CN117801957A - 一种白僵菌的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白僵菌的发酵方法。包括以下步骤：将白僵菌接种到培养基，发酵培养，所述白僵菌的名称为伊拉克白僵菌HS‑01(Beauveria varroae)HS‑01，保藏编号为CGMCC No.22428。通过上述方法获得的发酵后的产物对鳞翅目害虫有致死作用，可以作为生防制品，具有致死率高、生防效果好的优点，有很好的应用开发前景。

Description

一种白僵菌的发酵方法
本发明为分案申请，原中国发明专利申请号为：202111337604.1，申请日为：2021年11月09日，申请时专利名称为：一种白僵菌及其应用。
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种白僵菌的发酵方法。
背景技术
生物防治(biological control)是指利用一种生物对付另外一种生物的方法。该方法具有无公害、无污染、成本低、效率高等诸多优点，表现出巨大的防控潜力，是现代农林生产较为科学、高效的防控方式。当前世界林业发展的主题是生态林业和可持续发展，在森林病虫害控制中明确要求减少化学药剂的使用量，提倡采用生物源生长调节剂、杀菌(虫)剂、激素类杀菌(虫)剂等生物药剂。国外一些学者于本世纪60年代开始寻找病虫发生的生态学、生物学和化学生态学原因，深入开展相关的研究与实践。目前，国内外已开发出很多生物菌剂和生物农药，如烟碱、苦参碱、楝素、茴蒿素和茶皂素等植物源农药已经实现大规模成产，微生物源农药方面主要以细菌、放线菌以及链霉菌为主，如多粘类芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌等，绿僵菌、白僵菌等杀虫真菌的商品化制剂也得到了大面积的推广。
白僵菌Beauveria作为一种重要的昆虫病原真菌，以其高效、低毒、不污染环境、对人畜无害等特点长期以来受到了广泛的关注和深入的研究,其对鞘翅目、同翅目、鳞翅目以及螨类等诸多害虫的田间防治也都取得了满意的效果，并且已有多种剂型产品在欧美国家登记注册,用于多种农林害虫的微生物防治。白僵菌主要通过体壁侵染的方式感染宿主,它的侵染体有分生孢子、芽生孢子和菌丝体3种形式。其中,分生孢子是最常见的侵染体,可以被加工成多种剂型。目前，市面上常见的大部分是球孢白僵菌，尚未发现其他类型的白僵菌。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种白僵菌的发酵方法。该白僵菌属于伊拉克白僵菌(Beauveria varroae)，对鳞翅目害虫有致死作用，具有致死率高、生防效果好的优点，有很好的应用开发前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种白僵菌，菌株名称为伊拉克白僵菌HS-01(Beauveria varroaeHS-01)，该白僵菌的分类命名为伊拉克白僵菌(Beauveria varroae)，在本发明实施例中将其命名为HS-01，保藏编号为CGMCC No.22428，于2021年05月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述菌株为首次报道，根据本发明实施例检测结果，菌株HS-01对鳞翅目害虫有致死作用，具有致死率高的优点，短时间内可实现很好的生防效果，具有很好的应用开发前景。
本发明提供一种白僵菌的发酵方法，包括以下步骤：将上述白僵菌接种到培养基，发酵培养。
采用上述发酵方法可以将白僵菌扩大培养，并用于生物防治，具有很好的防治效果。
可以为白僵菌选择合适的培养基以利于白僵菌的生长，例如：本发明实施例中采用的发酵培养基包括一级PDA培养基和二级液体培养基；一级PDA培养基的配方:每1000mL蒸馏，水马铃薯200g,葡萄糖10g,琼脂20g；二级液体培养基的配方:每200mL蒸馏水，蛋白胨1g,酵母粉1g,葡萄糖4g,K2PO4 0.1g,MgSO4 0.1g,KCl 0.1g。
培养时，先在一级PDA培养基上培养，5-7d后转至二级液体培养基摇瓶发酵。
发酵培养的条件为：温度为25℃-28℃。
采用上述的发酵方法，有利于白僵菌的培养。
本发明提供一种白僵菌的孢子的制备方法，包括以下步骤：采用上述发酵方法发酵白僵菌，得到产物，之后分离，获得孢子。
分离的方法可以包括离心和/或过滤，通过上述分离方法(离心、过滤等)可以来获取白僵菌的孢子。
本发明提供上述发酵方法制备的产物在生物防治中的应用。本发明提供上述制备方法制备的孢子在生物防治中的应用。
上述发酵方法制备的产物和/或上述制备方法制备的孢子可以应用于对鳞翅目害虫的生物防治。优选地，用于灯蛾科、菜蛾科、螟蛾科和/或粉蝶科的昆虫的生物防治。例如，可以应用于对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫、玉米螟中的一种或几种的组合的生物防治。在应用时，具有致死率高、短时间内可实现很好的生防效果，应用开发前景广泛等优点。
本发明提供一种生防制品，包括上述白僵菌、上述白僵菌的发酵产物和/或从上述白僵菌的发酵产物提取的成分。例如：生防制品可以包括白僵菌、白僵菌的孢子粉、白僵菌的发酵液中的一种或几种的组合，也可以包括除上述成分外添加的本领域常规添加的成分。
生防制品的剂型可以为粉剂、油剂、悬乳剂或者其他的剂型。
以粉剂为例，以白僵菌HS-01菌株为目标菌株,发明人初步筛选了可湿性粉剂，配方包括：白僵菌HS-01的孢子粉35重量份；载体50重量份；润湿剂7重量份；分散剂8重量份。所述载体可以为硅藻土，所述润湿剂可以为拉开粉BX，所述分散剂可以为分散剂NNO。
油剂是指将白僵菌的分生孢子粉按一定比例兑入载体油中并辅以多种助剂而制成的一种制剂,一般通过超低容量喷雾使用,具有粘着力强和渗透性好的特点,可以破坏虫体表面蜡质层和几丁质,从而有利于菌体芽管的侵入，传染力更强。由于油剂具有良好的分散性和附着性,其对寄主的效果都会得到提高。同时,其理化性质稳定,有助于孢子粉在常温下的贮存。也可以向油剂中加入具有与分生孢子粉生物相容性的乳化剂,从而可以用水将其稀释为不同浓度的孢子水悬乳液,用于常规容量的喷雾。
本发明提供上述白僵菌在生物防治中的应用。在应用时，具有致死率高、短时间内可实现很好的生防效果，应用开发前景广泛等优点。
进一步，上述白僵菌可以应用于对鳞翅目害虫的生物防治。优选地，用于灯蛾科、菜蛾科、螟蛾科和/或粉蝶科的昆虫的生物防治。
进一步，上述白僵菌可以应用于对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫、玉米螟中的一种或几种的组合的生物防治。
根据本发明实施例的记载，本发明提供的白僵菌对上述昆虫的校正死亡率可达到100％。
本发明提供上述生防制品在生物防治中的应用。在应用时，本发明提供的生防制品具有致死率高、短时间内可实现很好的生防效果，应用开发前景广泛等优点。
进一步，上述生防制品可以应用于对鳞翅目害虫的生物防治。优选地，用于灯蛾科、菜蛾科、螟蛾科和/或粉蝶科的昆虫的生物防治。
进一步，上述生防制品可以应用于对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫、玉米螟中的一种或几种的组合生物防治。
本发明提供一种生物防治的方法，包括以下步骤：将上述白僵菌或上述生防制品施加于需生物防治的植物。采用上述方法进行生物防治具有致死率高的优点，短时间内可实现很好的生防效果。
附图说明
图1为实施例中白僵菌分子鉴定的结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中涉及的材料与试剂如下。
供试虫源：花布灯蛾(Camptoloma interiorata)，美国白蛾(Hyphantria cunea，Drury)，鳞翅目，灯蛾科；小菜蛾(Plutella xylostella L.)，鳞翅目，菜蛾科；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenee)，鳞翅目，螟蛾科；菜青虫(Pieris rapae L.)，鳞翅目，粉蝶科；采集自被害寄主，由发明人所在实验室内人工继代饲养。
菌株测定所需试剂：如表1所示。
表1实施例所用试剂一览表
实施例1
1、菌株采集、分离、纯化
2019年秋，在吉林省吉林市红石林场随机采集到1头已感染白僵菌的橡甲，橡甲表面可见明细的白色菌丝，挑取菌丝，采用PDA培养基(PDA培养基的配方:马铃薯200g,葡萄糖10g,琼脂20g,蒸馏水1000mL)，25℃培养，5-7d后，挑取菌丝，分离纯化(转接，直至得到纯菌为止)，获得纯化后的菌株，将其编号为菌株HS-01。
2、菌株HS-01的形态和分析
PDA平板上，25℃培养5-7d进行观察，菌落形态如下：白色，中心突起，菌落大部分不平坦，为放射状脊沟，近外缘有环状纹；菌落初期侧面观为乳突型；分生孢子平均大小为3.14(2.70～3.99)μm×2.16(1.42～2.95)μm。
3、菌株HS-01的分子鉴定
(1)提取DNA：将菌株HS-01采用TIANamp Micro DNA Kit微量样品基因组DNA提取试剂盒中提取基因组DNA，获得菌株HS-01的DNA。
(2)设计并合成引物ITS1和ITS4，引物序列如下：
ITS1:5’TCCG TAGG TGAA CCTG CGG 3'(SEQ ID NO:1)；
ITS4:5’TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC 3'(SEQ ID NO:2)。
(3)PCR鉴定
采用TAKARA公司的LA Taq试剂盒进行PCR扩增，PCR反应体系包括：TaKaRa LA Taq0.5μl，10×LA Taq Buffer II(Mg2+Plus)5μl，dNTP Mixture(2.5mM each)8μl，模板DNA(菌株HS-01的DNA)2μL，上游引物ITS1 1μL(终浓度10μmol/L)，下游引物ITS4 1μL(终浓度10μmol/L)，灭菌蒸馏水补足至50ul。
PCR扩增程序包括：94℃4min；94℃40s，52℃1min，72℃1.5min，36个循环；72℃8min；4℃保存。
取PCR扩增获得的产物5ul在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳(电泳条件110V，15min)，在紫外凝胶成像仪上成像、拍照，电泳检测后将含有目的条带的PCR产物送至长春库美生物公司进行双向测序。测得其序列长度为1290bp；与GenBank数据库中序列进行比对，比对结果如图1所示，结果表明菌株HS-01经鉴定为伊拉克白僵菌(Beauveriavarroae)。
4、菌株HS-01发酵培养
制备白僵菌菌板：将纯化的菌株HS-01，打7mm菌饼，接种至一级PDA培养基上，25℃培养，制得白僵菌菌板。一级PDA培养基的配方:马铃薯200g,葡萄糖10g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。
摇瓶发酵：取培养5d的白僵菌菌板，使用7mm打孔器，打菌饼10个，接种至提前灭菌的二级液体培养基中，转数150r/min、25℃，发酵时间为7d，获得白僵菌孢子悬液。二级液体培养基的配方:蛋白胨1g,酵母粉1g,葡萄糖4g,K2PO4 0.1g,MgSO4 0.1g,KCl 0.1g，蒸馏水200mL。
5、白僵菌对昆虫防治效果测定
以5×106/ml白僵菌HS-01孢子悬液接种供试虫源3-4龄幼虫。供试虫源分别为花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟。
取10ml分生孢子悬浮液放在培养皿中，接种时将供试虫源在孢子悬液中浸渍5s后取出，常温下单头饲养。每组20头供试虫源幼虫，3次重复，以无菌水处理为对照。每日记录死亡虫数并计算死亡率，持续10d。
白僵菌HS-01孢子悬液接种供试虫源后第2d起，各供试虫源幼虫就出现了不同程度的感病反应，主要表现为食欲不振，活动力明显减弱等特征；5d部分幼虫死亡，校正死亡率为32.1-45.6％(实验数据如表2所示)，第7d花布灯蛾幼虫死亡率达100％，10d时所有试虫死亡率均达100％，相比市售的白粉菌致病的症状为发病虫体菌丝多，本发明的白僵菌导致的发病虫体更僵硬，表面菌丝不多，并且解剖后虫体内壁呈粉色。
表2中市售指的是球孢白僵菌可湿性粉剂(购自江西天人生态股份有限公司)，将市售采用上述方法用于对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟的防治效果测定。从表2中数据可以看出，对于3d校正死亡率，本发明的白僵菌HS-01对花布灯蛾、小菜蛾、菜青虫的校正死亡率均高于市售；对于5d校正死亡率，本发明的白僵菌HS-01对花布灯蛾的校正死亡率高于市售；对于7d校正死亡率，本发明的白僵菌HS-01对花布灯蛾、小菜蛾、菜青虫的校正死亡率高于市售；对于10d校正死亡率，本发明的白僵菌HS-01对花布灯蛾、玉米螟的校正死亡率高于市售，本发明的白僵菌HS-01对美国白蛾、小菜蛾、菜青虫的校正死亡率可以达到100％。
表2
菌株HS-01为发明人所在研究组自主分离获得，为国内外首次报道，根据表2数据表明，菌株HS-01对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟等鳞翅目害虫均有致死作用，具有致死率高、生防效果好等优点，有很好的应用开发前景。
实施例2白僵菌HS-01的可湿性粉剂对昆虫防治效果测定
以白僵菌HS-01菌株为目标菌株,制备了可湿性粉剂，配方：孢子粉35重量份；载体硅藻土50重量份；润湿剂拉开粉BX 7重量份；分散剂NNO 8重量份。硅藻土、拉开粉BX、分散剂NNO均可以通过市购获得。
可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组分混合。
将含有白僵菌HS-01可湿性粉剂(简称HS-01剂)和市售分别用于花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟等昆虫的生物防治，检测并计算死亡率。表3中市售指的是球孢白僵菌可湿性粉剂(购自江西天人生态股份有限公司)。检测结果如表3所示，对于3d校正死亡率，本发明的含有白僵菌HS-01粉剂对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟的校正死亡率均高于市售；对于5d校正死亡率，本发明的含有白僵菌HS-01粉剂对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟的校正死亡率均高于市售；对于7d校正死亡率，本发明的含有白僵菌HS-01粉剂对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫和玉米螟的校正死亡率均高于市售。结果表明，本发明制备的可湿性粉剂对上述昆虫具有很好的生防效果。
表3
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白僵菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将白僵菌接种到培养基，发酵培养，所述白僵菌的名称为伊拉克白僵菌HS-01(Beauveria varroae)HS-01，保藏编号为CGMCC No.22428。
2.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于，所述培养基包括一级PDA培养基和二级液体培养基。
3.根据权利要求2所述发酵方法，其特征在于，一级PDA培养基的配方包括:每1000mL蒸馏，水马铃薯200g,葡萄糖10g,琼脂20g。
4.根据权利要求2所述发酵方法，其特征在于，二级液体培养基的配方包括:每200mL蒸馏水，蛋白胨1g,酵母粉1g,葡萄糖4g,K2PO4 0.1g,MgSO40.1g,KCl 0.1g。
5.根据权利要求2-4任一项所述发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：先在一级PDA培养基上培养，5-7d后转至二级液体培养基摇瓶发酵。
6.根据权利要求1-4任一项所述发酵方法，其特征在于，发酵培养的温度为25℃-28℃。
7.一种白僵菌的孢子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1-6任一项所述发酵方法发酵白僵菌，得到产物，之后分离，获得孢子。
8.根据权利要求7所述白僵菌的孢子的制备方法，其特征在于，分离的方法包括离心和/或过滤。
9.权利要求1-6任一项所述发酵方法制备的产物在生物防治中的应用。
10.权利要求7或8所述制备方法制备的孢子在生物防治中的应用。
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