CN110106093A - 一种球孢白僵菌菌株及其应用 - Google Patents

一种球孢白僵菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种球孢白僵菌菌株及其应用，本发明的一种球孢白僵菌菌株，该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveriabassiana JXAS‑02；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2019年04月25日；保藏编号：CCTCC M 2019293。本发明从生物防治的角度出发，通过生物诱集法，以吉丁虫幼虫为诱饵，从土壤中分离鉴定到一株对吉丁虫具有高效杀虫能力的球孢白僵菌菌株JXAS‑02，该菌剂对吉丁虫幼虫和成虫具有很强的防治感染能力，利用该菌株分生孢子悬浮液喷施或灌注吉丁虫蛀食坑道，可以有效控制吉丁虫种群数量。

Description

一种球孢白僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及昆虫微生物防治技术领域，尤其涉及一种吉丁虫易感球孢白僵菌JXAS-02，及该菌在吉丁虫科害虫防治方面的应用。
背景技术
吉丁虫属鞘翅目，吉丁甲科，成虫生活于木本植物上，产卵于树皮缝内。幼虫大多数在枝干或根部皮内柱食，危害严重时树皮爆裂，故名爆皮虫。柱道大多宽而扁，大量木屑状粪便。一般一年发生一代，以老熟幼虫在柱道内越冬，翌年化蛹并羽化外出。成虫常在树干上爬行，并到树冠上取食叶片补充营养。交尾1-2天后产卵于树干，幼虫孵化后潜入树皮下，在韧皮部和木质部边材串食危害，树表被害处症状不明显，揭开树皮可见大量坑道和粪便。该虫导致树木疏导组织破坏，造成干枝死亡，危害十分严重。
目前防治吉丁虫的方法主要有：（1）化学防治：在秋季幼虫越冬前或春季幼虫刚开始活动时，针对幼虫在皮下形成层活动的特点，使用养乐果，菊酯和煤油按比例混合后涂抹树干伤口；活动期可用根施呋喃丹；成虫期则可用辛硫磷等农药；（3）人工物理防治：在成虫羽化前将枯死的树木及时砍除焚烧处理，消灭越冬幼虫。由于吉丁虫，为钻柱性害虫，幼虫生活于树皮下的坑道内，不容易发现，物理防治难度较大；而成虫飞翔能力强，躲避喷施农药，导致化学防治效果亦不理想，而且环境污染较大。
目前，缺乏一种对吉丁虫具有高效杀虫能力的球孢白僵菌菌株及其应用。
发明内容
为了克服现有防治技术的不足，本发明提供了一种对吉丁虫具有高效杀虫能力的球孢白僵菌菌株及其应用。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种球孢白僵菌菌株，该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveriabassiana JXAS-02；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2019年04月 25日；保藏编号：CCTCC M 2019293。
进一步地，所述的球孢白僵菌JXAS-02的内转录间隔区的序列，即ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的球孢白僵菌制备的球孢白僵菌菌剂。
进一步地，所述的球孢白僵菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）（c）中的至少一种：
（a）所述的球孢白僵菌的发酵培养物；
（b）所得球孢白僵菌细胞的超声裂解上清；
（c）所得球孢白僵菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明的一种分离球孢白僵菌的吉丁虫诱饵方法，包括如下步骤：
（1）取野外土壤，于室内摊开自然晾干一天，防止昆虫寄生型线虫感染；待土壤晾干后，放于塑料盒中，用盛有无菌水的喷壶喷雾充分浸润土壤，以不结块为宜；
（2）将吉丁虫幼虫埋入土壤中，放置于温度20-30℃，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待吉丁虫被真菌寄生并成为僵虫后，将僵虫取出，每个僵虫放于一个装有充分浸润滤纸的培养皿中，待真菌子实体充分生长；
（3）用清水将僵虫表面的沙粒漂洗干净后，用消毒酒精表面消毒30秒后，研磨虫尸，并将虫尸裂解液涂布于含有25ug/mL氯霉素的PDA平板或燕麦平板上，待真菌克隆长出后，划线纯化或单孢子纯化后，经ITS测序鉴定为球孢白僵菌。
本发明所述的球孢白僵菌在防治鞘翅目吉丁虫科害虫中的应用。
本发明所述的球孢白僵菌在制备防治吉丁虫科害虫的药物中的应用。
有益效果：本发明从生物防治的角度出发，通过生物诱集法，以吉丁虫幼虫为诱饵，从土壤中分离鉴定到一株对吉丁虫具有高效杀虫能力的球孢白僵菌菌株JXAS-02，该菌剂对吉丁虫幼虫和成虫具有很强的防治感染能力，利用该菌株分生孢子悬浮液喷施或灌注吉丁虫蛀食坑道，可以有效控制吉丁虫种群数量。
附图说明
下面将结合附图进一步说明，附图中：
图1为土壤中自然死亡的吉丁虫幼虫僵虫；
图2为球孢白僵菌JXAS-02的PDA平板上菌落形态图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
本发明的一种球孢白僵菌菌株，该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveriabassiana JXAS-02；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2019年04月 25日；保藏编号：CCTCC M 2019293。
所述的球孢白僵菌JXAS-02的内转录间隔区的序列，即ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的球孢白僵菌制备的球孢白僵菌菌剂。
所述的球孢白僵菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）（c）中的至少一种：
（a）所述的球孢白僵菌的发酵培养物；
（b）所得球孢白僵菌细胞的超声裂解上清；
（c）所得球孢白僵菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明的一种分离球孢白僵菌的吉丁虫诱饵方法，包括如下步骤：
（1）取野外土壤，于室内摊开自然晾干一天，防止昆虫寄生型线虫感染；待土壤晾干后，放于塑料盒中，用盛有无菌水的喷壶喷雾充分浸润土壤，以不结块为宜；
（2）将吉丁虫幼虫埋入土壤中，放置于温度20℃，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待吉丁虫被真菌寄生并成为僵虫后，将僵虫取出，每个僵虫放于一个装有充分浸润滤纸的培养皿中，待真菌子实体充分生长；
（3）用清水将僵虫表面的沙粒漂洗干净后，用消毒酒精表面消毒30秒后，研磨虫尸，并将虫尸裂解液涂布于含有25ug/mL氯霉素的PDA平板或燕麦平板上，待真菌克隆长出后，划线纯化或单孢子纯化后，经ITS测序鉴定为球孢白僵菌。
本发明所述的球孢白僵菌在防治鞘翅目吉丁虫科害虫中的应用。
本发明所述的球孢白僵菌在制备防治吉丁虫科害虫的药物中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种分离球孢白僵菌的吉丁虫诱饵方法，包括如下步骤：在步骤（2）中，将吉丁虫幼虫埋入土壤中，放置于温度30℃，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待吉丁虫被真菌寄生并成为僵虫后，将僵虫取出，每个僵虫放于一个装有充分浸润滤纸的培养皿中，待真菌子实体充分生长。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种分离球孢白僵菌的吉丁虫诱饵方法，包括如下步骤：在步骤（2）中，将吉丁虫幼虫埋入土壤中，放置于温度25℃，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待吉丁虫被真菌寄生并成为僵虫后，将僵虫取出，每个僵虫放于一个装有充分浸润滤纸的培养皿中，待真菌子实体充分生长。
试验1
吉丁虫僵虫的分离获得（吉丁虫诱饵法/吉丁虫诱虫诱饵法）
本发明所获得的球孢白僵菌来源于土壤中自然死亡的吉丁虫幼虫僵虫，具体过程为：实验前一天提前粉碎并晾干好的艾溪湖湿地公园土壤。将枯死桂花树皮柱道中的吉丁虫幼虫埋入土壤，置于27摄氏度，相对湿度80%的充当诱饵，吉丁虫在死亡前会在土壤中爬动，吸附沾染真菌，十天后，从土壤中取出自然死亡的吉丁虫僵虫（Fig：1），用消毒酒精表面消毒后，将幼虫尸体放于PDA培养基上，让侵入虫体的真菌萌发并长出分生孢子。用接种幻挑取孢子，在新的PDA平板上划线，待真菌长出后，进行单胞子分离，并接种于PDA平板上培养。该菌在PDA平板上白色或乳白色，棉絮状或绒毛状；形成分生孢子时，菌体仍为白色或乳白色，棉絮状或绒毛状。
土壤中自然死亡的吉丁虫幼虫僵虫如图1所示； JXAS-02在PDA固体培养基上的表型如图2所示。
通过ITS1和ITS4引物对JXAS-02进行ITS序列PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳切胶分离纯化后，送上海生工两端测序(Sangon)后，用BioEdit软件将序列拼接得到ITS序列，序列特征如下：
5’TCCGTAGGCCCCCCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTGGGGGAGGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAGTAGGGCCGGAGGAA3’
球孢白僵菌菌株JXAS-02室内吉丁虫杀虫能力测定
将球孢白僵菌菌株JXAS-02接种划线于PDA平板上，置于27摄氏度，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待真菌长满整个平板，用0.5%吐温-80溶液冲洗平板，将真菌孢子冲洗下来，收集分生孢子后用滤纸过滤除去大块的真菌子实体。用细胞计数仪计数分生孢子悬浮液浓度后，将分生孢子用0.5%吐温-80溶液稀释成浓度为1×103，1×104，1×105，1×106，1×107，1×108孢子/mL的溶液。每个浓度三个重复，每个重复组30头吉丁虫幼虫。孢子悬浮液处理吉丁虫幼虫采用浸泡法，即将每个吉丁虫幼虫用镊子按入孢子悬浮液液面以下并维持3秒钟。0.5%吐温-80作为空白对照。处理后的吉丁虫幼虫放于27摄氏度，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，每天取出并记录死亡僵虫数量，计算每个浓度的死亡率，并通过SPSS软件，得出半数死亡浓度，JXAS-02菌株室内吉丁虫幼虫杀虫能力测试结果的数据如下如表1所示：
表1
LC50=1.36*104孢子/mL
球孢白僵菌菌株JXAS-02室外吉丁虫杀虫能力测定
选取被吉丁虫钻柱枯死的移栽桂花树，通过树皮下柱道缓慢灌注JXAS-02菌株孢子悬浮液，直至柱道灌满孢子液，十天后，观察记录死亡吉丁虫总数及死亡率如表2所示：
表2
孢子悬浮液浓度（孢子/mL） 死亡率%
1*10<sup>5</sup> 35.7%（5/14）
1*10<sup>6</sup> 50%（6/12）
1*10<sup>7</sup> 70%（7/10）
如表1和表2所示，本发明的菌株JXAS-02是以活的吉丁虫幼虫为诱饵，从土壤中分离得到的球孢白僵菌菌株，和以往先盲筛分离菌株，再测定是否可以杀吉丁虫的方法相比，具有明显的优势，即：分离到的菌株是天然易感染吉丁虫的。室内生测半数致死浓度LC50低至1.36*104孢子/mL，室外实验半数死亡浓度约1*106孢子/mL，说明该菌株对球孢白僵菌具有很高的感染能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 江西省科学院微生物研究所
<120> 一种球孢白僵菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌菌株(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tccgtaggcc cccctgcgga gggatcatta ccgagttttc aactccctaa cccttctgtg 60
aacctaccta tcgttgcttc ggcggactcg ccccagcccg gacgcggact ggaccagcgg 120
cccgccgggg acctcaaact cttgtattcc agcatcttct gaatacgccg caaggcaaaa 180
caaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggctct ggcatcgatg aagaacgcag 240
cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga atccagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 300
cattgcgccc gccagcattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcgac 360
ctcccctggg ggaggtcggc gttggggacc ggcagcacac cgccggccct gaaatggagt 420
ggcggcccgt ccgcggcgac ctctgcgtag taatacagct cgcaccggaa ccccgacgcg 480
gccacgccgt aaaacaccca acttctgaac gttgacctcg aatcaggtag gactacccgc 540
tgaacttaag catatcagta gggccggagg aa 572

Claims (7)

1.一种球孢白僵菌菌株，其特征在于：该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveriabassiana JXAS-02；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2019年04月 25日；保藏编号：CCTCC M 2019293。
2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌菌株，其特征在于：所述的球孢白僵菌JXAS-02的内转录间隔区的序列，即ITS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的球孢白僵菌制备的球孢白僵菌菌剂。
4.根据权利要求3所述的球孢白僵菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）（c）中的至少一种：
（a）权利要求1所述的球孢白僵菌的发酵培养物；
（b）权利要求1所得球孢白僵菌细胞的超声裂解上清；
（c）权利要求1所得球孢白僵菌细胞的超声裂解沉淀。
5.一种分离球孢白僵菌的吉丁虫诱饵方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）取野外土壤，于室内摊开自然晾干一天，防止昆虫寄生型线虫感染；待土壤晾干后，放于塑料盒中，用盛有无菌水的喷壶喷雾充分浸润土壤，以不结块为宜；
（2）将吉丁虫幼虫埋入土壤中，放置于温度20-30℃，相对湿度80%的恒温恒湿培养箱中培养，待吉丁虫被真菌寄生并成为僵虫后，将僵虫取出，每个僵虫放于一个装有充分浸润滤纸的培养皿中，待真菌子实体充分生长；
（3）用清水将僵虫表面的沙粒漂洗干净后，用消毒酒精表面消毒30秒后，研磨虫尸，并将虫尸裂解液涂布于含有25ug/mL氯霉素的PDA平板或燕麦平板上，待真菌克隆长出后，划线纯化或单孢子纯化后，经ITS测序鉴定为球孢白僵菌。
6.权利要求1或2所述的球孢白僵菌在防治鞘翅目吉丁虫科害虫中的应用。
7.权利要求1或2所述的球孢白僵菌在制备防治吉丁虫科害虫的药物中的应用。
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