两组数据之间存在显著性差异。

图4：水稻在喷施0.01％Tween-20水溶液(对照)与100ng/ml 2’-脱氧鸟苷(含0.01％Tween-20)两小时后，使用OD₆₀₀＝0.5的RS105的菌液对拟南芥进行喷施接种，接种14天后，对发病叶片进行取样拍照，并做细菌生长数量统计。图中表型图可以看出2’-脱氧鸟苷处理后的水稻发病病斑明显比对照要少(图4中A)，并且细菌生长数量与对照相比极显著降低(图4中B，t检验，P<0.01)。“**”两组数据之间存在极显著性差异。

图5：水稻在喷施0.01％Tween-20水溶液(对照)与100ng/ml 2’-脱氧鸟苷(0.01％Tween-20)两小时后，使用嵌入法将带菌木质火柴棒嵌入到水稻叶鞘中，并用保鲜膜封上保湿。接种4天后，将发病后的水稻整株剪下并拍摄发病病斑表型。图中可以看出，喷施2’-脱氧鸟苷后与对照相比能够明显降低病斑长度。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语：

2’-脱氧鸟苷(2'-Deoxyguanosine)，是一种核苷酸类物质，别名有2'-脱氧鸟苷、2-脱氧鸟苷、2-脱氧鸟苷(一水)、9-Β-D-2-呋喃脱氧核苷鸟嘌呤、鸟嘌呤脱氧核糖核苷等。

2’-脱氧鸟苷的结构类似物包括但不限于：8-羟基-2-脱氧鸟苷、去氧鸟苷单磷酸、阿昔洛韦或更昔洛韦。

正如背景技术部分所介绍的，植物虽然存在自身免疫抗病系统，但其抗病能力是有限的，仍需要植物抗病诱抗剂来增强其抗病能力。植物抗病诱抗剂对于植物病害的控制功效已是不可否认的事实。因此，开发高效、无毒的植物抗病诱抗剂，并使之产业化，将对全人类及整个生态系统产生重大影响。本申请的发明人在植物抗病诱抗剂研究领域深耕多年，在研究的过程中发现，2’-脱氧鸟苷与对照相比，2’-脱氧鸟苷可激发植物叶片活性氧爆发，病程相关基因PR1高量表达，并且显著降低病斑面积以及细菌生长数量。与传统诱抗剂相比，100ng/ml 2’-脱氧鸟苷即可提高植物抗病性，具有微量、高效特点。核苷酸及其衍生物广泛存在于各种生物当中，故2’-脱氧鸟苷的原材料来源充沛。该植物抗病诱抗剂既可被植物直接吸收利用，又可以自然降解或者转化成其它物质再利用，对环境无污染，对保障农产品安全生产具有重要意义。该物质用于防治植物病时，可以使用直接喷施的方法进行处理，在病害高发期可以提前喷施，做到“治未病，防未然”，因此，2’-脱氧鸟苷或其结构类似物可以作为一种全新的高效、无毒的植物抗病诱抗剂，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中，本发明实施例中所用到的植物抗病诱抗剂是按如下方法制备得到的：

2’-脱氧鸟苷是一种纯合物，以超纯水作为溶剂配制成2’-脱氧鸟苷浓度为100ng/ml的工作液，向工作液中添加Tween-20，使Tween-20的体积百分含量为0.01％，制备得到植物抗病诱抗剂。

实施例1：

1.试验作物：拟南芥(为Col-0背景)。

2.种植方式：拟南芥在温室中种植，日照时间为16小时，黑暗培养8小时，培养温度为常温21℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。

3.试验方法：

拟南芥在培养到第4周时，将植物抗病诱抗剂(2’-脱氧鸟苷浓度为100ng/ml，Tween-20的体积百分含量为0.01％)喷施在拟南芥叶片上，同时以仅喷施0.01％(体积百分含量)Tween-20水溶液作为对照。2小时后取叶片做活性氧检测，并提取RNA检测PR1基因表达水平；同时接种丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Pseudomonas syringae pv tomatoDC3000,DC3000)。三天后观察拍照，且取发病叶片做细菌生长曲线，并计算细菌生长数量。

4.试验结果：

4.1活性氧检测结果

分别利用DAB色与NBT染色方法检测叶片中H₂O₂与超氧阴离子含量，结果见图1，由图1可以看出，脱氧鸟苷能够引起H₂O₂与超氧阴离子在拟南芥叶片大量积累。

4.2 PR1基因表达量检测结果

用定量RT-PCR技术检测拟南芥在喷施0.01％Tween-20水溶液(对照)与植物抗病诱抗剂(2’-脱氧鸟苷浓度为100ng/ml，Tween-20的体积百分含量为0.01％)后抗病基因PR1的表达，结果见图2，由图2可以看出，2’-脱氧鸟苷处理后PR1基因表达水平相较对照大幅上调。

4.3接种丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000后拟南芥的抗病性

结果见图3，由图3a可以看出2’-脱氧鸟苷处理后的拟南芥发病病斑明显变小；由图3a可以看出细菌生长数量与对照相比显著降低。

上述试验结果表明，外源喷施本发明的植物抗病诱抗剂两小时后能够引起拟南芥叶片中活性氧爆发以及PR1基因高表达，同时增强拟南芥对Pst DC3000的抗病性。

实施例2：

1.试验作物：水稻(为粳稻中花11)。

2.种植方式：水稻在温室中种植，日照时间为16小时，黑暗培养8小时，培养温度为常温28℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。

3.试验方法：

水稻在培养到第8周时，将植物抗病诱抗剂(2’-脱氧鸟苷浓度为100ng/ml，Tween-20的体积百分含量为0.01％)喷施在水稻叶片上，同时以仅喷施0.01％Tween-20水溶液作为对照。2小时后接种条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola,Xoc)生理小种RS105，发病期间，每隔四天再次喷施植物抗病诱抗剂，对照组每隔四天再次喷施0.01％Tween-20水溶液。14天后病斑拍照，且对发病叶片进行细菌生长量进行统计。

4.试验结果：

结果见图4，由图4可以看出，2’-脱氧鸟苷处理后的水稻发病病斑明显比对照要少(图4中A)，并且细菌生长数量与对照相比极显著降低(图4中B)。

上述试验结果表明，外源喷施本发明的植物抗病诱抗剂可以显著降低水稻叶片病斑面积，减少细菌生长数量，提高水稻对RS105的抗病性。说明2’-脱氧鸟苷也能提高植物对细菌性病害的抗性。

实施例3：

1.试验作物：水稻(为粳稻中花11)。

2.种植方式：水稻在温室中种植，日照时间为16小时，黑暗培养8小时，培养温度为常温28℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。

3.试验方法：

水稻在培养到第10周时，将植物抗病诱抗剂(2’-脱氧鸟苷浓度为100ng/ml，Tween-20的体积百分含量为0.01％)喷施在水稻的茎秆部位，同时以仅喷施0.01％Tween-20水溶液作为对照。2小时后在叶鞘处接种纹枯病菌并保湿，3-4天观察发病情况，将发病后的水稻整株剪下并拍摄发病病斑表型。

4.试验结果：

结果见图5，由图5可以看出，喷施2’-脱氧鸟苷后与对照相比能够明显降低病斑长度。

上述试验结果表明，外源喷施本发明的植物抗病诱抗剂可以显著提高水稻对纹枯病的抗病性。这说明2’-脱氧鸟苷也能提高植物对真菌病害的抗性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.核苷酸类物质在制备植物抗病诱抗剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核苷酸类物质为嘌呤核苷酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核苷酸类物质为2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

4.一种植物抗病诱抗剂，其特征在于，所述植物抗病诱抗剂的有效成分为2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

5.根据权利要求4所述的植物抗病诱抗剂，其特征在于，所述植物抗病诱抗剂中包含1ng/ml-1μg/ml的2’-脱氧鸟苷或其结构类似物。

6.根据权利要求4所述的植物抗病诱抗剂，其特征在于，所述植物抗病诱抗剂中还包含0.01～0.05％(体积百分含量)的表面活性剂Tween-20。

7.权利要求4-6任一项所述的植物抗病诱抗剂在防治农作物真菌类和/或细菌类病害中的应用。

8.一种防治农作物真菌类和/或细菌类病害的方法，其特征在于，将权利要求4-6任一项所述的植物抗病诱抗剂喷施于农作物叶片或者根茎上。

9.2’-脱氧鸟苷或其结构类似物在制备引起植物活性氧爆发及抗病基因PR1表达上调的植物调节剂中的应用。

10.一种能引起植物活性氧爆发及抗病基因PR1表达上调的植物调节剂，其特征在于，所述植物调节剂以有效量的2’-脱氧鸟苷或其结构类似物作为活性成分。