CN118308226B - 一株苏格兰白僵菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株苏格兰白僵菌（Beauveria caledonica），其保藏编号为：CCTCC NO:M 2024178，该苏格兰白僵菌可用于香蕉假茎象甲的防治。本发明的发明人香蕉假茎象甲成虫上采集分离得到一株虫生真菌，通过形态学和分子生物学手段鉴定其为苏格兰白僵菌，属白僵菌属，是典型的昆虫病原真菌。通过对菌株生物学特性和毒力测试，确定了苏格兰白僵菌的培养条件和致病力，对香蕉假茎象甲等虫害防治提供了新型菌株来源，具有较高的研究价值。

Description

一株苏格兰白僵菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株苏格兰白僵菌及其应用。

背景技术

香蕉假茎象甲（Odoiporus LongicollisOlivier.）又名香蕉双黑带象甲、香蕉双带象甲，是香蕉的重要害虫之一，主要以幼虫蛀食香蕉假茎，造成大量纵横交错的虫道，妨碍水分和养分输送，植株被害后，生长不良，叶片发黄变小，逐渐枯萎下垂结果少，严重者不能抽蕾，已挂果植株果指短小不饱满，极易倒伏。

目前，国内外对于香蕉假茎象甲的防治主要以化学防治为主，由于害虫主要在假茎内层取食危害，化学防治效率不高，一般生产上采用灌根处理，这会直接导致土壤污染和误杀有益生物。

发明内容

针对上述的技术问题，本发明的目的是一株苏格兰白僵菌及其应用，该苏格兰白僵菌可用于防治香蕉假茎象甲。

为了实现上述目的本发明第一方面提供一株苏格兰白僵菌，其保藏编号为：CCTCCNO:M 2024178。

本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂的有效成分为上述的苏格兰白僵菌。

本发明第三方面提供上述的苏格兰白僵菌在香蕉假茎象甲防治中的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

（一）本发明的苏格兰白僵菌分离自香蕉假茎象甲成虫上，相较于工程菌而言，其更容易适应环境，在香蕉假茎象甲上定殖；

（二）苏格兰白僵菌分离自香蕉假茎象甲成虫上，取自于香蕉的原始生长环境，不会对环境产生污染，也不会对其它有益昆虫造成不利影响；

（三）本发明的苏格兰白僵菌对香蕉假茎象甲具有良好的防治效果。

附图说明

图1是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在PDA培养基上形态特征图（左：培养基正面；右：培养基背面）；

图2是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在光学显微镜下的形态图（左：菌丝；右：孢子）；

图3是本发明中苏格兰白僵菌扫描电镜下微观形态特征

图4是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2的系统发育树；

图5是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在不同培养基上的生长速率图；

图6是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在不同pH下的菌落生长速率及产孢量图；

图7是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在不同温度下菌落生长直径图；

图8是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在不同光周期下菌落生长直径图；

图9是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2在不同碳源的培养基上的生长情况图；

图10是本发明中苏格兰白僵菌Cs-2不同浓度孢子悬浮液对香蕉假茎象甲成虫累计死亡率的比较图。

生物保藏

本发明提供的苏格兰白僵菌（Beauveria caledonica），分类命名为：苏格兰白僵菌Cs-2 Beauveria caledonica Cs-2，已于2024年 1月23 日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2024178。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中苏格兰白僵菌Cs-2和苏格兰白僵菌CCTCC NO.M 2024178为同一菌株，二者意义相同，其名称（编号）可以互换使用。

本发明的发明人在研究过程中分离获得了一株苏格兰白僵菌，命名为：苏格兰白僵菌Cs-2，已于2024年 1月23 日保藏于国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2024178。

基于此，本发明第一方面提供一株苏格兰白僵菌，其保藏编号为CCTCC NO:M2024178。

本发明第二方面提供一种菌剂，菌剂的有效成分为苏格兰白僵菌Cs-2。

经进一步研究发现苏格兰白僵菌可用于防治香蕉假茎象甲。

基于此，本发明第三方面提供上述的苏格兰白僵菌在香蕉假茎象甲防治中的应用。

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例一菌株的分离与鉴定

1、菌株的分离

2022年7月18日，从云南省景洪市嘎洒镇曼金龙村（N21°54′13″，E100°48′25″，海拔623.5m）香蕉假茎象甲成虫上采集分离得到一株虫生真菌，命名为：苏格兰白僵菌Cs-2。

2、菌株的鉴定

2.1 将菌株接种于PDA培养基上，如附图1所示，图中1左图为培养基正面，右图为培养基背面，菌落粉状，起初菌丝白色，7天左右开始产孢，后多为粉状孢子，15天左右菌落有中心开始变为粉奶油色，孢子层开始出现裂痕，30天左右基本全部变色，背面浅棕黄色。

2.2菌株菌丝及孢子在光学显微镜下的形态观察

如附图2（图2左：菌丝图；右：孢子图）所示，菌株菌丝无色光滑，直径为1.5～2.0μm，产孢细胞浓密簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊上，球形至瓶形，产孢细胞大小为2.4～5.7μm×1.9～3.3μm，产孢轴长约14μm，轴上具小齿突，呈膝状弯曲。产孢细胞和泡囊常倍增，在分生孢子梗或菌丝上聚成相当密实的孢子头。分生孢子无色，光滑，单细胞，多为短圆筒形，少为椭圆形，两端通常钝圆。分生孢子大小为2.5～6.5μm×1.3～2.2μm。

2.3分子鉴定

提取真菌 DNA，以菌株基因组 DNA 为模板，采用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4( 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行菌株rDNA-ITS序列PCR扩增。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。

将该目的菌株的ITS序列结果提交至NCBI网站(https:llblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通过BLAST比对后，筛选并下载与目的菌株具有较高同源性的序列，再使用MEGA7.0软件，通过邻接法(neighbor-joiningmethod,NJ)，运行1000次bootstrap验证，构建系统发育树，如附图3所示。

苏格兰白僵菌Cs-2菌株的ITS序列结果：GACTGATCTCCTCCGCTTATTGATATGCCGCAAGTTCCCTACGTTACACGTCCTCCCGTTATTGATATGCCGTGCGAGTTGATTTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGATCCCCAATGCCGACTTCCACGGGCTGGGCCCAGGAAGTCGAGTGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATTTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAACATGCTGGTAATACAAGAGTTTGAGGGTCCCCGGCGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAAAAGGGTTTGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCCTTACGGAAGGGATT

Cs-2菌株与参比标准菌株Beauveria caledonicaBCRC的相似性为99.35%；结合形态特征，确定Cs-2菌株为苏格兰白僵菌Beauveria caledonica。

3、Cs-2菌株的生物学特性

3.1在不同培养基：PDA、PDA＋虫粉（利用烘箱将香蕉假茎象甲烘干后用研钵将其研磨成粉）、SDAY、SDAY＋虫粉，在四种不同培养基条件下，第3、6、9、12、15、18天苏格兰白僵菌Cs-2的菌落直径柱状图如附图4所示。苏格兰白僵菌在以PDA＋虫为培养基条件下生长最快，18 d时直径达到60.21±3.26 mm，其次为PDA培养基，综上，PDA培养基更适合苏格兰白僵菌的生长和产孢，同时，适当加入香蕉假茎象甲虫粉有利于菌株的生长和产孢。

3.2在不同pH：pH=6-11，培养条件为：PDA培养基、温度25℃，培养Cs-2菌株。用“十字交叉法”测量菌落直径，在18天时用直径为0.5 cm的打孔器分别在各菌落半径1/2处打取菌碟，置于50 mL锥形瓶中，加入20 mL 0.05%吐温-80无菌液，将锥形瓶放在磁力搅拌器上充分搅拌，用血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积，测定菌株的分生孢子产量。结果显示苏格兰白僵菌Cs-2在pH=6-11的培养基上均可产孢，在18天分别测量产孢量，其中，当pH=6条件下产孢最多，18天后每cm²菌落孢子量为7.39×10⁷个，pH=8条件下产孢最少，18天后每cm²菌落孢子量为4.12×10⁷个。如附图5所示。

3.3在不同温度：20、25、28、30℃，培养条件为：PDA培养基，光期为L//D=12h//12h，培养Cs-2菌株，在3、6、9、12、15和18天分别测量菌落直径，如附图6所示。由图6可知，苏格兰白僵菌Cs-2在温度为20、25、28℃条件下均可生长，当温度到达30℃时停止生长，在3、6、9、12、15和18天分别测量菌落直径，其中，当温度为25℃条件下生长最快，18天后菌落直径为64.25±1.40mm，温度为30℃条件下停止生长。

3.4在不同光周期：24L:0D、0L:24D、12L:12D、16L:8D、8L:16D，培养条件为：PDA培养基、温度25℃，培养Cs-2菌株，结果显示：株苏格兰白僵菌菌株在L//D=12 h//12 h、L//D=24 h//0 h、L//D=0 h//24 h、L//D=16 h//8 h、L//D=8 h//16 h五个光照条件下均可生长，Cs-2在光周期为L//D=24 h//0 h条件下时菌落直径最大，直径为50.94±3.32 mm。如附图7所示。

3.5不同碳氮源培养基，培养条件为：温度25℃，光期为L//D=12h//12h，培养Cs-2菌株；苏格兰白僵菌Cs-2在不同碳源的培养基上均可产孢，在18天分别测量产孢量，如附图8所示，其中，当以蔗糖为碳源的条件下产孢最多，18天后每cm²菌落孢子量为7.80×10⁷个，以果糖为碳源的条件下产孢最少，18天后每cm²菌落孢子量为3.47×10⁶个。在以甘氨酸、硫氨酸、蛋白胨和牛肉膏为氮源的条件下，苏格兰白僵菌以牛肉膏为唯一氮源条件下菌落直径均显著高于其余三种氮源，18 d时菌落直径为36.74±1.01 mm；其次为蛋白胨，甘氨酸和硫氨酸条件下四株菌株直径均显著低于牛肉膏和蛋白胨。

通过上述试验可看出离体培养的最佳条件为光照24L:0D、温度25℃的虫粉PDA培养基，在此条件下第18d菌落直径和产孢量最高，在不同碳氮源中为果糖和牛肉膏条件下生长最佳。

实施例二Cs-2对香蕉假茎象甲的致病力

在香蕉田间捕获香蕉假茎象甲成虫，以没有带菌虫体的健康香蕉假茎片为食物饲养虫群，25±0.5℃，相对湿度为75%的全黑暗条件下在实验室隔离60天，期间每两天补充一次新鲜香蕉假茎片，并每天观察象甲状态，如果发现有死亡虫体，立即用灭菌镊子将虫体取出，放于无菌培养皿中，并观察昆虫尸体是否是被真菌感染，同时对该培养盒进行消毒，更换假茎片处理。在整个60天期间只有没有真菌感染迹象的昆虫用于后期致病力测定。

健康虫体在含0.04%Tween 80的分生孢子悬浮液中浸泡10s，浓度分别为1×10⁵、1×10⁷和1×10⁹cfu/ml。对照虫浸泡在0.04%Tween 80溶液中10s。然后将昆虫单独放置在灭菌培养盒中，健康香蕉假茎片作为食物来源，25±0.5℃，相对湿度75%的黑暗条件下饲养25天。共设置5个重复，每个重复15头。每天记录死亡率，所有死亡昆虫的尸体用次氯酸钠和70%乙醇进行表面消毒，并用蒸馏水连续冲洗15 s，放于无菌培养皿中，并观察昆虫尸体是否是被真菌感染，根据真菌的生长情况进发病确认。

根据25天不同复接浓度下香蕉假茎象甲的死亡情况发现，孢子浓度越高则累计死亡虫数越多，当孢子浓度为1×10⁹cfu/ml时，25天校正死亡率显著高于其他浓度下的校正死亡率，达到78.95%，半数死亡时间LT50/d为10天，随着孢子浓度的降低，累计死亡率也随之降低。

其中，校正累计死亡率（%）=[(处理组累计死亡率-对照组累计死亡率)/(1-对照死亡率) ]×100%

不同浓度的苏格兰白僵菌Cs-2对香蕉假茎象甲虫的致病力如下表1所示。

苏格兰白僵菌Cs-2不同浓度孢子悬浮液对香蕉假茎象甲成虫累计死亡率的比较图，如附图9所示，累计死亡曲线成“S”型，在5-11天死亡率最高。

表1苏格兰白僵菌Cs-2对香蕉假茎象甲虫的致病力

注：图中*表示相同天数水平下不同浓度的苏格兰白僵菌（Cs-2）悬浮液接种香蕉假茎象甲后致死率之间差异显著（p＜0.05）。

Claims (3)

1.一株苏格兰白僵菌（Beauveria caledonica），其保藏编号为：CCTCC NO:M 2024178。

2.一种菌剂，其特征是：菌剂的有效成分为如权利要求1的苏格兰白僵菌。

3.如权利要求1所述的苏格兰白僵菌在香蕉假茎象甲防治中的应用。